Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-03-27T13:38:08Z No. of bitstreams: 1 2013_TainaMacheriniMarques.pdf: 3539369 bytes, checksum: acd0b0410a6aa4e6814cb34fa6dd6edd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-03-27T13:59:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_TainaMacheriniMarques.pdf: 3539369 bytes, checksum: acd0b0410a6aa4e6814cb34fa6dd6edd (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-27T13:59:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_TainaMacheriniMarques.pdf: 3539369 bytes, checksum: acd0b0410a6aa4e6814cb34fa6dd6edd (MD5) / MicroRNAs circulantes são encontrados em todos os fluidos corporais e podem ser associados com a modulação do microambiente tumoral e progressão de doenças. Na presença de células cancerosas, componentes presentes no microambiente normal, tornam-se desregulados, promovendo a sobrevivência celular, a progressão da doença e resistência às drogas. Vários microRNAs atuam como participantes no processo de desenvolvimento de leucemia, quer aumentando ou diminuindo os níveis de expressão. Aqui, mostramos dados onde microRNAs circulantes foram identificados no soro de medula óssea de pacientes com leucemia linfoide aguda (LLA). Foram investigados, por smallRNA seq a presença de microRNAs no microambiente do tumor em amostras de soro de quatro pacientes, colhidos ao diagnóstico (fase um) e durante o seguimento do tratamento quimioterápico (fase dois e três). No total, foram identificados 946 microRNAs conhecidos, apenas os microRNAs com o mínimo de cinco leituras por milhões em uma das fases foram consideradas, totalizando 391 microRNAs. Após a análise estatística, somente microRNAs com diferença de expressão entre as fases de tratamento com um valor de p em 0,05 foram considerados. Entre eles, 258 apresentaram número de leituras com diferença significativa entre a fase um e a fase dois, 199 entre a fase um e três e 237 comparando fase dois e três. Os seis microRNAs com diferença mais significativa entre as fases foram relacionados em outras doenças com a atuação como proto-oncogenes, progressão, invasão, angiogênese, metástase tumoral, inibição de apoptose e promotor de crescimento celular. O miR-486-5p foi o maior em quantidade de leituras (reads) e aquele com a maior diferença significativa entre as fases, diminuindo durante o tratamento, com exceção do paciente com recidiva da doença. Sugerindo que este microRNA 486-5p, possa ser utilizado como biomarcador associado ao resultado do tratamento. O microRNA 423, descrito como participante no crescimento celular, possibilitou a estratificação entre os grupos de risco, indicando sua possível utilização como marcador na classificação de risco dos pacientes. Esse estudo é o primeiro a relacionar os microRNAs circulantes em microambiente tumoral durante as etapas de tratamento quimioterápico e a sugerir o uso como biomarcadores. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Circulating microRNAs have been found in all body fluids and could be associated with modulation of tumor microenvironment and progression of diseases. In the presence of cancer cells, components present in normal microenvironment, become deregulated, promoting cell survival, disease progression and drug resistance. Several microRNAs act as participants in the process of development leukemia either increasing or decreasing the expression levels. Here, we show data where circulating microRNAs were found in bone marrow serum from acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. We investigated, by smallRNA seq the presence of microRNAs in tumor microenvironment from four patients, collected diagnosis (phase one) and during sequence chemotherapy treatment (phase two and three). In totally, 946 known microRNAs were identified, only microRNAs with minimum of five reads per million in one of phases were considered, totaling 391 microRNAs. After statistical analysis, only microRNAs with expression difference between treatment phases with a p value under 0,05 were considered. Among them, 258 presented significant difference expression between phase one and two, 199 between phase one and three and 237 comparing phase two to three. The six more different expressed microRNAs have been linked with other diseases acting as proto-oncogenes, progression, invasion, angiogenesis, tumor metastasis, inhibition apoptosis and cell growth promoter. The miR-486-5p was the largest in number reads and the one with the most significant difference between the phases, decreasing during treatment, except for patients with relapsed disease. Suggesting that this microRNA 486-5p could be used as biomarker associated to treatment outcome. The microRNA 423, described as participating in cell growth, was able stratify risk among groups, indicating its possible use as a biomarker in the risk classification. This study is the first to relate the circulating microRNAs in the tumor microenvironment during the stages of chemotherapy and suggested their use as biomarkers.

Doctor en Química / En esta tesis doctoral se estudió, en forma experimental y teórica, la reacción de acoplamiento oxidativo de las quinonas carbo- y heterocíclicas 2-metil-1,4-benzoquinona, 8,8-dimetilnaftalen-l,4,5(8H)-triona y el éster metílico del ácido 1,3-dimetil-5,8-dioxo-5,8-dihidro-isoquinolin-4-carboxílico (una isoquinolin quinona), con aminas alifáticas (derivados de N-fenilpiperazina) y aromáticas (derivados de anilina), comparando un medio de reacción orgánico como el diclorometano con un medio de reacción sustentable como el agua. Se aplicó la metodología sintética desarrollada en la obtención de nuevos inhibidores de la enzima fosfatasa Cdc25B, implicada en el control de la proliferación celular y asociada con cáncer. Los compuestos fueron también estudiados como inhibidores de la respiración mitocondrial, un blanco donde comúnmente actúan compuestos quinonicos, además de su efecto antiproliferativo en células tumorales de ratón y humanas. Se encontró que el medio acuoso puede incrementar tanto la reactividad como la regioselectividad, en las reacciones de acoplamiento C-N de aminas con quinonas. Para los casos estudiados en este trabajo, las reacciones en agua dan mejores, o al menos, los mismos resultados que al usar un medio de reacción convencional como diclorometano. Los cálculos teóricos, basados en índices de reactividad DFT y el potencial electrostático molecular ayudaron a racionalizar los cambios en la reactividad observada experimentalmente. A partir de la quinona 8,8-dimetilnaftalen-l,4,5(8H)-triona, se obtuvieron nuevos inhibidores de la enzima Cdc25B de tipo aminiquinonicos, los cuales presentaron inhibición de tipo mixta, con Ki y Ki´ en el rango micromolar y en un caso con Ki´ submicromolar. Los cálculos de docking permitieron visualizar la forma de unión de los compuestos en el sitio activo de la enzima, lo que explica en parte la acción inhibitoria de los compuestos. Los resultados de la inhibición de la respiración mitocondrial mostraron que la adición de un sustituyente amino, ya sea anilina, fenilpiperazina o bisfenilamina en la quinona 8,8-dimetolnaftalen-l,4,5(8H)-triona inactiva su acción. Los resultados de inhibición de la proliferación celular de las aminoquinonas obtenidas, mostraron que para el caso de las células de ratón la relación de proliferación de células cancerosas/células normales es siempre mayor a uno, indicando una selectividad por las células cancerosas, en cambio en las células humanas esta relación se invirtió, siendo siempre las células normales más susceptibles que las cancerosas. El compuesto más activo frente a las células tumorales de ratón TA3 fue la o-acetil anilinquinona (1,29 uM), mientras que frente a las células tumorales humanas MCF7 el compuesto más activo fue la o-cloro anilinquinona (18,67 uM) / The oxidative coupling reactions of carbo- and heterocyclic quinones 2-methyl-1,4-benzoquinone, 8,8- dimethylnaphthalene- l,4,5(8H)-trione and the methyl ester of 1,3-dimethyl-5,8-dioxo -5,8- dihydro-isoquinoline -4- carboxylic acid with aliphatic amines (N-phenylpiperazine derivatives) and aromatic (aniline derivatives) were studied experimentally and theoretically. A comparison between a typical organic solvent such as dichloromethane and water, a sustainable reaction medium, was performed. The developed synthetic methodology was applied in the synthesis of new inhibitors of Cdc25B phosphatase enzyme, which is involved in the control of cell proliferation and therefore proposed as a target in cancer research. The inhibition of mitochondrial respiration and the antiproliferative effects in mouse and human tumor cells provoked by the series of compounds were also studied. The results of these studies show that water enhance both reactivity and regioselectivity, in the coupling C-N reactions of quinones with amines. The experimental changes in reactivity were explained by theoretical calculations based on DFT reactivity indexes and molecular electrostatic potential. Starting from 8,8-dimethylnaphthalen-l,4,5(8H)-trione, new aminoquinone Cdc25B enzyme inhibitors were obtained. These compounds showed inhibition of mixed type, with Ki and Ki' in the micromolar range and in one case with Ki' submicromolar. Docking calculations showed the binding of compounds in the active site of the enzyme, explaining partially their inhibitory action. The results on mitochondrial respiration showed that the addition of an amino substituent, either aniline, bisphenilamine or phenylpiperazine to 8,8-dimetolnaftalen-l,4,5(8H)-trione inactivate its inhibitory activity. For the case of mouse cells the results on cell proliferation showed that, the ratio of inhibition of proliferation of cancer versus normal cells is always greater than one. This indicates selectivity for cancer cells. The opposite is observed in human cells. The most active compound against tumor cells mouse TA3 was o-acetyl anilinquinone (1.29 uM ) while facing MCF7 human tumor cells the most active compound was o-chloro anilinquinone (18.67 uM). / FONDECYT

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-02T17:21:35Z No. of bitstreams: 1 2016_KarollynedaSilvaMorais.pdf: 1281173 bytes, checksum: b0efd37124c639ccd7ed0e47dc36d9f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-04T18:32:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_KarollynedaSilvaMorais.pdf: 1281173 bytes, checksum: b0efd37124c639ccd7ed0e47dc36d9f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T18:32:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_KarollynedaSilvaMorais.pdf: 1281173 bytes, checksum: b0efd37124c639ccd7ed0e47dc36d9f9 (MD5) / As células normais tem potencial proliferativo regulado, e na maioria dos tipos celulares, obedecem a um número determinado de ciclos. Para que uma célula possa proliferar indefinidamente e de forma autônoma e ser considerada uma célula de câncer, ela deve passar pelo processo de imortalização. Os telômeros estão intimamente relacionados com o processo de imortalização, pois encurtam a cada ciclo celular, limitando a capacidade proliferativa. A telomerase é uma enzima que restaura a integridade dos telômeros, e está presente em 85% dos tipos de câncer, o que a torna um potencial alvo terapêutico. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais incidente em todo o mundo, e entre as mulheres é o primeiro em mortalidade. Dada a sua importância epidemiológica, foram utilizadas neste estudo linhagens de câncer de mama que expressam telomerase, MCF-7 e MDA-MB-231, submetidas a tratamentos de curto e longo prazo com o inibidor de telomerase MST-312. Este foi citotóxico para ambas as linhagens em tratamentos de curto prazo, com morte celular acentuada nas doses de 5 μM em MCF-7 e 10 μM em MDA-MB-231, efeito este que independe da crise telomérica. Após 18 semanas de tratamento em dose subtóxica do MST-312, as linhagens foram novamente submetidas aos ensaios de citotoxicidade. A linhagem de MCF-7 apresentou maior sensibilidade ao MST-312 após o tratamento de longo prazo, com sinais de senescência celular acentuadas nos grupos tratados com o inibidor e cariótipos característicos de crise telomérica. Enquanto que a linhagem MDA-MB-231 demonstrou sinais de aquisição de resistência à droga, não demonstrando senescência celular, e maior viabilidade celular no grupo tratado com MST-312 por 18 semanas, quando comparado com o grupo controle. Demonstrando que células que expressam telomerase respondem de maneira diferente ao mesmo inibidor. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Normal cells show a limited potential proliferative, presenting a reduced number of cell cycles. For one cell to be able to proliferate indefinitely and it becomes a tumoral cell, it needs to suffer an immortalization process. The telomeres are closely relating to the immortalization cell process, once that to each cell cycle they are facing a shortening which limits the proliferative capacity of them. Additonally, the telomerase enzyme, the protein that plays an importante role in to restore the telomere integrity and is present in about 85% of câncer types, it became a potential therapeutic target. The breast câncer is the second câncer type with the major incidence in the world and the first cause of mortality by tumor among women. Due its epidemiologic importance, in this study were used two cell lineages of breast câncer which express the telomerase enzyme, MCF-7 and MDA-MB-231, which they were submitted to treatments of long and short duration with the telomerase inhibitor MST-312. Both cell lineages utilized in this work showed citotoxicity in the treatments of short duration, with accentuated death cell in response to 5 μM dose of MST-312 in MCF-7 and 10 μM dose in the MDA-MB-231, this effect probably is independent of telomeric shortening. After 18 weeks of treatment using sub-toxic doses of the MST-312 inhibitor, the cell lineages were submitted to citotoxicity essays. The MCF-7 lineage presented a sensibility more elevated during the treatment of long duration showing cell senescence signals more accentuated in the group treated with the inhibitor and with intrinsic karyotypes of telomeric crisis. As results, the cell lineage MDA-MB-231 demonstrated signals of resistence acquisition to drug employed in this work, without signals of cell senescece, and in the citotoxicity essay under 10 μM dose, it was showed a significative cell number of inviable cells in the control group in comparing to the group treated for 18 weeks with MST-312 inhibitor. These results demonstrate that cells which are able to express the telomerase enzyme can respond of different ways to the same inhibitor.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-13T12:59:41Z No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-13T13:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-13T13:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Introdução: Diversos estudos discutem a segurança do uso de nanopartículas já que estas são capazes de promover alterações na expressão gênica, padrão epigenético, homeostase do ferro e estresse oxidativo em ensaios in vitro. Uma gama de estudos aponta diferentes comportamentos celulares em resposta à exposição a nanopartículas, mas ainda não existe um consenso sobre os reais benefícios e riscos que estes nanomateriais podem apresentar em um sistema biológico complexo. Portanto, torna-se necessário estudar estes riscos a fim de contribuir com o desenvolvimento de nanopartículas mais adequadas para aplicações biológicas. Objetivo: Avaliar e caracterizar os possíveis efeitos citotóxicos e epigenéticos em células de carcinoma de glândula submandibular humana (HSG) submetidas a exposição de nanopartículas de maghemita funcionalizadas com cobertura de citrato (NPs). Analisar possíveis alterações na expressão gênica mediante a quantificação do número de transcritos para determinados genes alvo comprometidos com a regulação epigenética e estresse oxidativo. Materiais e métodos: As NPM-citrato foram sintetizadas pelo método de coprecipitação de Fe (II) e Fe (III) e adição direta de ácido cítrico. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados por detecção da lactato desidrogenase (LDH) e ensaio de MTT. A morfologia celular foi analisada por coloração panótica InstaProv em microscópio de luz. A detecção de ferro intracelular foi realizada pelo ensaio do Azul da Prússia. As quantificações de metilação global de DNA e de acetilação das histonas H3 e H4 foram realizados por ensaio colorimétrico. A expressão dos genes FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 foi realizada por qRT-PCR. Para análise da produção de espécies reativas de oxigênio foi utilizado protocolo de H2DCFA. Resultados: As NPM-citrato nas concentrações testadas de 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL não apresentaram efeito citotóxico pela metodologia empregadas. Contudo, foram observadas alterações na morfologia celular, como vacuolização citoplasmática nas células expostas a nanopartículas por 24h e 48h, presença de ferro intracelular mesmo após a retirada do tratamento, intensa produção de espécies reativas de oxigênio dose e tempo dependentes, diminuição no perfil global de metilação de DNA e acetilação das histonas H3 e H4: a acetilação da H3 diminui para 38% e 62% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Para a H4 a hipoacetilação foi mais acentuada, diminuindo de 82% para 4% e 10% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Diferenças entre o acúmulo de transcritos dos genes estudados também foram observadas: transcritos referentes aos genes de COX-2, FERRL, e FERRH encontraram-se aumentados, enquanto que DNMT3a sofreu uma diminuição no número de transcritos. Conclusão: Concluímos que as nanopartículas de maghemita recobertas com citrato são capazes de induzir vacuolização citoplasmática, acúmulo de ROS, diminuição do padrão de metilação global e de acetilação de H3 e H4, alteração do acúmulo dos transcritos COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a e HDAC1 sem comprometer a viabilidade das células HSG. Esse é o primeiro relato sobre os efeitos genéticos e epigenéticos das NPM-citrato sobre células HSG. / Introduction: A plethora of studies debate about the safety of the use of nanoparticles due to their ability to promote alterations in gene expression, epigenetic patterns, iron homeostasis, and oxidative stress in vitro. Several papers report these different cell behaviours to different nanoparticles, but there is still no consensus on the real benefits and risks associated to nanoparticle exposure on a complex biological system. Hence, it is necessary to elucidate these risks in order to contribute with adequate therapy development and biological applications. Objective: To evaluate and distinguish possible cytotoxic and epigenetic effects on human submandibular gland (HSG) cancer cells exposed to maghemite nanoparticles functionalised with citric acid. Methodology: The NPM-citrate were synthesized by coprecipitation of Fe (II) and Fe (III) method and direct addition of citric acid. LDH and MTT were performed in order to evaluate cytotoxicity. Cell morphology was analysed by panoptic staining. Intracellular iron detection was assayed by the Prussian Blue. Methylation of DNA and Histone acetylation quantifications were performed by colorimetric assays. Gene expression of FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 was performed by qRT-PCR. For ROS production assay protocol for H2DCFA was performed. Results: No cytotoxic effects were observed on cells exposed to the tested concentrations of 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL. Although, cell morphology was found altered by both concentrations after 24h and 48h of exposure. Intracellular iron presence was also observed even after cease of exposure as well as intense generation of ROS. Furthermore, global DNA methylation and acetylation of histones H3 and H4 were also found to be altered. Histone 3 acetylation decreased to 38% and 62% after treatments with 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL, respectively. Hipoacetylation for H4 was even more accentuated and decreased from 82% to 4% and 10% after treatments of 0.5 mgFe/mL e 3.0 mgFe/mL, respectively. Differences between the gene transcripts accumulation were also reported: COX-2, FERRL and FERRH were found to be overexpresses, while DNMT3a decreased its transcript accumulation. Conclusion: We conclude that maghemite nanoparticles functionalized with citric acid were able to promote cytoplasmatic vacuolization, ROS generation, decreasing of global methylation pattern and acetylation of H3 and H4 and alteration on transcript accumulation of COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a and HDAC1 without impairment of HSG cells viability. This is the first report on the genetic and epigenetic effects of maghemite nanoparticles functionalized with citric acid on HSG cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-24T13:46:04Z No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLemosChaves.pdf: 1364299 bytes, checksum: efcf646591435abc204b5dcaad6d4495 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-24T14:00:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLemosChaves.pdf: 1364299 bytes, checksum: efcf646591435abc204b5dcaad6d4495 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-24T14:00:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLemosChaves.pdf: 1364299 bytes, checksum: efcf646591435abc204b5dcaad6d4495 (MD5) / O câncer de mama é um dos mais frequente entre as mulheres em todo o mundo. Em busca de drogas mais eficientes para o tratamento de câncer, complexos metálicos estão sendo amplamente estudados. A intercalação destes complexos em bases de DNA pode inibir eventos como transcrição e replicação, causando morte celular. No entanto, a utilização destes compostos é limitada devido à sua toxicidade sistêmica. Nesse contexto, o uso de citrato de ródio [Rh2 (H2cit)4] associado com nanopartículas magnéticas (NPs) pode reduzir a toxicidade sistêmica no tratamento do câncer. Neste estudo, foram comparados os efeitos do citrato de ródio livre [Rh2 (H2cit)4], [Rh2(H2cit)4] carreado por nanopartículas (NPs) [Magh-Rh2(H2cit)4] e NPs de maguemita funcionalizadas com ácido-cítrico (Magh-cit) em células MCF-7 de câncer de mama e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A). Foram também realizados estudos para verificar a indução de apoptose por esses fármacos, em células MCF-7. As concentrações estudadas de citrato de ródio livre foram menos citotóxicas do que as outras formulações do fármaco avaliadas em ambas as linhagens celular. Além disso, os resultados obtidos por citometria de fluxo, mostraram aumento estatisticamente significativo de fragmentação de DNA em 36 horas de tratamento com Magh-Rh2(H2cit)4 NPs (300 µM) e com a mesma concentração de ferro de Magh-cit NPs. Os mesmos tratamentos analisados por imagens confocais mostraram a fragmentação nuclear, em células MCF-7 depois de (48 horas). Após 24 horas, os tratamentos induziram translocação de citocromo C das mitocôndrias. Após pelo menos 12 horas de tratamento com as nanopartículas, foi possível identificar caspases efetoras ativas. Portanto, foi demonstrado que o citrato de ródio associado com nanopartículas de maguemita e nanopartículas de maghemita ligada ao citrato induziram citotoxicidade em células tumorais e podem representar uma alternativa para o tratamento do câncer de mama. Também foi demonstrado que as nanopartículas podem induzir, em células MCF-7, alterações celulares características de morte celular por apoptose, mesmo na ausência de caspases 3. ______________________________________________________________________________ SUMMARY / Breast cancer is a of the most frequent cancer among women worldwide. In search of more efficient drugs against cancer, metal complexes are being widely studied. The intercalation of these compounds in DNA bases impairs transcription and replication events causing cell death. Nevertheless, the use of these compounds is limited because of their systemic toxicity. In this regard, the use of dirhodium citrate [Rh2(H2cit)4] associated with magnetic nanoparticles (NPs), should work reducing systemic toxicity in cancer treatment. In this study, we compared the effects of Rh2(H2cit)4, Rh2(H2cit)4-loaded maghemite NPs [Magh-Rh2(H2cit)4] and citrate-loaded maghemite NPs (Magh-cit) on MCF-7 breast cancer cells and MCF-10A non-tumor and nontumorigenic epithelial breast cells. Events of apoptosis stimulated by nanoparticles were also checked. The concentrations rhodium citrate was less cytotoxic than other forms of drugs evaluated. Moreover, the results obtained by flow cytometry showed statistically significant increase in DNA fragmentation 36 hours of treatment with Magh-Rh2(H2cit)4 NPs (300 µM) and with the same iron concentration of Magh-cit NPs. The same treatments analyzed by confocal images showed nuclear fragmentation in MCF-7 cells after (48 hours). Treatment with 300 µM rhodium citrate Magh-Rh2(H2cit)4 NPs and Magh-cit NPs after 24 hours, caused release of cytochrome c from mitochondria, indicading alteration of mitochondrial membrane permeability. After at least 12 hours of treatment with nanoparticles, it was possible to identify active effector caspases. We showed that dirhodium citrate associated with maghemite nanoparticles and citrate-loaded maghemite NPs induced cytotoxicity in tumor cells and should represent a great alternative for breast cancer treatment. It has been shown that nanoparticles can induce changes that characterize apoptotic cell death in MCF-7 cells, even in the absence of caspase 3.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-09-17T15:48:44Z No. of bitstreams: 1 2013_NathaliaMoraesVasconcelos.pdf: 2898585 bytes, checksum: 64ad702001f98b5d13e5eafab2c73121 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-09-23T13:05:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_NathaliaMoraesVasconcelos.pdf: 2898585 bytes, checksum: 64ad702001f98b5d13e5eafab2c73121 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-23T13:05:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_NathaliaMoraesVasconcelos.pdf: 2898585 bytes, checksum: 64ad702001f98b5d13e5eafab2c73121 (MD5) / O câncer de mama é o tipo de câncer mais prevalente entre as mulheres em todo o mundo e o responsável pelo maior índice de morte feminina por câncer. Em modelos experimentais, a inflamação crônica foi descrita como indutora, porém alguns dados não são reproduzidos na clínica. Os inflamassomas, complexos multiprotéicos de sinalização intracelular atuantes na imunidade inata e adaptativa, vem sendo associados a funções celulares contrastantes dependendo do tipo de célula cancerígena analisada, o que também é verdade para os receptores do tipo Toll. Porém, a relação do inflamassoma NLRP3 e o câncer de mama é pouco conhecida. Considerando ainda a presença dos receptores NLRs e TLRs nas células não hematopoiéticas e, logo, a possibilidade de modulação do microambiente inflamatório pela própria célula tumoral, propôs-se analisar a presença e função do receptor NLRP3 e seu inflamassoma em células tumorais da mama in vitro. Foi observado que os componentes NLRP3 e ASC estão presentes em MCF7, porém há baixa expressão de ASC em MDA-MB-231. Ainda, houve ativação de caspase-1, indicando ativação do complexo, e diminuição das quantidades de proteínas NLRP3 e ASC na presença de Nigericina. A utilização de LPS e Nigericina induziu elevada morte celular em ambas as linhagens, com características como fragmentação nuclear, rompimento da membrana plasmática e PARP1 não clivado, eventos típicos da piroptose, a morte celular induzida pela ativação dos inflamassomas. Apenas a MDA-MB-231 secretou TNFα após as estimulações, e nenhuma das células secretou IL1β e IL6. Além disso, a utilização dos estímulos alterou os padrões de ciclo celular e diminuiu a taxa de proliferação em ambas as linhagens, mas não alterou o fenótipo CD24/CD44 de forma geral. O uso de sobrenadantes de monócitos estimulados para o inflamassoma NLRP3 na cultura das células de câncer de mama demonstrou efeitos fenotípicos semelhantes ao uso dos agonistas, indicando um direcionamento tumoricida dos monócitos ativados, atuando por meio de seus fatores secretados. Estes resultados sugerem que o inflamassoma NLRP3 não só está presente em células tumorais da mama, mas que sua ativação possui um efeito tumoricida, quando ocorre na própria célula tumoral ou por fatores secretados de monócitos. Essa via pode representar um novo aspecto de modulação, o qual pode ser explorado para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de mama. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Breast cancer is the most prevalent type of cancer among women worldwide and the one responsible for their major cause of cancer death. In experimental models for this cancer, chronic inflammation is particularly described as an inducer; however there is some inconsistency in the clinic. The inflammasomes, intracellular multiprotein signaling complexes related to adaptative and innate immunity, are associated with contrasting roles regarding cancer immunity, depending on the cancer analyzed, which is also true for Toll-like Receptors. However, the relationship between the NLRP3 inflammasome and breast cancer is not completely understood. Considering the non-hematopoietic presence of TLRs and NLRs and, therefore, the possible generation of an inflammatory microenvironment by the tumor cells itself, we proposed to study the presence and function of the NLRP3 receptor and its inflammasome in breast tumor cells in vitro. We observed that the components NRLP3 and ASC are present in MCF7 cell line, but ASC is in low amounts in MDA-MB-231. Our data suggest caspase-1 activation, indicating activation of the complex, and diminished protein amounts of NLRP3 and ASC in the presence of Nigericin. When we used LPS and Nigericin, there was cell death induction in both cell lines, with nuclear fragmentation, plasma membrane rupture and non-cleaved PARP1, typical features of pyroptosis, the inflammasome mediated cell death. Only the MDA-MB-231 cell line secreted TNFα after stimulation, and neither of cells secreted IL1β nor IL6. Also, in the presence of the stimulus, there was alteration in the cell cycle pattern and decrease in the proliferation index of both cell lines, but not in the phenotype CD24/CD44 globally. The use of supernatants from NLRP3 stimulated monocytes in the culture of breast cancer cells induced similar phenotypic events to the presence of the agonists, which indicate an antitumoral activity of the activated monocytes, functioning through its secreted factors. Ours results suggest that the NLRP3 inflammasome is not only present in breast cancer cells, but its activation has a tumoricidal effect when occurring in the cancer cell or through secreted factors from monocytes. This pathway may represent a new modulation aspect, which may be further studied for the development of therapies against breast cancer.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”. El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal; 2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal. Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1. La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1 total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD- 1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation. An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1 phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark. Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1 and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally, assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2 expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability, respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt

Orientador: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Valéria Valente / Banca: Fernando Rogerio Pavan / Banca: Fábio Vieira dos Santos / Banca: Raquel Alves dos Santos / Resumo: Os extratos metanólicos dos capítulos de quatro espécies, pertencentes à família Eriocaulaceae, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) e S. suberosus (Ss), suas substâncias isoladas, 1 (luteolina), 2 (1,5,7-trihidroxi-3,6-dimetoxixantona), 3 (1,3,6,8-tetrahidroxi-2,5-dimetoxixantona), 4 (1,3,6,8-tetrahidroxi-5-metoxixantona), 5 (7-metoxiluteolina-8-c--glicopiranosídeo), 6 (7-metoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 7 (7,3'-dimetoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 8 (6-hidroxiluteolina) e a mistura M (A-1,3,6-trihidroxi-2-metoxixantona e B-1,3,6-triidroxi-2,5-dimetoxixantona) foram avaliados quanto ao seu potencial em causar mutações e também de prevenir o acontecimento dessas, através do teste de Ames e verificou-se que todos os extratos e suas substâncias isoladas não foram considerados mutagênicos sob as condições testadas, e que os mesmos apresentaram um efeito antimutagênico de forte a moderado contra a aflatoxina B1 (AFB1), o benzo[a]pireno (BaP), o 4-nitro-o-fenilenodiamino (NPD), a mitomicina C (MMC) e a azida sódica (AS); quanto ao potencial em causar danos no DNA e de prevenir e/ou reparar os danos causados por agentes genotóxicos por meio do ensaio Cometa, que identificou os extratos Sd, Sn e Ss e as flavonas 1 e 5 como causadores de dano significativo no DNA das células HepG2, após 4 horas de tratamento, dano esse que foi reparado pelas células, visto que nenhum efeito genotóxico foi observado após 24 horas. E ainda Sm, Sn e Ss e todas as isoladas, exceto 8, foram capazes de inibir os danos causados pelo agente genotóxico MMS no DNA; quanto ao seu potencial citotóxico frente às células cancerosas HepG2 e MCF-7/BUS, que identificou que todos os extratos, exceto Sm, e todas as substâncias isoladas foram capazes de induzir morte das células HepG2 significativamente, com a maioria das amostras alcançando... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The methanol extracts of capitula of four species belonging to the Eriocaulaceae family, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) and S. suberosus (Ss), its isolated compounds 1 (luteolin), 2 (1,5,7-trihydroxy-3,6-dimethoxyxanthone), 3 (1,3,6,8-tetrahydroxy-2,5-dimethoxyxanthone), 4 (1,3,6,8-tetrahydroxy-5-methoxyxanthone), 5 (7-methoxyluteolin-8-C--glucopyranoside), 6 (7-methoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 7 (7,3'-dimethoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 8 (6-hydroxyluteolin) and the mixture M (A-1,3,6-trihydroxy-2-methoxyxanthone and B-1,3,6-trihydroxy-2,5-dimethoxyxanthone) were evaluated for their potential to cause mutations and also to prevent the occurrence of them, using the Ames test, and it was found that all extracts and their isolated compounds were not considered mutagenic under the test conditions, and they also showed a strong to moderate antimutagenic effect against aflatoxin B1 (AFB1), benzo[a]pyrene (BaP), 4-nitro-o-phenilenodiamine (NPD), mitomycin C (MMC) and sodium azide (SA). They were also evaluated for the potential to cause DNA damage and to prevent and/or repair the damage caused by genotoxic agents, using the Comet assay, which identified the extracts Sd, Sn, Ss and the flavones 1 and 5 as causing significant DNA damage, after 4 hours of treatment. Such damage has been repaired by the cells, since no genotoxic effect was observed after 24 hours. Also Sm, Sn, Ss and all isolated compounds, except 8, were able to inhibit the damage caused by the genotoxic agent MMS. They were evaluated for their potential to cause cancer cells (HepG2 and MCF-7/BUS) death, and we found that all extracts, except Sm, and all the compounds were able to induce significant death of HepG2 cells, with most of the samples reaching 50% cell death. In MCF-7/BUS cells, after 24 hours of treatment, values were lower than 50% cell death... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-05Bitstream added on 2014-06-13T21:05:18Z : No. of bitstreams: 1 oliveirahohne_ap_dr_arafcf_parcial.pdf: 220644 bytes, checksum: 2e767ea9b730b3087de494d3f280ba59 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-11-14T12:17:03Z: oliveirahohne_ap_dr_arafcf_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-11-14T12:17:47Z : No. of bitstreams: 1 000726257.pdf: 1971793 bytes, checksum: 77104b5e69557d84254b8db4f8e6372a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os extratos metanólicos dos capítulos de quatro espécies, pertencentes à família Eriocaulaceae, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) e S. suberosus (Ss), suas substâncias isoladas, 1 (luteolina), 2 (1,5,7-trihidroxi-3,6-dimetoxixantona), 3 (1,3,6,8-tetrahidroxi-2,5-dimetoxixantona), 4 (1,3,6,8-tetrahidroxi-5-metoxixantona), 5 (7-metoxiluteolina-8-c--glicopiranosídeo), 6 (7-metoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 7 (7,3’-dimetoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 8 (6-hidroxiluteolina) e a mistura M (A-1,3,6-trihidroxi-2-metoxixantona e B-1,3,6-triidroxi-2,5-dimetoxixantona) foram avaliados quanto ao seu potencial em causar mutações e também de prevenir o acontecimento dessas, através do teste de Ames e verificou-se que todos os extratos e suas substâncias isoladas não foram considerados mutagênicos sob as condições testadas, e que os mesmos apresentaram um efeito antimutagênico de forte a moderado contra a aflatoxina B1 (AFB1), o benzo[a]pireno (BaP), o 4-nitro-o-fenilenodiamino (NPD), a mitomicina C (MMC) e a azida sódica (AS); quanto ao potencial em causar danos no DNA e de prevenir e/ou reparar os danos causados por agentes genotóxicos por meio do ensaio Cometa, que identificou os extratos Sd, Sn e Ss e as flavonas 1 e 5 como causadores de dano significativo no DNA das células HepG2, após 4 horas de tratamento, dano esse que foi reparado pelas células, visto que nenhum efeito genotóxico foi observado após 24 horas. E ainda Sm, Sn e Ss e todas as isoladas, exceto 8, foram capazes de inibir os danos causados pelo agente genotóxico MMS no DNA; quanto ao seu potencial citotóxico frente às células cancerosas HepG2 e MCF-7/BUS, que identificou que todos os extratos, exceto Sm, e todas as substâncias isoladas foram capazes de induzir morte das células HepG2 significativamente, com a maioria das amostras alcançando... / The methanol extracts of capitula of four species belonging to the Eriocaulaceae family, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) and S. suberosus (Ss), its isolated compounds 1 (luteolin), 2 (1,5,7-trihydroxy-3,6-dimethoxyxanthone), 3 (1,3,6,8-tetrahydroxy-2,5-dimethoxyxanthone), 4 (1,3,6,8-tetrahydroxy-5-methoxyxanthone), 5 (7-methoxyluteolin-8-C--glucopyranoside), 6 (7-methoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 7 (7,3'-dimethoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 8 (6-hydroxyluteolin) and the mixture M (A-1,3,6-trihydroxy-2-methoxyxanthone and B-1,3,6-trihydroxy-2,5-dimethoxyxanthone) were evaluated for their potential to cause mutations and also to prevent the occurrence of them, using the Ames test, and it was found that all extracts and their isolated compounds were not considered mutagenic under the test conditions, and they also showed a strong to moderate antimutagenic effect against aflatoxin B1 (AFB1), benzo[a]pyrene (BaP), 4-nitro-o-phenilenodiamine (NPD), mitomycin C (MMC) and sodium azide (SA). They were also evaluated for the potential to cause DNA damage and to prevent and/or repair the damage caused by genotoxic agents, using the Comet assay, which identified the extracts Sd, Sn, Ss and the flavones 1 and 5 as causing significant DNA damage, after 4 hours of treatment. Such damage has been repaired by the cells, since no genotoxic effect was observed after 24 hours. Also Sm, Sn, Ss and all isolated compounds, except 8, were able to inhibit the damage caused by the genotoxic agent MMS. They were evaluated for their potential to cause cancer cells (HepG2 and MCF-7/BUS) death, and we found that all extracts, except Sm, and all the compounds were able to induce significant death of HepG2 cells, with most of the samples reaching 50% cell death. In MCF-7/BUS cells, after 24 hours of treatment, values were lower than 50% cell death... (Complete abstract click electronic access below)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-27T16:14:54Z No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-31T19:05:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T19:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 / Exossomos e microvesículas fazem parte das vesículas extracelulares. Estas são produzidas e liberadas por uma variedade de tipos celulares, inclusive em sobrenadante do meio celular, e estão presentes em diferentes fluidos biológicos. Elas podem carregar mRNA e miRNA, dentre outras moléculas. No câncer, os miRNA associados às vesículas extracelulares estão relacionados com a comunicação entre as células tumorais e o microambiente tumoral. Este estudo avaliou a presença das proteínas relacionadas com a maquinaria de processamento de miRNA, nas vesículas extracelulares secretadas pelas linhagens celulares MDA-MB231 (câncer de mama humano) e fibroblasto humano no tempo de crescimento celular de 72 horas. Para purificar estas partículas foi utilizado o método de centrifugação diferencial e ultracentrifugação. Após isto, caracterizou-se as vesículas pelo seu tamanho e distribuição de partículas utilizando a resistência de pulso, pelo sistema qNANO. Para a detecção de proteínas, a técnica de western blot foi realizada a fim de se identificar a presença das proteínas de interesse. Como resultado, as vesículas extracelulares provenientes dos sobrenadantes das linhagens celulares foram purificadas e caracterizadas pelo seu tamanho adequadamente. Observou-se também que a quantidade de partículas de vesículas extracelulares da linhagem tumoral obtida pelo sistema qNANO, foi superior quando comparada à amostra não-tumoral. Os resultados da detecção de proteínas por western blot demonstram que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2 estão presentes na amostra proveniente da linhagem tumoral MDA-MB231. Confirmou-se a presença de proteínas TSG101, Alix, CD63 - marcadoras moleculares de vesículas extracelulares. Confirmou-se também ausência nas amostras, da proteína Calnexina, a qual é controle negativo e é indicativo de contaminação nas vesículas extracelulares. Por fim, foram identificadas em ambas as amostras as proteínas ApoA-IV, AQP2 e IL-6, as quais estão associadas ao microambiente tumoral na sinalização do miRNA. Conclui-se que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2, pertencentes a maquinaria de processamento de miRNA, bem como proteínas ainda não discutidas pela literatura em vesículas extracelulares na linhagem tumoral estudada, estão presentes no sobrenadante da linhagem tumoral MDA-MB231, sugerindo um papel para essas moléculas na biologia tumoral. / Exossomes and microvesicles are part of the extracellular vesicles. There are produced and released by a variety of cell types, including cell media supernatant, and be present in different biological fluids. They can carry mRNA and miRNA, among other molecules. In cancer, miRNAs associated with extracellular vesicles are related to the communication between tumor cells and the tumor microenvironment. This study evaluated the presence of proteins related to the miRNA processing machinery in the extracellular vesicles secreted by cell lines MDA-MB231 (human breast cancer) and human fibroblast at cell growth time of 72 hours. Purification of the culture medium supernatant was carried out by the differential ultracentrifugation method. After this, the vesicles were characterized by their size and particle distribution using the pulse resistance by qNANO system. For the detection of proteins, the western blot technique was performed to identify the presence of the proteins of interest. As a result, extracellular vesicles from cell line supernatants were purified and characterized by their size appropriately. It was also observed that the number of extracellular vesicles particles of the tumor lineage obtained by qNANO system was superior when compared to the nontumor sample. The results of western blot detection of proteins demonstrate that Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins, related to miRNA processing machinery, are present in the sample from the MDA-MB231 tumor line. We confirmed the presence of TSG101, Alix, CD9 – which are extracellular vesicle molecular marker proteins. Also, we confirmed in both samples the absence of Calnexin, which is a negative control, it is indicative of contamination in the extracellular vesicles. Lastly, we identified in both samples ApoAIV, AQP2 and IL-6 proteins which are associated with tumor microenvironment in miRNA signaling. In conclusion, Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins belonging to miRNA processing machinery, as well as proteins not yet discussed in the literature in extracellular vesicles from tumor cell, were present in the supernatant of the MDAMB231 tumor cell, suggesting a role for these molecules in tumor biology.