Denna uppsats syftar till att undersöka behovet av indirekt eld och Close Air Support i militäraoperationer i bergsterräng och belysa vilka aspekter som påverkar nyttjandet av försvarsmaktensenheter och verkanssystem vid insatser i bergsmiljö. För att svara på syftet med uppsatsen har följande studiefråga ställts: Hur använde USA den grundläggande förmågan verkan för att påverka motståndaren under Operation Anaconda? Fallstudie och textanalys har använts som vetenskaplig metod och teknik för denna uppsats. Inledningsvis studerades texter om operation Anaconda och hur operationen genomfördes. Därefter studerades svenska doktriner och reglementen avseende teorier om grundläggande förmågor och hur verkan uppnås i striden. Slutligen analyserades hur USA använde den grundläggande förmåganverkan under operation Anaconda med tyngdpunkt på indirekt eld och close air support. De viktigaste slutsatserna är att striden genomförs i tre dimensioner med indirekt eld, direktriktadeld och minor. Alla är väsentliga för att effekt med verkan skall uppnås i striden. Försvinner en dimension bör de andra dimensionerna öka med fler element. / This paper aims to examine the need for indirect fire and Close Air Support of military operations in mountainous terrain, highlighting the aspects that affect the use of Swedish armed forces units and their technical systems in the mountain environment. To answer the purpose of this paper the following question was asked: How did U.S. forces use the basic capacity of effect to the opponent during Operation Anaconda? A case study and text analysis has been used as a scientific method and technique for this thesis. Initially texts about Operation Anaconda were studied on how the operation was carried out. Then Swedish doctrines and regulations relating to theories of basic abilities and the effect achieved in the battle were studied. Finally, the writer analyzed how the U.S. used the basic capacity of effect during Operation Anaconda, with an emphasis on indirect fire and close air support. The main conclusions are that the battle is carried out in three dimensions with indirect fire, direct fire and mines. All are essential to achieved effect in the battle. If one dimension diminishes the other dimensions should increase by more elements.

Computer Algebra Systems (CAS) have been changing the mathematics instruction requirements for many years. Since the tendency of using CAS in mathematics instruction has been rising for decades and reports have often been positive, the implementation of notebook classes seems to be the consequent next step of mathematics instruction supported by computers. Experiences that have been made with the use of CAS in PC-rooms can be transformed directly into the classroom. Hence the use of CAS is no longer limited to certain rooms. The permanent availability of the notebook with installed CAS offers the chance to realize these concepts that have already been approved with the use of CAS so far. The following speech shall show what these concepts could look like and that the use of notebooks is not only the further development of teaching in PC-classes. Examples from personal experience in teaching will especially show meanders and thought-provoking impulses in order to support teachers finding their way into teaching mathematics instruction in notebook classes successfully. Please allow me to point out two things in the beginning: (1) Yes, I am a vehement supporter of the use of notebooks (and the use of CAS in particular) in mathematics instruction. (2) No, I do not believe that teachers who have chosen another path (or at least partly) are teaching badly.

<p><p>This thesis describes, analyses and compares changes in the practice of human resource management (HRM), the roles of human resource departments (HRD) and management models in companies in Belgium, France (partially) and Chile by highlighting the similarities and differences. This is therefore an international comparative study.<p><p><p>The study is carried out using a contextualist analytical approach.<p><p><p>It answers the question: <b>what are the changes in HRM practice, the roles of HRD and the management models in social organisations in different contexts?</b><p><p><p>It uses theoretical models (“typical ideals”) to analyse reality, while drawing from writers such as Mintzberg, Pichault and Nizet, Crozier, Crouch, Ulrich, Pettigrew. With regard to management, the study resorts to classical, instrumental and political models. As regards human resource management (HRM), it is based on objective, conventionalist and individualised models. In the human resource department (HRD), the models are those of administrative officer, operational expert and strategic partner.<p><p><p>The changes do not only result from a decision-making process dictated mechanically by contextual factors but more particularly from complex interaction and the balance of power among the actors concerned who use the contextual elements to advance their own interests.<p><p><p>Amongst the most relevant developments which bear <b>similar</b> characteristics, one can cite:<p><p><p>1.- <b>a significant increase in the use of management methods specific to the instrumental or “Californian” model, </b><p><p><p>2.- <b>more extensive use of individual competencies in HRM practices</b>, and<p><p><p>3.- <b>a significant reduction in the size of the HRD and, notably, in the profile of administrative officer of the HRD. </b><p><p><p>As regards the <b>differences</b> found in the various contexts, one can highlight the fact that:<p><p><p>1.- <b>In the Belgian and French models, the dominant managerial model remains political management.</b> On the other hand, <b>in the Chilean model, the Californian management model has become clearly dominant. </b><p><p><p>2.- <b>In Belgium and France, the dominant HRM practices are those of the conventionalist model. On the other hand, in Chile, the dominant HRM practices are those of the individualised model. </b><p><p><p>3.- The evolution of the roles of HRD, <b>in the Belgian model, has been practically non-existent or appeared later since the dominant role has remained that of the administrative officer (AO). On the other hand, in the Chilean model, the dominant role has become that of operational expert (OE). </b> The role of strategic partner (SP) which was so recommended and desired by managers has been long in developing.<p><p><p>The professional relations model and the political system constitute one of the most important factors which explains the differences noted. In Belgium, the neo-corporate and social-democrat model of professional relations at the national level (with a strong trade unionist movement) functions as a socio-economic regulatory mechanism reflecting the forces and the agreements between social partners. In Chile, there exists neither social dialogue nor equivalent institutionalisation at the national level; what prevails here is the confrontational Latin model (with a weak trade unionist movement).<p><p><p>Similarly, in Belgium social legislation is more comprehensive, regulating the market more and protecting people’s interests. Furthermore, it offers greater social security coverage via, in addition, vast public expenditure by the State. In Chile on the other hand, social legislation is more incomplete and more flexible, favouring rather discretionary decisions by managers and allowing the interplay of market forces to regulate the labour market. The right to strike, the allocation of unemployment benefits, the procedures for hiring and firing, etc. testify to these differences.<p><p><p>The characteristics of the “hybrid” Belgo-Latin culture based on the traditional negotiation model increasingly influence, for example, the development of a political management model and conventionalist HRM practices, team work or coaching, etc. On the other hand, the characteristics of Chilean Latin culture, where authoritarianism and paternalism are still very present, stimulate a more classical management model and objective HRM practices.<p><p><p>The differences between the developments are evident. The social aspects (social security, education, workers’ rights, etc.) are better guaranteed in the Belgian model and the productivist logic stronger and damaging in the Chilean model. As long as the actors involved remain as they are, with their ideological, political and cultural particularities and their specific strengths, these models will remain different.<p><p><p><p><p>Cette thèse décrit, analyse et compare les changements des pratiques de la gestion des ressources humaines (GRH), les rôles des directions des ressources humaines (DRH) et les modèles de management, dans des entreprises situées en Belgique, en France (partiellement) et au Chili, en relevant les similitudes et les différences. Il s’agit donc d’une recherche internationale comparative.<p><p><p>La recherche s’inscrit dans une approche d’analyse contextualiste.<p><p><p>Elle répond à la question :<b>quels sont les changements des pratiques de GRH, des rôles des DRH et des modèles de management dans des organisations sociales situées dans des contextes différents ?</b><p>Elle utilise des modèles théoriques (des “ideaux types”) pour analyser la réalité, en s’inspirant des auteurs tels que Mintzberg, Pichault et Nizet, Crozier, Crouch, Ulrich, Pettigrew. Au niveau du management, l’étude a recourt aux modèles: classique, instrumental et politique. Au niveau de la gestion des ressources humaines (GRH), elle se base sur les modèles: objectivant, conventionnaliste et individualisant. Tandis qu’au niveau de la direction des ressources humaines (DRH), les modèles sont ceux d’agent administratif, d’expert opérationnel et de partenaire stratégique.<p><p><p>On constate que les changements ne résultent pas seulement d’un processus décisionnel dicté mécaniquement par les éléments du contexte mais surtout d’un jeu complexe d’interactions, d’un jeu de pouvoir des acteurs concernés, qui mobilisent les éléments du contexte pour faire prévaloir leurs intérêts.<p><p><p>Parmi les évolutions <b>similaires</b> les plus relevantes, on peut citer:<p><p><p>1.- <b>l’accroissement important de l’usage des méthodes de management propres au modèle instrumental ou « californien » ;</b><p><p><p>2.- <b>l’utilisation plus extensive des pratiques de GRH individualisantes</b> et, <p><p><p>3.- <b>la diminution importante de la taille de la DRH et, notamment, du profil d’agent administratif de la DRH. </b><p><p><p>Quant aux <b>différences</b> retrouvées dans ces contextes différents, on peut relever :<p><p><p>1.- <b>Dans les cas belge et français le modèle managérial dominant reste le management politique. </b> Par contre, <b>dans le cas chilien, le modèle de management « californien » est devenu clairement dominant. </b><p><p><p> 2.- <b>Les pratiques dominantes de GRH, en Belgique et en France, restent celles du modèle conventionnaliste. Par contre, au Chili, les pratiques dominantes de GRH sont celles du modèle individualisant. </b><p><p><p>3.- L’évolution des rôles de la DRH, <b>dans le cas belge, a été pratiquement nulle ou plus tardive puisque le rôle dominant est resté d’agent administratif (AA). </b> Par contre, <b>dans le cas chilien, le rôle dominant est devenu celui d’expert opérationnel (EO). </b> Le rôle du partenaire stratégique (PS), tant prôné et souhaité par les managers, tarde lourdement à se développer.<p><p><p>Le modèle de relations professionnelles et le système politique, constituent un des facteurs parmi les plus importants qui expliquent les différences constatées. En Belgique, le modèle de relations professionnelles néo-corporatiste et social-démocrate au niveau national (avec un syndicalisme fort) fonctionne comme un mécanisme de régulation socio-économique reflétant les forces et les accords entre les partenaires sociaux. Tandis qu’au Chili, il n’existe ni de concertation sociale ni d’institutionnalisation équivalente au niveau national ;il prévaut ici le modèle confrontationnel et latin (avec un syndicalisme faible).<p><p><p>De même, tandis qu’en Belgique il existe une législation sociale plus complète régulant davantage le marché et protégeant les intérêts des personnes, en offrant une sécurité sociale plus large avec, en plus, une forte participation de l’Etat dans les dépenses publiques, au Chili la une législation sociale est plus incomplète et plus souple, favorisant davantage les décisions discrétionnaires des managers amenant principalement une régulation par le libre jeu du marché du travail. Le droit de grève, l’assignation de chômage, les procédures de licenciements ou d’embauche, etc. témoignent de ces différences.<p><p><p>Les traits de la culture latine « hybride » belge, traditionnellement négociatrice, influencent davantage, par exemple, le développement d’un modèle de management politique et des pratiques de GRH conventionnalistes, un travail en équipe ou le coaching, etc. Par contre, les traits de la culture latine chilienne, où l’autoritarisme et le paternalisme sont encore forts présents, stimulent un modèle de management plutôt classique et des pratiques de GRH objectivantes.<p><p><p>La différence des évolutions est évidente. Les aspects sociaux (sécurité sociale, éducation, droits des travailleurs, etc.) sont mieux garantis dans le cas belge et la logique productiviste est plus forte et nuisible dans le cas chilien. Tant que les acteurs indiqués demeurent, avec leurs particularités idéologiques, politiques, culturelles et leurs forces spécifiques, ces modèles resteront différents. <p><p> / Doctorat en sciences politiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en sciences psychologiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes CRISPR-Cas confèrent aux bactéries une immunité adaptative contre les éléments génétiques mobiles jouant ainsi un rôle important dans l’évolution bactérienne. Cependant, moins de la moitié des génomes bactériens encodent des systèmes CRISPR-Cas ; cela, malgré la protection qu’ils confèrent et leur haut taux de transfert horizontal. Des hypothèses telles que le coût des phénomènes d’auto-immunité ou de posséder des défenses adaptatives plutôt qu’innées ont été mises en avant pour expliquer ce paradoxe. Je propose une nouvelle hypothèse complémentaire : le contexte génétique jouerait un rôle important dans la fixation d’un système CRISPR-Cas après son transfert. Plus précisément, j’ai étudié comment les interactions entre les systèmes de réparation de l’ADN et les CRISPR-Cas influencent la distribution de ces derniers. Pour cela, j’ai d’abord examiné finement la distribution des systèmes CRISPR-Cas dans les génomes bactériens. J’ai ensuite analysé les co-occurences des systèmes de réparation de l’ADN et des CRISPR-Cas et démontré l’existence d’associations positives et négatives entre eux. Enfin, je me suis concentrée sur une des associations négatives découvertes pour valider mes prédictions expérimentalement et comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents. Mes travaux permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre systèmes de réparation de l’ADN et CRISPR-Cas et démontrent la nécessite d’accommodation des CRISPR-Cas à un contexte génétique pour être sélectionnés et maintenus dans les génomes bactériens. / CRISPR-Cas systems confer bacteria and archea an adaptative immunity against phages and other invading genetic elements playing an important role in bacterial evolution. Only 47% of bacterial genomes harbor a CRISPR-Cas system despite their high rate of horizontal transfer. Hypothesis such as the cost of autoimmu- nity or the trade off between a constitutive or an inducible defense system have been put forward to explain this paradox. I propose that the genetic background plays an important role in the process of maintaining a CRISPR-Cas system af- ter its transfer. More precisely I hypothesized that CRISPR-Cas systems interact with DNA repair pathways. To test this idea, we detected DNA repair pathways and CRISPR-Cas systems in bacterial genomes and studied their co-occurences. We report both positive and negative associations that we interpret as poten- tial antagonistic or synergistic interactions. We then focused on one interaction to validate our result experimentally and explored molecular mechanisms behind those interactions. My findings give insights on the complex interactions between CRISPR-Cas systems and DNA repair mechanisms in bacteria and provide a first example on the necessity of accommodation of CRISPR-Cas systems to a specific genetic context to be selected and maintained in bacterial genomes.

The main aim of this contribution is to introduce the potential that modern information technologies open to authors converting a teaching material from a printed to an electronic version. The authors come out of their own experience and propose options that are suitable especially for creation of study materials in mathematics education. Among others the contribution presents the use of flash animations, java scripts and Computer Algebra Systems.

Ce projet de thèse vise à modéliser puis à apporter la preuve de concept d’une thérapie cellulaire et génique autologue de maladies héréditaires du foie par la transplantation d’hépatocytes différenciés à partir des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques du patient, une fois celles-ci corrigées du défaut génétique. L’hémophilie B (HB) est une maladie héréditaire causée par une mutation du gène F9, codant le facteur IX (FIX) de la coagulation synthétisé dans le foie par les hépatocytes. Des fibroblastes d’un patient porteur de la « mutation royale » ont été reprogrammés en iPSC puis différenciés en hépatocytes. L’étude de l’ARNm du F9 par séquençage haut débit a confirmé la présence d’un site d’épissage anormal codant une protéine tronquée. D’autres iPSC ont été obtenues à partir des cellules d’un second patient HB exprimant un FIX inactif. Après insertion ciblée d’une cassette thérapeutique codant le FIX dans un site génomique sûr à l’aide d’endonucléases artificielles (CRISPR/Cas9), nous avons différencié les iPSC corrigées et non corrigées en hépatocytes (respectivement corr-HB-Heps et HB-Heps) et confirmé une expression plus importante de l’ARNm du F9 et de la protéine FIX dans les corr-HB-Heps. En revanche, nous n’avons pas détecté d’activité du FIX transgénique sans doute à cause d’une différenciation incomplète des hépatocytes. Nous avons alors développé un protocole de différenciation en sphéroïdes permettant une différenciation plus efficace confirmée aux niveaux ARN et protéine FIX. L’analyse de l’activité du FIX produit nous permettra de valider la correction in vitro avant de la valider in vivo en transplantant les corr-HB-Heps dans un modèle de souris F9KO. Finalement, la dernière partie de ce travail a consisté à développer un protocole de différenciation d’iPSC de singe en hépatocytes en vue d’une transplantation autologue dans le foie de l’animal donneur pour valider la faisabilité et la sécurité de cette approche chez le gros animal. / This PhD project aims to model and to bring a proof of concept for autologous cell/gene therapy of inherited liver diseases by transplanting hepatocytes differentiated from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs), after correction of the genetic defect. Hemophilia B (HB) is an inherited disease caused by a mutation in the F9 gene encoding clotting factor IX (FIX), synthesized in the liver by hepatocytes. Fibroblasts of a patient with the "royal mutation" were reprogrammed in iPSCs then differentiated into hepatocytes. The study of the F9 mRNA by high-throughput sequencing confirmed the presence of an abnormal splice site leading to a truncated protein explaining hemophilia. Other iPSCs were obtained and characterized from the cells of a second HB patient expressing an inactive FIX. By targeting in these iPSCs the insertion of a therapeutic cassette encoding FIX into a safe harbor site using artificial endonucleases (CRISPR/Cas9), we differentiated the corrected and non-corrected iPSC into hepatocytes. Quantitative analyzes confirmed a higher expression of F9 mRNA and FIX protein in the corrected clones. In contrast, we did not detect transgenic FIX activity due to a lack of post-translational modifications necessary for FIX activity. We then developed a protocol of differentiation in spheroids quantitatively more efficient to produce FIX. Detection of FIX activity will validate our in vitro approach before validation in vivo by transplanting the corrected hepatocytes in a F9KO mouse model. Finally, the last part of this work consisted in the development of a differentiation protocol of nonhuman primate iPSCs into hepatocytes for autologous transplantation into the liver of the donor animal in order to validate the feasibility and the safety of such an approach in the large animal

Numerous mutations contribute to tumorigenesis of cancer cells. For most of them it remains unclear whether they are driver or passenger mutations. A classic knock-out to study their function in cancer cells used to take a lot of effort. The CRISPR/Cas-system can be used as a programmable “genome editing” tool. In this work, oncogenes have been inactivated with the CRISPR/Cas-system. Considering off-targets, Streptococcus pyogenes sgRNAs can be designed for 88% of the known cancer mutations. The activity of 15 sgRNAs, targeting 13 mutations in proto-oncogenes (deletions, insertions and point mutations), has been tested with a RFP-GFP-reporter plasmid. For 13 sgRNAs, activity prediction scores correlated with measured activity. Furthermore, sgRNAs have shown preferential binding to mutated versions of targeted proto-oncogene sequence and did not induce double strand breaks in the wild type sequence. For 10 sgRNAs, the activity against their target sequence has been more than 4 times higher than against the wild type sequence. Most of those sgRNAs target insertions or deletions and fewer target point mutations. Permanent knock-out of three mutated proto-oncogenes NPM1, BRAF and PIK3CA has been achieved with a lentiviral expression of CRISPR/Cas. Accordingly, effects on proliferation and phenotype have been studied. Knock-out of NPM1 c.863_864insTCTG mutation has been studied in heterozygous mutated OCI AML3 cell line. Proliferation was strongly inhibited by the corresponding sgRNA. Cells arrested in G0/1-phase of cell cycle (77%) compared to control cells (56%), although no difference was observed for sub-G1 phase, indicating no induction of apoptosis. Cells treated with NPM1 sgRNA had 88% reduced expression of NPM1 c.863_864insTCTG mRNA as well as less cytoplasmic localization of nucleophosmin as assessed by immunostaining. The activity of sgRNA has been confirmed by deep sequencing, showing a shift of wild type to mutated allele ratio from 51:49 to 68:32. This effect was enhanced by the additional treatment with the NHEJ inhibitor SCR7. A BRAFV600E sgRNA was tested in homozygously mutated melanoma cell lines A-375 and SK MEL-28. No differences were detected in comparison to controls. However, in the CRC cell line RKO, heterozygous for BRAFV600E and PIK3CAH1047R, proliferation was inhibited through sgRNAs against either BRAF or PIK3CA. A combination of both had no synergistic effect on proliferation. Activity and specificity of the sgRNA targeting BRAF were confirmed by deep sequencing, while the PIK3CA sgRNA showed a moderate induction of double strand breaks also in the wild type allele. The relation of wild type to mutated allele of BRAF was changed from 32:68 before treatment to 51:49 afterwards. This effect can be explained by a “re mutation” to the wild type after DSB via HDR with wild type sister chromatid as template. This effect was observed for PIK3CA sgRNA to a lesser extent. In conclusion, these results show the applicability of the CRISPR/Cas-system for the inactivation of mutated proto-oncogenes.:List of tables III List of figures IV List of abbreviations V 1 Introduction 1 1.1 Cancer 1 1.2 Oncogenes 2 1.2.1 Role in cancer 2 1.2.2 Targeted therapies 3 1.2.3 NPM1 5 1.2.4 BRAF 6 1.2.5 PIK3CA 7 1.3 CRISPR/Cas-system 7 1.4 Aim and motivation 10 2 Material and Methods 11 2.1 Design of sgRNAs 11 2.2 Plasmids 11 2.3 Cell culture 12 2.4 FACS analysis 14 2.5 T7 assay 14 2.6 Cell cycle analysis 15 2.7 Immunostaining 15 2.8 Apoptosis assay 16 2.9 Quantification of mutant NPM1 transcripts 16 2.10 Deep sequencing 16 2.11 Statistical Analysis 19 3 Results 20 3.1 Design of sgRNAs targeting oncogenes 20 3.2 Evaluation of sgRNA efficacy and selectivity 23 3.3 Effects of oncogene knock-out in cancer cell lines 27 3.3.1 Targeting NPM1 in AML cells 27 3.3.2 Targeting BRAF in melanoma cells 30 3.3.3 Targeting BRAF and PIK3CA in colorectal carcinoma cells 31 4 Discussion 37 4.1 The design of sgRNAs is possible for most cancer mutations 37 4.2 sgRNAs targeting oncogenes have to be tested 37 4.3 Oncogenes can be knocked out with the CRISPR/Cas-system 37 4.3.1 NPM1 in AML cells 37 4.3.2 BRAF in melanoma cells 38 4.3.3 BRAF and PIK3CA in CRC cells 38 4.4 Advantages and disadvantages to target oncogenes with the CRISPR/Cas-system 40 4.5 Concluding remarks 41 5 Original Article 43 6 Summary 47 7 Zusammenfassung 49 List of references 51 Appendix VIII / In Krebszellen tritt eine Vielzahl von Mutationen auf. Für den Großteil der Mutationen ist ungeklärt, ob es sich um krebsverursachende oder passagere Mutationen handelt. Ein gezieltes Ausschalten (Knock-out) dieser Gene zur Untersuchung ihrer Funktion in Krebszellen war bisher mit großem Aufwand verbunden. Das CRISPR/Cas-System lässt sich als programmierbares „Genome-editing“ Werkzeug einsetzen und wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um gezielt mutierte Protoonkogene zu inaktivieren. Für 88% der bekannten, in Krebszellen auftretenden Mutationen lassen sich, unter Berücksichtigung von off-targets, Streptococcus pyogenes sgRNAs entwerfen. Mit Hilfe eines RFP-GFP-Reporter-Plasmides wurde die Aktivität von 15 sgRNAs gegen 13 Mutationen (Deletionen, Insertionen und Punktmutationen) in Protoonkogenen überprüft. Für 13 der sgRNAs zeigte sich eine Aktivität, die mit der Vorhersage durch den Algorithmus korrelierte. Außerdem wurde gezeigt, dass die sgRNAs spezifisch genug binden, um zwar bei der mutierten Sequenz eines Protoonkogens, jedoch nicht bei der Wildtyp-Sequenz Doppelstrangbrüche zu erzeugen. Unter den sgRNAs waren 10 mit mehr als 4-fach höherer Aktivität bei komplett übereinstimmender Zielsequenz gegenüber der Wildtyp-Sequenz. Diese spezifischen sgRNAs waren vor allem gegen Insertions- oder Deletionsmutationen gerichtet, einige auch gegen Punktmutationen. Durch permanente, lentivirale Expression von CRISPR/Cas wurden die Effekte eines Knock-out von drei mutierten Protoonkogenen, NPM1, BRAF und PIK3CA, auf das Wachstum und phänotypische Aspekte humaner Krebszelllinien untersucht. Ein Knock-out der NPM1 c.863_864insTCTG Mutation wurde in heterozygot mutierten OCI AML3 Zellen untersucht, es zeigte sich eine starke Proliferationshemmung. In der Zellzyklusanalyse trat ein G0/1-Arrest dieser Zellen (77%) im Vergleich mit Kontroll-Zellen (56%) auf, jedoch keine Unterschiede in der sub-G1-Analyse, sodass nicht von einer vermehrten Apoptose auszugehen ist. Die mit sgRNA behandelten OCI-AML3 Zellen zeigten sowohl eine um 88% verminderte NPM1 c.863_864insTCTG mRNA-Expression als auch verminderte zytoplasmatische Sublokalisation des Nucleophosmins in der Immunfärbung. Die hohe Aktivität der gRNA gegen mutiertes NPM1 wurde durch Deep Sequencing bestätigt, außerdem hat sich das Verhältnis vom Wildtyp- zu mutiertem Allel von 51:49 zu 68:32 verschoben. Dieser Effekt wurde durch Zugabe des NHEJ-Hemmstoffes SCR7 noch verstärkt. Die sgRNA gegen BRAFV600E wurde in den homozygot mutierten Melanom-Zelllinien A-375 und SK-MEL-28 getestet. Bei Proliferationsversuchen zeigten sich keine Unterschiede im Vergleich zu Kontrollzellen. In der kolorektalen Krebszelllinie RKO, die heterozygot BRAFV600E und PIK3CAH1047R ist, zeigte sich bei der Testung von sgRNAs gegen BRAF, PIK3CA und Kombination beider sgRNAs eine Wachstumshemmung. Jedoch lag kein synergistischer Effekt bei sgRNA-Kombination vor. Zudem bestätigten sich Aktivität und Spezifität der sgRNA gegen BRAF im Deep Sequencing, während die sgRNA gegen PIK3CA in mäßigem Umfang Doppelstrangbrüche im Wildtyp-Allel verursachte. Das Verhältnis vom Wildtyp- zu mutiertem BRAF Allel verschob sich von 32:68 ohne sgRNA zu 51:49 nach sgRNA-Behandlung. Eine mögliche Erklärung dieser Beobachtung ist die Rückmutation zum Wildtyp-Allel nach Doppelstrangbruch mit Hilfe homologer Rekombination durch das Wildtyp-Schwesterchromatid. Für PIK3CA konnte dieser Effekt in schwächerem Ausmaß ebenfalls beobachtet werden. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass das CRISPR/Cas-System zur Inaktivierung mutierter Protoonkogene genutzt werden kann.:List of tables III List of figures IV List of abbreviations V 1 Introduction 1 1.1 Cancer 1 1.2 Oncogenes 2 1.2.1 Role in cancer 2 1.2.2 Targeted therapies 3 1.2.3 NPM1 5 1.2.4 BRAF 6 1.2.5 PIK3CA 7 1.3 CRISPR/Cas-system 7 1.4 Aim and motivation 10 2 Material and Methods 11 2.1 Design of sgRNAs 11 2.2 Plasmids 11 2.3 Cell culture 12 2.4 FACS analysis 14 2.5 T7 assay 14 2.6 Cell cycle analysis 15 2.7 Immunostaining 15 2.8 Apoptosis assay 16 2.9 Quantification of mutant NPM1 transcripts 16 2.10 Deep sequencing 16 2.11 Statistical Analysis 19 3 Results 20 3.1 Design of sgRNAs targeting oncogenes 20 3.2 Evaluation of sgRNA efficacy and selectivity 23 3.3 Effects of oncogene knock-out in cancer cell lines 27 3.3.1 Targeting NPM1 in AML cells 27 3.3.2 Targeting BRAF in melanoma cells 30 3.3.3 Targeting BRAF and PIK3CA in colorectal carcinoma cells 31 4 Discussion 37 4.1 The design of sgRNAs is possible for most cancer mutations 37 4.2 sgRNAs targeting oncogenes have to be tested 37 4.3 Oncogenes can be knocked out with the CRISPR/Cas-system 37 4.3.1 NPM1 in AML cells 37 4.3.2 BRAF in melanoma cells 38 4.3.3 BRAF and PIK3CA in CRC cells 38 4.4 Advantages and disadvantages to target oncogenes with the CRISPR/Cas-system 40 4.5 Concluding remarks 41 5 Original Article 43 6 Summary 47 7 Zusammenfassung 49 List of references 51 Appendix VIII

La thèse "Sang sucré, pouvoirs codés et médecine amère" est le résultat d'une démarche relevant de l'anthropologie médicale critique s'étant principalement déroulée dans la communauté Innue de Pessamit sur la Haute-Côte-Nord du Québec. Cette recherche vise initialement à répondre à cette première question : à quels facteurs peut-on attribuer les insuccès répétés des campagnes de prévention concernant le diabète en milieu autochtone? En particulier, elle cherche à jeter un nouvel éclairage sur l'avènement des conditions d'émergence de l'épidémie de diabète qui afflige un nombre grandissant de membres des Premières Nations. Cette thèse soutient que le développement de ce que la santé publique nomme des "facteurs de risque", fait d'avantage appel à l'émergence de nouvelles caractéristiques identitaires qui doivent être comprises dans le cadre du développement d'un mouvement de revendication et d'affirmation nationale qui est intimement lié à un long et fastidieux processus de décolonisation. Le postulat de départ ici veut qu'il soit utopique de chercher à comprendre les dynamiques qui animent le niveau local sans préalablement les situer dans le cadre du mouvement de mondialisation et de globalisation des marchés. Notre lecture met donc en évidence un ensemble de facteurs sociaux, politiques, économiques et culturels qui créent les conditions d'émergence et de développement du diabète, appréhendé bien sûr en tant que maladie par le monde biomédical, mais également et surtout en tant que "normalité" dans le milieu de vie des Autochtones. Nous démontrons, entre autres, que l'obésité est aujourd'hui en milieu innu, une réalité intégrée à un système complexe de codes identitaires porteurs de sens, permettant l'inclusion et l'exclusion des acteurs de la société. En prenant en considération les niveaux "micro" et "macro" , cette thèse met en lumière qu'à un niveau intermédiaire "méso" , État colonial et "colonisés" se sont mutuellement dotés de systèmes de contrôle puissants assurant l'exercice et l'application du pouvoir au quotidien. Et c'est en prenant en considération ces forces vives en jeu dans la société autochtone moderne que cette thèse apporte un nouvel éclairage sur une question de fond qui intéresse tout particulièrement les milieux de la santé publique : pourquoi les campagnes de prévention primaire, secondaire et tertiaire de la santé publique en milieu autochtone se butent-elles constamment à d'importants insuccès et ce malgré l'injection d'importants investissements humains, scientifiques et budgétaires ?

Cette recherche est fondée sur l'importance de dépister les élèves qui éprouvent des difficultés en identification de mots au début du 2e cycle du primaire. L'objectif général de l'étude est d'analyser, avec une clientèle québécoise, la valeur d'un instrument conçu pour des écoliers français, le Test d'identification de mots écrits élaboré par Ecalle (2006). L'épreuve a été passée à 197 élèves de 3e année. Les enseignants ont également porté un jugement sur les habiletés en décodage de leurs élèves. L'analyse des résultats a permis de conclure à une bonne validité psychométrique de l'épreuve lorsqu'elle est soumise à des élèves québécois. De plus, les résultats ont montré que l'instrument pouvait être plus sensible que le jugement de l'enseignant pour détecter des problèmes de décodage chez certains élèves et qu'il pouvait servir à dresser des profils pertinents en identification de mots.