A transformação plastidial oferece uma série de vantagens em relação à transformação nuclear, como: altos níveis de expressão de proteínas, capacidade de expressar múltiplos transgenes em operons e contenção gênica pela ausência de transmissão pelo pólen. Devido ao alto número de cópias do genoma plastidial por cloroplasto e ao alto número de cloroplastos por células vegetais, são necessários ciclos de regeneração sob condições seletivas para obter transformantes homoplásmicos. A análise de homoplasmia é realizada pela metodologia de Southern blot ou pelo teste de herança do transgene pela germinação de sementes em meio seletivo. O Southern blot é trabalhoso, demorado e para maior sensibilidade envolve o uso de radioisótopos, enquanto o teste de germinação é realizado somente após a produção de sementes necessitando de um ciclo de reprodução da planta. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido, sensível e eficaz para determinar o grau de homoplasmia de plantas transplastômicas, baseado na técnica de PCR em tempo real. Folhas de fumo foram transformadas com vetores compostos pelos genes 9 dessaturase (pMR1), 15 dessaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) e 12/3 dessaturase (pMR10), todos contendo o gene de seleção aadA. No total, 44 plantas foram obtidas, sendo 21 plantas positivas para a inserção do transgene. O grau de homoplasmia foi determinado pela proporção entre o número de cópias do transgene e o número de cópias do gene endógeno. Inicialmente, misturas de DNA de plantas transplastômicas homoplásmicas (pMR1 e pMR3) com DNA de planta tipo selvagem foram preparadas para simular diferentes graus de homoplasmia. DNA da planta transplastômica ou do plasmídeo foi diluído em série para construção das curvaspadrão, com a quantidade dos genes sendo estimada por meio da plotagem nessas curvas. Os índices de homoplasmia detectados na PCR em tempo real foram compatíveis com os resultados do teste de germinação com valores abaixo de 1 para plantas heteroplásmicas, 1 para a planta homoplásmica e 0 para as plantas sem a inserção do transgene. Os resultados das análises de amostras coletadas após o primeiro ciclo de regeneração mostraram que 13 das 21 plantas já se apresentavam em estado homoplásmico não sendo necessários mais ciclos de regeneração. A PCR em tempo real mostrou ser um método eficiente para análise do grau de homoplasmia de plantas transplastômicas. / Plastid transformation offers several advantages in relation to nuclear transformation, such as high-level of protein expression, the feasibility of expressing multiple transgenes in operons and gene containment through the lack of pollen transmission. Due to the high copy number of plastidial genome in chloroplasts and the high number of chloroplasts per plant cells, regeneration cycles under selective conditions are necessary to obtain homoplasmic transformants. Homoplasmy analysis is performed by Southern blot methodology or transgene inheritance test through seed germination in selective medium. Southern blot is laborious, time consuming and for more sensitivity it would require the use of radioisotopes, while germination test can be performed only after seed production which require a plant reproduction cycle. The objective of this study was to develop a fast, sensitive and effective method to determine the homoplasmy degree of transplastomic plants, based on real-time PCR. Tobacco leaves were transformed with vectors containing the 9 desaturase (pMR1), 15 desaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) and 12/3 desaturase (pMR10) each one with the aadA selection gene. In total, 44 plants were obtained, of which 21 were positive for the insertion of the transgene. The homoplasmy degree was determined by the proportion between the number of transgene copies and the number of endogenous gene copies. Initially, mixtures of homoplastomic plants DNA (pMR1 and pMR3) with wild-type plant DNA were prepared to simulate different degrees of homoplasmy. Transplastomic plant DNA or plasmid DNA was diluted to construct the standard curves and the gene amount was detected by plotting in this curves. The homoplasmy rate detected in real-time PCR were consistent with the results of germination test with values below 1 for heteroplasmic plants, 1 for homoplasmic plants and 0 for plants without the transgene insertion. The results obtained from the samples collected after the first regeneration cycle showed that 13 of the 21 plants were already in a homoplasmic state and did not require more cycles of regeneration. The real-time PCR proved to be an effective method for analyzing the homoplasmy degree of transplastomic plants.

Os cloroplastos encontrados nas folhas de plantas e algas pertencem a uma classe de organelas subcelulares denominadas de plastídios. Os plastídios possuem seu próprio genoma (plastoma), o qual contêm genes que participam de funções essenciais no metabolismo vegetal, como fotossíntese, síntese de aminoácidos e outras rotas biossintéticas. O plastoma da maioria das plantas superiores tem tamanho entre 120 a 180 kb. Em angiospermas é caracterizado pela presença de duas regiões repetidas invertidas (IRs) separadas por duas regiões de cópia única; uma longa (LSC) e outra curta (SSC). Para o sequenciamento completo da molécula do DNA (cpDNA) de Eucalyptus grandis, foram preparadas bibliotecas que geraram 9.033 seqüências de DNA. A seqüência completa foi determinada e possui o tamanho de 160.292 pb. As regiões IRs apresentam ter 26.400 pb; a SSC, 18.501 pb e; a LSC, 88.991 pb. As regiões codificadoras foram anotadas por análise de similaridade ao plastoma de Eucalyptus globulus. Todas as categorias gênicas presentes neste plastoma foram encontradas no plastoma de E. grandis. Estas duas espécies possuem 99,57% de similaridade na seqüência de nucleotídeos e apresentam total similaridade na organização dos seus genes. A disponibilidade de plastomas completos de diferentes espécies de Eucalyptus, torna possível realizar estudos comparativos para a identificação de polimorfismos espécie-específicos, importantes para serem utilizados como marcadores moleculares no melhoramento genético de Eucalyptus. / The chloroplasts found in plant leaves and algae belong to a class of subcellular organelle called plastids. The plastids has its own genome (plastome) which contain genes that participate in mainly functions on plant metabolism like photosynthesis, amino acids synthesis and other biosynthetic pathways. The plastome of most of higher plants are between 120-180 kb in size. It is characterized in angiosperms by two inverted repeat regions (IRs) separated by two regions of unique single copies; one large (LSC) and another small (SSC). For the complete sequencing of the DNA (cpDNA) molecule of chloroplast from Eucalyptus grandis, libraries were prepareted and generated 9,033 DNA sequences. The complete sequence was determined and it is 160,292 bp in size. The IRs showed to have 26,400 bp; the SSC, 18,502 bp and; the LSC, 88.991 bp in size. The gene coding regions were annotated by similarity analysis against the Eucalyptus globulus plastome. All types of gene categories present in E. globulus were found in E. grandis plastome. These two species show 99.57% of similarity on nucleotide sequence and they both present total similarity in their gene organization. The availability of complete plastomes from different Eucalyptus species make possible to perform comparative studies to identify species-specific polymorphisms, wich are important to be used as molecular markers in Eucalyptus breeding programs.

A transformação plastidial oferece uma série de vantagens em relação à transformação nuclear, como: altos níveis de expressão de proteínas, capacidade de expressar múltiplos transgenes em operons e contenção gênica pela ausência de transmissão pelo pólen. Devido ao alto número de cópias do genoma plastidial por cloroplasto e ao alto número de cloroplastos por células vegetais, são necessários ciclos de regeneração sob condições seletivas para obter transformantes homoplásmicos. A análise de homoplasmia é realizada pela metodologia de Southern blot ou pelo teste de herança do transgene pela germinação de sementes em meio seletivo. O Southern blot é trabalhoso, demorado e para maior sensibilidade envolve o uso de radioisótopos, enquanto o teste de germinação é realizado somente após a produção de sementes necessitando de um ciclo de reprodução da planta. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido, sensível e eficaz para determinar o grau de homoplasmia de plantas transplastômicas, baseado na técnica de PCR em tempo real. Folhas de fumo foram transformadas com vetores compostos pelos genes 9 dessaturase (pMR1), 15 dessaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) e 12/3 dessaturase (pMR10), todos contendo o gene de seleção aadA. No total, 44 plantas foram obtidas, sendo 21 plantas positivas para a inserção do transgene. O grau de homoplasmia foi determinado pela proporção entre o número de cópias do transgene e o número de cópias do gene endógeno. Inicialmente, misturas de DNA de plantas transplastômicas homoplásmicas (pMR1 e pMR3) com DNA de planta tipo selvagem foram preparadas para simular diferentes graus de homoplasmia. DNA da planta transplastômica ou do plasmídeo foi diluído em série para construção das curvaspadrão, com a quantidade dos genes sendo estimada por meio da plotagem nessas curvas. Os índices de homoplasmia detectados na PCR em tempo real foram compatíveis com os resultados do teste de germinação com valores abaixo de 1 para plantas heteroplásmicas, 1 para a planta homoplásmica e 0 para as plantas sem a inserção do transgene. Os resultados das análises de amostras coletadas após o primeiro ciclo de regeneração mostraram que 13 das 21 plantas já se apresentavam em estado homoplásmico não sendo necessários mais ciclos de regeneração. A PCR em tempo real mostrou ser um método eficiente para análise do grau de homoplasmia de plantas transplastômicas. / Plastid transformation offers several advantages in relation to nuclear transformation, such as high-level of protein expression, the feasibility of expressing multiple transgenes in operons and gene containment through the lack of pollen transmission. Due to the high copy number of plastidial genome in chloroplasts and the high number of chloroplasts per plant cells, regeneration cycles under selective conditions are necessary to obtain homoplasmic transformants. Homoplasmy analysis is performed by Southern blot methodology or transgene inheritance test through seed germination in selective medium. Southern blot is laborious, time consuming and for more sensitivity it would require the use of radioisotopes, while germination test can be performed only after seed production which require a plant reproduction cycle. The objective of this study was to develop a fast, sensitive and effective method to determine the homoplasmy degree of transplastomic plants, based on real-time PCR. Tobacco leaves were transformed with vectors containing the 9 desaturase (pMR1), 15 desaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) and 12/3 desaturase (pMR10) each one with the aadA selection gene. In total, 44 plants were obtained, of which 21 were positive for the insertion of the transgene. The homoplasmy degree was determined by the proportion between the number of transgene copies and the number of endogenous gene copies. Initially, mixtures of homoplastomic plants DNA (pMR1 and pMR3) with wild-type plant DNA were prepared to simulate different degrees of homoplasmy. Transplastomic plant DNA or plasmid DNA was diluted to construct the standard curves and the gene amount was detected by plotting in this curves. The homoplasmy rate detected in real-time PCR were consistent with the results of germination test with values below 1 for heteroplasmic plants, 1 for homoplasmic plants and 0 for plants without the transgene insertion. The results obtained from the samples collected after the first regeneration cycle showed that 13 of the 21 plants were already in a homoplasmic state and did not require more cycles of regeneration. The real-time PCR proved to be an effective method for analyzing the homoplasmy degree of transplastomic plants.

Os cloroplastos encontrados nas folhas de plantas e algas pertencem a uma classe de organelas subcelulares denominadas de plastídios. Os plastídios possuem seu próprio genoma (plastoma), o qual contêm genes que participam de funções essenciais no metabolismo vegetal, como fotossíntese, síntese de aminoácidos e outras rotas biossintéticas. O plastoma da maioria das plantas superiores tem tamanho entre 120 a 180 kb. Em angiospermas é caracterizado pela presença de duas regiões repetidas invertidas (IRs) separadas por duas regiões de cópia única; uma longa (LSC) e outra curta (SSC). Para o sequenciamento completo da molécula do DNA (cpDNA) de Eucalyptus grandis, foram preparadas bibliotecas que geraram 9.033 seqüências de DNA. A seqüência completa foi determinada e possui o tamanho de 160.292 pb. As regiões IRs apresentam ter 26.400 pb; a SSC, 18.501 pb e; a LSC, 88.991 pb. As regiões codificadoras foram anotadas por análise de similaridade ao plastoma de Eucalyptus globulus. Todas as categorias gênicas presentes neste plastoma foram encontradas no plastoma de E. grandis. Estas duas espécies possuem 99,57% de similaridade na seqüência de nucleotídeos e apresentam total similaridade na organização dos seus genes. A disponibilidade de plastomas completos de diferentes espécies de Eucalyptus, torna possível realizar estudos comparativos para a identificação de polimorfismos espécie-específicos, importantes para serem utilizados como marcadores moleculares no melhoramento genético de Eucalyptus. / The chloroplasts found in plant leaves and algae belong to a class of subcellular organelle called plastids. The plastids has its own genome (plastome) which contain genes that participate in mainly functions on plant metabolism like photosynthesis, amino acids synthesis and other biosynthetic pathways. The plastome of most of higher plants are between 120-180 kb in size. It is characterized in angiosperms by two inverted repeat regions (IRs) separated by two regions of unique single copies; one large (LSC) and another small (SSC). For the complete sequencing of the DNA (cpDNA) molecule of chloroplast from Eucalyptus grandis, libraries were prepareted and generated 9,033 DNA sequences. The complete sequence was determined and it is 160,292 bp in size. The IRs showed to have 26,400 bp; the SSC, 18,502 bp and; the LSC, 88.991 bp in size. The gene coding regions were annotated by similarity analysis against the Eucalyptus globulus plastome. All types of gene categories present in E. globulus were found in E. grandis plastome. These two species show 99.57% of similarity on nucleotide sequence and they both present total similarity in their gene organization. The availability of complete plastomes from different Eucalyptus species make possible to perform comparative studies to identify species-specific polymorphisms, wich are important to be used as molecular markers in Eucalyptus breeding programs.

O complexo coletor de luz (LHC) do fotossistema II (PSII) é o principal complexo de proteínas associado a pigmentos situado na membrana dos tilacóides de cloroplastos em plantas. O LHCII funciona como uma antena de transferência de energia para a captura e direcionamento da energia luminosa do PSII para o PSI. A ação coordenada dos dois fotossistemas com o direcionamento do fluxo de elétrons gera a quebra da molécula de água, através da membrana do tilacóide, produzindo força assimilatória ATP e NADPH. A energia química produzida na fotossíntese é de suma importância para a assimilação de carbono, biossíntese de aminoácidos e metabólicos secundários. Portanto, este é um importante gene para estudos em biotecnologia. Linhagens transgênicas de tabaco (TR-1 e TR-2) as quais expressam constitutivamente o transgene Lhcb1*2 de ervilha obtidas por Labate e colaboradores (2004) foram utilizadas nesse trabalho. Estas plantas apresentaram diversos efeitos pleiotrópicos relacionados à anatomia, morfologia, bioquímica e fisiologia. Uma proteína pode não atuar isoladamente, mas freqüentemente interagindo com outras proteínas, influenciando diversos processos metabólicos. O perfil de proteômica dessas linhagens transformantes, em relação à planta selvagem (WT) foi investigado. As proteínas totais foram extraídas de folhas de plantas de três meses crescidas em câmaras de crescimento, então separadas por 2D-PAGE. As proteínas diferencialmente expressas foram identificadas por LC-MS/MS. Os resultados mostram que 244 spots apresentaram alterações significativas na expressão nas duas linhagens transgênicas em relação à WT. 122 spots são expressos exclusivamente nas linhagens transformantes, e 24 spots somente na selvagem. Muitas proteínas como ATP synthase e ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase foram mais expressas nas linhagens transgênicas, mas a glutamine synthetase, uma importante proteína na reciclagem de nitrogênio nos cloroplastos, teve sua expressão diminuída. Para analisar as alterações na expressãode genes relacionados ao ritmo circadiano entre outros, como a conformação do PSII, cotilédones de plântulas estioladas foram submetidas à luz e amostras coletadas depois de 0, 3, 6, 12 e 24 horas. O nível de transcritos foram analisados por PCR quantitativo. A diferenciação de plastídio à cloroplasto maduro foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, para se entender as diferenças entre os genótipos em estudo no desenvolvimento vegetal. A expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de ervilha em plantas transgênicas de tabaco acarretou a indução e repressão de várias proteínas e genes em distintos passos de vias metabólicas, estabilizando a homeostase celular, exercendo uma influência significativa no desenvolvimento vegetal e produção de biomassa. / The light harvesting complex (LHC) of photosystem II (PSII) is the major ensemble of pigmet-biding proteins situated in the thylakoid membranes of the chloroplast in plants. The LHCbII functions as an energy-transferring antenna for capturing and delivering light energy to the photosystems PSII and PSI. The coordinated actions of the two photosystems in turn drive the flow of electrons, generated by the splitting of water, through the thylakoid membranes to produce the assimilatory force ATP and NADPH. The chemical energy produced by photosynthesis is very important for the assimilation of carbon, amino acids biosynthesis, and secundary metabolism. Therefore it is an important gene for biotechnological studies. Transgenic tobacco lines (TR-1 and TR-2) which express the pea Lhcb1*2 transgene constitutively obtained by Labate et al. (2004) were used in this work. These plants presented pleiotropic effects related to anatomy, morphology, biochemistry and physiology. As a protein may not act by itself, but it is, frequently interacting with other proteins, influencing a lot of metabolic processes. The proteomic profile of these transgenic lines, in relation to the wild type (WT), was investigated. The total proteins extracted from leaves of three-month old plants grown in growth chambers were separated by 2DPAGE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. The results showed that 225 spots displayed significant changes in the expression of the two transgenic lines in relation to the WT. 122 spots were exclusively expressed in the transgenic lines, and 24 only in the wild type. Many proteins as ATP synthase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase are overexpressed in the transgenic lines, but the glutamine synthetase, an important protein tor nitrogen recycling in the chloroplasts, showed a reducted level of expression. In order to analyse the alterations of the expression of genes related to the circadian rhythm among others, involved in the conformation of the PSII, cotyledons from etiolated seedlings were thenexposed to light and samples collected after 0, 3, 6, 12 and 24 hours. The level of transcripts were analysed by RT/RT-PCR. The PSII conformation were analysed by transmition electron microscopy, with the aim of verifying the evolution of plastids into the chloroplasts which could be leading to changes in plant development. The overexpression of the pea Lhcb1*2 gene in transgenic tobacco plants, lead to the induction and suppression of several proteins and genes in key metabolic pathways, as a way to establish a cellular homeostasis, exerting a significant influence on plant development and biomass production.

A maioria das proteínas organelares são codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas especificamente ao seu destino final. O direcionamento aos diferentes subcompartimentos subcelulares é feito por uma complexa e ampla maquinaria que envolve sequências de direcionamento, proteínas citossólicas e receptores organelares específicos. Entretanto, relativamente pouco se conhece sobre o processo na qual uma proteína recém sintetizada é transportada ao seu destino final. Parte significativa das proteínas destinadas às organelas possui a informação necessária ao seu transporte localizada na extremidade N-terminal. Vários estudos têm buscado caracterizar as etapas que envolvem a localização de uma proteína, desde os estágios iniciais após a sua síntese até os fatores que regulam o seu correto endereçamento. Modificações pós-traducionais, regiões 5-UTR, região C-terminal, transporte por vias alternativas e interações proteína-proteína podem agir na localização subcelular de proteínas. O estudo de redes biomoleculares se tornou um dos focos de estudo da biologia de sistemas e demonstra um enorme potencial na descoberta de diversos processos biológicos, como as interações proteína-proteína. As proteínas que possuem duplo direcionamento (DD) em Arabidopsis thaliana foram analisadas em redes de interação proteína-proteína (PPI) e proteínas que interagem com proteínas de DD foram escolhidas quanto a função e localização para a verificação de um eventual papel dessas proteínas na localização subcelular de outras proteínas. Para tanto, foram realizadas varreduras em ensaios de duplo-híbrido em levedura para os genes de GRF9 (14-3-3) e ATH7 (tiorredoxina tipo h). Os resultados para GRF9 incluem as proteínas peroxidase PRXR1 e dihidrolipoamida acetiltransferase. Já os resultados para ATH7 mostram a interação com glutamina sintetase (AT5G35630.3). A combinação dos estudos in silico com a varredura via duplo-híbrido de levedura abrem novas perspectivas no entendimento do controle da localização subcelular de proteínas. / Most organellar proteins are nuclear encoded, synthesized in the cytosol and then targeted to their destination. Specific subcellular targeting is conducted by a complex machinery for the specific localization of the proteins, which includes targeting sequences, cytosolic proteins and specific organelar receptors. However, little is known about the process that happens from the synthesis of a protein and the transport to its final destination. Most organellar proteins contain the information for their localization in the N-terminal sequence. Many studies have searched to characterize the steps involved in protein targeting, from the early stages after its synthesis to the cytosolic factors regulating its correct localization. Post-translational modifications, 5-UTR regions, the C-terminal extension on the protein, alternative transport pathways and proteinprotein interactions may influence the subcellular location of some proteins. The use of biomolecular netwoks has become one of the main focus of systems biology studies and possess a major potential in the discovery of several biological processes, such as protein-protein interactions (PPI). Dual-targeted (DT) proteins in Arabidopsis thaliana were analyzed through a PPI network, and the proteins displaying interactions with DT proteins were selected by their funtion and location. The selected proteins were analyzed for their eventual role in the subcellular targeting of other proteins. Screenings in yeast two-hibrid assays were performed for the genes GRF9 (14-3-3) and ATH7 (h-type thioredoxin). The results for GRF9 include a peroxidase (PRXR1) and dihydrolipamide acetyltransferase. The results for ATH7 include glutamine synthetase (AT5G35630.3). Combination of in silico analysis with yeast two-hibrid screenings provide new perspectives for understanding the control of subcellular localization.

O complexo FtsH em Arabidopsis, presente nos tilacóides, é formado pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Os tipos A e B apresentam grande identidade em seus domínios maduros, porém nenhuma similaridade é observada na região amino-terminal do peptídeo de trânsito. Em um experimento de importação em cloroplastos isolados, FtsH2 e FtsH5 foram importadas e subsequentemente integradas aos tilacóides através de um mecanismo de processamento em duas etapas que resultou em um domínio lumenal amino-proximal, uma única âncora transmembrânica e um domínio carboxi-proximal estromal. A integração da FtsH2 em tilacóides isolados foi totalmente dependente do gradiente de prótons, enquanto que a integração da FtsH5 foi dependente de NTPs, sugerindo que a inserção na membrana ocorre pelas vias TAT e Sec, respectivamente. Tal observação foi corroborada por experimentos de competição in-organello e inibição por anticorpos específicos. Os domínios amino-proximais até as âncoras transmembrânicas foram suficientes para a correta integração aos tilacóides. A região madura da FtsH2 apresentou incompatibilidade com a maquinaria Sec, como demonstrado pela troca de peptídeos de trânsito. A incompatibilidade não parece ser determinada por qualquer elemento específico da FtsH2, uma vez que nenhum domínio isolado apresentou incompatibilidade com a via Sec de transporte. Tal fato sugere uma incompatibilidade estrutural que requer a FtsH2 intacta. A descoberta que as subunidades FtsH do tipo A e B, que apresentam grande identidade e usam diferentes vias de integração para formar o mesmo complexo multimérico é uma observação nova e interessante para o estudo da biogênese de proteínas de membranas. O mecanismo de regulação que governa a atividade do complexo FtsH em Arabidopsis é ainda desconhecido, entretanto é proposta a existência de fatores adicionais. Dessa forma, a proteína plastidial FtsH de Arabidopsis foi usada como isca em um rastreamento por duplohíbrido de levedura. O rastreamento resultou em 48 colônias que ativaram os genes repórteres histidina e adenina. Entre todos os cDNAs sequenciados, foi encontrado um candidato em potencial denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein). Experimentos GST Pull-Down também indicam uma interação entre FtsH5 e FIP. O precursor FIP radioativo foi incubado com cloroplastos de ervilha. Após a incubação, os cloroplastos foram lisados e separados em estroma e tilacóides. FIP permaneceu associada exclusivamente à fração membranosa dos tilacóides. A inserção na membrana foi verificada através da resistência ao tratamento com álcali e o tratamento dos tilacóides com protease resultou em um fragmento protegido, característico de proteínas inseridas na membrana. A construção FtsH5::GFP transformada em Nicotiana tabacum resultou no direcionamento do gene quimérico aos cloroplastos. Dessa forma, assim como FtsH5, FIP é uma proteína plastidial que está localizada na membrana dos tilacóides. Géis nativos utilizando FIP radioativa mostram que ela está associada a um complexo de aproximadamente 450 kDa, que é o tamanho esperado para o complexo tilacoidal FtsH em Arabidopsis. Como as proteínas FtsH apresentam tanto o domínio ATPase quanto protease, acreditamos que FIP pode de alguma forma modular a atividade do complexo FtsH nos tilacóides. / The Arabidopsis thylakoid FtsH protease complex is composed of FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. Type A and type B subunits display a high degree of sequence identity throughout their mature domains, but no similarity in their amino-terminal targeting peptide regions. In chloroplast import assays, FtsH2 and FtsH5 were imported and subsequently integrated into thylakoids by a two-step processing mechanism that resulted in an amino-proximal lumenal domain, a single transmembrane anchor, and a carboxyl proximal stromal domain. FtsH2 integration into washed thylakoids was entirely dependent on the proton gradient, whereas FtsH5 integration was dependent on NTPs, suggesting their integration by Tat and Sec pathways, respectively. This finding was corroborated by in organello competition and by antibody inhibition experiments. The amino proximal domains through the transmembrane anchors were sufficient for proper integration. The mature FtsH2 protein was found to be incompatible with the Sec machinery as determined with targeting peptide-swapping experiments. Incompatibility does not appear to be determined by any specific element in the FtsH2 domain as no single domain was incompatible with Sec transport. This suggests an incompatible structure that requires the intact FtsH2. That the highly homologous type A and type B subunits of the same multimeric complex use different integration pathways is a striking example of the notion that membrane insertion pathways have evolved to accommodate structural features of their respective substrates. The regulation mechanism which governs the Arabidopsis FtsH complexs activity is still unknown, but it is proposed the presence of additional factors. For this reason, the plastidial Arabidopsis FtsH5 was used as bait in a yeast two hybrid screening. The screening resulted in 48 colonies that activated the histidine and adenine reporter genes. Among all the sequenced cDNAs we have found a potential candidate named FIP (FtsH5 Interacting Protein). GST Pull-Down experiments also indicate an interaction between FtsH5 and FIP. Radiolabeled FIP was incubated with intact isolated chloroplasts. After incubation, intact chloroplasts were lysated and separated into stroma and thylakoids. FIP remained associated exclusively with the thylakoid membrane fraction. The insertion into membrane was verified throughout resistance to alkali treatment and the thylakoid protease treated fraction resulted in a protected fragment, characteristic of membrane-inserted proteins. Agroinfiltrated Nicotiana tabacum leaves with a FtsH5::GFP construct resulted that the chimeric gene was targeted to chloroplasts. Thus, as FtsH5, FIP is a plastidial protein which is located into thylakoid membrane. Blue native gels using radiolabeled FIP protein show that it runs associated with a complex around 450 kDa, which is the expected size for the Arabidopsis FtsH thylakoidal complex. As FtsH proteins present both ATPase and protease domains, we believe that FIP can somehow modulates the activity of the thylakoidal FtsH complex.

Orientadores: Flavio Antonio Maës dos Santos, Maria Imaculada Zucchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:19:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silvestrini_Milene_D.pdf: 3891912 bytes, checksum: 6bb6bd65f788f261b8387e6c9daf17f8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A estrutura genética espacial de populações de plantas pode variar ao longo dos estádios ontogenéticos, através das gerações e entre diferentes condições ambientais. Estas mudanças são direcionadas por fatores ecológicos e evolutivos. As espécies pioneiras apresentam histórias de vida e estruturas populacionais características que são afetadas principalmente pelas mudanças ambientais geradas por distúrbios naturais ou antrópicos. O objetivo deste trabalho foi investigar como as características do ciclo de vida, os processos ecológicos e fatores genéticos associados aos distúrbios afetam a diversidade e estrutura genética de populações de uma espécie arbórea pioneira. Nós estudamos Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae), uma espécie arbórea pioneira abundante em clareiras e em áreas secundárias da Floresta Estacional Semidecidual, em duas áreas com níveis contrastantes de distúrbios antrópicos: uma floresta primária e uma floresta secundária em estádio inicial de sucessão. A fim de abordar a principal questão deste estudo, nós avaliamos o padrão de distribuição da espécie sob as diferentes condições ambientais geradas por distúrbios naturais e antrópicos (Capítulo I); testamos e caracterizamos iniciadores universais cloroplastidiais (cpSSR) para C. floribundus (Capítulo II); desenvolvemos e caracterizamos marcadores microssatélites nucleares (SSR) para C. floribundus bem como examinamos algumas características citogenéticas da espécie com o objetivo de testar a ocorrência de poliploidia e avaliar sua implicação para o uso dos marcadores SSR (Capítulo III); avaliamos a diversidade e estrutura genética de C. floribundus entre duas classes de tamanho e entre populações em uma floresta primária e uma floresta secundária em estádio inicial de sucessão (Capítulo IV). C. floribundus foi frequente e igualmente distribuído em clareiras de todos os tamanhos na floresta primária, mas sua estrutura populacional variou entre áreas com níveis contrastantes de distúrbio antrópico. Seis locos cpSSR foram otimizados e caracterizados em C. floribundus. O estudo citogenético permitiu a caracterização mais precisa dos locos SSR, bem como forneceu novos dados sobre a origem e a evolução da espécie. O número de bivalentes observados na meiose, n = 56 (2n = 8x = 112), mostrou a ocorrência de poliploidia em todas as populações estudadas. Altos níveis de diversidade genética foram encontrados para C. floribundus. A dispersão de sementes e as colonizações (e extinções) foram determinantes para a estrutura genética em fina escala encontrada nas populações de C. floribundus em ambos os tipos de florestas. Além disso, os efeitos destes processos associados aos distúrbios antrópicos parecem aumentar fortemente a diferenciação genética entre as populações na floresta em estádio inicial de sucessão. As análises de marcadores moleculares nucleares e cloroplastidias sugeriram que o fluxo gênico por pólen é responsável por manter a diversidade genética dentro das populações de C. floribundus tanto na floresta primária quanto na floresta secundária em estádio inicial de sucessão. Nesta última, o fluxo gênico por sementes parece ser igualmente importante. Os resultados obtidos mostraram que a dinâmica de clareiras, o processo de colonização e a dispersão de pólen e sementes afetam a diversidade e estrutura genética da espécie arbórea pioneira, aumentando-os ou diminuindo-os conforme o número de colonizadores, número de populações-fonte, as taxas de fluxo gênico e o nível de perturbação antrópica da área / Abstract: The spatial genetic structure of plant populations may vary across life stages, across generations and among different environmental conditions. These changes are driven by evolutionary and ecological forces. Pioneer tree species exhibit particular life histories and population structures that are mainly affected by environmental changes generated by natural or human disturbances. Our aim was to investigate how the life-history traits, ecological processes, and the genetic factors associated to natural and human disturbances can affect the genetic diversity and structure of populations of a pioneer tree species. We studied Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae), a pioneer tree species abundant in gaps and secondary areas of the semi-deciduous tropical forest, in two areas with contrasting levels of human disturbance: a primary forest and an early successional forest. In order to address the main question of this study, we examined the pattern of distribution of the species under the different environmental conditions generated by natural and human disturbances (Chapter I); tested and characterized universal chloroplast microsatellite (cpSSR) primers for C. floribundus (Chapter II); developed and characterized nuclear microsatellite (SSR) markers for C. floribundus as well as examined some cytogenetic traits of the species in order to test for polyploidy and to evaluate its implications for the appropriate use of the SSR markers (Chapter III); and evaluated the genetic diversity and structure of C. floribundus between two size classes and among populations in the primary forest and in the early successional forest (Chapter IV). C. floribundus was widespread and equally distributed along the gap size range in the primary forest, but its population structure varied between areas with contrasting levels of human disturbance. Six universal cpSSR loci were optimized and characterized for C. floribundus. The cytogenetic study allowed the accurate characterization of SSR loci as well as provided new data on the origin and evolution of the species. The number of bivalents observed in meiosis n=56 (2n=8x=112) showed the occurrence of polyploidy in all populations studied. High genetic diversity levels were found for C. floribundus. Seed dispersal and colonizations (and extinctions) were determinants of the fine-scale genetic structure of C. floribundus in both forest types. Also, their effects associated to the human disturbances seem to strongly increase the genetic differentiation among populations in the early successional forest. Analysis of nuclear and chloroplast markers suggested that gene flow by pollen is responsible for maintaining the genetic diversity within populations of C. floribundus in both primary and early successional forests. In the latter, gene flow by seeds seem to be equally important. The results showed that gap dynamics, colonization process, and pollen and seed dispersal affect the genetic diversity and structure of the pioneer tree species by increasing or decreasing them depending mainly on the number of colonizers, the number of source populations, the gene flow rates, and the level of human disturbance of the area / Doutorado / Ecologia / Doutora em Ecologia

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The sustainable development of northern agroecosystems requires, among other factors, the use of species adapted to region the edafoclimtic conditions. Plants able to support water deficits are more indicated, considering to no regular distribution of pluviometric precipitation the high evapotranspiration are characteristic northest region of Brazil. The present work was carried out to determine the ecofisiologic and biochemistry behavoir of three cultivars of basil, Ocimum basilicum L. (Maria Bonita, Mara and Genovese) cultivated under water stress. The ecofisiologics variables were: hidric potential of leaves, photossintesis, transpiration, stomatal conductance; the biochemitry variables were: soluble carbohydrates and proteins, totals cloroplasts, tenor of essential oil and percentage of linalool. The varibles were analyzed in plants with four months of aged, cultivated in 24 vases of 17L, in greenhouse, having two treatments: T0 (control) and T1 (experimental group), with four repetitions. The variables were evaluated at 08:30 to 10:30 hours every two days, during 15 days in October 2005. In base of results it was identifyed that basil presents mechanisms of adaptation under water stress minimizing the water lose. Mara’and Maria Bonita’cultivars presented more adaptaded under water stress in comparison with ‘Genovese’cultivar. In relation to the essential linalool content the three cultivars kept their yield even under water stress. It was observed the geraniol presence in Maria Bonita cultivar. / O desenvolvimento sustentável dos agroecossistemas nordestinos requer, dentre outros fatores, o uso de espécies adaptadas às condições edafomorfoclimáticas da região. Plantas capazes de suportar déficits hídricos são mais indicadas, uma vez que a distribuição irregular da precipitação pluviométrica, aliada a alta evapotranspiração são características do Nordeste brasileiro. O presente trabalho objetiva determinar o comportamento ecofisiológico e análise bioquímica de três cultivares de manjericão, Ocimum basilicum L.(‘Maria Bonita’, ‘Mara’ e ‘Genovese’) quando cultivadas sob estresse hídrico. As variáveis ecofisiológicas foram: potencial hídrico foliar, fotossíntese, transpiração, condutância estomática; e as bioquímicas foram: carboidratos solúveis, proteínas solúveis, cloroplastos totais e teor de óleo essencial e de linalol no óleo essencial. As variáveis ecofisiológicas e bioquímicas foram analisadas quando as plantas apresentavam 4 meses de idade. Cultivadas em 24 vasos de 17 L, em estufa agrícola, sendo 2 tratamentos: T0 (testemunha) e T1 (grupo experimental), com 4 repetições. As variáveis ecofisiológicas foram avaliadas entre 08:30 a 10:30 horas, em dias alternados, durante 15 do mês de outubro de 2005. Com base nos resultados obtidos, constatou-se que o manjericão apresenta mecanismos de adaptação, que sob condição de estresse hídrico, diminuem as perdas de água. As cultivares ‘Mara’ e ‘Maria Bonita’ apresentaram adaptadas às condições de estresse hídrico quando comparadas com a cultivar ‘Genovese’. Em relação ao teor linalol as três cultivares mantiveram as suas produtividades mesmo sob condição de estresse. Observou-se também, a presença de geraniol no óleo essencial da cultivar Maria Bonita.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANGEL jose.pdf: 1885350 bytes, checksum: 8203e3220392d36d98c1cc30c0439590 (MD5) Previous issue date: 2005-08-30 / The araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) is a tropical fruit tree species from the Cerrado (Brazilian Savannah) with high economic potential. The strong degradation of the Cerrado, allied to the predatory extractivism that threatens the species, points out to the necessity of development of research to support future conservation programs. With the aim to furnish information about the genetic status of this species and to guide future conservation strategies, 82 individuals from 11 natural populations were submitted to genetic analysis. The coalescent based analysis of the polymorphism present in the trn-L cpDNA allowed the detection of high levels of genetic diversity in the species. In spite of the high level of genetic similarity among different populations the results produced suggested that, , there is an incipient, but statistically significant, increasing differentiation process taking place due to current status of geographical isolation and genetic drift. The genetic differentiation coefficient estimated was equal to 7.3%. The spatial genetic divergence analyses suggested that the genetic distances are not associated to geographical distances between populations, evidencing the absence of current gene flow between adjacent populations. The coalescent based approach allowed the identification of different evolutionary scenes to the investigated populations. Among sampled populations cases from well conserved status to dangerous low levels of genetic diversity were detected. Results obtained by the use of coalescent models to infer the divergence time between populations suggested that natural populations of A. crassiflora were, until recently, part of a great regional continuum. These findings suggest that the low levels of genetic diversity among different populations must be due to the small time since isolation. / O araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) é uma espécie de árvore frutífera nativa do bioma Cerrado com elevado potencial de utilização econômica. A forte degradação desse bioma, aliada ao extrativismo predatório a que a espécie vem sendo submetida, justifica a necessidade de desenvolvimento de pesquisas que subsidiem a sua conservação. Objetivando obter informações que indiquem o status genético dessa espécie e orientem futuras estratégias de conservação, 82 indivíduos provenientes de 11 populações naturais foram analisados geneticamente. A análise do polimorfismo presente em seqüências da região trn-L do genoma cloroplastidial e posterior aplicação dos modelos associados à teoria da coalescência permitiram a detecção de elevados níveis de diversidade genética para a espécie. Os resultados obtidos indicam que, embora as populações amostradas tenham demonstrando elevada similaridade genética entre si, há uma incipiente, mas significativa, diferenciação genética entre elas, que tende a aumentar progressivamente devido ao efeito do isolamento geográfico e à força da deriva. O coeficiente de diferenciação genética entre as populações analisadas foi de 7,3%. A análise de divergência entre as populações amostradas não evidenciou a existência de associação significativa dos padrões de diferenciação genética com a distância geográfica entre elas. As informações obtidas pela análise baseada no modelo de coalescência permitiram a identificação de diferentes cenários evolutivos para as populações estudadas. Dentre as populações amostradas, foram identificadas desde populações em bom estado de conservação até populações com baixíssimos níveis de diversidade genética. Os resultados obtidos pela utilização do modelo coalescente para se inferir o tempo de divergência entre as populações sugeriram que as populações se A. crassiflora até há muito pouco tempo se constituíam em um grande contínuo populacional, sendo a baixa diversidade encontrada entre as populações atribuída ao pequeno tempo de divergência entre elas.