Les médicaments à base de substances naturelles telles que les plantes et les venins sont de plus en plus développés dans l’industrie pharmaceutique. Le contrôle qualité des matières premières ou teintures mères d’origine végétales ou animales, obligatoire dans un environnement BPF, est bien plus complexe que celui des petites molécules pharmaceutiques de synthèse. En effet, les substances responsables de l’activité thérapeutique recherchée sont souvent mal identifiées et on observe une variabilité qualitative et quantitative naturelle parfois importante, ce qui peut modifier de façon significative leur efficacité. Afin de s’assurer de l’homogénéité de chaque souche reçue, il est demandé, entre autre, de développer des méthodes de contrôle analytique permettant d’obtenir un « profil ou empreinte » analytique de la souche considérée, assimilable à une « carte d’identité » qui servira de référence pour le contrôle des lots utilisés en production. L’empreinte analytique (spectre, chromatogramme, électrophérogramme …) devra permettre une séparation la plus complète possible de l’ensemble des composés présents dans la souche considérée tout en tenant compte de sa « variabilité naturelle » afin d’assurer un contrôle qualitatif et semi-quantitatif.L’étude présentée a consisté à développer une approche analytique originale, combinant électrophorèse capillaire et chimiométrie, afin d’établir des profils électrophorétiques spécifiques («fingerprint») permettant d’effectuer le contrôle qualité de souches brutes de venins de serpents utilisés en thérapeutique. Les venins de serpent sont des mélanges complexes de peptides et de protéines, de plus en plus utilisés dans la conception de nouveaux médicaments. Comme toutes les substances naturelles, la composition des venins de serpents est sujette à une variabilité intra et inter individus relativement importante. De fait, la qualité de la matière première pour la production de médicament devient un challenge. Dans cette étude, l’électrophorèse capillaire s’est révélée comme une technique efficace pour la séparation des divers constituants composant les souches brutes de venins de serpent et l’obtention de leurs empreintes analytiques. L’étude a porté sur 4 venins de serpent, Lachesis muta, Bothrops lanceolatus, Vipera aspis aspis, Naja naja qui sont parmi les plus utilisés en thérapeutique. Une approche chimiométrique a alors été développée afin de tenir compte de variabilité qualitative et quantitative observée entre différents lots. Cette approche originale nous a permis d’extraire les pics d’intérêts (i.e. présents dans chaque lot d’un même venin) et d’établir une empreinte analytique de référence avec des seuils de conformité quantitatifs. / Although the therapeutic potential of natural substances is known for thousands of years in traditional medicine, it knows an increasing renewed interest in modern pharmaceutical industry as being an inexhaustible source of therapeutic active substances for various diseases.However, the quality control of these products, which is necessary to obtain reproducible biological activities and new commercial approvals, remains a great analytical challenge. Indeed, natural substances show a myriad of biological activities that can result from a specific or synergistic effects of many different components and this information remains still mostly unknown. Furthermore, because they are derived from living organisms and hence are affected by biotic and abiotic factors, it is extremely difficult to ensure a constant qualitative and quantitative composition for these natural substances among different batches. Consequently, there is a need to develop analytical strategies able to assess the “sameness” of natural productions that is analytical strategies able to assess required similarity between different batches by integrating acceptable qualitative and quantitative variations.To achieve this, the concept of analytical fingerprint has become more and more popular and is now starting to be accepted by regulatory authorities such as the FDA. This so-called “pattern-approach” aims at: (i) gaining effective and stable information about common features of a given strain (ii) evaluating similarity and difference with chemometric methods.If this concept has been quite largely studied for the quality assessment of herbal medicines, it is very still very little developed for animal active substances like snake venoms, which are of increasing interest in therapeutic research due to their rich composition in peptides and proteins. The routine quality control of venom raw substances is still often limited to a single gel electrophoresis which is clearly insufficient in terms of components resolution to achieve similarity-/dissimilarity between strains.MethodsIn this context, we have developed an original analytical fingerprint strategy that combines capillary electrophoresis and chemometrics. CE is a particularly well suited technique for peptides/proteins separation allowing to obtain complex specific fingerprints. Batches of different snake venoms have been analyzed with many replicates. All electropherograms have been processed using several chemometrics approaches (baseline correction, signals alignment, automatic recognition of common peaks …) to obtain a representative analytical trace that can be used for the quality assessment of different production lots.ResultsWe show that CE is a very well adapted method to produce highly specific and repeatable analytical profiles of different venom strains. Chemometric methods applied are very efficient to produce an average fingerprint for each strain that integrates features common to all batches and define acceptable variations in quantitative composition. Similarity/dissimilarity of different batches can then be assessed in an automatic manner.ConclusionAll presented results show the efficacy of CE combined with chemometrics to assess the quality of snake venom raw substances. It can be easily implemented in industrial quality control. This strategy can be implemented in future for other type of therapeutic substances of animal origin.

A eletroforese capilar é uma técnica largamente empregada em Química Analítica e em Bioquímica. Ela tem provado ser rápida e versátil; suas principais vantagens, em relação a outras técnicas analíticas, são a grande resolução e o pequeno volume de amostra necessário. Nosso principal objetivo, neste trabalho,é incluir efeitos físicos que nos permitam influenciar a migração em eletroforese capilar de maneira que atinjamos compressão da banda da amostra injetada. Em particular, consideraremos as mudanças globais nas mobilidades e na forma da banda causadas ou por efeitos de temperatura, ou por efeitos fotoquímicos específicos induzidos por luz laser. Após uma breve revisão sobre a técnica convencional, apresentaremos um estudo dos seus aspectos físicos e desenvolveremos sua formulação matemática usando propagadores. Prediremos compressão térmica, ou seja, estreitamento da banda do analito após sua passagem por uma região com um gradiente de temperatura, e apresentaremos soluções numéricas. Discutiremos, também, a compressão óptica de bandas e apresentaremos resultados experimentais obtidos, pela primeira vez, por nosso grupo, os quais corroboram a teoria. Por fim, listaremos algumas perspectivas de continuidade do trabalho. / Capillary electrophoresis is a widely employed technique in Analytical Chemistry and Biochemistry. It has proved to be fast and versatile; its main advantadges, with respect to other analytical techniques, are the high resolution and small volume of sample required. Our main goal in this work is including physical effects which allow us to influence migration in capillary electrophoresis in such a way that we achieve band compression of the injected sample. In particular, we shall consider the overall changes on mobilities and on band shape caused either by temperature effects or by specific photochemical effects induced by laser light. After a brief review of the conventional technique, we shall present a study of its physical aspects and develop its mathematical formulation using propagators. We shall predict thermal compression, i.e., sharpening of the analyte band after its passage through a region with a temperature gradient, and present numerical solutions. We shall also discuss the optical compression of bands and present experimental results obtained, for the first time, by our group, which corroborate the theory. Concluding, we shall present some perspectives for the continuation of this work.

[pt] Métodos analíticos foram desenvolvidos para a determinação seletiva de alcalóides de interesse farmacológico. Com o objetivo de permitir a determinação seletiva de camptotecina (CPT) em formulações farmacêuticas de irinotecana (CPT-11) ou de topotecana (TPT), dois métodos espectrofluorimétricos e um eletroforético, com detecção por fotometria de absorção, foram propostos. Os métodos espectrofluorimétricos permitiram a determinação seletiva de CPT usando um ajuste de alcalinidade do meio associado ao uso de varredura sincronizada ou de derivada de 2ª ordem. Alternativamente, o procedimento de derivação fotoquímica (com otimização com planejamento composto central) eliminou completamente as interferências no sinal do CPT. Nas condições otimizadas, a espectrofluorimetria permitiu a determinação de CPT em misturas contendo até 50 vezes mais TPT ou contendo até 10 vezes mais CPT-11. A resposta analítica indicou faixas lineares de trabalho e homoscedasticidade. O limite de detecção (LD) foi da ordem de 10(-10) mol L(-1) para o método baseado na derivação fotoquímica e uma ordem de grandeza a menos para os métodos sem derivatização fotoquímica. Testes foram feitos em medicamentos a base de TPT e de CPT-11 e as recuperações ficaram em torno de 100%. Esses resultados foram comparáveis aos obtidos com método de referência (HPLC). O estudo de incerteza de medição por fluorimetria indicou que a maior contribuição do processo era a preparação de solução por avolumação. A contribuição dessa fonte foi minimizada pela preparação de solução por meio de ajuste de massa, causando um grande impacto na redução da incerteza expandida. O método baseado na eletroforese eletrocinética capilar micelar (MEKC) permitiu a quantificação simultânea de TPT, CPT e CPT-11. Para conseguir o ajuste final das melhores condições, foi feito um estudo univariado seguido de um planejamento composto central. Para se melhorar a sensibilidade da detecção em até 76 vezes, foi utilizado um processo de pré-concentração no capilar por modo de empilhamento e uma cela de caminho óptico alongado. A escolha do tampão borato (pH 8,5) contendo SDS e acetonitrila permitiu condições robustas 7 de sinal de tempo de migração. A resposta analítica mostrou faixa linear e homoscedatidade, além de repetitividade em torno de 3,5%. O LD foi da ordem de 10(-7) mol L(-1) (TPT) e 10(-8) mol L(-1) (CPT-11 e CPT). Testes de recuperação em amostras de saliva fortificadas foram feitos e comparados com os obtidos por um método de referência (HPLC) de forma a mostrar a exatidão adequada para o método proposto. Para a determinação seletiva de B-carbolinas, a fosforimetria em substrato sólido (SSRTP) foi utilizada. O ajuste do átomo pesado seletivo e a aplicação de técnica de varredura sincronizada e de 2ª derivada aumentaram o grau de seletividade, pois induziu fosforescência dos analitos de interesse na amostra e melhorou a resolução espectral em relação aos interferentes. O ajuste da quantidade de HgCl2 (0,81 mg) permitiu a determinação seletiva de harmol na presença de quantidades até 10 vezes maiores de harmine, harmane, norharmane e harmaline. O método SSRTP seletivo proposto para determinação de harmol foi comparado com o resultado obtido por um método de referência adaptado baseado em MEKC, o qual também mostrou sua capacidade para a determinação seletiva de harmol na presença dos interferentes. LD absoluto na ordem de ng e comportamento linear da resposta analítica foram obtidos. No caso do método analítico desenvolvido para a determinação de harmane na presença de harmine em chás, estudos de otimização mostraram o AgNO3 como sal de átomo pesado no substrato, solução de amostra em pH 11 e medições feitas em 322 nm do espectro de 2ª derivada da varredura sincronizada ((delta)(lambda) = 109 nm). Testes de interferência mostraram que a matriz do chá não tem influência no sinal do harmane e que nas / [en] Analytical methods were developed for the selective determination of alkaloids of pharmacological interest. Aiming the selective determination of camptothecin (CPT) in irinotecan (CPT-11) or topotecan (TPT) based pharmaceutical formulations, two spectrofluorimetric methods and one electrophoretic method with absorciometic detection were proposed. The spectrofluorimetric method allowed the determination of CPT using the adjustment of the alkalinity of the sample solution associated with the use of synchronous scanning or 2nd order spectral derivation. Alternativelly, the photochemical derivatization (optimized by central composite design) completely eliminated interferences on the CPT signal. The optimized conditions allowed the spectrofluorimetric determination of CPT in mixtures containing up to 50 times more TPT or up to 10 times more CPT-11. The analytical response presented linear working ranges and homocedasticity. The limit of detection (LD) was in the order of 10(-10) mol L(-1) for the method based on photochemical derivatization and one order of magnitude higher for the methods without photochemical derivatization. Tests were made using TPT and CPT-11 based comercial drugs and recoveries were around 100%. Such results were comparable to those obtained with the reference method (HPLC). A study of fluorimetric measurement uncertainty indicated that the greatest contribution in the process was the preparation of solution by volume. The contribution from this source was minimized by the preparation of solutions by weight measurement which caused a major impact in reducing the expanded uncertainty. The method based on micellar electrokinetic capillary electrophoresis (MEKC) allowed the simultaneous quantification of TPT, CPT and CPT-11. To achieve final adjustment of conditions, an univariated study was made followed by a central composite design. To improve the sensitivity of detection up to 76 times, a pre-concentration in the capillary by the normal stacking mode was used along with an extended optical path cell. The choice of borate buffer (pH 8.5) containing SDS and acetonitrile implicated in robust conditions of signal and migration times. The response showed analytical linear working range and homocedasticity, and 9 repeatability of around 3.5%. The LD was in the order of 10(-7) mol L(-1) (TPT) and 10(-8) mol L(-1) (CPT-11 and CPT). Recovery tests using spiked saliva samples were made and compared with those obtained by a reference method (HPLC) to show the appropriated accuracy for the proposed method. For the selective determination of B-carbolines, solid surface room temperature phosphorimetry (SSRTP) was used. The adjustment of the selective heavy atom and the application of synchronized scanning technique and 2nd order spectral derivation, increased the degree of selectivity, because induced phosphorescence of the analytes of interest in the sample and improved spectral resolution. The adjustment of the amount of HgCl2 (0.81 mg) allowed the selective determination of harmol in the presence of up to 10 times higher amounts of harmine, harman, harmaline and norharman. The method proposed for selective SSRTP determination of harmol was compared with the results obtained by an adapted method based on MEKC, which also showed its ability to determine harmol in the presence of interferences. The absolute limit of detection in the ng order and linear behavior of the analytical response was obtained. For the analytical method developed for the determination of harman in the presence of harmine in teas, optimization studies indicated the following conditions: AgNO3 as the heavy atom salt deposited on the substrate, sample solution at pH 11 and measurements made at 322 nm of the 2nd order derivated synchronous scanning spectrum ((delta)(lambda) = 109 nm). Tests showed that, in optimized conditions, the tea matrix had no influence on the harman signal and and that harman could be determined in samples containing harmine in concentrations up to two times higher. The

A eletroforese capilar é uma técnica largamente empregada em Química Analítica e em Bioquímica. Ela tem provado ser rápida e versátil; suas principais vantagens, em relação a outras técnicas analíticas, são a grande resolução e o pequeno volume de amostra necessário. Nosso principal objetivo, neste trabalho,é incluir efeitos físicos que nos permitam influenciar a migração em eletroforese capilar de maneira que atinjamos compressão da banda da amostra injetada. Em particular, consideraremos as mudanças globais nas mobilidades e na forma da banda causadas ou por efeitos de temperatura, ou por efeitos fotoquímicos específicos induzidos por luz laser. Após uma breve revisão sobre a técnica convencional, apresentaremos um estudo dos seus aspectos físicos e desenvolveremos sua formulação matemática usando propagadores. Prediremos compressão térmica, ou seja, estreitamento da banda do analito após sua passagem por uma região com um gradiente de temperatura, e apresentaremos soluções numéricas. Discutiremos, também, a compressão óptica de bandas e apresentaremos resultados experimentais obtidos, pela primeira vez, por nosso grupo, os quais corroboram a teoria. Por fim, listaremos algumas perspectivas de continuidade do trabalho. / Capillary electrophoresis is a widely employed technique in Analytical Chemistry and Biochemistry. It has proved to be fast and versatile; its main advantadges, with respect to other analytical techniques, are the high resolution and small volume of sample required. Our main goal in this work is including physical effects which allow us to influence migration in capillary electrophoresis in such a way that we achieve band compression of the injected sample. In particular, we shall consider the overall changes on mobilities and on band shape caused either by temperature effects or by specific photochemical effects induced by laser light. After a brief review of the conventional technique, we shall present a study of its physical aspects and develop its mathematical formulation using propagators. We shall predict thermal compression, i.e., sharpening of the analyte band after its passage through a region with a temperature gradient, and present numerical solutions. We shall also discuss the optical compression of bands and present experimental results obtained, for the first time, by our group, which corroborate the theory. Concluding, we shall present some perspectives for the continuation of this work.

A eletroforese capilar é uma técnica largamente empregada em Química Analítica e em Bioquímica. Ela tem provado ser rápida e versátil; suas principais vantagens, em relação a outras técnicas analíticas, são a grande resolução e o pequeno volume de amostra necessário. Nosso principal objetivo, neste trabalho,é incluir efeitos físicos que nos permitam influenciar a migração em eletroforese capilar de maneira que atinjamos compressão da banda da amostra injetada. Em particular, consideraremos as mudanças globais nas mobilidades e na forma da banda causadas ou por efeitos de temperatura, ou por efeitos fotoquímicos específicos induzidos por luz laser. Após uma breve revisão sobre a técnica convencional, apresentaremos um estudo dos seus aspectos físicos e desenvolveremos sua formulação matemática usando propagadores. Prediremos compressão térmica, ou seja, estreitamento da banda do analito após sua passagem por uma região com um gradiente de temperatura, e apresentaremos soluções numéricas. Discutiremos, também, a compressão óptica de bandas e apresentaremos resultados experimentais obtidos, pela primeira vez, por nosso grupo, os quais corroboram a teoria. Por fim, listaremos algumas perspectivas de continuidade do trabalho. / Capillary electrophoresis is a widely employed technique in Analytical Chemistry and Biochemistry. It has proved to be fast and versatile; its main advantadges, with respect to other analytical techniques, are the high resolution and small volume of sample required. Our main goal in this work is including physical effects which allow us to influence migration in capillary electrophoresis in such a way that we achieve band compression of the injected sample. In particular, we shall consider the overall changes on mobilities and on band shape caused either by temperature effects or by specific photochemical effects induced by laser light. After a brief review of the conventional technique, we shall present a study of its physical aspects and develop its mathematical formulation using propagators. We shall predict thermal compression, i.e., sharpening of the analyte band after its passage through a region with a temperature gradient, and present numerical solutions. We shall also discuss the optical compression of bands and present experimental results obtained, for the first time, by our group, which corroborate the theory. Concluding, we shall present some perspectives for the continuation of this work.

Orientador: Susanne Rath / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mamani_MonicaCeciliaVargas_D.pdf: 2055058 bytes, checksum: 902c7f4569602c3648964344e6eba060 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Antimicrobianos são largamente empregados na medicina veterinária e resíduos destes podem permanecer nos alimentos de origem animal, acima de valores considerados seguros, quando não são respeitadas as boas práticas veterinárias. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e validação de métodos para a determinação de tetraciclinas, sulfonamidas, cloranfenicol e fluoroquinolonas em fármacos usando a eletroforese capilar (CE), assim como método multiresíduos para a determinação de oxitetraciclina, tetraciclinas, clortetraciclina, sulfametoxazol, sulfametazina, sulfaquinoxalina e cloranfenicol em leite usando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os métodos por CE, com detetor de arranjo de diodos (DAD), foram otimizados usando planejamento experimental, sendo estabelecidas as seguintes condições para as tetraciclinas: eletrólito, carbonato de sódio 50 mmol L + EDTA 1 mmol L, pH 10; voltagem, 13 kV; e temperatura, 23°C. Para as sulfonamidas, fluoquinolonas e cloranfenicol as condições ótimas para separação foram: eletrólito hidrogenofosfato de sódio 60 mmol L + tetraborato sódico 20 mmol L, pH 8,5; voltagem, 24 kV e temperatura, 26 °C. A determinação dos antimicrobianos no leite foi realizada por HPLC-DAD usando coluna C18 híbrida e fase móvel composta de uma fase aquosa (FA): tampão acetato de sódio 0,075 mol L, cloreto de cálcio 0,035 mol L e EDTA sódico 0,025 mol L, pH 7 e fase orgânica (FO): metanol:acetonitrila, 75:25v/v, com gradiente de eluição. O preparo de amostra consistiu na precipitação das proteínas seguida de extração em fase sólida. Os métodos foram validados e aplicados para análise de amostras de leite pasteurizado tipos A, B e C. / Abstract: Antimicrobial agents are widely employed in veterinary medicine and residues can remain in food of animal origin above their safe level, when good veterinary practices are not respected. The aim of this work was to develop and validate methods using capillary electrophoresis for the determination of tetracycline, sulphonamides, chloramphenicol and fluoroquinolones in drugs, as well as establishing a multiresidue determination of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline, sulphamethazine, sulphaquinoxaline, sulphamethoxazole and chloramphenicol in milk using high performance liquid chromatography (HPLC). The CE methods, with a photodiode array detector (DAD), were optimized using experimental design, with the following conditions been established for the separation of tetracyclines: electrolyte, 50 mmol L sodium carbonate + 1 mmol Lof EDTA, pH 10; voltage, 13 kV voltage and temperature, 23°C. For sulphamethazine, sulphaquinoxaline, sulphametoxazole, danofloxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin and chloramphenicol the optimum conditions were: electrolyte 60 mmol L sodium phosphate + 20 mmol L sodium tetraborate, pH 8.5; voltage 24 kV and temperature, 26 °C. The determination of antimicrobials in milk was carried through by HPLC-DAD using a C18 hybrid column and a mobile phase composed of 0.075 mol L sodium acetate, 0.035 mol L calcium chloride and 0.025 mol Lsodium EDTA, pH 7 (aqueous phase) and methanol:acetonitrile, 75:25 v/v (organic phase), with gradient elution. The sample preparation consisted in protein precipitation followed by solid phase extraction. The methods were validated and used for the analysis of pasteurize milk samples of type A, B and C. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Orientadores: Helena Teixeira Godoy, Roy Edward Bruns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T07:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ballus_CristianoAugusto_M.pdf: 1193943 bytes, checksum: dbcacad3ea4738e91db611595bd0de2b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nos últimos anos, o interesse em relação ao consumo do azeite de oliva aumentou significativamente, em função da divulgação dos benefícios à saúde provenientes da sua ingestão. O azeite de oliva extravirgem é obtido das azeitonas somente por meios mecânicos, e a ausência de etapas posteriores de refino permite a retenção de diversos compostos minoritários, entre eles os compostos fenólicos. Além disso, possui elevado teor de ácidos graxos monoinsaturados. Este trabalho teve como objetivos empregar a técnica de Análise de Componentes Principais (PCA) para classificar as amostras de azeite de oliva extravirgem provenientes de diferentes países por meio da análise da composição em ácidos graxos por cromatografia em fase gasosa, bem como otimizar métodos para separação de 13 compostos fenólicos por eletroforese capilar (CE). Sete ácidos graxos foram determinados por cromatografia em fase gasosa com detector por ionização em chama (GC-FID), e os compostos foram positivamente identificados utilizando-se espectrometria de massas. Dentre as amostras analisadas, nenhuma apresentou indícios de adulteração, considerando-se apenas a composição em ácidos graxos. Com o emprego da PCA, foi possível agrupar separadamente uma amostra de azeite proveniente da Argentina em relação às demais, além da verificação de correlações entre grupos de ácidos graxos. A mistura de 13 compostos fenólicos consistiu em tirosol, hidroxitirosol, oleuropeína glicosídeo, ácido ferrúlico, ácido p-cumárico, ácido cinâmico, ácido p-hidroxibenzoico, ácido gálico, ácido cafeico, luteolina, apigenina, ácido vanílico e ácido 3,4- dihidroxibenzoico. Técnicas estatísticas multivariadas foram empregadas para otimizar a separação, como o planejamento composto central, análise de superfície de resposta e o método de otimização simultânea de Derringer e Suich. Dois tipos de eletrólito para CE foram avaliados: tetraborato de sódio e ácido bórico. Também foram estudadas técnicas de pré-concentração on-line para aumentar a sensibilidade. Os procedimentos multivariados foram eficientes na determinação da condição ótima de separação, usando como respostas a resolução entre pares de compostos e o tempo de corrida. Com o uso da pré-concentração on-line, foi possível reduzir em 7,5 vezes o consumo de amostra e de solventes orgânicos como hexano e metanol. O método com melhor eficiência e menor tempo de corrida utilizou capilar de 50 µm d. i. x 60 cm comprimento efetivo com bulbo estendido, eletrólito ácido bórico 50 mmol L¿1, pH 10,2, 25ºC, injeção de 50 mbar por 25 s com aplicação de voltagem inversa (¿30 kV por 5 s) antes da aplicação da voltagem de corrida (+30 kV) e detecção em 210 nm, promovendo a separação em 12 min / Abstract: In recent years, interest concerning olive oil consumption has increased significantly, owing to the divulgation of health benefits that come from its ingestion. Extra-virgin olive oil is obtained from olives only by mechanical means, and the absence of subsequent refinement stages allows the retention of several minor compounds, phenolic compounds being among them. Moreover, it has a high level of monounsaturated fatty acids. The aims of this work were to employ Principal Component Analysis (PCA) for classifying extravirgin olive oil samples obtained from different countries by means of fatty acids composition analysis by gas chromatography, as well as to optimize methods for the separation of 13 phenolic compounds by capillary electrophoresis (CE). Seven fatty acids were determined by gas chromatography with a flame ionization detector (GC-FID), and the compounds were positively identified using mass spectrometry. Considering just the fatty acid profiles, none of the analyzed samples showed adulteration evidences. Employing PCA, it was possible to group an Argentinian sample separately from the others, as well as to verify certain correlations among fatty acids groups. The 13 phenolic compound mixture consisted of tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein glycoside, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, p-hydroxybenzoic acid, gallic acid, caffeic acid, luteolin, apigenin, vanillic acid and 3,4-dyhydroxybenzoic acid. Multivariate statistical techniques were employed to optimize the separation, central composite central design, response surface analysis and Derringer and Suich¿s simultaneous optimization method. Two CE electrolytes were assessed: sodium tetraborate and boric acid. Preconcentration techniques were also studied to improve CE sensitivity. Multivariate procedures were efficient to determine the optimal separation condition, using peak-pair resolution and running time as the responses. Using on-line preconcentration it was possible to reduce sample and toxic organic solvents, such as methanol and hexane, by a factor of 7,5. The method with the best efficiency and lowest running time employs a capillary column with 50 µm i. d. x 60 cm effective length with extended light path, 50 mmol L¿1 of boric acid electrolyte, pH 10,2, 25ºC, injection of 50 mbar for 25 s with application of reversed voltage (¿30 kV for 5 s) before setting running voltage (+30 kV), and detection at 210 nm, performing the separation at 12 min / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

O ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), substância utilizada como autoindutor nos sistemas de Quorum Sensing da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, foi utilizado como um modelo de estudos para a análise de moléculas secretadas por populações celulares utilizando técnicas eletroanalíticas. Cultivos celulares provenientes de três linhagens diferentes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri foram utilizados para os estudos. Uma linhagem selvagem (WT), que produzia DSF em quantidades naturalmente observadas, e duas linhagens geneticamente modificadas. Em uma linhagem (ΔC) a modificação genética resultava em elevada produção de DSF, para a segunda (ΔF) o resultado era a anulação da produção do autoindutor. As principais técnicas analíticas utilizadas foram: voltametria cíclica, eletroforese capilar e cromatografia líquida (com detecção UV-Vis e acoplada a espectrometria de massas), sendo a última para efeitos de comparação. Procedimentos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos foram realizados como etapas de pré-tratamento de amostras, visando diminuir a quantidade de interferentes e realizar uma pré-concentração do analito. Três metodologias principais foram adotadas. Uma primeira voltada para a diferenciação dos cultivos celulares, analisando-se ou os sobrenadantes provenientes dos cultivos ou os extratos resultantes dos pré-tratamentos desses sobrenadantes, tendo como principal foco a identificação de um sinal diferencial entre os cultivos que correspondesse às quantidades de DSF, ou seja, inexistente para a linhagem ΔF, de alta intensidade para linhagem ΔC e de intensidade intermediária para a linhagem WT. A segunda metodologia foi baseada no uso de uma molécula modelo para realizar experimentos e obter dados como parâmetros físico-químicos, o ácido láurico (ácido dodecanóico) foi escolhido por sua semelhança estrutural e facilidade de obtenção, curvas de calibração e experimentos de separação de moléculas com estrutura semelhante foram realizados com a técnica de eletroforese capilar. Uma terceira metodologia foi desenvolvida utilizando o padrão do ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), curvas de calibração foram obtidas com o padrão isolado apresentando ótimas linearidades, tanto com a técnica de eletroforese capilar quanto com cromatografia líquida com detecção UV-Vis, experimentos de adição de padrão às amostras também foram executados. Os experimentos realizados com as amostras não apresentaram os resultados esperados, os problemas foram associados principalmente à quantidade de interferentes na amostra e a baixa concentração do analito nos cultivos, sendo que os métodos de extração realizados não foram suficientes para solucioná-los. O insucesso da técnica de voltametria cíclica foi associado ao envenenamento do eletrodo, devido à alta quantidade de compostos orgânicos presentes na amostra, e dúvidas relacionadas à eletroatividade do DSF. As dificuldades encontradas com a técnica de eletroforese capilar foram associadas à alta força iônica da amostra, presença de interferentes e baixa concentração do analito nos cultivos. Mesmo os experimentos realizados com cromatografia líquida acoplada a detecção com espectrometria de massas não atenderam às expectativas, dificultando a elucidação dos problemas encontrados até então e impossibilitando o desenvolvimento de uma metodologia que atendesse aos objetivos propostos. / Cis-11-methyl-2-dodecenoic acid, also known as DSF (autoinducer of the Quorum Sensing system used by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri) was explored as a study model for the cell secreted molecules analysis by electroanalytical techniques. Cell cultures from three different cell lines of the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri were used for this study. A wild type (WT), which produced DSF in naturally observed quantities and two genetically modified ones. One of the lines (ΔC) had a genetic modification that resulted in an elevated production of DSF, and the other (ΔF) had a modification that stopped DSF production. Main analytical techniques used were: cyclic voltammetry, capillary electrophoresis and liquid chromatography (with UV-Vis detection and coupled with mass spectrometry), this last one was used with comparison purposes. Liquid-liquid extractions with organic solvents were realized as sample pre-treatment steps aiming the reduction of interfering species and analyte pre-concentration. Three main methodologies were adopted. One based in the differentiation of cell cultures analyzing or the cell culture supernatants or the resulting extracts from the pre-treatment steps. The main focus was the identification of a differential signal between the cultures that corresponded to the DSF quantities, in other words, null for the ΔF line, high intensity for the ΔC line and a an intermediary intensity for the WT line. The second methodology was based in experiments with a model molecule to obtain some data such as physical-chemistry parameters. Lauric acid (dodecanoic acid) was chosen for its structural similarity and easily acquisition. Calibration curves and similar structure molecules separation experiments were realized using capillary electrophoresis. Third and last methodology was developed using standard cis-11-methyl-2-dodecenoic acid (DSF). Calibration curves were obtained with the isolated standard showing great linearities using both capillary electrophoresis and liquid chromatography with UV-Vis detection. Experiments of standard addiction to the samples were also realized. Experiments using the samples did not show the expected results. Problems found were mainly associated with high amount of interfering species and low analyte concentration at the cultures, extraction methods used were not enough to solve this. The failures with the cyclic voltammetric techniques were associated to electrode poisoning, due to the high amount of organic compounds present at the sample, and DSF lack of electroactivity. Difficulties found with capillary electrophoresis were associated with the samples high ionic strength, presence of interfering species and low analyte concentration. Even liquid chromatography coupled with mass spectrometry experiments didn\'t attended the expectations. Making it difficult to elucidate the problems and not allowing the development of a methodology that could achieve the proposed objectives.

A malária é a doença que mais mortes causa no mundo. O uso de fármacos antimaláricos representa a solução mais eficaz para o combate e controle da doença e o interesse pelo desenvolvimento de novos fármacos é grande devido a problemas de resistência. Existe uma grande variedade de fármacos antimaláricos, sendo que muitos deles são quirais, vendidos e administrados como mistura racêmica. Nas últimas décadas, houve um aumento no interesse quanto aos aspectos farmacodinâmicos e farmacocinéticos de fármacos quirais, devido ao conhecimento de que um dos isômeros pode ser mais ativo ou mais tóxico que o outro. Sendo assim, tem-se a necessidade do desenvolvimento de métodos analíticos enantiosseletivos, e a eletroforese capilar tem emergido como uma técnica de separação quiral com alto poder de resolução. Além disso, a inexistência de métodos oficiais para fármacos antimaláricos e os poucos estudos que relatam aplicações na análise de formulações farmacêuticas, demandam o desenvolvimento e validação de novos métodos para tal finalidade. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de dois métodos analíticos, não quiral e quiral, para a determinação de fármacos antimaláricos em formulações farmacêuticas por eletroforese capilar. O método não quiral utilizou eletroforese capilar de zona, sendo otimizado para a separação de 7 fármacos antimaláricos (cloroquina, hidroxicloroquina, primaquina, quinidina, quinina, quinacrina e mefloquina) com um eletrólito composto por 45 mmol L-1 de tampão citrato, pH 4,50, e apresentou um tempo de análise de 10 minutos, permitindo a separação dos diastereoisômeros quinina e quinidina sem a adição de aditivos. O método quiral utilizou eletroforese capilar de zona modificada por ciclodextrina e foi otimizado para separação enantiosseletiva de cloroquina, mefloquina, hidroxicloroquina, primaquina, quinina e quinidina com um eletrólito composto por 50 mmol L-1 de tampão citrato, e 2% de S-β-CD, pH 2,7. A separação dos fármacos antimaláricos e seus enantiômeros foi alcançada com tempo de análise de 12 minutos. Os métodos desenvolvidos foram validados de acordo com os protocolos oficiais, apresentando características adequadas e foram aplicados na determinação de cloroquina, hidroxicloroquina e mefloquina em formulações farmacêuticas. Como figuras de mérito para o método não quiral, tem-se: linearidade (R2 > 0,99), LD (7,43 - 24,4 µmol L-1), LQ (22,5 - 73,8 µmol L-1), precisão intermediária (0,76 - 1,7% RSD), recuperação (97,8 - 102,2%). Para o método quiral, tem-se: linearidade (R2 > 0,99), LD (7,43 - 9,58 µmol L-1), LQ (22,8 - 29,0 µmol L-1), precisão intermediária (0,50 - 1,8% RSD), recuperação (97,7 - 102,5%). Um ensaio de robustez para ambos os métodos foi realizado para comparar os resultados obtidos aplicando-se pequenas variações de tensão e temperatura. Observou-se que não existe uma diferença significativa entre os resultados, a um nível de confiança de P = 95 %. / Malaria is a disease that causes a large number of deaths worldwide. The use of antimalarial drugs is the most effective solution to combat and control the disease and interest in the development of new antimalarial drugs is still of great importance due to resistance issues. There is a wide variety of antimalarial drugs, many of which are chiral, sold and administered as racemic mixtures. In recent decades there has been an increased interest regarding the pharmacodynamic and pharmacokinetic aspects of chiral drugs, due to the knowledge that one of the isomers can be more active or more toxic than the other. Thus, there is a need for the development of enantioselective analytical methods, and capillary electrophoresis has emerged as a chiral technique separation with high resolving power. Moreover, the lack of official methods for antimalarial drugs and the few studies reporting applications in the analysis of pharmaceutical formulations, demands the development and validation of new methods for this purpose. This work aims at the development of two analytical methods, non-chiral and chiral, for the determination of antimalarial drugs in pharmaceutical formulations by capillary electrophoresis. The non-chiral method used capillary zone electrophoresis, being optimized for the separation of 7 antimalarial drugs (chloroquine, hydroxychloroquine, primaquine, quinidine, quinine, quinacrine and mefloquine) with an electrolyte consisting of 45 mmol L-1 of citrate buffer, pH 4.50, and had an analysis time of 10 minutes, allowing separation of isolated diasteroisomers quinine and quinidine without any additives. The chiral method used capillary zone electrophoresis modified by cyclodextrin and was optimized for enantioselective separation of chloroquine, mefloquine, hydroxychloroquine, primaquine, quinine and quinidine with an electrolyte consisting of 50 mmol L-1 citrate buffer and 2% S-β-CD, pH 2.7. The separation of the antimalarial drugs and their enantiomers was achieved in less than 12 minutes. The proposed methods were validated following official protocols, with adequate results and were used for determination of chloroquine, hydroxychloroquine, and mefloquine in pharmaceutical formulations. Figures of merit for the non-chiral method include: linearity (R2> 0.99), LD (7.43 to 24.4 µmol L-1), LQ (22.5 to 73.8 µmol L-1), intermediary precision (0.76 to 1.7% RSD), and recovery (from 97.8 to 102.2%). For the chiral method, we have: linearity (R2> 0.99), LD (7.43 to 9.58 µmol L-1), LQ (22.8 to 29.0 µmol L-1), intermediary precision (0.50 to 1.8% RSD), and recovery (from 97.7 to 102.5%). For both methods a robustness test was performed to compare the results obtained by applying slight variations in voltage and temperature. It was observed that there is no significant difference between the results, a confidence level P = 95%.

Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos para determinação de espécies neutras por eletroforese capilar (CE) com detecção condutométrica sem contato (CCD). Estratégias baseadas em eletroforese capilar em solução livre (FSCE) e cromatografia micelar eletrocinética (MEKC) foram utilizadas em três casos: misturas de álcoois alifáticos, misturas de açúcares e salbutamol. Estas substâncias foram escolhidas por apresentarem ampla distribuição de características químicas. Os n-álcoois possuem regiões polares e apoIares distintas ao longo da cadeia carbônica, sendo que em solução aquosa se apresentam invariavelmente como espécies neutras. Os açúcares, apesar das longas cadeias carbônicas, possuem grande número de hidroxilas uniformemente distribuídas e podem ser ionizados a valores elevados de pH. Já o salbutamol, pode ser encontrado como espécie catiônica, neutra ou aniônica, dependendo do pH do meio. A melhor aproximação para os álcoois foi MEKC, que permitiu a separação e detecção da ordem de 10-4 mol·L-1 para cinco isômeros de pentanol. A utilização de eletrólito de corrida com pH 12,1 permitiu a determinação de frutose, glicose, galactose e sacarose da ordem de 10-5 moI&middotL-1 por FSCE em capilares de 20 µm. Salbutamol pode ser detectado como cátion e ânion em FSCE em limites de detecção da ordem de dez vezes menores que aquele obtido para a espécie neutra por MEKC. Como o mecanismo pelo qual ocorre a detecção condutométrica em MEKC não era ainda bem conhecido, foram desenvolvidos experimentos que ajudassem a elucidá-Io. Medidas de condutividade, viscosidade e análise de impedância de soluções tampão com dodecilsulfato de sódio (SDS) com n-álcoois e experimentos com soluções similares em MEKC demonstraram que a resposta observada com CCD é bastante complexa, pois vários fenômenos contribuem para o comportamento da condutividade na região dos analitos. Os principais fenômenos, os quais não estavam sendo devidamente considerados em modelos anteriores, são a dissociação e a ionização provocadas pelos analitos sobre as micelas. Estes fenômenos seriam particularmente significativos para as mobilidades das espécies envolvidas nas micelas, provocando a propagação de vacâncias que seriam então detectadas. / In the present work, analytical methods for determination of neutral species based on capillary electrophoresis (CE) with contactless conductivity detection (CCD) were developed. Free solution capillary electrophoresis (FSCE) and micelar electrokinetic chromatography (MEKC) were applied to three cases: mixtures of aliphatic alcohols, mixtures of sugars, and salbutamol. These substances were selected due to their distinctiveness. The alcohols have well-defined polar and apoIar regions in their carbonic chain and are typical non-ionic species in aqueous medium. The sugars have a great number of hydroxyl groups along the carbonic chain, which give a polar nature and can be ionized at high pH values. The salbutamol is amphoteric. The best approach for the alcohols was MEKC that allowed separation of five pentanol isomers with limit of detection of 10-4 mol·L-1. A running electrolyte with pH 12.1 allowed determination of 10-5 mol·L-1 of fructose, glucose, galactose, and sucrose, using FSCE with 20-µm inner diameter capillary. The sensitivity for the cationic and anionic forms of albuterol in FSCE was about ten times greater than that one achieved by MEKC for the neutral species. Since the conductivity detection in MEKC was not clearly understood, some experiments were carried out in order to improve the knowledge about it. Conductivity and viscosity measurement as well as impedance analysis of buffered sodium dodecyl sulfate solution with n-alcohols and experiments using similar conditions in MEKC showed that CCD response is complex, because several phenomena contribute to the solution conductivity in the region of the analytes. The main phenomena, which are not properly considered in the previous models, are the effects of the analytes on the dissociation and ionization of the micelles. These phenomena would be responsible for the vacancies detected as negative peaks, which would be formed by the augment of the mobilities of the species involved in the micelle formation.