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smig-1(ev809) is a novel suppressor of multiple distal tip cell (DTC) migration mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. In the C. elegans hermaphrodite, the two U-shaped gonad arms develop and form as a result of the migration of two DTCs. smig-1(ev809) suppresses DTC migration defects of mutants encoding components of intracellular glycosylation pathways as well as extracellular basement membrane glycoproteins. The smig-1(ev809) mutation bypasses the requirement for a fully functional chondroitin pathway and MIG-17 metalloprotease in DTC pathfinding. I found that i) suppression of the hypomorphic chondroitin mutant mig-22(k141) is not completely dependent on MIG-17 activity; ii) the smig-1(ev809) mutant is likely to be a loss- of-function suppressor; and iii) SMIG-1 does not visibly affect the localization of poorly glycosylated MIG-17 on the gonad surface. Understanding SMIG-1 function will shed light on the role of glycosylation, the extracellular matrix and basement membranes in cell migration during development.

smig-1(ev809) is a novel suppressor of multiple distal tip cell (DTC) migration mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. In the C. elegans hermaphrodite, the two U-shaped gonad arms develop and form as a result of the migration of two DTCs. smig-1(ev809) suppresses DTC migration defects of mutants encoding components of intracellular glycosylation pathways as well as extracellular basement membrane glycoproteins. The smig-1(ev809) mutation bypasses the requirement for a fully functional chondroitin pathway and MIG-17 metalloprotease in DTC pathfinding. I found that i) suppression of the hypomorphic chondroitin mutant mig-22(k141) is not completely dependent on MIG-17 activity; ii) the smig-1(ev809) mutant is likely to be a loss- of-function suppressor; and iii) SMIG-1 does not visibly affect the localization of poorly glycosylated MIG-17 on the gonad surface. Understanding SMIG-1 function will shed light on the role of glycosylation, the extracellular matrix and basement membranes in cell migration during development.

Les facteurs d’ADP-ribosylation (ARFs) sont des petites GTPases impliquées dans le transport vésiculaire, la synthèse des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Les isoformes 1 (ARF1) et 6 (ARF6) sont les plus étudiées. ARF1 est connue pour être distribuée à l’appareil de Golgi, alors qu’ARF6 est confinée principalement à la membrane plasmique. Récemment, il a été démontré qu’ARF6 est hautement exprimée et activée dans plusieurs cellules de cancer du sein invasif et que celle-ci contrôle les processus de migration et d’invasion. Cependant, le rôle d’ARF1 dans ces processus biologiques impliqués dans la formation de métastases du cancer du sein demeure méconnu. Dans la présente étude, nous avons utilisé comme modèle d’étude pour ARF1 les MDA-MB-231, une lignée de cellules invasives du cancer du sein exprimant de haut niveau de récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR). Afin d’évaluer le rôle d’ARF1 dans la migration, dans la transition épithéliale mésenchymateuse (EMT) et dans la prolifération cellulaire, nous avons procédé à deux types d’approches expérimentales, soit l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 par l’interférence à l’ARN de même que la surexpression de formes mutantes dominante négative (ARF1T31N) et constitutivement active d’ARF1 (ARF1Q71L), qui miment les formes inactive et active de la GTPase, respectivement. De manière intéressante, la suppression d’ARF1 et la surexpression de la forme inactive d’ARF1 induisent l’arrêt de la migration et de la prolifération des MDA-MB-231 de manière dépendante à l’activation de l’EGFR et ce, en bloquant l’activation de la voie PI3Kinase. De plus, nous démontrons qu’ARF1, de même que les ARF GEFs Cytohésine-1 et Cytohésine-2, contribuent au phénotype invasif des cellules tumorales de cancer du sein. Dans les mêmes approches expérimentales, nous montrons que l’inactivation d’ARF1 dans les MDA-MB-231 déclenche un arrêt de croissance irréversible associé à l’induction de la sénescence et ce, en régulant la fonction de la protéine du rétinoblastome pRb. Enfin, cette étude a permis de mettre en évidence le rôle physiologique d’ARF1 dans les processus de migration et de prolifération cellulaire, deux événements biologiques responsables de la progression du cancer du sein. / The ADP-ribosylation factors (ARFs) are small GTPases involved in vesicular transport, lipids synthesis and cytoskeleton remodelling. The isoforms 1 (ARF1) and 6 (ARF6) are the most studied. ARF1 is classically distributed at the Golgi apparatus whereas ARF6 is found at the plasma membrane and onto recycling endosomes. It was recently demonstrated that ARF6 is highly expressed and activated in several breast cancer cell lines and is associated with enhanced migration and invasiveness. However, the role of ARF1, in these biologicals processes necessary for metastasis formation, remains unclear. In this study, we used MDA-MB-231 cells, an invasive breast cancer cell line, that expressed high levels of EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) to investigate the role of ARF1 in migration and proliferation. To further establish the role of ARF1 in cell migration, EMT and proliferation, we used two experimental approaches. First, we decreased endogenous ARF1 expression by RNA interference and second we overexpressed the dominant negative (ARF1T31N) and constitutively active (ARF1Q71L) ARF1 mutants, which mimick the inactive and active forms of ARF1, respectively. We demonstrated that depletion of ARF1 as well as overexpression of the inactive form of ARF1 blocked EGFR-mediated cell migration and proliferation by inhibiting the activation of PI3Kinase. Moreover, we showed, using invasive and non invasive breast cancer cell lines, that ARF1 and both Cytohesin-1 and Cytohesin-2 are required for invasivness. Using similar approaches, we reported that inactivation of ARF1 in MDA-MB-231 cells promotes cell growth arrest associated to senescence program by regulating the function of the Retinoblastoma protein pRb. Altogether, these findings demonstrate a physiological role for ARF1 in cell migration and proliferation. These two biologicals events are necessary for breast cancer progression.

Le peptide hCAP18/LL-37, une partie de la défense immunitaire innée, a maintenant été reconnu comme multifonctionnelle pour les cellules eucaryotes. Nos études démontrent sa contribution au développement du cancer, montrant qu'il est surexprimé dans la plupart des tumeurs mammaires humaines, active la signalisation la famille de ERBB et augmente le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du sein. Notre comparaison des deux lignées du cancer du sein n'a pas révélé de récepteurs communs, mais une structure peptidique identiques mais de chiralité différente est pré requis pour le peptide dans toutes ses activités. Nous émettons l'hypothèse que LL-37 active indirectement des récepteurs transmembranaires en se liant à la membrane cellulaire. Des peptides tronqués dérivés de LL-37 inhibent ses activités et peuvent aider à concevoir une future thérapie anticancéreuse. / The peptide hCAP18/LL-37, part of the innate immune defense, has now been recognized as multifunctional for eukaryotic cells. Our studies demonstrate its contribution to cancer development, showing that it is overexpressed in most human breast tumors, activates ERBB signaling and increases the metastatic potential of breast cancer cells. Our comparison on two breast cancer lines did not reveal any common receptors but identical structural prerequisites for the peptide in all its activities. We hypothesize that LL-37 indirectly activates transmembrane receptors by attaching to the cellular membrane. Truncated derivatives inhibit its activities and may help to design a future anticancer therapy.

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La migration cellulaire dirigée est un processus crucial lors du développement embryonnaire, de la cicatrisation, de la réponse immunitaire mais aussi lors de la formation de métastases. La réussite de ces processus nécessite que les cellules perçoivent un signal asymétrique, l'interprète et s'oriente pour migrer de façon dirigée. In vivo, la migration est dirigée par de nombreux signaux du microenvironnement cellulaire. L'hypoxie, ou diminution du niveau d'oxygène tissulaire, est une caractéristique importante de l'environnement cellulaire dans l'embryon et dans les tumeurs solides. Du fait de la limitation de la diffusion de l'oxygène, l'hypoxie génère in vivo des gradients d'oxygène. Nous avons développé une méthode originale dans laquelle des cellules épithéliales génèrent elles-mêmes gradient d'oxygène in vitro. Et de façon très intéressante, ces cellules sont capables de migrer de façon directionnelle vers des concentrations en oxygène plus élevées. Cette capacité d'aérotaxie est indépendante de la respiration mitochondriale et des acteurs de réponse à l'hypoxie. Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) seraient les médiateurs de la réponse migratoire au gradient. La production asymétrique de ROS entre l'avant et l'arrière des cellules serait à l'origine de l'activation différentielle du récepteur EGFR et de la persistance des cellules vers des concentrations plus importantes en oxygène. Cette capacité chimio-attractante de l'oxygène, connue chez les bactéries, mais non décrite pour des cellules eucaryotes, pourrait jouer un rôle majeur lors du développement embryonnaire et dans la dissémination métastatique / Cell migration is a crucial process during embryonic development, wound healing, immune system but also metastasis. Success of these processes relies on the capacities of cells to sense an asymmetric signal, interpret it and orient themselves to migrate in a directed manner. In vivo, migration is guided by several signals from the cellular microenvironment. Hypoxia, or decrease in the level of tissue oxygen, is an important feature of the cellular environment in the embryo and in solid tumors. Owing to the limitation of oxygen diffusion, hypoxia often generates oxygen gradients in vivo. We have developed an original method in which epithelial cells themselves generate oxygen gradient in vitro. And interestingly, these cells are able to migrate directionally to higher oxygen concentrations. This aerotaxis ability is independent of mitochondrial respiration and hypoxia response pathway. The reactive oxygen species (ROS) would mediate the migratory response to the gradient. The asymmetric production of ROS between the front and the back of the cells would be at the origin of the differential activation of the EGFR receptor and the persistence of cells towards higher oxygen concentrations. This chemoattractant capacity of oxygen, known in bacteria, but not described for eukaryotic cells, could play a major role in embryonic development and in metastatic dissemination

O dimorfismo sexual relacionado à hipertensão arterial surge na adolescência e persiste por toda vida adulta. Homens apresentam maior incidência de doenças cardiovasculares quando comparados a mulheres de mesma faixa etária. O mesmo perfil é observado em modelos animais de hipertensão, nos quais machos apresentam maiores níveis pressóricos quando comparados a fêmeas. Dessa forma, a testosterona é frequentemente relacionada à hipertensão arterial. Entretanto, os mecanismos pelos quais a testosterona exerce efeitos vasculares ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da testosterona sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), importantes mediadores do processo hipertensivo, em células da musculatura lisa vascular (CMLV) de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Os receptores para andrógenos, as fontes de EROs (papel da NADPH oxidase), bem como os efeitos funcionais celulares (migração celular) relacionados aos efeitos da testosterona também foram analisados. Para tanto, CMLV do leito mesentérico de ratos Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) e SHR foram isoladas, cultivadas e estimuladas com testosterona 10-7mol/L em diferentes tempos, de acordo com cada protocolo. Sempre que necessário, as células foram pré-incubadas por 30 minutos com inibidores específicos para o estudo dos mecanismos envolvidos, tais como: flutamida (inibidor do receptor clássico para andrógenos), apocinina (inibidor da NADPH oxidase), PP2 (inibidor da c-Src), actinomicina D (inibidor da transcrição gênica) e cicloheximida (inibidor da síntese protéica). Nossos resultados indicam que a testosterona induz a geração de EROs por mecanismos dependentes do tempo e da linhagem de ratos, de modo que células isoladas de animais SHR são mais sensíveis a testosterona. Esta geração ocorre por dois mecanismos principais: um mediado pelo receptor clássico para andrógenos (AR) e outro mediado pelo receptor de membrana para andrógenos (ARm), resultando em efeitos genômicos e não-genômicos, respectivamente. Enquanto os efeitos genômicos são comuns, isto é, são observados em células de animais normotensos e hipertensos, os efeitos não-genômicos são específicos, e ocorrem exclusivamente em células de animais hipertensos. A geração genômica de EROs, mediada pelo AR, depende da modulação da expressão de subunidades da NADPH oxidase. Por outro lado, a geração não-genômica, é mediada pelo ARm, independe de síntese protéica, e ocorre devido à ativação de vias de sinalização específicas, reguladoras do complexo enzimático NADPH oxidase. As EROs formadas a partir do estímulo com a testosterona tanto por mecanismos genômicos ou não-genômicos levam a migração celular por mecanismos mediados pelo RA. Nossos resultados sugerem que a testosterona tem papel importante na função de células da musculatura lisa vascular, o que pode contribuir para algumas alterações vasculares características do processo hipertensivo. Portanto, nosso trabalho é o primeiro a demonstrar que a testosterona regula vias de sinalização redox em CMLV levando a efeitos funcionais importantes, relacionados ao remodelamento vascular, os quais podem contribuir para o desenvolvimento e manutenção da hipertensão arterial. / Sexual dimorphism related to hypertension begins at childhood and persists through adulthood. The incidence of cardiovascular diseases is higher in men when compared to age-matched women. Although testosterone has been associated to the sexual dimorphism in hypertension, the mechanisms whereby testosterone acts in the vasculature remain unclear. The main objective of this study was to determine whether testosterone induces reactive oxygen species (ROS) generation, key players on hypertension, in vascular smooth muscle cells (VSMC) isolated from normotensive and hypertensive rats. The signaling pathways and the androgen receptors activated by testosterone, the role of NADPH oxidase in ROS generation and the cellular outcomes (cell migration) were also determined. Accordingly, VSMC isolated from the mesenteric bed of Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive (SHR) rats were stimulated with testosterone 10-7mol/L for different periods of time, according to each protocol. Whenever appropriate, cells were pre-incubated with specific inhibitors, such as flutamide 10-5mol/L (nuclear androgen receptor antagonist), apocynin 3x10-5mol/L (NADPH oxidase inhibitor), PP2 10-5mol/L (c-Src inhibitor), actinomycin D 10-5mol/L (inhibitor of gene transcription), and cycloheximide 10-5mol/L (protein synthesis inhibitor). Our findings demonstrate that testosterone induces ROS formation in a time and strain-dependent manner. Augmentation of ROS formation is higher in SHR-VSCMC, indicating an increased sensitivity of SHR-VSMC to testosterone stimuli. Testosterone-induced ROS production occurs by two main mechanisms: the first mediated through the classical androgen receptor (AR) and the second mediated through membrane-associated androgen receptor (ARm), leading to genomic and non-genomic effects, respectively. Whereas the genomic effects occur in VSMC from both strains, non-genomic effects are only observed in SHR-VSMC. The genomic ROS production is mediated through AR and depends on modulation of NADPH oxidase subunits. On the other hand, non-genomic ROS formation is mediated through RAm, does not rely on protein synthesis and occurs via specific signaling pathways that regulate NADPH oxidase. Genomic and non-genomic ROS production by testosterone leads to a common final effect: VSMC migration, indicating that testosterone plays a key role in VSMC function. These results indicate that testosterone signals through redox-sensitive pathways, important in c-Src-mediated migration of VSMCs in SHR. Such processes may contribute to vascular remodeling in hypertension.

Le succès de la réponse immunitaire repose en grande partie sur la capacité des leucocytes à se déplacer et à accomplir leur fonction au sein de structures anatomiques précises. Le fait qu’il puisse exister des mécanismes intrinsèques de coordination entre ces fonctions spécifiques et la migration de ces cellules n’a jamais été étudié auparavant. Nos travaux mettent en évidence, pour la première fois, l’existence d’un couplage entre la migration et la macropinocytose dans les cellules dendritiques qui explorent leur environnement en internalisant une grande quantité de matériel extra-cellulaire. C’est la Chaîne Invariante, protéine chaperon impliquée dans l’apprêtement des antigènes, qui est responsable de ce couplage en détournant le moteur Myosine II de l’arrière de la cellule, où elle promeut la migration, vers l’avant de la cellule. Ce recrutement transitoire de Myosin II autour des macropinosomes à l’avant favorise la macropinocytose et la délivrance de l’antigène dans les lysosomes, mais ralentit la cellule. L’implication de la Myosine II à la fois dans la migration et la capture d’antigène permet donc le couplage moléculaire entre ces deux processus et leur coordination spatio-temporelle. Cependant, les voies de signalisation impliquées dans le couplage avant/arrière dans les cellules dendritiques immatures restent encore méconnues. L’ensemble de mes travaux de thèse montrent que la libération de calcium du réticulum endoplasmique à travers les récepteurs IP3 (IP3Rs) est nécessaire pour maintenir le niveau de phosphorylation de la chaîne légère de Myosin (MLC) et la polarisation avant/arrière de Myosine II au cours de la migration des cellules dendritiques immatures. Nous montrons que les récepteurs IP3R1, 2 et 3 sont requis pour atteindre une vitesse maximale en 2- et 3-Dimension, et que le récepteur IP3R3, et dans une moindre mesure IP3R1, favorisent la persistance des cellules. En revanche, l’inhibition de l’expression du récepteur IP3R3 augmente la capacité des cellules dendritiques immatures à capturer l’antigène, ce qui est en accord avec notre résultat montrant que la capture de l'antigène est inversement reliée à la locomotion de cellules dendritiques. Nous proposons que le relargage du calcium par le réticulum endoplasmique favorise l’activité de la myosine II ce qui permet aux cellules dendritiques de ralentir de façon transitoire. Ce relargage calcique permet aux cellules dendritiques du optimiser l'internalisation des antigènes extracellulaires en maintenant leur polarité ce qui leur permet d’optimiser ainsi leur capacité d'échantillonnage de l’environnement. / The immune response heavily relies on the migration capacity of leukocytes. These cells must stop in precise anatomical locations to fulfill a particular task. But whether and how specific functions are coordinated with migration by cell-intrinsic mechanisms is not known. We here show that in dendritic cells, which patrol their environment for the presence of antigens by internalizing extracellular material, macropinocytosis is coupled to cell migration. Coupling relies on the diversion of the Myosin II motor from its migratory function at the cell rear to macropinosomes at the cell front by the Invariant Chain, a cell-specific regulator of antigen presentation. Transient Myosin II recruitment at the cell front promotes antigen macropinocytosis and antigen delivery to endolysosomes but antagonizes cell migration. Thus, the requirement for Myosin II for both migration and antigen capture provides a molecular mechanism to couple these two processes and allow their coordination in time and space. However, the signaling pathways involved in back/front coupling in migrating immature DCs remain unknown. Here we show that calcium released from the endoplasmic reticulum through IP3 Receptors (IP3Rs) is required to maintain Myosin regulatory light Chain (MLC) phosphorylation and Myosin II back/front polarization during DC locomotion. We found that while IP3R1, 2 and 3 are required for immature DCs to reach maximal speed in 2-Dimensional and 3-Dimensional environments, IP3R3 and to a lesser extent IP3R1 positively regulate their persistency. On the contrary, silencing of IP3R3 increases antigen uptake by immature DCs, consistent with our finding showing that antigen capture is inversely coupled to DC locomotion (Appendix, manuscript #1). We propose that by promoting myosin II activity, calcium released from the ER help DCs to transiently slow-down to uptake extracellular antigens without losing their polarity and thereby optimizes their environment sampling capacity.

Dans cette thèse, nous avons concentré notre étude sur les mécanismes qui génèrent la polarité cellulaire, en particulier dans le cas de la migration cellulaire. Malgré les derniers développements concernant l’observation de l’activité des RhoGTPases, les principes qui dictent la capacité des cellules à coordonner plusieurs modules de signalisation en parallèle ne sont toujours pas compris. L’optogénétique est un outil d’intérêt pour disséquer ces réseaux de signalisation à partir de la création d’une perturbation dont les caractéristiques spatiotemporelles sont contrôlées. Tout d’abord, à partir de la caractérisation des différents processus biophysiques en jeu, nous avons établi les relations quantitatives entre l’illumination et les gradients moléculaires que l’on induit. Nous avons déterminé qu’il est possible de créer des gradients subcellulaires avec une résolution spatiale de l’ordre de 5 μm et temporelle d’environ 3 minutes Ensuite, nous avons utilisé cette approche optogénétique pour contrôler l’activité de Cdc42, Rac1 et RhoA. Nous avons caractérisé les effets subcellulaires de l’activation de ces RhoGTPases en utilisant l’activité de membrane, les changements de forme cellulaire et leurs déplacements comme rapporteurs de la polarisation et de la migration. Nous avons ainsi montré qu’une activation locale de RhoGTPase permet la réorganisation interne des cellules jusqu’à générer un phénotype de migration.Enfin, nous avons caractérisé les effets d’une activation locale de RhoA sur différents acteurs moléculaires comme les points focaux d’adhésion, l’actine et les moteurs moléculaires myosines. Nous avons mesuré alors la dynamique de l’intégration des points focaux dans le cytosquelette et analysé la réponse du réseau d’acto-myosine au cours d’évènements de rétraction.Notre approche optogénétique couple le contrôle d’une perturbation à la mesure de la réponse cellulaire simultanément de manière directe et reproductible. Elle apporte une méthode pour contrôler la polarité cellulaire et une manière de disséquer des réseaux de signalisation à l’échelle subcellulaire. / In this thesis we focus on the mechanisms that establish cell polarization, particularly during cell migration. Despite latest developments that enable visualization of RhoGTPases activity, the underlying principles dictating the cell’s ability to coordinates multiple signaling modules is still unclear. Optogenetic methods have been recognized as promising tools to dissect these intracellular signaling networks by allowing perturbations to be spatially and temporally controlled. We established the quantitative relationship between illumination patterns and the corresponding gradients of induced signaling activity through the characterization of the biophysical properties of CRY2/CIBN. We determined that it is possible to create subcellular gradients of recruited proteins of different shapes of choice up to spatial resolutions of 5μm and temporal ones of ca. 3 minutes.We applied the aforementioned optogenetic approach as a means to perturb the activity of cdc42, Rac1 and RhoA. We characterized the effects of subcellular activation of those RhoGTPases using membrane activity, cell shape changes and cell displacement as reporters of cell polarization and migration. We show that localized activation of RhoGTPases can trigger cellular organization and drive the cell into a migrating state.We also characterized the effects of local activation of RhoA on different cellular effectors as focal adhesion complexes, actin filaments and myosin molecular motors. We measured the dynamics of the newly formed focal adhesion complexes and the acto-myosin complex during retraction events.Altogether, our optogenetic methodology enables simultaneous measurement of the imposed perturbation and the cell response in a straightforward and reproducible way. It provides a quantitative way to control cell polarity and a step forward in the dissection of subcellular signaling networks.