Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-12-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Citrus canker, caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a disease that causes serious problems to the global citrus industry, especially to orange(Citrus sinensis). In this regard, this thesis describes the development of new methodologies for the diagnosis of citrus canker by volatile biomarkers or macromolecules produced by the C. sinensis-Xac association, as well, performed the chemical study of the wild strain of bacteria Xac searching to isolate and/or identify chemical compounds that may be associated to pathogenicity. The methods for diagnosis of citrus canker involved: dynamic headspace-GC-MS, HS-SPME/GC-MS and MALDI-TOF/MS. The main volatile biomarker identified by dynamic headspace-GC-MS was isoamyl benzoate and by HS-SPME/GC-MS aromatic compounds (benzaldehyde, phenyl methanol, methyl benzoate, 2-phenyl ethanol, benzyl acetate and ethyl benzoate) when N2 was used in the sample preparation, while without N2, benzothiazole and 2-ethylhexyl benzoate were the main biomarkers. The MALDI-TOF/MS technique was effective to differentiate statistically macromolecules produced by the healthy leaves of C. sinensis when in comparation to symptomatic leaves of citrus canker. The chemical study of Xac allowed the isolation or identification of 15 substances, some of them acting as signaling molecules in other bacteria with genomic similarity. Among the substances are: cyclo (Pro-Leu), cyclo (Pro-Val) and two diastereoisomers of cyclo (Pro-Phe), for which the relative configurations were determined, cyclo (Phe-Phe), quinolin-4-carboxaldehyde, fatty acid amides (octadecanamide, cis-9-octadecenamide, cis-13-docosenamide) and cis-11-methyl-2-dodecenoic acid (signaling molecule in X. campestris pv. campestris). According to several studies in literature, some of these compounds are involved in cell communication of some microorganisms or can be phytoxins released by the bacteria into the plant. / O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é uma doença que provoca sérios problemas à citricultura mundial, principalmente à cultura da laranjeira, Citrus sinensis. Neste sentido, esta tese descreveu o desenvolvimento de novas metodologias para a diagnose do cancro cítrico por meio de biomarcadores voláteis ou macromoléculas produzidas por associação C. sinensis-Xac, bem como, realizou o estudo químico da linhagem selvagem da bactéria Xac buscando isolar e/ou identificar compostos químicos que de algum modo podem estar associados ao mecanismo de patogenicidade. As metodologias para diagnóstico do cancro cítrico envolveram: headspace dinâmico-GC-MS, HS-SPME/GC-MS e MALDI-TOF/MS. O principal biomarcador volátil identificado por headspace dinâmico-GC-MS foi o benzoato de isoamila e por HS-SPME/GC-MS foram identificados uma série de compostos aromáticos (benzaldeído, fenilmetanol, benzoato de metila, 2-feniletanol, acetato de benzila e benzoato de etila), quando utilizado N2 no preparo de amostra, enquanto que sem N2, benzotiazol e benzoato de 2-etilexila foram os principais biomarcadores identificados. A técnica MALDI-TOF/MS foi eficiente para diferenciar estatisticamente macromoléculas produzidas por folhas de C. sinensis sadias de folhas sintomáticas com cancro cítrico tanto de plantas em que o processo de infecção ocorreu artificialmente quanto naturalmente. O estudo químico de Xac levou ao isolamento e/ou identificação de 15 substâncias, algumas delas sinalizadoras em outras bactérias com similaridade genômica. Entre estas substâncias destacam-se: ciclo (Pro-Leu), ciclo (Pro-Val), dois diastereoisômeros de ciclo (Pro-Phe), às quais as configurações relativas foram determinadas, ciclo (Phe-Phe), quinolina-4-carboxaldeído, amidas de ácidos graxos (octadecanamida, cis-9-octadecenamida, cis-13-docosenamida) e o ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico (sinalizador em X. campestris pv. campestris). De acordo com vários estudos existentes na literatura, alguns desses compostos são envolvidos na comunicação celular de diferentes micro-organismos ou podem ser fitotoxinas lançadas pela bactéria na planta.

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o desenvolvimento de portaenxertos de citros Poncirus trifoliata, índices de ataque de cancro cítrico causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri e controle dessa doença com pulverizações cúpricas em dois viveiros, um convencional e outro orgânico, artificialmente inoculados, no Centro de Formação da EMATER, situado no município de Montenegro/RS, no Estado do Rio Grande do Sul. Para controle do cancro cítrico foram testadas pulverizações cúpricas em diferentes concentrações e freqüências utilizando-se calda bordalesa no viveiro orgânico e oxicloreto de cobre no viveiro convencional. Foram avaliados: o crescimento do diâmetro do caule dos portaenxertos; a produção de matéria seca da parte aérea e a contagem do número de lesões de cancro cítrico presentes em folhas e ramos. Com os dados obtidos foi possível verificar que os tratamentos cúpricos não controlaram o cancro cítrico; ambos os viveiros, convencional e orgânico proporcionaram desenvolvimento semelhante aos porta-enxertos; e, com pequenas variações, o cancro cítrico se desenvolveu com igual intensidade nos dois viveiros.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:56:16Z : No. of bitstreams: 1 jaciani_fj_me_jabo.pdf: 302453 bytes, checksum: 1fb27cbd11729232d8b900ef7c2e8c3c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A caracterização da estrutura genética de populações clonais de patógenos bacterianos tem sido feita, entre outros métodos, por “Southern blot” empregando-se como sondas seqüências de inserção ou genes avr. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de DNA baseadas em genes de patogenicidade para estudo da diversidade genética de isolados de Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii e Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. Observou-se a presença dos genes avrXacE1, avrXacE2 e lrp em todos isolados das subsp. citri e aurantifolii e a ausência do gene avrXacE2 no isolado da subsp. citrumelonis. Os perfis de restrição gerados por PCR-RFLP não revelaram polimorfismo nos genes amplificados e o uso de genes avr como sondas para “Southern blot” mostrou-se efetiva na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros e na identificação de relativo polimorfismo entre isolados da mesma espécie. A diversidade haplotípica foi maior com o gene avrXacE1. Com exceção à sonda correspondente ao gene lrp, o número de haplótipos identificados (17) variou de acordo com a endonuclease utilizada em “Southern blot”. Os isolados da subsp. citri apresentaram um maior número de cópias dos genes avr em comparação com isolados das subsp. aurantifolii e citrumelonis. O estado de São Paulo, que adota uma campanha de erradicação do cancro cítrico, apresentou a menor diversidade haplotípica, provavelmente em decorrência do curto período em que o patógeno interage com o hospedeiro. / The genetic structure of clonal populations of bacterial pathogens has been characterized, among other methods, by Southern blot using insertion sequences or avr genes as probes. The present work aimed the development of DNA primers and probes based on pathogenicity genes to study the genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis strains. The presence of avrXacE1, avrXacE2 and leucine rich protein (lrp) genes was observed in all citri and aurantifolii strains, as well as the absence of the avrXacE2 gene in citrumelonis isolate. The restriction profiles generated by PCR-RFLP did not show polymorphism in the amplified genes and the use of avr genes as Southern blot probes showed to be effective to differentiate Xanthomonas species pathogenic to citrus and to identify a relative polymorphism between strains belonging to the same species. The haplotype diversity was higher with the avrXacE1 gene. Excepting the probe corresponding to lrp gene, the number of haplotypes identified (17) varied according to the endonuclease used on Southern blot. The strains of the citri species presented a higher number of copies of the avr genes compared to aurantifolii and citrumelonis. The state of São Paulo, that adopts a campaign of eradication of the citrus canker, presented the smaller haplotype diversity, probably as result of the short period where the pathogen interacts with the host.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissSPS.pdf: 975208 bytes, checksum: 4bc88b44a9d4c83578ef8910f2124419 (MD5) Previous issue date: 2003-02-14 / Citrus canker is one of the main threats to the sanity of orange groves in the production region of the State of Sao Paulo, known as Citrus Belt. This disease has caused the elimination of million of trees and losses to the whole citrus production chain. Despite the official measures to canker eradication, growers can prevent having the disease in their groves adopting simple measures, recommended by FUNDECITRUS Fund for Citriculture Defense. These measures could be standardized and implemented in the citrus farms using approaches and tools for quality management by means of a management system upon which a phytossanitary quality certificate for citrus canker prevention can be established. This certificate could contribute do the to the reduction of the risks of occurrence and to the reduction of costs for the canker prevention and eradication. Besides that, the phytossanitary quality certificate could originate the establishment of a quality and origin certificate for the orange produced in the Citrus Belt, aiming the valuation of the state citriculture in internal and foreign orange markets, following the recent trends of quality certification of agro-food products and companies. The model for citrus canker prevention management system is proposed from a survey of quality certification systems in agrofood chains and the ISO 9000:2000 standards, SQF 2000 code and IFP Integrated Fruit Production system guidelines. A survey with 64 growers has been conducted to evaluate the adoption of prevention measures recommended by FUNDECITRUS and the growers´ perception of the prevention measures and of an eventual phytossanitary quality certificate for citrus canker prevention. / O cancro cítrico é uma das principais ameaças à sanidade dos pomares de laranja na região produtora do Estado de São Paulo, conhecida como Cinturão Citrícola. Esta doença tem levado à erradicação de milhões de árvores e perdas significativas para toda a cadeia produtiva da laranja. Além das medidas oficiais para erradicação do cancro, os produtores de laranjas podem se prevenir de ter a doença em seus pomares por meio de medidas simples, recomendadas pelo FUNDECITRUS Fundo de Defesa da Citricultura. Estas medidas podem ser padronizadas e implementadas nas propriedades utilizando abordagens e ferramentas para gestão da qualidade por meio de um sistema de gestão a partir do qual que pode ser estabelecido um certificado de qualidade fitossanitária para a prevenção do cancro cítrico. Este certificado poderia contribuir para reduzir os riscos de incidência e os custos de prevenção e erradicação do cancro. Além disto, poderia dar origem ao estabelecimento de um certificado ou selo de qualidade e origem para a laranja produzida no Cinturão Citrícola de modo a valorizar a citricultura paulista no mercado interno e externo de frutas in natura , acompanhando as tendências recentes de certificação da qualidade de produtos e empresas agroalimentares. O modelo para o sistema gestão da prevenção do cancro cítrico é proposto a partir de um levantamento de sistemas de certificação da qualidade em cadeias agroalimentares, tomando-se, como base, as normas ISO 9000:2000, o código SQF 2000 e as diretrizes para a PIF Produção Integrada de Frutas. Uma pesquisa tipo survey junto a 64 produtores foi realizada com a finalidade de avaliar a adoção das medidas de prevenção recomendadas pelo FUNDECITRUS e a percepção dos mesmos em relação ao cancro cítrico, às medidas de prevenção e a um possível certificado de qualidade fitossanitária para a prevenção do cancro.

O cancro cítrico (Xanthomonas axonopodis pv. citri) é uma das mais importantes doenças dos citros e seu controle é feito com medidas de exclusão e erradicação do patógeno. As chances de detecção de plantas doentes diminuem em pomares com baixa incidência da doença. Considerando-se as dificuldades da diagnose visual do cancro cítrico e as vantagens de uma tecnologia que possa melhorar o processo de detecção desta doença no campo, procurou-se identificar características espectroscópicas únicas de uma planta com esta doença. Os objetivos do presente trabalho foram verificar as características espectroscópicas de folhas com cancro cítrico e correlacioná-las às alterações na eficiência fotossintética do tecido foliar doente e relacionar severidade da doença à eficiência fotossintética. Os perfis espectroscópicos e a eficiência fotossintética de plantas das espécies Citrus sinensis (?Hamlin?), Citrus reticulata (?Ponkan?) e Citrus limonia (?Cravo?) foram avaliados antes e após a inoculação com Xanthomonas axonopodis pv. citri. O modelo y = (1 - x) ?, onde y representa a assimilação líquida relativa de CO2 e x, a severidade da doença, foi ajustado aos dados por meio de regressão não-linear. O modelo monomolecular foi ajustado à relação entre assimilação líquida relativa de CO2 e razões espectroscópicas da região do vermelho, também por regressão não-linear. Concluiu-se que a doença afeta a eficiência fotossintética de ?Ponkan? e ?Hamlin?. Em ?Hamlin?, a doença não apenas reduz a área foliar, mas também reduz a fotossíntese do tecido verde remanescente. Há relação positiva entre as razões espectroscópicas da região do vermelho e a fotossíntese nas variedades testadas. / Citrus canker (Xanthomonas axonopodis pv. citri) is one of the most important diseases of citrus. Regulatory control is applied by means of exclusion and eradication of the pathogen. Possibilities of detection of infected trees decrease in orchards with low disease incidence. Considering the difficulties in visual diagnosis of citrus canker and the advantages of a technology that can improve the process of its detection in the field, single spectroscopic characteristics of a plant with this disease was searched. The objectives of the present work were to verify the spectroscopic characteristics of leaves with citrus canker and to correlate them to photosynthetic efficiency of these diseased leaves, and to relate disease severity to photosynthetic efficiency. Spectroscopic profiles and photosynthetic efficiency of Citrus sinensis (?Hamlin?), Citrus reticulata (?Ponkan?) and Citrus limonia (?Cravo?) were assessed before and after the inoculation with Xanthomonas axonopodis pv. citri. The model y = (1 - x) ?, in which y represents relative net assimilation of CO2 and x, disease severity, was fitted to the data by nonlinear regression. The monomolecular model was fitted to the relationships between relative net assimilation of CO2 and spectroscopic reasons of the red region, also by nonlinear regression. It was concluded that the disease affects the photosynthetic efficiency of ?Ponkan? and ?Hamlin?. In ?Hamlin?, the disease not only reduces the amount of leaf area, but also reduces the photosynthesis of the remaining green leaf tissue. There is a positive relationship between spectroscopic reasons of the red region and photosynthesis in ?Hamlin?, ?Ponkan?, and ?Cravo?.

A doença cancro cítrico é considerada uma das mais importantes doenças da citricultura devido ao seu poder de proliferação nas fazendas, e aos danos causados às plantas e frutos. Os prejuízos causados pela presença da doença são consideravelmente preocupantes, pois as principais medidas de controle pelos órgãos responsáveis envolvem a erradicação de plantas infectadas e demais plantas vizinhas, inviabilizando economicamente grandes áreas produtivas. A legislação brasileira exige um extenso protocolo de atividades que necessita ser realizado antes da confirmação do diagnóstico. Atrasos na confirmação do diagnóstico favorecem a proliferação da doença. Assim, qualquer esforço em acelerar esta detecção deve com certeza ter um grande impacto nesta área. Esta é a motivação de nosso trabalho, onde aplicamos a técnica de espectroscopia por imagens de fluorescência em folhas de culturas cítricas com a intenção de avaliar a capacidade de diagnóstico desta técnica em plantas assintomáticas contaminadas no laboratório com cancro cítrico. O objetivo é determinar o instante de tempo mínimo necessário entre a infecção e o diagnóstico preciso da doença. Este estudo foi aplicado para experimentos envolvendo amostras destrutivas e não-destrutivas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicar tal técnica na detecção de cancro cítrico. / The citrus canker disease is considered one of the most important citrus diseases due to its ability to spread on farms, and to damage plants and fruits. The damage, caused by the citrus canker, can be devastating, because the main control actions involve the eradication of infected plants and other plants nearby, causing large economic losses. Brazilian law requires an extensive testing protocol to confirm the diagnosis. Delays in diagnosis tests allows the spread of the disease. Therefore, any effort to accelerate this procedure will have a major impact in this area. This is the motivation of our work, where we apply the fluorescence imaging spectroscopy technique on citrus leaves with the goal to evaluate the diagnostic capability of this technique in asymptomatic plants infected with citrus canker in the laboratory. The goal is to determine the minimum time delay between infection and accurate diagnosis of the disease. This study was applied to experiments involving non-destructive and destructive samples. The results show the possibility of applying this technique in the detection of citrus canker.

A doença cancro cítrico é considerada uma das mais importantes doenças da citricultura devido ao seu poder de proliferação nas fazendas, e aos danos causados às plantas e frutos. Os prejuízos causados pela presença da doença são consideravelmente preocupantes, pois as principais medidas de controle pelos órgãos responsáveis envolvem a erradicação de plantas infectadas e demais plantas vizinhas, inviabilizando economicamente grandes áreas produtivas. A legislação brasileira exige um extenso protocolo de atividades que necessita ser realizado antes da confirmação do diagnóstico. Atrasos na confirmação do diagnóstico favorecem a proliferação da doença. Assim, qualquer esforço em acelerar esta detecção deve com certeza ter um grande impacto nesta área. Esta é a motivação de nosso trabalho, onde aplicamos a técnica de espectroscopia por imagens de fluorescência em folhas de culturas cítricas com a intenção de avaliar a capacidade de diagnóstico desta técnica em plantas assintomáticas contaminadas no laboratório com cancro cítrico. O objetivo é determinar o instante de tempo mínimo necessário entre a infecção e o diagnóstico preciso da doença. Este estudo foi aplicado para experimentos envolvendo amostras destrutivas e não-destrutivas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicar tal técnica na detecção de cancro cítrico. / The citrus canker disease is considered one of the most important citrus diseases due to its ability to spread on farms, and to damage plants and fruits. The damage, caused by the citrus canker, can be devastating, because the main control actions involve the eradication of infected plants and other plants nearby, causing large economic losses. Brazilian law requires an extensive testing protocol to confirm the diagnosis. Delays in diagnosis tests allows the spread of the disease. Therefore, any effort to accelerate this procedure will have a major impact in this area. This is the motivation of our work, where we apply the fluorescence imaging spectroscopy technique on citrus leaves with the goal to evaluate the diagnostic capability of this technique in asymptomatic plants infected with citrus canker in the laboratory. The goal is to determine the minimum time delay between infection and accurate diagnosis of the disease. This study was applied to experiments involving non-destructive and destructive samples. The results show the possibility of applying this technique in the detection of citrus canker.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box" ou “plant-inducible-promoter box", localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box", a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box" foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box" foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box" putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro" ou “in vivo"). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box" para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro") or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo") conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

O cancro cítrico é uma das doenças mais temidas da citricultura devido ao seu poder de proli-feração nas fazendas, aos danos causados às plantas e aos frutos e à forma de combate adota-da pelos órgãos responsáveis através da erradicação das plantas contaminadas e de outras em sua vizinhança. No Brasil, um dos principais motivos que minimiza a eficiência da erradicação do cancro cítrico é a confirmação do diagnóstico, que necessita ser realizada em alguns laboratórios credenciados. A análise de muitas amostras em conjunto com o tempo gasto com o transporte aumenta a chance de proliferação da doença no campo. Neste trabalho aplicamos técnicas de espectroscopia da fluorescência em folhas de culturas cítricas na intenção de pro-por um método de diagnóstico do cancro cítrico a ser realizado na fazenda e com resposta em tempo real. As amostras experimentais são folhas de variedades cítricas sadias e contaminadas com cancro ou outras doenças. Iniciamos o trabalho aplicando espectroscopia da fluorescência no laboratório. Os resultados provaram a viabilidade do método, mas revelou uma enorme sobreposição de dados ao tentar discriminar o cancro de outra doença. Análises com-plementares nos revelaram que os experimentos deveriam ser feitos no campo, identificando plantas contaminadas e tomando a fluorescência de folhas sadias como referência. A espec-troscopia da fluorescência no campo foi feita com um espectrômetro portátil. O resultado nos possibilitou propor critérios de discriminação do cancro baseado em figuras de mérito. O melhor critério apresentou 79% de acertos, com 88% de sensibilidade e 68% de especificidade. Concluímos que os valores poderiam ser melhores se a espectroscopia fosse realizada com imagens, pois as variações do espectro ocorrem devido ao posicionamento da fibra na lesão do cancro. Passamos a estudar a espectroscopia das imagens da fluorescência com um sistema baseado em um espectrógrafo. Os resultados provaram a viabilidade do estudo e revelaram particularidades espaciais e espectrais das doenças. Infelizmente essa instrumentação só pode ser usada no laboratório, por isso optamos por desenvolver outro sistema mais simples e robusto, a base de uma roda de filtros com filtros passa-banda. Os re-sultados revelaram novas particularidades espaciais e espectrais das amostras, porém nos revelou a necessidade de um processamento de imagem para obter análises quantitativas. O sistema de imagens com filtro ainda foi usado em outro experimento complementar onde as imagens forneceram resultados quantitativos, provando a funcionalidade da técnica. / Citrus canker is one of the most feared diseases of citrus due to its dissemination in the farms, the damage caused to plants and fruits and how to combat adopted by national government through the eradication of infected plants and others in your neighborhood. In Brazil, one of the main reasons that minimizes the effectiveness of citrus canker`s eradication is the confir-mation of the diagnosis by specialized laboratories. The time spent to transport and to analyses many samples increases the chance of canker spreading in the field. In our work we apply spectroscopic techniques of fluorescence in leaves of citrus crops with the aim to propose a method for diagnosis of citrus canker to be held on the farm and real-time response. The expe-rimental samples are leaves of healthy citrus varieties and contaminated with canker or other diseases. We began the work by applying fluorescence spectroscopy in the laboratory. The results proved the feasibility of the method, but showed a huge overlap of data to try to dis-criminate cancer from other diseases. Further analysis revealed that those experiments should be done in the field, focusing to identify infected plants and taking the fluorescence of healthy leaves as a reference. Fluorescence spectroscopy in the field was made with a portable spectrometer. The result allowed us to propose some criteria for canker discrimination based on figures of merit. The best criteria presents 79% correct tests, with 88% sensitivity and 68% specificity. We conclude that these values could be better if the spectroscopy was performed with images, because the variations of the spectrum are due to the positioning of the fiber over the canker lesion. We study the spectroscopy of fluorescence images with a system based on a spectrograph. The results proved its feasibility and revealed spatial and spectral particular features of the diseases. Unfortunately, this instrumentation can only be used in the laborato-ry, so we decided to develop another system more simple and robust. The new system is based on a filter wheel with band-pass filters. The results revealed new spatial and spectral characteristics of the samples, but revealed the need for an image processing for quantitative analysis. This imaging system was still used in another supplementary experiment where the images have provided quantitative results, proving the functionality of the technique.

Submitted by GABRIELLE VIEIRA null (gabriellevieir@gmail.com) on 2018-04-05T12:53:30Z No. of bitstreams: 1 Metabólitos secundários de fungos da Antártica com ação antimicrobiana em Xanthomonas spp.pdf: 8795008 bytes, checksum: 0df6b298004d2d27c6a56a8a8367648b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-05T14:02:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_g_me_rcla.pdf: 8781866 bytes, checksum: e535d140907c0db6ece0255e817ca841 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T14:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_g_me_rcla.pdf: 8781866 bytes, checksum: e535d140907c0db6ece0255e817ca841 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As bactérias do gênero Xanthomonas afetam culturas agrícolas de grande importância econômica no Brasil. O controle destas doenças realizado pela utilização de produtos químicos, entre outras práticas, causa impactos negativos na saúde e ao meio ambiente. Isso torna a busca de alternativas sustentáveis de combate a estas doenças cada vez mais importante. Uma possível alternativa aos produtos químicos que tem despertado grande interesse é a aplicação de metabólitos secundários. Suspeita-se que fungos que vivem em ambientes extremos como a Antártica podem produzir metabólitos secundários ainda desconhecidos. Dessa maneira, este projeto teve como objetivo principal investigar a potencial atividade de metabólitos secundários produzidos por 33 fungos isolados do solo contra três espécies de Xanthomonas economicamente importantes para a agricultura do país. Para tanto, foram utilizados fungos coletados em solo em expedição à Antártica (2013) no âmbito do INCT Criosfera, que estão preservados junto à Central de Recursos Microbianos da UNESP. Os extratos (n=66) foram testados contra Xanthomonas patogênicas das culturas de tomate (Xanthomonas euvesicatoria), frutas cítricas (Xanthomonas citri subsp. citri) e maracujá (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). Do total de extratos brutos submetidos a bioensaio contra os fitopatógenos, 18 (27,27%) apresentaram taxa de inibição ≥ 90%. Os extratos com potencial inibitório tiveram origem em fungos identificados por sequenciamento da região ITS4 e ITS5 como pertencentes ao filo Ascomycota, gênero Pseudogymnoascus. Alguns extratos ativos foram purificados utilizando diversas técnicas cromatográficas por fracionamento bioguiado como cromatografia por exclusão molecular, cromatografia em coluna em fase normal, cromatografia em coluna de fase reversa e cromatografia líquida de alta eficiência por interação hidrofílica. As frações obtidas foram testadas frente à Xanthomonas citri subsp. citri. Duas frações, obtidas por cromatografia líquida de alta eficiência, C2F2 e C2F5 apresentaram atividade inibitória contra o fitopatógeno. / Bacteria of the genus Xanthomonas affect agricultural crops of great economic importance in Brazil. Control of these diseases is made by the use of chemicals, among other practices, that causes negative impacts on human health and the environment. This makes the search for sustainable alternatives to combat these diseases increasingly important. A possible alternative to chemicals that have aroused great interest is the application of secondary metabolites. It is suspected that fungi living in extreme environments such as Antarctica may produce secondary metabolites as of yet unknown. Therefore this study had as main objective investigate the potential activity of secondary metabolites produced by 33 fungi isolated from the soil against three economically important Xanthomonas species. For this purpose fungi previously collected in the Antarctic expedition (2013) under the INCOS Criosfera and preserved at the Microbial Resource Center of UNESP were utillized. The extracts produced by the 33 isolates (n = 66) were tested against pathogenic Xanthomonas of tomato crops: Xanthomonas euvesicatoria; citrus: Xanthomonas citri subsp. citri; and of passion fruit culture, Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. From the total of extracts submitted to bioassay against phytopathogens, 18 (27.27%) presented inhibition rate ≥ 90%. The extracts with inhibitory potential were produced by fungi identified through sequencing of the ITS4 and ITS5 regions as belonging to the Ascomycota phylum, genus Pseudogymnoascus. Some active extracts were purified using chromatography techniques by bioguided fractionation such as solid phase chromatography by molecular exclusion, normal phase column chromatography, reverse phase column chromatography, and high performance liquid chromatography by hydrophilic interaction . The fractions obtained by cromatography were tested for antibacterial activity in Xanthomonas citri subsp. citri. Two fractions, obtained by high performance liquid chromatography, C2F2 and C2F5, showed inhibitory activity against the phytopathogen. / FAPESP: 2015/20629-6.