Orientador: Paula Rahal / Banca: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Wilson Araújo da Silva Júnior / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Sônia Maria Oliani / Resumo: GPC3 (Glipican-3) é membro de uma família de proteoglicano de heparina sulfatada (HSPG). O GPC3 pode atuar controlando a migração celular, regulação negativa do crescimento celular e indução de apoptose. Esse gene é relatado por estar hipoexpresso em vários tipos de cânceres, o que pode resultar no crescimento celular descontrolado e contribuir para o fenótipo maligno de alguns tumores. O objetivo desse estudo foi analisar o mecanismo de ação do gene GPC3 em carcinoma renal de células claras (CCRCC). Primeiramente, foi construído o vetor de expressão e transfectado nas linhagens celulares de carcinoma renal ACHN e 786-O. A expressão de GPC3 foi analisada usando qRT-PCR e imunohistoquímica. A proliferação celular foi avaliada usando o MTT e o ensaio de formação de colônia. Análises de apoptose e ciclo celular foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado que o gene GPC3 estava com baixa expressão em amostras de carcinoma renal de células claras e nas linhagens celulares quando comparado com amostras renais normais. Foi observado que a expressão de RNAm e os níveis de proteína GPC3 aumentaram após a transfecção com o vetor de expressão contendo a ORF de GPC3 nas linhagens celulares. A taxa de proliferação celular diminuiu nas células superexpressando GPC3 em ambas as linhagens, ACHN e 786-O (p<0,01). A apoptose não foi observada nas linhagens celulares de carcinoma renal superexpressando GPC3 (p > 0,05); entretanto, ocorreu um aumento na população de células na fase G1 do ciclo celular (p< 0,05). Esses resultados sugerem que o gene GPC3 reduz a taxa de proliferação celular por meio da parada do ciclo celular na fase G1 em carcinoma renal / Abstract: Background: GPC3 (Glypican 3) is a member of the family of glypican heparan sulfate proteoglycans (HSPG). The GPC3 gene may play a role in controlling cell migration, negative regulation of cell growth and induction of apoptosis. This gene is reported to be downregulated in several cancers, which can result in uncontrolled cell growth and which can also contribute to the malignant phenotype of some tumors. The purpose of this study was to analyze the mechanism of action of the GPC3 gene in clear cell renal cell carcinoma (CCRCC). Methods: First, we constructed the expression vector and transfected renal carcinoma cell lines. GPC3 expression was analyzed using qRT-PCR and immunohistochemistry. We evaluated cell proliferation using MTT and colony formation assays. Apoptosis and cell cycle analyses were evaluated using flow cytometry. Results: We observed that the GPC3 gene was downexpressed in the clear cell renal cell carcinoma samples and in cell lines, which were both compared to normal renal samples. We observed that GPC3 mRNA expression and protein levels increased after the transfection into ACHN and 786-O cell lines. We found that the cell proliferation rate decreased in cells overexpressing GPC3 in both cell lines, ACHN and 786-O (p < 0.01). Also, apoptosis in the renal cell carcinoma cell line was not observed in cells overexpressing GPC3 (p > 0.05), but there was an increase in the cell population during the G1 phase in the cell cycle (p< 0.05). Conclusion: We suggest that the GPC3 gene reduced the cell proliferation rate through cell cycle arrest during the G1 phase in renal cell carcinoma / Doutor

O balanço do fluoreto (F) dentro do corpo é modulado por sua ingestão, absorção e remoção, e os rins, responsáveis pela sua excreção do organismo, são particularmente vulneráveis à toxicidade do F. Os efeitos nefrotóxicos do F envolvem mudanças estruturais marcantes nos rins, além disso, estudos proteomicos têm mostrado grandes alterações no perfil de proteínas envolvidas em pontos chave na transdução de sinal. Estes efeitos podem influenciar negativamente no transporte iônico nos rins. A vista deste fato, o transporte iônico no canal de sódio epitelial (ENaC) é limitante para a taxa de reabsorção de sódio nos rins, sendo essencial para a manutenção do equilíbrio eletrolítico e homeostase do corpo. Assim, este trabalho objetivou investigar os efeitos do F, utilizando concentrações semelhantes às que podem ser encontradas no néfron durante a fluorose dentária, na viabilidade celular e expressão de transportadores de membrana (ENaC) em linhagem celular renal M-1. Para os ensaios de viabilidade das células da linhagem M-1 foi empregado os testes colorimétricos Cristal Violeta e MTT, utilizando as concentrações de tratamento com fluoreto de sódio (NaF) a 10, 40, 100, 200 e 400 M, durante períodos experimentais de 24, 48, 72 e 96 h. As mesmas concentrações e os mesmos tempos foram utilizados no tratamento com cloreto de sódio (NaCl), utilizado como controle na possível interferência de Na+ na modulação das células. Para a investigação da influência do F: 1) nos canais ENaC foi utilizada a técnica de imunofluorescência e 2) para a análise de expressão gênica das subunidades que formam o ENaC, foi utilizada a técnica RT-PCR. Em nossos resultados pudemos observar que as maiores concentrações tanto de NaF quanto de NaCl provocaram a diminuição da viabilidade celular para ambos os ensaios de viabilidade, no entanto, foi possível observar algumas diferenças na resposta do tratamento com NaF em comparação com NaCl, por meio do ensaio Cristal Violeta. Não foi observado diferenças nas imagens de imunofluorescêcia, mas outros aspectos morfológicos foram vistos nessas imagens, como o aparecimento de domes celular, sugerindo que até mesmo a maior concentração de F não foi capaz de inibir a proliferação celular. Nosso resultado mais significativo foi em relação à expressão das subunidades dos canais de ENaC, onde a concentração de 400 M foi capaz de diminuir bruscamente a expressão das três subunidades do ENaC, enquanto as concentrações de 100 e 200 M mostraram apresentar expressão igual e em alguns casos até maior que o grupo controle. Pudemos concluir que doses de F na ordem de micromolares podem modular a expressão das subunidades formadoras do ENaC, positivamente quando em baixas concentrações e negativamente quando em concentrações elevadas. / The balance of fluoride (F) within the body is modulated by its ingestion, absorption and removal, and the kidneys, responsible for their excretion of the organism, are particularly vulnerable to the toxicity of F. The nephrotoxic effects of F involve marked structural changes in the kidneys , in addition, proteomic studies have shown large changes in the profile of proteins involved in key points in signal transduction. These effects may negatively influence ion transport in the kidneys. In view of this fact, the ionic transport in the epithelial sodium channel (ENaC) is limiting to the rate of sodium reabsorption in the kidneys, being essential for the maintenance of the electrolyte balance and homeostasis of the body. Thus, the objective of this work was to investigate the effects of F, using concentrations similar to those found in the nephron during dental fluorosis, cell viability and expression of membrane transporters (ENaC) in renal cell line M-1. For the M-1 cell line viability assays, the Crystal Violet and MTT colorimetric assays were used, using the 10, 40, 100, 200 and 400 M sodium fluoride (NaF) treatment concentrations during experimental periods of 24, 48, 72 and 96 h. The same concentrations and the same times were used in the treatment with sodium chloride (NaCl), used as control in the possible interference of Na + in the modulation of the cells. For the investigation of the influence of F: 1) in the ENaC channels, the immunofluorescence technique was used and 2) for the analysis of gene expression of the subunits that form the ENaC, the RT-PCR technique was used. In our results it was observed that the higher concentrations of NaF and NaCl caused a decrease in cell viability for both viability assays, however, it was possible to observe some differences in NaF treatment response in comparison to NaCl, through test Crystal Violet. No differences were observed in immunofluorescence images, but other morphological aspects were seen in these images, such as the appearance of cellular \"domes\", suggesting that even the highest F concentration was not able to inhibit cell proliferation. Our most significant result was the expression of the subunits of the ENaC channels, where the concentration of 400 M was able to decrease expression of the three subunits of the ENaC, whereas the concentrations of 100 and 200 M showed equal expression and in some cases even higher than the control group. We can conclude that doses in the order of micromolar the F can modulate the expression of the ENaC forming subunits, positively when in low concentrations and negatively when in high concentrations.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:22Z : No. of bitstreams: 1 000846657_20170814.pdf: 327624 bytes, checksum: 7ef206fbad82624c5b13293820611818 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-18T12:37:00Z: 000846657_20170814.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-18T12:37:50Z : No. of bitstreams: 1 000846657.pdf: 655179 bytes, checksum: a3015379981e83babb9b5ebdeb18615d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / GPC3 (Glipican-3) é membro de uma família de proteoglicano de heparina sulfatada (HSPG). O GPC3 pode atuar controlando a migração celular, regulação negativa do crescimento celular e indução de apoptose. Esse gene é relatado por estar hipoexpresso em vários tipos de cânceres, o que pode resultar no crescimento celular descontrolado e contribuir para o fenótipo maligno de alguns tumores. O objetivo desse estudo foi analisar o mecanismo de ação do gene GPC3 em carcinoma renal de células claras (CCRCC). Primeiramente, foi construído o vetor de expressão e transfectado nas linhagens celulares de carcinoma renal ACHN e 786-O. A expressão de GPC3 foi analisada usando qRT-PCR e imunohistoquímica. A proliferação celular foi avaliada usando o MTT e o ensaio de formação de colônia. Análises de apoptose e ciclo celular foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado que o gene GPC3 estava com baixa expressão em amostras de carcinoma renal de células claras e nas linhagens celulares quando comparado com amostras renais normais. Foi observado que a expressão de RNAm e os níveis de proteína GPC3 aumentaram após a transfecção com o vetor de expressão contendo a ORF de GPC3 nas linhagens celulares. A taxa de proliferação celular diminuiu nas células superexpressando GPC3 em ambas as linhagens, ACHN e 786-O (p<0,01). A apoptose não foi observada nas linhagens celulares de carcinoma renal superexpressando GPC3 (p > 0,05); entretanto, ocorreu um aumento na população de células na fase G1 do ciclo celular (p< 0,05). Esses resultados sugerem que o gene GPC3 reduz a taxa de proliferação celular por meio da parada do ciclo celular na fase G1 em carcinoma renal / Background: GPC3 (Glypican 3) is a member of the family of glypican heparan sulfate proteoglycans (HSPG). The GPC3 gene may play a role in controlling cell migration, negative regulation of cell growth and induction of apoptosis. This gene is reported to be downregulated in several cancers, which can result in uncontrolled cell growth and which can also contribute to the malignant phenotype of some tumors. The purpose of this study was to analyze the mechanism of action of the GPC3 gene in clear cell renal cell carcinoma (CCRCC). Methods: First, we constructed the expression vector and transfected renal carcinoma cell lines. GPC3 expression was analyzed using qRT-PCR and immunohistochemistry. We evaluated cell proliferation using MTT and colony formation assays. Apoptosis and cell cycle analyses were evaluated using flow cytometry. Results: We observed that the GPC3 gene was downexpressed in the clear cell renal cell carcinoma samples and in cell lines, which were both compared to normal renal samples. We observed that GPC3 mRNA expression and protein levels increased after the transfection into ACHN and 786-O cell lines. We found that the cell proliferation rate decreased in cells overexpressing GPC3 in both cell lines, ACHN and 786-O (p < 0.01). Also, apoptosis in the renal cell carcinoma cell line was not observed in cells overexpressing GPC3 (p > 0.05), but there was an increase in the cell population during the G1 phase in the cell cycle (p< 0.05). Conclusion: We suggest that the GPC3 gene reduced the cell proliferation rate through cell cycle arrest during the G1 phase in renal cell carcinoma

Made available in DSpace on 2015-06-16T02:06:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000470446-Texto+Completo-0.pdf: 5542034 bytes, checksum: cb2fd7a5960d4cf7f92d7bee885029f6 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introduction: New drugs have been developed to treat renal cell carcinoma apparently improving overall survival. Methods: This is an observational study in a retrospective cohort. Five hundred nine patients with renal cell carcinoma treated between 2002 and 2012 in Southern Brazil were divided in two groups: patients receiving public health system care and participants in clinical research protocols. Data collected from medical records were: socio-demographic and clinical characteristics, type of surgery and pathological information. Statistical analysis was performed using Chi-square, Fisher exact, Student's t tests; the survival curve was according to Kaplan-Meier method and Cox regression. Significance was considered at p<0. 05.Results: Patients were male (68. 6%), Caucasian (94. 9%), and had no family history of cancer (91. 6%). Most cases were submitted to nephrectomy and the most frequent histological type was clear cell carcinoma (90. 7%). Global median survival for all patients was 50. 2 (45. 0-54. 7) months. Global survival was different between patients enrolled in clinical trials [142. 1 months (95% CI: 94. 1- 152. 6)] and those treated in the public health system [44. 9 months (95% CI: 39. 5 - 49. 1)] (p<0. 001). The unadjusted hazard ratio was 0. 24 (0. 15-0. 37). After adjustment for gender, age, smoking at the time of diagnosis, body mass index, skin color, patient origin, ECOG score, histology and clinical stage, hazard ratio was 0. 26 (0. 13-0. 55) (p<0. 001).Conclusion: Renal cell carcinoma patients treated in clinical research protocols have longer survival when compared to patients managed within the public health care system in Brazil. This finding strongly suggests that, in this setting, participation in clinical research protocols should be encouraged. / Introdução: Novas drogas têm sido desenvolvidas para o tratamento de carcinoma de células renais, melhorando, aparentemente, a sobrevivência global.Métodos: Este é um estudo observacional em uma coorte retrospectiva. Quinhentos e nove pacientes com carcinoma de células renais, tratados entre 2002 e 2012 num hospital Universitário do sul do Brasil, foram divididos em dois grupos: aqueles que foram tratados pelo sistema de saúde pública e os participantes em protocolos de pesquisa clínica. Os dados coletados a partir dos prontuários foram: características sócio-demográficas e clínicas, tipo de cirurgia e informações patológicas. A análise estatística foi realizada por meio dos testes Qui-quadrado, exato de Fisher, t de Student; a curva de sobrevivência foi realizada de acordo com o método de Kaplan-Meier e regressão de Cox. A significância foi considerada quando p <0,05.Resultados: A maioria dos pacientes era do sexo masculino (68,6%), Caucasianos (94,9%), e não tinham histórico familiar de câncer (91,6%). A maioria dos casos foi submetida à nefrectomia e o tipo histológico mais freqüente foi o carcinoma de células claras (90,7%). A sobrevida global mediana para todos os pacientes foi de 50,2 (45,0-54,7) meses. A sobrevida global foi diferente entre os pacientes incluídos em ensaios clínicos [142,1 meses (IC 95%: 94. 1- 152,6)] e aqueles tratados no sistema público de saúde [44,9 meses (IC 95%: 39,5-49,1)] (p <0,001). A taxa de risco não ajustada foi de 0,24 (0,15-0,37); após o ajuste para idade, sexo, tabagismo no momento do diagnóstico, índice de massa corporal, cor da pele, origem do paciente, pontuação ECOG, histologia e estadiamento clínico, a taxa de risco foi de 0,26 (0,13-0,55) (p <0,001).Conclusão: Pacientes com carcinoma de células renais tratados em protocolos de pesquisa clínica têm maior sobrevida quando comparados aos pacientes tratados no âmbito do sistema público de saúde no Brasil. Esse achado sugere fortemente que, neste cenário, a participação em protocolos de pesquisa clínica deve ser incentivada.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Marilia de Freitas Calmon Saiki / Banca: Wilson Araújo da Silva Junior / Banca: Patricia Simone Leite Vilamaior / Banca: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni / Resumo: O carcinoma renal de células claras (ccRCC) é o mais comum dos subtipos histológicos de carcinoma renal. Este carcinoma é histologicamente caracterizado pela presença de células com citoplasma claro e abundante. O processo inicial de metástase pode ser atribuída à transição epitélio mesênquima (EMT). Neste estudo, buscou-se identificar genes diferencialmente expressos em ccRCC, construindo assim um perfil molecular para este tumor. Nós selecionamos genes descritos na literatura que apresentam relação com EMT, diferenciação e proliferação celular. Analisou-se por PCR quantitativo e imuno-histoquímica a expressão dos genes e suas proteínas, respectivamente, e os possíveis mecanismos epigenético que regulam a sua expressão em amostras de ccRCC e linhagem celular. Os genes OCLN e GAS1 foram encontrados com baixa expressão em ccRCC, e nós sugerimos que o miR-122 e miR- 34a podem regular sua expressão, respectivamente, neste tipo de câncer. Além disso, mostramos, por qPCR e imuno-histoquímica, a alta expressão de SLC2A1 foi significantemente alta em ccRCC. O conjunto de genes identificados neste estudo possibilita a compreensão das bases moleculares e de desenvolvimento do ccRCC / Abstract: Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common histological subtype of kidney cancer. This carcinoma is histologically characterized by the presence of clear and abundant cytoplasm. The initial process of ccRCC metastatic tumor formation can be attributed to epithelial- mesenchymal transition (EMT). In this study, we sought to identify genes differentially expressed in ccRCC and build a molecular profile of this cancer. We selected genes described in the literature to be related to EMT, cellular differentiation and proliferation. We analyzed the gene and protein expression by quantitative PCR and immunohistochemistry, respectively, and examined possible epigenetic mechanisms that regulate their expression in ccRCC samples and cell lines. OCLN and GAS1 genes were under-expressed in ccRCC, and we report that miR-122 and miR- 34a, respectively, may regulate their expression in this cancer. Furthermore, we showed by quantitative PCR (qPCR) and immunohistochemistry that SLC2A1 was significantly over-expressed in ccRCC. The set of genes identified in this study furthers our understanding of the molecular basis and development of ccRCC / Doutor

O balanço do fluoreto (F) dentro do corpo é modulado por sua ingestão, absorção e remoção, e os rins, responsáveis pela sua excreção do organismo, são particularmente vulneráveis à toxicidade do F. Os efeitos nefrotóxicos do F envolvem mudanças estruturais marcantes nos rins, além disso, estudos proteomicos têm mostrado grandes alterações no perfil de proteínas envolvidas em pontos chave na transdução de sinal. Estes efeitos podem influenciar negativamente no transporte iônico nos rins. A vista deste fato, o transporte iônico no canal de sódio epitelial (ENaC) é limitante para a taxa de reabsorção de sódio nos rins, sendo essencial para a manutenção do equilíbrio eletrolítico e homeostase do corpo. Assim, este trabalho objetivou investigar os efeitos do F, utilizando concentrações semelhantes às que podem ser encontradas no néfron durante a fluorose dentária, na viabilidade celular e expressão de transportadores de membrana (ENaC) em linhagem celular renal M-1. Para os ensaios de viabilidade das células da linhagem M-1 foi empregado os testes colorimétricos Cristal Violeta e MTT, utilizando as concentrações de tratamento com fluoreto de sódio (NaF) a 10, 40, 100, 200 e 400 M, durante períodos experimentais de 24, 48, 72 e 96 h. As mesmas concentrações e os mesmos tempos foram utilizados no tratamento com cloreto de sódio (NaCl), utilizado como controle na possível interferência de Na+ na modulação das células. Para a investigação da influência do F: 1) nos canais ENaC foi utilizada a técnica de imunofluorescência e 2) para a análise de expressão gênica das subunidades que formam o ENaC, foi utilizada a técnica RT-PCR. Em nossos resultados pudemos observar que as maiores concentrações tanto de NaF quanto de NaCl provocaram a diminuição da viabilidade celular para ambos os ensaios de viabilidade, no entanto, foi possível observar algumas diferenças na resposta do tratamento com NaF em comparação com NaCl, por meio do ensaio Cristal Violeta. Não foi observado diferenças nas imagens de imunofluorescêcia, mas outros aspectos morfológicos foram vistos nessas imagens, como o aparecimento de domes celular, sugerindo que até mesmo a maior concentração de F não foi capaz de inibir a proliferação celular. Nosso resultado mais significativo foi em relação à expressão das subunidades dos canais de ENaC, onde a concentração de 400 M foi capaz de diminuir bruscamente a expressão das três subunidades do ENaC, enquanto as concentrações de 100 e 200 M mostraram apresentar expressão igual e em alguns casos até maior que o grupo controle. Pudemos concluir que doses de F na ordem de micromolares podem modular a expressão das subunidades formadoras do ENaC, positivamente quando em baixas concentrações e negativamente quando em concentrações elevadas. / The balance of fluoride (F) within the body is modulated by its ingestion, absorption and removal, and the kidneys, responsible for their excretion of the organism, are particularly vulnerable to the toxicity of F. The nephrotoxic effects of F involve marked structural changes in the kidneys , in addition, proteomic studies have shown large changes in the profile of proteins involved in key points in signal transduction. These effects may negatively influence ion transport in the kidneys. In view of this fact, the ionic transport in the epithelial sodium channel (ENaC) is limiting to the rate of sodium reabsorption in the kidneys, being essential for the maintenance of the electrolyte balance and homeostasis of the body. Thus, the objective of this work was to investigate the effects of F, using concentrations similar to those found in the nephron during dental fluorosis, cell viability and expression of membrane transporters (ENaC) in renal cell line M-1. For the M-1 cell line viability assays, the Crystal Violet and MTT colorimetric assays were used, using the 10, 40, 100, 200 and 400 M sodium fluoride (NaF) treatment concentrations during experimental periods of 24, 48, 72 and 96 h. The same concentrations and the same times were used in the treatment with sodium chloride (NaCl), used as control in the possible interference of Na + in the modulation of the cells. For the investigation of the influence of F: 1) in the ENaC channels, the immunofluorescence technique was used and 2) for the analysis of gene expression of the subunits that form the ENaC, the RT-PCR technique was used. In our results it was observed that the higher concentrations of NaF and NaCl caused a decrease in cell viability for both viability assays, however, it was possible to observe some differences in NaF treatment response in comparison to NaCl, through test Crystal Violet. No differences were observed in immunofluorescence images, but other morphological aspects were seen in these images, such as the appearance of cellular \"domes\", suggesting that even the highest F concentration was not able to inhibit cell proliferation. Our most significant result was the expression of the subunits of the ENaC channels, where the concentration of 400 M was able to decrease expression of the three subunits of the ENaC, whereas the concentrations of 100 and 200 M showed equal expression and in some cases even higher than the control group. We can conclude that doses in the order of micromolar the F can modulate the expression of the ENaC forming subunits, positively when in low concentrations and negatively when in high concentrations.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-21T17:34:19Z No. of bitstreams: 1 Ana Claudia Mallet de Souza Ramos.pdf: 923885 bytes, checksum: 8abdfd61e6d345ec8e6d3633951b0d80 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-21T17:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Claudia Mallet de Souza Ramos.pdf: 923885 bytes, checksum: 8abdfd61e6d345ec8e6d3633951b0d80 (MD5) Previous issue date: 2014-03-29 / Introduction: Chronic kidney disease is a worldwide growing problem. The kidney has the ability for nearly complete regenerate after ischemia/reperfusion or toxic injury. However, in some injuries the kidney undergoes epithelial-mesenchymal transition and fibrosis with loss of function. The best treatment is transplantation; nevertheless less than one third of patients are able to receive a kidney transplant due to lack of organs. Cell therapy may retard the progression of chronic kidney disease boht in allograft or in native kidney. This study aims to evaluate the feseabilty of a cell therapy. The main objective of this study is to evaluate the cell response to uremic toxins, specially indoxil sulfate. Methods: Human kidney cells were obtained by digestion method from human kidneys discard from Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP-EPM. Immunofluorescence technique and flow cytometry (FACS) were performed to characterize cells. Indoxil sulfate was used to stimulate injury FACS and immunofluorescence were performed to determine the expression of apha smooth muscle actin. Results: Eight donors were included, only six cultrues were kept. Donors were 46,25 years old on avarage, 100% received vasoactive drugs and 50% received nefrotoxic drugs.Cells were kept for 7 days until confluency were obtain in the passage zero, for the other passages duplication time was 72h.In the primary culture, 3.3% were proximal tubule cells, 1.7% distal tubule cells, 4.6% were EPO producing fibroblasts, 3.6% were mesenchymal cells and 8.9% pluripotente stem cells. There were no changing on cells phenotype while indoxil sulfate were added to the cultures. Conclusions: Primary culture from deceased donors do not change phenotype when exposed to indoxil sulfato. / Introdução: A doença renal crônica é um problema mundial em crescimento nas últimas décadas.O rim tem a capacidade de se regenerar após isquemia-reperfusão e lesões tóxicas. Entretanto, em alguns insultos inicia o processo de transição epitelial-mesenquimal com consequente acúmulo de tecido fibrótico e perda da função. O melhor tratamento doença renal crônica é o transplante, porém existeescassez de órgãos.Potencialmente a terapia celular poderá retardar a progressão da doença renal em humanos tanto em rins nativos como em rins transplantados. Este estudo tem como objetivo avaliar células renais para terapia celular no tratamento da doença renal crônica.O objetivo central é avaliar a resposta celulara toxinas urêmicas especialmente o indoxil sulfato. Métodos: Células renais foram obtida por método de digestão à partir de rins descartados do Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP_EPM.Imunofluorescencia e citometria de fluxo(FACS) foram utilizados para caracterização de células. O indoxil sulfato foi utilizado para estimular lesão renal sendo avaliadas quanto a expressão de alpha-smooth muscle actin. Resultados: Oito doadores foram incluídos neste estudo. Seis culturas foram continuadas. Os doadores apresentaram idade média de 46,25 anos, 100% fez uso de drogas vasoativas e 50% fez uso de drogas nefrotóxicas. O tempo de confluência na passagem zero foi de 7 dias e duplicação celular foi de 72 h. 3,3% das células da cultura primária são de túbulo proximal, 1,7% de túbulo distal, 4,6% fibroblastos produtores de EPO, 3,6% céulas mesenquimais e 8,9%progenitoras multipotentes. As células da cultura primária não tiveram seu fenótipo aletrado com o tratamento com indoxil sulfato. Conclusões:Não houve alteração do fenótipo celular em resposta ao indoxil sulfato.

O carcinoma de células renais (CCR) é responsável por, aproximadamente, 1 a 3% das neoplasias malignas humanas e, dentre os tumores urológicos, é o mais agressivo. A heterogeneidade biológica, a resistência aos fármacos e os efeitos colaterais à quimioterapia são os maiores obstáculos ao tratamento eficaz do CCR. Várias moléculas vêm sendo correlacionadas com o fenótipo agressivo deste tumor, sendo uma delas o fator de transcrição NF-kB. Estudos demonstraram a ativação de NF-kB no CCR e muitos apontaram NF-kB1 (p50) como uma molécula importante na progressão tumoral e metástase. Neste trabalho, foi utilizada a técnica de silenciamento gênico de interferência por RNA - Short hairpin RNA (shRNA) - para diminuir a expressão de NF-kB1 em células murinas de carcinoma de células renais (Renca). Verificou-se que, in vitro, a diminuição da expressão do gene NF-kB1 reduz a capacidade proliferativa das células Renca e aumenta a taxa de apoptose tardia/necrose e a quantidade de células na fase G2/M do ciclo celular. Além disso, as análises de Western blot revelaram aumento significativo da expressão proteica de Ciclina B1 e Bax. A regulação negativa da p50 também alterou a capacidade clonogênica das células que, conjugada à irradiação ionizante, levou à diminuição significativa da fração de sobrevivência das células Renca e diminuiu a viabilidade celular verificada através do ensaio de MTS. Os ensaios in vivo mostraram que as células com baixa expressão de NF-kB1 (Renca-shRNA- NF-kB1) apresentam tumorigenicidade significativamente menor que as células controle e as análises de imunohistoquímica mostraram aumento significativo das áres necróticas dos tumores Renca-shRNA-NF-kB1, além da diminuição da marcação de Ki-67, um marcador de proliferação celular. Os resultados indicam que a diminuição da expressão de NF-kB1 pode suprimir a tumorigênese do CCR, induzindo apoptose tardia/necrose, podendo ser um potencial alvo terapêutico para este carcinoma. / Renal cell carcinoma (RCC) is responsible for approximately 1 to 3% of human malignancies and, among urological tumors, is the most aggressive. Biological heterogeneity, drug resistance, and side effects to chemotherapy are major obstacles to effective RCC treatment. Several molecules have been correlated with the aggressive phenotype of this tumor, one of them being the transcription factor NF-kB. Studies have demonstrated the activation of NF-kB in the RCC and many have pointed to NF-kB1 (p50) as an important molecule in tumor progression and metastasis. In this study, the gene silencing technique of RNA Short hairpin RNA (shRNA) interference was used to decrease the expression of NF-kB1 in murine cells of renal cell carcinoma (Renca). It has been found that, in vitro, the decrease in NF-kB1 gene expression reduces the proliferative capacity of Renca cells and increases the rate of late apoptosis/necrosis and the number of cells in G2/M phase of the cell cycle. In addition, Western blotting analyzes revealed a significant increase in the protein expression of Cyclin B1 and Bax. Knockdown of p50 also altered clonogenic ability of cells and, together with ionizing irradiation, significantly increased renal cell fraction and decreased cell viability through the MTS assay. In vivo assays showed that cells with low expression of NF-kB1 (Renca-shRNA-NF-kB1) showed significantly less tumorigenicity than control cells and immunohistochemical analyzes showed a significant increase in necrotic areas of the Renca-shRNA-NFkB1. Moreover, decreased the Ki-67 labeling, a cell proliferation biomarker. The results indicate that the decrease in NF-kB1 expression may suppress RCC tumorigenesis, inducing late apoptosis/necrosis, and may be a potential therapeutic target for this carcinoma.

O carcinoma de células renais (CCR) é o tumor mais agressivo que afeta o rim de pessoas adultas. O CCR é uma doença heterogênea, com diferentes alterações moleculares e variados patrões histológicos e clínicos que apresentam evolução diferente. Atualmente apenas variáveis anatomopatológicas clássicas são utilizadas para determinar o prognóstico dos pacientes. Utilizando uma plataforma de microarranjos de DNA, nosso grupo identificou em um trabalho anterior um conjunto de genes que se encontram diferencialmente expressos em tumores de rim. Neste estudo, nove candidatos foram selecionados para avaliação como marcadores de prognóstico no CCR. Foi confirmada a alteração na expressão dos genes ARNTL, ACTN4 e EPAS1 (p < 0,05) em amostras tumorais de CCR através de PCR em tempo real. Adicionalmente, foi observada a alteração da expressão dos genes ARNTL, EPAS1 e CASP7 em linhagens celulares imortalizadas derivadas de tumores renais, recapitulando por tanto, as alterações observadas nos tumores obtidos de pacientes. Posteriormente investigamos o padrão de expressão proteica destes candidatos por imunohistoquímica utilizando microarranjos de tecidos. Foi detectada a diminuição significativa (p < 0,05) da expressão das proteínas ACTN4, ARNTL, CASP7 e EPAS1 em tumores de pacientes com CCR relativamente ao tecido renal não tumoral. Além disso, foi possível determinar valores de imunomarcação capazes de estratificar pacientes com CCR em diferentes grupos de risco quanto à sobrevida câncer-específica, que adicionalmente apresentaram associação significativa com parâmetros anatomopatológicos utilizados na clínica. As imunomarcações de ACTN4, ARNTL, e EPAS1 se mostraram parâmetros independentes de prognóstico de sobrevida dos pacientes. A imunomarcação de CASP7 foi capaz de identificar subgrupos de pacientes com pior prognóstico dentro de um conjunto de pacientes de baixo risco em função do estadio clinico, além de identificar pacientes com menor risco de morte pelo câncer entre aqueles apresentaram recorrência em até 5 após a cirurgia. O conjunto de resultados obtidos aponta para um novo conjunto de biomarcadores moleculares com potencial relevância para auxiliar no prognóstico de pacientes com carcinoma de células renais. / The renal cell carcinoma (RCC) is the most aggressive tumor that affects the kidney in adult people. The RCC is a heterogeneous disease, with many different molecular alterations and varied histological and clinical patterns with different outcome. Currently, only classic anatomopathological variables are used to determine patients\' prognosis. Using a DNA microarray platform, our group identified in a previous work a set of genes differentially expressed in renal tumors. In this study, nine candidates were selected for evaluation as prognostic biomarkers in RCC. Alteration of the gene expression in RCC tumor samples was confirmed for ARNTL, ACTN4 and EPAS1 (p < 0.05) by real time PCR. Additionally, gene expression changes of ARNTL, EPAS1 and CASP7 were also observed in immortalized cell lines derived from renal tumors, recapitulating the expression changes detected in the patients\' tumors. Next, we used tissue microarrays to investigate the protein expression of the selected candidates by immunohistochemistry. Expression of the proteins ACTN4, ARNTL, CASP7 and EPAS1 was detected as significantly downregulated (p < 0.05) in patients´ tumors relative to non-tumor renal tissue. Furthermore, immunostaining patterns of the selected candidates were able to stratify patients with RCC in different risk groups according to cancer-specific survival, which also showed significant associations with anatomopathological parameters used in the clinics. ACTN4, ARNTL and EPAS1 immunostaining resulted as independent prognostic parameters of patient survival. CASP7 immunostaining was able to identify subgroups of patients with worse prognosis in a set of low risk patients as determined by their clinical stage, and also identified patients with lower risk of death from cancer amongst patients that relapsed within 5 years after surgery. Overall, these results point to a new set of molecular biomarkers with potential relevance to help in the prognosis of patients with renal cell carcinoma.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O carcinoma de células renais (CCR) representa atualmente uma patologia de grande interesse clínico. Sua incidência vem aumentando, especialmente os achados acidentais, que hoje representam 50% dos casos novos diagnosticados (23). Por tratar-se de patologia altamente resistente à quimioterapia e radioterapia, seu potencial de cura encontra-se no tratamento cirúrgico, quando em estádios iniciais, órgano-confinados (62). Inúmeros ensaios clínicos foram propostos para tratar tumores localmente avançados ou metastáticos, mas os resultados inconsistentes encontrados na literatura sejam com quimioterapia, imunoterapia, hormonioterapia ou radioterapia demonstram que a pesquisa clínica deverá progredir em outras direções (22). Foi produzida, em nosso laboratório, uma proteína recombinante oriunda de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense, denominada Amblyomin-X, capaz de inibir o fator Xa de coagulação e de induzir a citotoxicidade em diferentes linhagens de células tumorais (24). Neste trabalho foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X em culturas de adenocarcinoma de células renais murinas (Renca) e carcinoma de células renais humanas (Caki-1) com diferentes concentrações deste composto. Analisamos a morfologia e viabilidade celular, ciclo celular e o tipo de morte celular induzido pelo tratamento com a proteína. E também foi avaliado o potencial de inibição da atividade proteassômica frente ao tratamento com Amblyomin-X. Os resultados mostraram que as linhagens Caki-1 e Renca são sensíveis ao Amblyomin-X, o qual induz modificações nas características morfológicas e viabilidade celular após 24 e 48 horas de tratamento. Observamos também que houve morte dose e tempo-dependente, modulação das fases G0/G1 e diminuição das fases S e G2/M do ciclo celular e que em altas concentrações de Amblyomin-X, devido ao seu efeito citotóxico, diminui todas as fases do ciclo celular. Em células Caki-1 ocorreu decréscimo dos níveis de Interleucina-6. Os resultados descritos neste trabalho sugerem que o Amblyomin-X induz citotoxidade em células Renca através do mecanismo de Apoptose. Um dos possíveis alvos do Amblyomin-X é o sistema ubiquitina-proteassomo, visto que foi observada a inibição da atividade catalítica do proteassomo do tipo quimiotripsina em células tratadas com Amblyomin-X. / The renal cell carcinoma (RCC) is currently a disease of great clinical interest. Its incidence is increasing, especially the incidental findings, which now represent 50% of new cases diagnosed. Because it is highly resistant to disease chemotherapy and radiotherapy, their potential to cure is the surgical treatment, while in the early stages, organo-confined. Numerous clinical trials have been proposed to treat locally advanced or metastatic tumors, but results are inconsistent in the literature with chemotherapy, immunotherapy, hormone therapy or radiotherapy have shown that clinical research should progress in other directions. It was produced in our laboratory, a recombinant protein originating from a cDNA library of the salivary glands of Amblyomma cajennense called amblyomin-X, capable of inhibiting factor Xa coagulation and induce cytotoxicity in different tumor cell lines. This study evaluated the effects of Amblyomin-X in cultured murine renal cell adenocarcinoma (Renca) and human renal cell carcinoma (Caki-1) at different concentrations (0.15 to 1.5 ƒÝM) of this compound. We analyze the morphology and cell viability, cell cycle and the type of cell death induced by treatment with the protein. It also evaluated the potential of proteasome inhibition of the activity front in dealing with Amblyomin-X. Then determine that the strains Caki-1 and Renca are sensitive to Amblyomin-X, which induces changes in morphology and cell viability after 24 and 48 hours of treatment with Amblyomin-X. We also observed that death was dose-dependent and time-dependent, inducing a decrease in all phases of the cell cycle and decreased levels of IL-6. The results described herein suggest that the Amblyomin-X induces cytotoxicity in Renca cells through the mechanism of apoptosis. One of the possible targets of Amblyomin-X is the ubiquitin-proteasome system, as was also observed inhibition of catalytic activity of the proteasome chymotrypsin type. / FAPESP: 08/52338-7 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações