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Carcinoma of unknown primary (CUP) is an intriguing clinical finding that is defined as biopsy-proven metastasis from a malignancy in the absence of an identifiable primary site after a complete clinical work-up. CUP is a relatively common clinical entity, accounting for approximately 3–5% of all cancer diagnoses, and consists of a heterogeneous group of tumors that have acquired the capacity to metastasize before the development of a clinically evident primary lesion. Notable advances have been made over the past years in the treatment of well-defined clinical subgroups of CUP, such as women with peritoneal carcinomatosis and young adults with poorly differentiated carcinomas of midline distribution, but for the majority of patients, the prognosis still remains poor. In this review, we highlight recent advances in the diagnosis and treatment of patients with CUP syndrome, and emphasize the importance of identifying several favorable subsets of CUP, amenable to specific treatment options. In addition, we will point out novel diagnostic and therapeutic approaches which will hopefully improve both our understanding and the prognosis of this more or less neglected disease. / Unter dem Cancer of Unknown Primary (CUP)-Syndrom werden diejenigen Tumorerkrankungen zusammengefasst, bei denen auch nach Abschluss der Diagnostik nur Metastasen, jedoch kein Primärtumor gefunden wird. Das CUP-Syndrom macht ca. 3–5% aller neu diagnostizierten Malignomfälle aus und umfasst eine heterogene Gruppe von Tumoren, die die Fähigkeit zur Metastasierung erlangt haben bevor sich ein klinisch manifester Primärtumor entwickelt hat. Obwohl bemerkenswerte Fortschritte in der Behandlung von Patienten mit bestimmten, gut definierten Erkrankungssubgruppen, wie beispielsweise Frauen mit isolierter Peritonealkarzinose oder jungen Erwachsenen mit gering differenzierten Karzinomen mit Mittellinienverteilung, erzielt werden konnten, ist die Prognose bei der Mehrzahl der Patienten nach wie vor schlecht. Wir berichten im weiteren Verlauf dieser Übersichtsarbeit über Fortschritte in der Diagnostik und Therapie von Patienten mit CUPSyndrom und weisen darauf hin, dass es trotz der immer noch sehr schlechten Prognose von großer Bedeutung ist, Patienten mit bestimmten Subtypen des CUP-Syndroms zu identifizieren, die spezifischen Therapien mit der Option auf Heilung zugeführt werden sollten. Darüber hinaus möchten wir auf neuere diagnostische und therapeutische Bestrebungen aufmerksam machen, die das Verständnis und die Prognose dieses auch in der Onkologie bisher stiefmütterlich behandelten Krankheitsbildes hoffentlich verbessern werden. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Le cetuximab est une thérapie ciblée dirigée contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) utilisée dans le cancer colorectal (CCR) en combinaison avec des chimiothérapies (5-FU, irinotécan et oxaliplatine). Sa fixation inhibe les voies de signalisation en aval du récepteur conduisant à une diminution de la prolifération et de la survie des cellules ciblées. Cependant, chez les patients atteint de CCR présentant une protéine KRAS mutée, le cetuximab est inefficace, de plus, la moitié des patients présentant une protéine KRAS wild-type ne répond pas non plus au cetuximab. Afin de découvrir des nouveaux biomarqueurs de sélection des patients qui pourraient bénéficier de ce traitement ou d'améliorer la réponse des patients, une meilleure connaissance des mécanismes d'action du cetuximab est nécessaire. Par exemple récemment, des études ont montré que la protéine p53 participait à la réponse au cetuximab. Il serait intéressant de savoir si le statut de cette protéine peut constituer un bon marqueur de réponse. Précédemment, nous avons montré que l'activation de la « mitogen activated protein kinase » p38 (MAPK p38) induit une résistance à l'irinotécan in vitro et in vivo et est un marqueur de non réponse à cette drogue. De plus, d'autres équipes ont montré que la MAPK p38 bloque également la réponse au 5-FU et participe à la cytotoxicité de l'oxaliplatine. Il semble alors que la MAPK p38 soit impliquée dans les mécanismes d'action des anti-tumoraux. Il est donc intéressant de savoir si la MAPK p38 participe également à la cytotoxicité des thérapies ciblées comme le cetuximab. Pour répondre à ces questions nous avons choisi de comparer deux lignées cellulaires de CCR KRAS wild-type mais au statut TP53 différent et qui répondent différemment au cetuximab: la lignée Caco2 (30% d'inhibition de la survie, TP53 muté) et la lignée DiFi (80% d'inhibition de la survie, TP53 sauvage). Nous avons effectué des tests de cytotoxicité combinant le cetuximab et l'inhibition transcriptionnelle ou pharmacologique de p38 ou l'inhibition transcriptionnelle de p53. Nous avons également testé l'apoptose et la prolifération induite par le cetuximab en l'absence de la MAPK p38 ou de p53. Enfin nous avons testé l'expression des gènes BIM, p27 et PUMA impliqués dans l'apoptose et la prolifération. Dans cette étude, nous avons démontré que la MAPK p38 et p53 participent à l'effet cytotoxique du cetuximab dans les cellules DiFi. En revanche, dans les cellules Caco2, la MAPK p38 bloque partiellement l'effet du cetuximab. Nous avons également montré l'implication de p38 et p53 dans l'apoptose induite par le cetuximab et l'implication de p38 dans l'inhibition de la prolifération. La protéine p38 est impliquée dans la régulation de ERK et dans la localisation nucléaire de FOXO3a responsable de l'expression des gènes BIM et p27. Enfin, nous avons montré que p38 a également un rôle dans le mécanisme d'action d'inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant l'EGFR (lapatinib et erlotinib). Pour conclure, nous avons déterminé que p38 et p53 sont impliquées dans le mécanisme d'action du cetuximab. Nous avons décris l'implication de la voie p38-FOXO3a dans le mécanisme d'action du cetuximab. Enfin, p38 et p53 semblent être de bons biomarqueurs de réponse au cetuximab. / Cetuximab is used in colorectal cancer (CRC), as targeted therapy against the Epithelial Growth Factor receptor (EGFR), in association with chemotherapy (5-FU, oxaliplatin and irinotecan). Its binding inhibits signaling pathways downstream to the receptor leading to a decrease in proliferation and surviving. In KRAS mutated CRC patients, Cetuximab is ineffective, and half of KRAS Wild Type (WT) patients does not respond to Cetuximab either. Thus, a better knowledge of Cetuximab mechanism of action will help to improve response rate and to find new biomarkers of response. Recently, studies have shown that p53 protein is involved in the response to cetuximab. It would be interesting to know if the status of this protein could be a biomarker of response. Previously, we have shown that activation of the mitogen activated protein kinase p38 (p38MAPK) induces irinotecan resistance in vitro and in vivo and is a predictive factor of response to irinotecan. Moreover, others teams found that p38 MAPK also partially block 5-FU response and participate to oxaliplatin cytotoxicity. It seems that p38 is involved in mechanism of action of anti-tumor agent. The aim of our project is to determine, in KRAS WT colorectal cells, if p38 MAPK is involved as well in the cetuximab effect. In this aim, experiments were done on two KRAS WT CRC cell lines but with different p53 status which respond differently to Cetuximab: Caco2 cells (30% of survival inhibition, TP53 mutated) and DiFi cells (80% of survival inhibition, TP53 wild-type). Cytotoxic experiments combining cetuximab treatment and inhibition of p38MAPK or p53 by transcriptional inhibition or using a pharmacological inhibitor of p38 (SB202190) were performed. We assessed apoptosis and inhibition of proliferation by FACS analysis of cell cycle and DNA synthesis. In addition, BIM, PUMA and p27 expression were analyzed by QPCR and Western Blot. Our results showed that inhibition of p38MAPK enhances Cetuximab cytotoxic effect in Caco2 cells but impairs it in DiFi cells as inhibition of p53. We also observed that inhibition of p38 MAPK and p53 decreases cetuximab induced apoptosis and inhibition of p38 decrease anti-proliferative effect in DiFi cells. The prevention of cell death by SB202190 in cetuximab treated DiFi cells could be explained by ERK pathway activation and the decrease of FOXO3a nuclear localization leading to p27 and BIM expression decrease, respectively involved in cellular proliferation and mitochondrial apoptosis. Our results have shown the same inhibiting effect of SB202190 on the cytotoxic effect of two tyrosine-kinase inhibitors targeting EGFR (lapatinib and erlotinib) in DiFi cells indicating that p38MAPK implication is linked to inhibition of EGFR kinase activity not to Cetuximab only. We have shown that p38MAPK is involved in response to the inhibition of EGFR activity via nuclear localization of FOXO3a. p53 protein has also a role in cetuximab response. Both seem to be predictive factors of response to cetuximab therapy.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Zielstellung 7 3 Theoretischer Teil 9 3.1 Monoklonale Antikörper 9 3.2 Endoradionuklidtherapie mit Hilfe radiomarkierter Antikörper 11 3.3 Pretargeting-Konzepte zur Anwendung in der Radioimmuntherapie 12 3.3.1 Kennzeichen des Tumor-Pretargeting 12 3.3.2 Pretargeting unter Nutzung bispezifischer monoklonaler Antikörper 13 3.3.3 Das (Strept)avidin/Biotin-System 16 3.3.4 Komplementäre Oligonukleotide 20 3.3.4.1 D-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als komplementäres System für Pretargeting-Anwendungen 20 3.3.4.2 L-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als potentielle und stabile Komponenten für das Pretargeting von Tumoren 23 3.3.4.3 Pretargeting-Konzept mit L-konfigurierten Oligonukleotiden – Bisherige Arbeiten im HZDR 24 3.4 Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) als potentielles Target für Pretargeting-Anwendungen 28 3.4.1 Die Biologie des EGFR und dessen Funktion in der Onkogenese 28 3.4.2 Der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab 30 3.4.3 Antikörper vermittelte Rezeptorinternalisierung - ein Ausschlusskriterium für das Pretargeting? 32 4 Ergebnisse und Diskussion 35 4.1 Verwendete komplementäre L-DNA-Leitstruktur, Chelatoren und Radionuklide 35 4.2 Darstellung der Radionuklid markierbaren Komponente des Pretargeting Systems 39 4.2.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 39 4.2.2 Konjugation von 17mer-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 1a-e mit NOTA-Bn-thioharnstoff-ethyl-maleinimid 5 und DOTA-GA-Mal 7 41 4.3 Darstellung der targetspezifischen Komponente – Funktionalisierung von Cetuximab mit komplementärer L-DNA 44 4.3.1 Synthesestrategie 44 4.3.2 NOTA-Funktionalisierung von Cetuximab 46 4.3.2.1 Syntheseplanung und Durchführung 46 4.3.2.2 Analytische Charakterisierung des Derivates 47 4.3.3 Maleinimid-Funktionalisierung von NOTA3-C225 51 4.3.3.1 Syntheseplanung und Durchführung 51 4.3.3.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 53 4.3.4 Konjugation von NOTA3-C225-Malk mit komplementärer 17mer-L-DNA 2 55 4.3.4.1 Syntheseplanung und Durchführung 55 4.3.4.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 56 4.4 Radiochemische Synthesen 61 4.4.1 68Ga-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 61 4.4.2 64Cu-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 63 4.4.3 64Cu-Markierung NOTA funktionalisierter Cetuximab-Derivate 65 4.4.3.1 Entwicklung einer Methode zur schonenden Radiomarkierung von Antikörpern mit 64Cu 65 4.4.3.2 Analytische Charakterisierung der 64Cu-markierten Cetuximab-Derivate mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 67 4.4.4 177Lu-Markierung von DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d 70 4.5 In-vitro-Charakterisierung und Bewertung des Pretargeting-Systems auf dessen Eignung für In-vivo-Anwendungen 72 4.5.1 Vorüberlegungen 72 4.5.2 Untersuchungen zur Oberflächenladung modifizierter Cetuximab- Derivate 74 4.5.3 Schmelzpunktbestimmung zur Bewertung der Hybridstabilität 77 4.5.3.1 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/c-L-DNA- Hybride 77 4.5.3.2 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 77 4.5.3.3 Die Schmelztemperatur der NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 78 4.5.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Abhängigkeit von PEG-Substituenten unterschiedlicher Größe auf das Hybridisierungs- verhalten 79 4.5.4.1 Vorbetrachtung 79 4.5.4.2 Hybridisierungsuntersuchungen in Phosphatpuffer 79 4.5.4.3 Hybridisierungsuntersuchungen in humanem Vollblut 81 4.5.5 Kompetitionsbindungsstudien zur Bestimmung der Affinität von konjugierten Cetuximab-Derivaten 82 4.5.5.1 Vorbetrachtung 82 4.5.5.2 Kompetitionsbindungsstudien an A431-Zellhomogenaten 83 4.5.5.3 Kompetitionsbindungsstudien an FaDu-Zellhomogenaten 84 4.5.5.4 Schlussfolgerungen 85 4.5.6 Sättigungsbindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 87 4.5.6.1 Vorbetrachtung 87 4.5.6.2 Sättigungsbindungsstudien an A431-Zellen 88 4.5.6.3 Sättigungsbindungsstudien an FaDu-Zellen 91 4.5.6.4 Schlussfolgerungen 95 4.5.7 Pretargeting-Bindungsstudien von NOTA3-C225-(c-L-DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 mit [64Cu]Cu6a-e an A431- und FaDu-Zellen 98 4.5.7.1 Vorbetrachtung 98 4.5.7.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 99 4.5.7.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 101 4.5.7.4 Schlussfolgerungen 103 4.5.8 Internalisierungs-Bindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 103 4.5.8.1 Entwicklung eines geeigneten Internalisierungsassays basierend auf dem Pretargeting-Konzept 103 4.5.8.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 106 4.5.8.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 113 4.5.8.4 Schlussfolgerungen 119 4.6 In-vivo-Pretargeting-Studien 121 4.6.1 Untersuchung der In-vivo-Stabilität und Bluteliminierung von [64Cu]Cu-NOTA-L-DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) 121 4.6.2 Kleintier-PET-Untersuchung von [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 zur Ermittlung der Pretargeting-Wartezeit 123 4.6.3 Pretargeting-Kleintier-PET-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [68Ga]Ga-NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG ([68Ga]Ga6a-e) in Mäusen 125 4.6.4 Pretargeting-Studien von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [64Cu]Cu-NOTA-L DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) in Mäusen 129 4.6.4.1 Kleintier-PET-Untersuchungen an FaDu tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 129 4.6.4.2 Bioverteilung nach Pretargeting-Experimenten an A431 tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 132 4.6.5 Pretargeting-SPECT-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG ([177Lu]Lu8d) 134 4.7 Abschließende Bewertung von Cetuximab auf dessen Eignung als Antikörper für das Tumor-Pretargeting 135 5 Zusammenfassung und Ausblick 137 6 Experimenteller Teil 141 6.1 Material 141 6.1.1 Chemikalien 141 6.1.2 Puffergemische und Lösungen 143 6.1.3 Synthetische L-Oligonukleotide 146 6.1.4 Radionuklide 146 6.1.5 Zellkulturen 146 6.1.5.1 A431-Zelllinie 146 6.1.5.2 FaDu-Zelllinie 147 6.1.6 Tiermodelle 147 6.1.7 Geräte 148 6.2 Analytische Methoden 149 6.2.1 NMR-Spektroskopie 149 6.2.2 Massenspektrometrie 149 6.2.2.1 ESI-MS 149 6.2.2.2 Maldi-TOF 150 6.2.3 UV/Vis-Spektroskopie 150 6.2.4 Chromatographie 151 6.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 151 6.2.4.2 Hochleistungsflüssigchromatographie 151 6.3 Synthesevorschriften und analytische Daten 153 6.3.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 153 6.3.2 Synthese der NOTA und DOTA funktionalisierten 17mer-L-DNA- Verbindungen 154 6.3.3 Synthese konjugierter Cetuximab-Derivate 157 6.3.4 Radiochemische Synthesen 161 6.3.4.1 68Ga-Radiomarkierungen 161 6.3.4.2 64Cu-Radiomarkierungen 163 6.3.4.3 177Lu-Radiomarkierungen 167 6.4 Biologisch-chemische Methoden 168 6.4.1 Schmelzpunkt-Bestimmung Fehler! Textmarke nicht definiert. 6.4.2 Gelelektrophorese 168 6.4.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 168 6.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 169 6.4.2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 170 6.4.3 Zellkultur 170 6.4.3.1 Auftauen und Anzüchten von kryokonservierten Zellen 170 6.4.3.2 Kryokonservierung von Zelllinien 170 6.4.3.3 Subkultivierung 171 6.4.3.4 Zellzahlbestimmung 171 6.4.3.5 Herstellung von Zellhomogenat 172 6.4.4 Hybridisierungs- und Bindungsassays 172 6.4.4.1 In-vitro-Hybridisierungsuntersuchungen 172 6.4.4.2 Kompetitionsassay an Zellhomogenat 173 6.4.4.3 Sättigungsbindungsstudien an intakten Zellen 174 6.4.4.4 Pretargeting-Bindungsstudien 175 6.4.4.5 Internalisierungs-Bindungsstudien 176 6.4.4.6 Bicinchoninsäure-Assay (BCA) zur Proteinbestimmung 177 6.4.4.7 Gammacounter 177 6.4.5 Metabolitenanalytik 178 6.4.6 Bioverteilungsuntersuchungen 178 6.4.7 Positronen-Emissions-Tomographie (PET) 179 6.4.8 Single-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) 179 7 Anhang 180 7.1 Originaldaten 180 7.1.1 Schmelzkurven 180 7.1.2 Gelelektrophorese und Autoradiographie 181 7.1.3 Bioverteilungsdaten 186 7.2 Übersicht der Substanzen 188 7.3 Abkürzungsverzeichnis 191 7.4 Literaturverzeichnis 194 7.5 Pubblikationen, Poster und Vorträge 209 7.6 Danksagung 212

Le cetuximab (CTX) est un anticorps monoclonal anti-EGFR indiqué dans les cancers ORL dont les modalités de prescription pourraient être améliorées. Après chimiothérapie d’induction (étude Tremplin), en comparaison au cisplatine, il était moins toxique mais sans améliorer la préservation laryngée. À la première injection, le CTX peut déclencher un choc anaphylactique lié à la préexistence d’IgE anti-αGal. Des tests prédictifs détectant ces IgE ont été développés et réalisés chez 41 patients avec une sensibilité et une valeur prédictive négative de 100%. La relation entre concentrations sériques et efficacité/toxicité a été étudiée chez 34 patients. La pharmacocinétique a été décrite à l’aide d’un modèle combinant des mécanismes d’élimination non saturable (CL) et saturable (k0). La clairance globale du CTX, reflet de l’exposition des patients, était reliée aux survies sans progression et globale (SG). Le grade de radiodermite était associé à la SG. Une simulation pharmacocinétique suggère, qu’en comparaison à l’injection standard de CTX, une injection toutes les trois semaines entrainera des AUC proches mais des concentrations résiduelles différentes. / Cetuximab (CTX) is an anti-EGFR monoclonal antibody approved in head and neck cancer, which prescription modalities may be improved. After induction chemotherapy (Tremplin study), compared to cisplatin, CTX was less toxic but did not improve larynx preservation. During first infusion, CTX can induce an anaphylaxis reaction due to the presence of preexisting anti-αGal IgE. Predictive assays detecting these IgE were developed and tested in 41 patients, with sensitivity and negative predictive values of 100%. Relationship between serum concentrations and efficacy/toxicity was studied in 34 patients. CTX pharmacokinetics was described using a model combining non-saturable (CL) and saturable (k0) eliminations. Global clearance, which reflects patient exposure, was related to progression free and overall (OS) survivals. Severe radiation dermatitis was also associated with OS. A pharmacokinetic simulation suggests that, in comparison to standard CTX infusion, an infusion every three weeks will lead to similar AUC but to different residual concentrations.

Les anticorps monoclonaux ont révolutionné le traitement de nombreuses pathologies. Cependant, leur pharmacocinétique (PK) et l’influence de leur concentration sur la réponse clinique restent mal connues. Nous avons étudié les sources de variabilité interindividuelle de la PK du cetuximab, un anticorps anti- EGFR, ainsi que l’influence de l’exposition à cet anticorps sur la réponse. Nous avons validé une méthode ELISA de dosage du cetuximab. Dans un modèle murin, nous avons étudié l’absorption pulmonaire du cetuximab. Nous avons étudié la PK du cetuximab chez un patient hémodialysé. Nous avons décrit la PK du cetuximab chez des patients traités pour cancer colorectal métastatique, à l’aide d’un modèle combinant des éliminations d’ordre 0 et 1. Enfin, nous avons identifié la clairance globale du cetuximab, paramètre pouvant être estimé précocement par la concentration résiduelle à J14, comme un facteur influençant la survie sans progression des patients. Nos travaux montrent qu’une description de la PK d’un anticorps par approche compartimentale permet d’identifier les sources de variabilité et d’étudier l’impact de la PK sur la réponse clinique. / Monoclonal antibodies have profoundly modified the treatment of many diseases. However, their pharmacokinetics (PK) and the influence of their concentrations on the clinical response are poorly known. We studied the sources of the interindividual variability of PK of cetuximab, an anti-EGFR, and the influence of the exposure to this antibody on the response. We validated an ELISA technique to measure cetuximab concentrations. We studied the pulmonary absorption of cetuximab in a murine model. We studied cetuximab PK in a hemodialysed patient. In metastatic colorectal cancer patients, we described cetuximab PK with the help of a model combining zero- and first-order eliminations. Finally, we identified the global clearance of cetuximab, a parameter which can be estimated by residual concentration on day 14, as a factor influencing progression-free survival of the patients. Our work shows that the description of the PK of an antibody by compartmental approach allows to identify sources of variability and to study the impact of PK on the clinical response.

Les traitements des cancers des VADS reposent sur la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Malgré ces traitements, la survie globale des patients à 5 ans est de l’ordre de 50%. Les causes d’échec thérapeutique sont dues au profil de résistance des tumeurs. Le ciblage de l’axe EGFR/mTOR/HIF-1 par une combinaison de rapalogues et d’anti-EGFR a montré son efficacité sur certaines tumeurs solides. L’objet de ce travail de thèse a été de caractériser l’impact d’une combinaison de drogues à faibles doses sur des lignées cellulaires des VADS au moyen d’une approche pharmacologique et moléculaires. Nos résultats montrent que la combinaison de la rapamycine (5nM) au cetuximab (2,5μg/ml) diminue la survie clonogénique des cellules et permet une inhibition du facteur de transcription HIF-1α. Cette combinaison de drogue améliore l’efficacité de la radiothérapie. En revanche, l’induction de HIF-2a induite par le traitement provoque la résistance des cellules aux traitements par, et une rechute rapide des tumeurs in vivo. L’inhibition de HIF-2 permet une inhibition de la survie cellulaire d’environ 100% dans un modèle résistant. / Management of HNSCC relies on surgery, radiotherapy, and chemotherapy. Despite these treatments, the 5 years overall survival of patient is lower than 50%. Main causes of therapeutic failure are due to the profile of resistance of tumors. The efficacy of a combination rapalogues and anti-EGFR therapies in targeting the EGFR/mTOR/HIF-1 axis in solid tumors was shown previously. In this PhD work, we have evaluated the impact of a low-dose drug combination on head and neck cancer cells lines with a pharmacological and molecular approach. We show that the combination of rapamycine (5nM) and cetuximab (2,5μg/ml) efficiently inhibits the HIF-1 transcription factor and impairs cell clonogenic survival. The efficacy of radiation therapy is improved by this drug combination. However, cell resistance to the treatment is acquired via the induction of HIF-2 in our resistant model cell line. This induction is associated with more tumor relapse in tumors mice xenograft. The inhibition of HIF-2 achieves a dramatic drop of cell clonogenic survival to < 1%.

Carcinoma of unknown primary (CUP) is an intriguing clinical finding that is defined as biopsy-proven metastasis from a malignancy in the absence of an identifiable primary site after a complete clinical work-up. CUP is a relatively common clinical entity, accounting for approximately 3–5% of all cancer diagnoses, and consists of a heterogeneous group of tumors that have acquired the capacity to metastasize before the development of a clinically evident primary lesion. Notable advances have been made over the past years in the treatment of well-defined clinical subgroups of CUP, such as women with peritoneal carcinomatosis and young adults with poorly differentiated carcinomas of midline distribution, but for the majority of patients, the prognosis still remains poor. In this review, we highlight recent advances in the diagnosis and treatment of patients with CUP syndrome, and emphasize the importance of identifying several favorable subsets of CUP, amenable to specific treatment options. In addition, we will point out novel diagnostic and therapeutic approaches which will hopefully improve both our understanding and the prognosis of this more or less neglected disease. / Unter dem Cancer of Unknown Primary (CUP)-Syndrom werden diejenigen Tumorerkrankungen zusammengefasst, bei denen auch nach Abschluss der Diagnostik nur Metastasen, jedoch kein Primärtumor gefunden wird. Das CUP-Syndrom macht ca. 3–5% aller neu diagnostizierten Malignomfälle aus und umfasst eine heterogene Gruppe von Tumoren, die die Fähigkeit zur Metastasierung erlangt haben bevor sich ein klinisch manifester Primärtumor entwickelt hat. Obwohl bemerkenswerte Fortschritte in der Behandlung von Patienten mit bestimmten, gut definierten Erkrankungssubgruppen, wie beispielsweise Frauen mit isolierter Peritonealkarzinose oder jungen Erwachsenen mit gering differenzierten Karzinomen mit Mittellinienverteilung, erzielt werden konnten, ist die Prognose bei der Mehrzahl der Patienten nach wie vor schlecht. Wir berichten im weiteren Verlauf dieser Übersichtsarbeit über Fortschritte in der Diagnostik und Therapie von Patienten mit CUPSyndrom und weisen darauf hin, dass es trotz der immer noch sehr schlechten Prognose von großer Bedeutung ist, Patienten mit bestimmten Subtypen des CUP-Syndroms zu identifizieren, die spezifischen Therapien mit der Option auf Heilung zugeführt werden sollten. Darüber hinaus möchten wir auf neuere diagnostische und therapeutische Bestrebungen aufmerksam machen, die das Verständnis und die Prognose dieses auch in der Onkologie bisher stiefmütterlich behandelten Krankheitsbildes hoffentlich verbessern werden. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

A baixa seletividade dos métodos convencionais para diagnóstico e terapia de neoplasias, bem como o fato de nem sempre alcançarem o sucesso terapêutico desejado, configuram dificuldades para a prática oncológica. Diante disso, os anticorpos monoclonais (AcMs) radiomarcados, aplicados em técnicas diagnósticas, têm se destacado, visto que permitem a entrega seletiva da radiação ao alvo de interesse. A metodologia Radioimunodiagnóstico (RID), utilizando AcM anti-EGFR radiomarcado, possibilita triagem prévia, avaliando a resistência ao tratamento e estratificando pacientes que possam apresentar benefícios à imunoterapia com cetuximabe. Além disso, permite monitorar a progressão da terapia, visando tratamento mais efetivo e direcionado, promulgando a abordagem da medicina personalizada. No Brasil, ainda não há radioimunoconjugado disponível para diagnóstico e seguimento do câncer. Nesse contexto, o objetivo com este trabalho foi o de desenvolver uma formulação farmacêutica para padronizar uma rotina de produção dos radiofármacos para radioimunodiagnóstico de câncer de cabeça e pescoço e de câncer colorretal: cetuximabe-DTPA-111In e cetuximabe-DFO-89Zr. Em adição, corroborar na elucidação dos mecanismos de resistência das células tumorais à terapia com o cetuximabe, através da realização de estudos de ligação do radioimunoconjugado à receptores celulares. Em relação aos radiofármacos estudados, destaca-se que os processos de conjugação do cetuximabe com os quelantes DTPA, na razão molar 1:20, e com o DFO, 1:5, foram bem-sucedidos e otimizados, demonstrando boa reprodutibilidade. Os imunoconjugados apresentaram preservação da imunorreatividade e alta estabilidade quando armazenados a -20°C por até seis meses. Esses imunoconjugados, quando radiomarcado com 111In e 89Zr, exibiram pureza radioquímica superior a 95%, sem necessidade de purificação pós-marcação, e estabilidade por tempo que possibilita seu transporte às clínicas distantes do centro produtor. As análises in vitro do cetuximabe-DTPA-111In em células FaDu-C10 (linhagem resistente) demonstraram percentual inexpressivo de ligação e internalização do radioimunoconjugado, congruindo na explanação do modelo de resistência conferido à linhagem. O estudo de corpo inteiro em MicroPET/TC revelou redução no perfil de captação no grupo de bloqueio, com excesso de cetuximabe não marcado, e intensa captação do cetuximabe-DFO-89Zr pelo tumor de células escamosas no grupo sem bloqueador, confirmando a especificidade in vivo do radioimunoconjugado. Os estudos de biodistribuição dos radiofármacos foram compatíveis com os descritos em literatura e validaram os resultados obtidos por imagens em MicroSPECT/TC e MicroPET/TC, além de apresentarem apreciável captação tumoral, considerando os tempos analisados. A estabilidade alta in vivo e a eficácia da marcação foram confirmadas pela baixa captação óssea e em tecidos não alvos. O melhor intervalo pós-injeção do radiofármaco para avaliação in vivo foi após cinco dias da administração. Conclui-se, portanto, que os radioimunoconjugados para imuno-SPECT e imuno-PET, cetuximabe-DTPA-111In e cetuximabe-DFO-89Zr, são ferramentas promissoras para diagnóstico e monitoramento de câncer receptor específico (EGFR) e para estratificação de pacientes à terapia anti-EGFR, encorajando a continuidade deste projeto para futuros estudos clínicos. / The low selectivity of conventional methods for cancer diagnosis and therapy, as well as the fact that these methods could not achieve the desired therapeutic success, constitute difficulties for the oncological practice. In this regard, radiolabeled monoclonal antibodies (mAbs) applied in diagnostic techniques have been highlighted, since they allow the selective delivery of the radiation to the specific target. The radioimmunodiagnosis methodology (RID), using radiolabeled anti-EGFR mAbs, enables previous screening, evaluating resistance to treatment and stratifying patients who may present benefits to cetuximab immunotherapy. In addition, it allows monitoring the progression of the therapy, aiming for a more effective and directed treatment, leading the personalized medicine approach. A radioimmunoconjugate is not yet available for diagnosis and management of cancer in Brazil. In this context, this research was carried out to develop a pharmaceutical formulation to standardize a routine production of radiopharmaceuticals for diagnosis and monitoring head and neck cancer and colorectal carcinoma: 111In-DTPA-cetuximab and 89Zr-DFO-cetuximab. In addition, corroborate in the elucidation of the tumor cells resistance mechanisms to EGFR-targeted therapy, through in vitro and in vivo radioimmunoconjugate binding studies to cellular receptors. Regarding to the radiopharmaceuticals studied, cetuximab was conjugated to DTPA chelator at 1:20 molar ratio and to DFO at 1: 5, and these processes were successful and optimized, showing good reproducibility. Immunoconjugates showed preservation of immunoreactivity and high stability when stored at -20 °C for up to 6 months. These immunoconjugates when radiolabeled with 111In and 89Zr have exhibited radiochemical purity above 95%, without any post-labeling purification, and the radioimmunoconjugates have demonstrated stability for a time that allows them to be transported to clinics far from the producer center. 111In-DTPA-cetuximab in vitro analyzes in FaDu-C10 cells (resistant cell line) has presented an inexpressive percentage of binding and internalization of the radioimmunoconjugate, ensuring the resistance model conferred to this cell line. The MicroPET/CT imaging study has revealed a reduction in uptake profile for \"Blocking\" group, with an excess of unlabeling cetuximab, and an intense 89Zr-DFO-cetuximab uptake in squamous cell tumor for \"Non-blocking\" group, that evidenced the in vivo radioimmunoconjugate specificity. The biodistribution studies of the radiopharmaceuticals were well-matched with those described in the literature and they validated the results obtained through the MicroSPECT/CT and MicroPET/ CT images. In addition, these studies in vivo have displayed a substantial tumor uptake, according with the analyzed time points. The radioimmunoconjugate showed high in vivo stability and labeling procedures efficiency, which were confirmed by low bone and non-target tissues uptake. The best post-injection interval for in vivo evaluation is after 5 days of radioimmunoconjugate administration. In conclusion, the radioimmunoconjugates for immuno-SPECT and immuno-PET, 111In-DTPA-cetuximab and 89Zr-DFO-cetuximab, are promising tools for diagnosis and monitoring of specific receptor cancer (EGFR), as well as for stratification of patients to anti-EGFR therapy, and thus encourages the continuity of this project for future clinical trials.