A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

Submitted by ALINE CRISTINA LOPES null (line.cl@hotmail.com) on 2016-05-02T12:42:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Aline_Cristina_Lopes.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T14:14:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lopes_ac_me_jabo.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T14:14:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lopes_ac_me_jabo.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A citricultura é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro. Entretanto, inúmeras pragas e doenças atacam os citros, causando grandes prejuízos econômicos. O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é um grave problema para o setor, não havendo ainda um método eficaz para o seu controle. Neste estudo, utilizando RNASeq, foram analisados os perfis transcricionais de Xac inoculada em duas espécies de citros contrastantes à doença: laranja doce ‘Pêra Rio’ (Citrus sinensis L. Osbeck), menos suscetível e lima ácida ‘Galego’ (Citrus aurantifolia Swingle), altamente suscetível, às 48 e 72 horas após a infecção (hai), com o objetivo de identificar genes de Xac envolvidos no processo de infecção. Foram identificados 80 genes de Xac diferencialmente expressos (GDEs) no hospedeiro laranja doce ‘Pêra Rio’, sendo 41 e 39 nos tempos de 48 e 72 hai, respectivamente. Em lima ácida ‘Galego’ foram identificados 82 GDEs, sendo 40 no tempo de 48 hai e 42 em 72 hai. Alguns destes genes diferencialmente expressos foram avaliados pela técnica de PCR quantitativa em tempo real, sendo estes hpa1, hrpE, hrpW, virK, ahpC, katE, katG, cydA e cydB, os quais estão envolvidos na patogenicidade e virulência, na defesa ao estresse oxidativo e na fosforilação oxidativa. Os genes de patogenicidade e virulência foram induzidos em Xac em ambos os hospedeiros, enquanto que os genes relacionados à cadeia respiratória foram inibidos em ambos os hospedeiros, com maior inibição em lima ácida ‘Galego’. No entanto, os genes relacionados ao estresse oxidativo apresentaram um perfil de expressão maior em Xac na interação com laranja doce ‘Pêra Rio’ do que em lima ácida ‘Galego’, principalmente ahpC e katG. A determinação da concentração de H2O2 nas folhas revelou que laranja doce ‘Pêra Rio’, espécie menos suscetível ao cancro cítrico, possui maior quantidade de H2O2 do que lima ácida ‘Galego’, espécie altamente suscetível. Isso sugere que a menor susceptibilidade ao cancro cítrico da laranja ‘Pêra Rio’ pode estar relacionada com a maior quantidade de H2O2 presente nesta espécie, o que leva a bactéria a ativar seu arsenal de enzimas para combater o estresse oxidativo do meio, retardando a infecção. / The citrus industry is one of the main activities of Brazilian agribusiness. However, many pests and diseases attack citrus, causing great economic losses. The citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a major problem for the sector, there is not yet an effective method for its control. In this study, the transcriptional profiles of Xac inoculated in two species of contrasting citrus disease were analyzed using RNA-Seq : sweet orange 'Pêra Rio' (Citrus sinensis L. Osbeck), moderately tolerant and Mexican Lime 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle) highly susceptible at 48 and 72 hours after infection (hai) aiming to identify Xac genes involved in the infection process. We identified 80 Xac differentially expressed genes (DGE) in sweet orange 'Pera Rio', 41 and 39 at 48 and 72 hai, respectively. In Mexican Lime 'Galego' 82 DGE were identified, 40 at 48 and 42 at 72 hai. Some of these differentially expressed genes were evaluated by real time quantitative PCR : hpa1, hrpE, hrpW, Virk, ahpC, KatE, katG, cyda and cydB, which are involved in pathogenicity and virulence, oxidative stress defense and oxidative phosphorylation. The pathogenicity and virulence genes were induced in Xac in both hosts, whereas the respiratory chain-related genes were inhibited in both hosts with greater inhibition in Mexican lime 'Galego'. However, genes related to oxidative stress showed a higher expression profile in Xac interaction with sweet orange 'Pera Rio' than with Mexican lime 'Galego', mainly ahpC and katG. The determination of H2O2 concentration in leaves revealed a higher amount of H2O2 in sweet orange 'Pêra Rio' moderately tolerant to citrus canker, than in Mexican Lime 'Galego' highly susceptible to citrus canker. The results suggests that the lower susceptibility to citrus canker orange 'Pera Rio' may be related to the greater amount of H2O2 present in this specie, which leads the bacteria to activate their arsenal of enzymes to fight oxidative stress environment, slowing the infection.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-05Bitstream added on 2014-06-13T20:33:53Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_rm_me_jabo.pdf: 510263 bytes, checksum: 543073ee3d6f55d77bb1607889dc966f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system’s secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system’s proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system’s pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3253.pdf: 2155477 bytes, checksum: 03c92d367d865f20f90059d887400f1f (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Citrus canker is an economically important disease that affects many citrus growing areas around the world, and there is no effective control or cure. The causative agents are bacteria from the genus Xanthomonas, recently classified as two novel species, X. citri e X. fuscans. The most virulent strain is X. citri subsp. citri (Xac). In this study, we did a differential proteomic analysis of a periplasmatic proteins enriched fraction from Xac, by comparison of the protein profiles after cellular growth in pathogenicity inducing medium (XAM1) or non-inducing medium (Nutrient Broth). We performed Bidimensional Electrophoresis (2D-PAGE) in triplicate and statistical analyses were done with the software Image Master Platinum (GE). At least 80 spots showed significant differences on protein expression (p<0.05) between the two conditions tested (induction/ non-induction) and had their proteins digested by trypsin. The peptides were analyzed by mass spectrometry (LCESI- Q-Tof) and the results were compared with proteins from genome databases using the Mascot tool. Among Xac proteins identified with higher expression in in vitro pathogenicity inducing situation, two are classified as proteins involved with Pathogenicity, Virulence, and Adaptation (in according to the genome annotation): superoxidase dismutase (XAC2386) e phosphoglucomutase (XAC3579). A highly differential spot (46), increased in the inducing condition, had their proteins identified as lytic murein transglycosilase (XACb0007) and/or transglycosylase (XAC3225), oxidoreductase (XAC1160) and DNA polymerase III subunit beta (XAC0002). The spot 46 was isolated from several 2D gels and used to produce antibody in mouse. The expressions of these proteins were analyzed by Western blot in others citrus canker genome strains, which differ from Xac in the virulence and host types. This analysis showed that proteins from the spot 46 had different expression pattern among these strains, with higher expression in Xac growing in inducing condition. We conclude that the proteomic study of proteins from periplasmic fraction is an important strategy to detect Xac proteins involved with pathogenicity and virulence, even including proteins transported outside the cell. Proteins found in this fraction could be used as biomarkers, however more experiments are still necessary. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura, não existindo atualmente medidas preventivas e curativas eficazes para combatê-la. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans. A variedade mais agressiva aos citros é a bactéria X. citri subsp. citri (Xac). Pelo presente trabalho, realizamos a análise proteômica diferencial de uma fração celular de Xac enriquecida em proteínas periplasmáticas, após indução in vitro da sua patogenicidade, comparativamente à condição de não indução de patogenicidade (controle). As proteínas dessa fração foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), sendo a análise estatística das intensidades dos spots realizada por meio do software Image Master Platinum (GE). Aproximadamente 80 spots apresentaram expressão diferencial significativa (p<0,05) entre as duas condições estudadas, os quais foram isolados do gel e sua(s) proteína(s) constituinte(s) digerida(s) com tripsina. Os peptídeos resultantes da digestão foram analisados por espectrometria de massas (LC-ESI-QTof) e os dados obtidos utilizados na identificação da proteína por pesquisa em bancos de Xac e/ou de outros organismos com o software Mascot. Dentre as proteínas de Xac identificadas como mais expressas após indução de patogenicidade in vitro duas estão classificadas como proteínas relacionadas com Patogenicidade, Virulência e Adaptação (segundo anotação do genoma de Xac), sendo elas: superoxidase dismutase (XAC2386) e fosfoglicomutase (XAC3579). Proteínas pertencentes a um spot com notável aumento de expressão em situação de indução de patogenicidade (spot 46) foram identificadas por espectrometria de massas, sendo elas: proteína lytic murein transglycosilase (XACb0007) e/ou transglycosylase (XAC3225), oxidoredutase (XAC1160) e subunidade beta da DNA polimerase III (XAC0002). O spot 46 foi isolado a partir de vários géis 2D e utilizado para produção de anticorpos em camundongos. A análise da expressão da(s) proteína(s) pertencente(s) ao spot 46 foi realizada por meio de Western blot nas linhagens-genoma B e C do cancro cítrico, as quais diferem de Xac na virulência e tipo de citros- hospedeiro. Por esta análise foi verificado que proteínas do spot 46 possuem expressão muito distinta entre as linhagens genoma do cancro cítrico, sendo sua expressão preponderante em Xac, especialmente em situação de indução de patogenicidade. Concluímos que o estudo das proteínas utilizando a fração periplasmática como objeto de estudo é de grande interesse para investigação de proteínas envolvidas com patogenicidade e virulência em Xac, e que tenham passagem pelo periplasma, inclusive de proteínas transportadas para o meio extracelular. Além disso, algumas proteínas desta fração possuem potencial para serem utilizadas como biomarcadores ou como possível alvo de combate ao cancro cítrico.

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-22T12:11:52Z No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T14:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) Previous issue date: 2015-03-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citrus canker imposes damages to citriculture by causing drop in productivity and fruit quality and the absence of effective control and cure. Thus, the economic potential of citrus is limited in part by this disease mainly caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XAC) that presents the greatest virulence and broad spectrum of citrus hosts, compared to bacteria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii types B (XauB) and C (XauC). In a proteomic analysis previously performed by our research group, periplasmic trehalase was identified as a protein which expression differed between XAC e XauC in an in vitro induction of pathogenicity. Trehalase is an enzyme that catalyzes hydrolysis reaction of trehalose, a disaccharide composed of two glucose units, which role in the plant-pathogen interaction is poorly understood. One of the objectives of the study was to obtain this enzyme in purified form using an IPTG-inducible heterologous expression system in E. coli, for purposes of partial characterization of its structure and activity. The recombinant XAC periplasmic trehalase is a monomer bearing wide pH stability and showed Michaelian kinetics. The Michaelis-Menten constant (Km) for trehalose was 0,124 ± 0,015 mM and Vmax 17,319 ± 0,035 μMol glucose.min-1.mg protein-1 . Circular dichroism spectroscopy indicated the following composition of secondary structures: 42.7% α-helices and 13% β-sheets. A gene knockout method based on double homologous recombination between the genomic DNA and suicide vector pNPTS138 has made possible to obtain a strain deleted in the gene encoding the periplasmic trehalase (XACΔ0604), which enabled to evaluate the relationship between this gene and the XAC pathogenicity in Citrus aurantifolia. Infiltrated leaves with XACΔ0604 showed drenching and necrosis of plant tissue and intense brownish pustules compared with wild XAC, suggesting greater virulence of the mutant strain. The periplasmic trehalase activity was compared in XAC and XauC cell extracts from two culture mediums, non-pathogenicity-inducing (CN) and pathogenicity-inducing (XAM-M). Interestingly, XauC has showed higher enzyme activity compared to XAC in XAM-M. Thus, the noticeable higher XACΔ0604 pathogenicity and the greater activity of XauC periplasmic trehalase compared to XAC are indicatives that trehalose may promote pathogenicity. / O cancro cítrico impõe prejuízos ao setor citricultor por ocasionar queda na produtividade e qualidade dos frutos e pela ausência de medidas eficazes de controle e cura. Assim, o potencial econômico dos citros é limitado, em parte, por essa doença causada principalmente pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), que apresenta maior virulência e largo espectro de hospedeiros cítricos, comparativamente às bactérias Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipos B (XauB) e C (XauC). Em um trabalho de análise proteômica anteriormente realizado por nosso grupo de pesquisa, a trealase periplasmática foi identificada como uma proteína cuja expressão foi diferencial entre XAC e XauC, em condição de indução da patogenicidade in vitro. A trealase é uma enzima que catalisa a reação de hidrólise da trealose, um dissacarídeo formado por duas unidades de glicose, cujo papel na interação planta-patógeno é ainda pouco compreendido. Um dos objetivos do trabalho foi obter esta enzima purificada, utilizando um sistema de expressão heteróloga induzível por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) em E. coli, para fins de caracterização parcial da sua estrutura e atividade. A trealase periplasmática de XAC de origem heteróloga apresentou-se como um monômero relativamente estável em relação ao pH, e de cinética Michaeliana,. A constante de Michaelis-Menten (Km) da enzima para a trealose foi de 0,124 ± 0,015 mM e a Vmáx 17,319 ± 0,035 μMol de glicose.min-1.mg de proteína-1. Análise de dicroísmo circular resultou na seguinte composição de estruturas secundárias: 42,7 % de α-hélices e 13 % de folhas-β. Uma metodologia de nocaute gênico baseada na dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico e o vetor suicida pNPTS138 viabilizou a obtenção de uma linhagem mutante deletada no gene que codifica a trealase periplasmática (XAC∆0604), o que possibilitou avaliar a relação entre tal gene e a patogenicidade de XAC em Citrus aurantifolia. Folhas infiltradas com a suspensão de XAC∆0604 apresentaram maior encharcamento e necrose do tecido vegetal, além de intensas pústulas acastanhadas quando comparadas com as folhas infiltradas com XAC selvagem, sugerindo maior virulência da linhagem mutante. A atividade da trealase periplasmática foi comparada em extratos celulares brutos provenientes de cultivos de XAC e XauC em dois meios de cultura, não-indutor de patogenicidade (CN) e indutor de patogenicidade (XAM- M). A bactéria XauC apresentou maior atividade enzimática de trealase em relação à XAC em XAM-M. Sendo assim, a acentuada patogenicidade de XAC∆0604 em relação à linhagem selvagem XAC e a maior atividade da trealase periplasmática de XauC em relação à XAC reforçam os recentes trabalhos que indicam a trealose como promotora da patogenicidade em fitopatógenos.

O cancro cítrico, causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é um dos mais graves problemas fitossanitário da citricultura brasileira. Com a introdução da lagarta minadora dos citros (Phyllocnistis citrella [LMC]), houve um aumento drástico do número de focos do cancro cítrico, além da mudança do padrão espacial de fortemente agregado para moderadamente agregado e ao acaso. Foram avaliados: (1) suscetibilidade de três condições foliares: folha intacta, ferimento mecânico e injúria de LMC nas fases ovo, 1º ínstar, 3º ínstar e pupa, inoculados em diferentes concentrações de Xac (101, 102, 104 e 106 ufc/ml); (2) período de suscetibilidade da folha intacta, do ferimento mecânico e injúria de LMC inoculados a 106 ufc/ml; e (3) efeito da temperatura (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 42°C) e duração do molhamento foliar (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h) em folhas sem ferimento inoculadas a 106 ufc/ml. A concentração mínima de inóculo para causar sintomas da doença em folha intacta, injúria de LMC fase ovo e 1º ínstar foi de 104 ufc/ml; em ferimento mecânico e injúria de LMC fase 3º ínstar e pupa, 102 ufc/ml. Injúria da fase pupa resultou em grande severidade do que nos demais tratamentos a 106 ufc/ml (2 vezes maior do que em folha intacta).O período de suscetibilidade da injúria de LMC foi seis vezes mais longo do que do ferimento mecânico e a máxima suscetibilidade foi três vezes maior que em folha intacta. A LMC está relacionada com o aumento do dano que expõem mesofilo foliar à infecção direta de Xac, aumentando a suscetibilidade da folha por longo período. A faixa de temperatura ótima para o desenvolvimento do cancro cítrico foi de 25-35ºC. Entretanto, a severidade foi mais alta entre 30-35ºC. Sintomas de cancro não desenvolveram a 42ºC e na ausência de molhamento foliar. O efeito da temperatura foi maior do que a duração do molhamento foliar. A mínima duração de molhamento para infecção de Xac foi menor que 4 horas. / Asiatic citrus canker, caused by X. axonopodispv.citri (Xac), is one of the most serious phytosanitary problems in Brazilian citrus crops.The introduction of the citrus leafminer (Phyllocnistis citrella [CLM]), has resulted in an increase in the number of disease foci and has changed the spatial pattern of citrus canker symptomatic trees from strong aggregation to intermediate aggregation and random patterns. We evaluated: (1) susceptibility of three distinct leaf condition: intact leaves, mechanical wounding, and injury caused by CLM at the egg stage, 1st instar, 3rd instar, and pupal stage, inoculated at different concentration of Xac (101, 102, 104, and 106 cfu/ml); (2) susceptibility period of intact leaves, mechanical wounding, and CLM injury inoculated at 106 ufc/ml; and (3) effect of temperature (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 42°C) and leaf wetness durations (0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h) on unwounded leaves inoculated at 106 ufc/ml. The minimum inoculum concentration to cause symptom development in intact leaves, CLM injury at the egg stage and 1st instar was 104 cfu/ml; in mechanically wounded leaves and CLM injuries at the 3rd instar and pupa stage, 102 cfu/ml. The injuries from pupa stage resulted in greater disease severity than other treatments at 106 cfu/ml (two times higher than in the intact leaf). Susceptibility period of CLM injury was six time longer than mechanical wounding and maximum observed susceptibility was three times higher than intact leaf. CLM is related to the amount of damage that exposes mesophyll cells to direct Xac infection, increasing the susceptibility of leaf for long period. Optimal temperature for development of citrus canker was 25–35°C. However, disease severity was highest in the range 30–35°C. Symptoms did not develop at 42°C and zero hour of leaf wetness duration. Effect of temperature was .greater than leaf wetness duration. The minimum wetness duration for Xac infection was as short as 4 h.

Molibdênio é um elemento traço envolvido na fixação de nitrogênio, enxofre e carbono. Oligopeptídeos estão envolvidos na nutrição bacteriana e diversos outros processos de sinalização intercelular. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel funcional das proteínas ligadoras dos sistemas de captação de molibdato (ModA) e oligopeptídeo (OppA) em Xanthomonas axonopodis pv. citri em condições in vitro e in vivo. O mutante ModA mostrou uma produção diminuída de goma xantana, alteração do biofilme e adesão prejudicada em condições in vitro. In vivo a interação do mutante modA mostrou alterações nas lesões causadas em folhas de grapefruit possivelmente resultado da baixa expressão do gene gumB. O mutante na proteína OppA apresentou células mais co-agregadas alterando a estrutura do biofilme e consequentemente diminuindo sua capacidade de adesão. In vivo, a linhagem mutante não alterou o fenótipo de patogenicidade, mas a sua capacidade de crescimento foi afetada no início da fase estacionária sugerindo que o sistema Opp desempenha um papel nutricional. / Molybdenum is a trace element involved in nitrogen fixation, sulfur and carbon. Oligopeptides are involved in bacterial nutrition and several other intercellular signaling processes. The aim of this study was to investigate the functional role of binding proteins of molybdate (ModA) and oligopeptide (OppA) uptake systems of Xanthomonas campestris pv. citri in in vitro and in vivo conditions. ModA mutant showed a decreased production of xanthan gum, altered biofilm and adhesion impaired in vitro conditions. In vivo ModA mutant interaction showed changes in injuries on leaves of grapefruit possibly due to low expression of the gumB gene. The OppA mutant showed more cells co-aggregated by changing the structure of the biofilm and consequently reducing their capacity to adhere. In vivo, the mutant strain did not modify the phenotype of pathogenicity, but its ability for growth was affected at the early stationary phase suggesting that the Opp system plays a nutritional role.

Com clima diversificado e terras férteis, o Brasil tem vocação natural para o desenvolvimento agropecuário e todas as suas vertentes. Assim, o agronegócio é hoje a principal locomotiva da economia brasileira, representando cerca de um terço do nosso Produto Interno Bruto (PIB). Nesse contexto, o Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do planeta, com destaque para a produção de laranjas. Particularmente, o país lidera a produção mundial de suco de laranja e conta com uma participação de 85% nas exportações deste produto. Porém, um dos principais fatores atuais que restringem os lucros e a expansão da citricultura é o controle fitossanitário. Atualmente, dentre as principais doenças podemos destacar o HLB e o cancro cítrico. Ambas, doenças bacterianas que não têm cura comprometem a produção e desenvolvimento da fruta e levam à morte da árvore. Dessa maneira, o monitoramento destas é fundamental para evitar danos aos frutos e a necessidade da erradicação de plantações inteiras. O presente trabalho avaliou o emprego das técnicas de Espectroscopia de Fluorescência Induzida por Laser (LIFS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Induzido por Laser (LIBS) como forma de diagnóstico destas doenças, se apresentando como uma alternativa às inspeções visuais e ao PCR utilizados atualmente. Para isso, folhas de citros in natura provenientes de plantas sadias, com HLB ou com cancro foram amostradas e medidas com ambos os sistemas. Através do sistema LIFS foi realizado um estudo de precocidade no diagnóstico do HLB. Este sistema fotônico pôde detectar a doença até 21 meses antes do aparecimento dos primeiros sintomas visuais. Foram utilizados classificadores sazonais, criados a partir de Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e conjuntos de calibração previamente avaliados. Quanto ao cancro cítrico e o sistema LIFS, taxas de acerto superiores a 90% foram alcançadas nos melhores casos de validação cruzada dos dados. A diferenciação do cancro e do HLB também foi possível pela mesma técnica ao avaliar um conjunto pequeno de dados, que atingiu uma taxa de acerto de 82%. Através dos espectros obtidos pelo sistema LIBS, avaliou-se as variações nutricionais causadas na planta devido à doença. Por meio de tais variações e métodos de PLSR foi construído um modelo para o diagnóstico de HLB alcançando taxas de acerto da ordem de 75%. Em relação ao cancro cítrico e o sistema LIBS, um estudo preliminar foi realizado, e uma taxa de acerto superior a 90% foi atingida. Por fim, os resultados corroboraram com a ideia inicial de se realizar o diagnóstico do HLB e do cancro cítrico através de técnicas fotônicas. Dentre outras vantagens estas permitem uma análise rápida, in loco, sem a necessidade de preparo de amostra. Além disso, para o HLB, as técnicas fotônicas demonstraram menor sensibilidade à distribuição não homogênea da doença, quando comparada com a técnica de referência (qPCR). / The diverse climate and fertile soils make Brazil a country with a natural vocation for agricultural development. Thus, agribusiness is now the main locomotive of the Brazilian economy, accounting for about one-third of our Gross Domestic Product (GDP). In this context, Brazil is the third largest fruit producer in the world, with emphasis on the orange production. Particularly, the country leads the world production of orange juice, and with a stake of 85% in exports of this product. However, one of the main factors that restrict current profits and the expansion of citrus production is phytosanitary control. Currently, among the major diseases we highlight the HLB (Greening) and Citrus Canker, two bacterial diseases that have no cure and affect production and fruit development. Therefore, monitoring is essential to prevent damage to the fruits and the complete eradication of infected orchards. The present study evaluated the use of Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy (LIFS) and Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) techniques as alternative diagnostic methods to visual inspection and PCR technique, currently used. For that, citrus leaves from healthy, HLB or citrus canker infected plants, were sampled and measured with both systems. Through LIFS system, a study of the HLB early diagnosis was done. This photonic system could detect the disease up to 21 months before the tree show the visual symptoms. Seasonal classifiers were used, which were designed from Partial Least Square Regression (PLSR) methods and calibration database previously acquired. Regarding citrus canker and LIFS system, success rates higher than 90% were achieved in the best cases. The differentiation between citrus canker and HLB was also possible using the same technique reaching a success rate around 82%. Through the spectrum obtained by LIBS system, it was evaluated the nutritional variations caused in the plant due to HLB, and based on these data, the diagnosis was done. The average success rate was 75%, which was achieved by PLSR model. Regarding on citrus canker and LIBS system, a preliminary study was carried out and a success rate greater than 90% was achieved. Finally, the results corroborated with the use of photonic techniques for the HLB and citrus canker diagnosis. Among other advantages, they allow rapid analysis, in loco and without the need of sample preparation. In addition, for the HLB, photonics techniques showed lower sensitivity to the non-homogeneous distribution of the disease when compared with the reference technique (qPCR).

A informação sobre a dinâmica espaço-temporal de doenças de plantas é de importância fundamental em estudos epidemiológicos, podendo ser utilizada para descrever e entender o desenvolvimento das doenças, desenvolver planos de amostragem, planejar experimentos controlados e caracterizar perdas na produção ocasionadas pela doença. O estudo de padrões espaciais de doenças de plantas, que são reflexos do processo de dispersão dos patógenos, é importante em estudos epidemiológicos, como o de doenças dos citros, para se definirem estratégias mais adequadas para o controle das doenças, diminuindo os prejuízos causados. A Citricultura é uma das principais atividades agrícolas do Brasil e representa a principal atividade econômica de mais de 400 municípios do Triângulo Mineiro e do Estado de São Paulo, onde se encontra a maior área de citros do país e a maior região produtora de laranjas do mundo. Na avaliação do padrão espacial, diferentes métodos têm sido utilizados, dentre os quais incluem-se o ajuste de distribuições, como, por exemplo, a distribuição beta-binomial, o estudo da relação variância-média, o cálculo de correlação ao intraclasse, a utilização de técnicas de autocorrelação espacial, métodos de classes de distâncias e o ajuste de modelos estocásticos espaço-temporais. Diante da importância de se estudarem padrões espaciais da incidência de doenças em plantas e da necessidade de se conhecer melhor a epidemiologia da morte súbita dos citros e do cancro cítrico, uma técnica baseada em verossimilhança para o ajuste de modelos estocásticos espaço-temporais foi utilizada na caracterização de padrões espaciais. Modificações na metodologia original, buscando uma diminuição do tempo gasto nas análises, foram propostas nesse estudo. Os resultados mostram que as modificações propostas resultaram em uma diminuição significativa no tempo de análise, sem perda de acurácia na estimação dos parâmetros dos modelos considerados. / The information about the spatial-temporal dynamics is of fundamental importance in epidemiological studies for describing and understanding the development of diseases, for developing efficient sampling plans, for planning controlled experiments, for evaluating the effect of different treatments, and for determining crop losses. The Citriculture is the major economic activity of more than 400 municipalities in Minas Gerais and São Paulo States. This is the largest citrus area in Brazil, and the largest sweet orange production area in the world. Therefore, it is very important to study and to characterize spatial patterns of plant diseases, such as citrus canker and citrus sudden death. In the spatial dynamics study, many different methods have been used to characterize the spatial aggregation. These include the fitting of distributions, such as the beta-binomial distribution, the study of variance-mean relationships, the calculation of intraclass correlation, the use of spatial autocorrelation techniques, distance class methods and, the fitting of continuous time spatiotemporal stochastic models. In this work, an improved technique for fitting models to the spatial incidence data by using MCMC methods is proposed. This improved technique, which is used to investigate the spatial patterns of plant disease incidence, is considerably faster than Gibson’s methodology, in terms of computational time, without any loss of accuracy.

Submitted by JULIE ANNE ESPÍNDOLA AMORIM (julie__anne@hotmail.com) on 2018-06-05T18:33:56Z No. of bitstreams: 1 Tese_23-03-18-final_corrigida_05-06-2018_Juliecorrigidapdf.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-05T18:59:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 amorim_jae_dr_jabo.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T18:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amorim_jae_dr_jabo.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico tipo A, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), é uma das doenças de citros mais importantes, afetando todas as cultivares comerciais, para a qual não existem ainda estratégias de controle eficientes. Os genes ntrB e ntrC codificam, respectivamente, a histidina quinase (HK) e o regulador de respostas (RR), pertencentes a um sistema de dois componentes (TCSs), que atuam no sistema regulador de nitrogênio (NTR). Porém, o possível papel desses genes na virulência da XccA e de outros fitopatógenos ainda não foi elucidado. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos dos genes ntrB e ntrC no desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo (Citrus limonia Osbeck), bem como a possível relação desses genes com a regulação da expressão de genes do sistema de secreção tipo 3 (SST3), considerado um dos principais fatores de virulência da XccA. Os mutantes ΔntrB e ΔntrC foram obtidos pela técnica de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia da polimerase de extensão por sobreposição. A mutação dos genes causou redução na sintomatologia do cancro cítrico e diminuição da população bacteriana no espaço intercelular do tecido foliar da planta. A análise das curvas de crescimento in vitro revelou que a ausência do gene ntrB não alterou a viabilidade da bactéria, enquanto a mutação do gene ntrC afetou o “fitness” bacteriano em meio de cultura NB. Análises in vitro indicaram que o mutante ΔntrC formou duas vezes mais biofilme e produziu cinco vezes mais goma xantana do que a XccA 306 in vitro. A expressão dos genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW e hrpD6) do SST3 avaliados foi significativamente maior (p < 0,05) no mutante ΔntrC do que na XccA 306 e no ΔntrB, indicando que ntrC possa atuar na regulação do SST3. Porém, o nível de expressão desses genes no mutante ΔntrB não apresentou diferença significativa (p > 0,05) em relação à XccA 306. A modelagem molecular revelou semelhança estrutural entre as regiões receptoras de NtrC e HrpG, sugerindo que a fosforilação de HrpG por NtrB possa ocorrer in vivo. Em síntese, os resultados obtidos neste estudo indicam que a mutação dos genes ntrB e ntrC afeta o desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo e que o gene ntrC pode atuar na regulação dos mecanismos de formação de biofilme, produção de goma xantana e expressão de genes do SST3 e/ou que a ausência desse gene ocasione um desequilíbrio celular na XccA 306, resultando na alteração desses mecanismos, enquanto NtrB pode apresentar papel na regulação de genes do SST3 por meio da fosforilação de HrpG. / The citrus canker type A, provoked by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), is one of themost important citrus diseases, affecting all the commercial cultivars, for which there are no effective control strategies. The ntrB and ntrC genes encode a histidine kinase (HK) and the response regulator (RR), respectively, belong to a two-component system (TCSs), related to the nitrogen regulatory system (NTR). However, the possible role of ntrB and ntrC genes in the virulence of XccA and other phytopathogens has not yet been elucidated. Therefore, the aim of this study was to investigate the impact of the ntrB and ntrC genes on the development of citrus canker in rangpur lime (Citrus limonia Osbeck), as well as the possible relation of ntrB and ntrC genes with the regulation of the type 3 secretion system (T3SS) gene expression, which is considered one of the main virulence factors of XccA. The ΔntrB and ΔntrC were obtained by site-directed mutagenesis through overlap extension polymerase chain reaction. The mutation of the ntrB and ntrC genes caused a reduction of the citrus canker symptoms, and decrease of the bacterial population in the intracellular space of the foliar tissue of the plant. In vitro growth curves analysis revealed that the ΔntrB did not affect the viability of the bacterium, whereas the ΔntrC affected the bacterial fitness in NB culture medium. In vitro analysis indicated that the ΔntrC formed 2x more biofilm, and produced 5x xanthan gum compared to the XccA 306. The T3SS related genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW and hrpD6) expression was significantly higher (p <0.05) in the ΔntrC than in the XccA 306 and the ΔntrB, indicating that ntrC can modulate the regulation of T3SS. However, the level of expression of these genes in the ΔntrB did not differ (p> 0.05) in relation to the XccA 306. Molecular modeling revealed structural similarity between NtrC and HrpG receptors motifs, suggesting that phosphorylation of HrpG by NtrB may occur in vivo. Overall, the results obtained in this study strongly suggest that the mutation of the ntrB and ntrC genes affect the development of rangpur lime citrus canker and that ntrC gene may play an important role in the regulation of the mechanisms of biofilm formation, xanthan gum production and T3SS gene expression and/or that the absence of this gene causes a cellular imbalance in XccA 306 resulting in the alteration of these mechanism, whereas the NtrB may have a role with the regulation of T3SS genes by phosphorylation of HrpG. / 3385/2013