De nombreuses études ont contribué à dévoiler les mécanismes à la base de l’athérosclérose. Cette maladie est médiée par un important déséquilibre homéostatique, qui entraine une inflammation vasculaire contribuant à sa progression. Plusieurs équipes de recherche ont axé leurs investigations sur l’étude d’importants biomarqueurs inflammatoires telle que la protéine C-réactive (CRP). Considérée comme facteur de risque de maladies cardiovasculaires, cette dernière participe aussi aux différents stades du développement de l’athérosclérose. Notre étude révèle pour la toute première fois un processus d’auto-induction de l’expression de la CRP régit par les CE vasculaires. Ce mécanisme représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour la prévention de l’athérosclérose. L’estrogène (E2) est une hormone féminine qui possède un rôle athéroprotecteur via entre autres, la modulation de la réponse inflammatoire. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si elle avait un effet bénéfique sur le profil athérogénique de la CRP exprimée par les cellules endothéliales (CE). En effet, nos travaux ont démontré que l’E2 a la capacité de moduler le rétrocontrôle positif de l’expression de la CRP, contribuant à diminuer également le profil inflammatoire de cette dernière. De plus, nous avons établi que l’E2 restitue une importante voie pro-angiogénique impliquant la réponse migratoire des CE au VEGF, en contrant l’effet d’inhibition de la CRP. Cette nouvelle découverte nous a permis d’éclaircir un important mécanisme de guérison vasculaire de cette hormone dans un contexte inflammatoire. Ainsi, ces données contribuent à mieux comprendre la production endogène de la CRP par les CE vasculaires et l’activité cardioprotectrice de l’E2. / Numerous studies have contributed to reveal the mechanisms underlying cardiovascular diseases such as atherosclerosis. This disease is mediated by an important homeostatic imbalance, which causes vascular inflammation contributing to its progression. Several research groups have focused their studies on inflammatory biomarkers such as C-reactive protein (CRP). Considered as a risk factor for cardiovascular diseases, it also participates in various stages of atherosclerosis development. Our study shows for the first time a process of self-induction of the CRP expression regulated by vascular EC. This mechanism represents a new potential therapeutic target for the prevention of atherosclerosis formation. Estrogen (E2) is a female hormone which has an atheroprotective role through various vascular regulation mechanisms including modulation of the inflammatory response. Thus, we sought to determine whether it had a beneficial effect on atherogenic profile of CRP expressed by endothelial cells (EC). Indeed, our work has demonstrated for the first time that E2 has the ability to modulate the CRP expression positive feedback identified in our study, which also helps to reduce the inflammatory profile of the latter. In addition, we determined that E2 restores an important proangiogenic response involving migration of vascular EC to VEGF, by countering the inhibition effect of CRP. This new discovery has enabled us to clarify an important vascular healing mechanism of this hormone in an inflammatory context. Thus, these data provide further advances that contribute to a better understanding of the endogenous CRP production by vascular EC and the cardioprotective activity of E2.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L'endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s'est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l'activation de l'endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l'adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d'étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d'abord, nous avons exploré l'utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d'une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d'un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d'optimiser les techniques d'étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l'origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les " Endothelial Colony Forming Cells " (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l'effet de diverses matrices et de la densité d'ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l'obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l'HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l'absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l'HTAP et non dans l'hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L'autre étude a montré l'intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d'HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L'hypothèse récente d'une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l'effet d'un processus d'ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n'a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l'inverse, l'hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC.

Le gène Egfl7 codant une protéine majoritairement sécrétée par les cellules endothéliales a été découvert au sein du laboratoire. Ce gène a la particularité d'héberger dans sa séquence intronique deux microARNs complémentaires nommés miR126-3p et miR-126-5p. Les microARNs sont de petites séquences de 20 à 25 nucléotides régulant l'expression de leurs cibles en se fixant sur leurs ARNm pour induire leur dégradation ou l'inhibition de leur traduction. L'expression endothéliale et les fonctions du microARN miR126-3p (microARN principal du duplex miR126-3p/126-5p) ont déjà été très largement abordées alors que celles de miR126-5p (microARN secondaire du duplex) restent inconnues. Les objectifs de notre étude ont donc été d'établir le patron d'expression de miR-126-5p lors du développement vasculaire et de caractériser ses fonctions dans les cellules endothéliales. Par hybridation in situ, miR-126-5p a été détecté dans les vaisseaux sanguins embryonnaires de souris principalement dans les cellules endothéliales. Cette spécificité endothéliale a été retrouvée dans différents organes tels que le cœur et les poumons et est maintenue in vitro. L'inhibition et la surexpression de miR-126-5p dans des cellules endothéliales veineuses (HUVEC) in vitro n'affectent pas les capacités de prolifération, de migration ou d'organisation en pseudocapillaires de ces cellules. En revanche, l'inhibition de miR-126-5p dans les HUVECs entraine une répression de l'adhérence des leucocytes à la surface d'un tapis de cellules endothéliales ainsi qu'une augmentation de la transmigration de monocytes à travers une monocouche endothéliale. A l'inverse, sa surexpression génère des phénotypes opposés. Des analyses in silico de recherche de cibles pour miR-126-5p en lien avec le recrutement leucocytaire ont permis d'identifier une protéine participant à la transmigration des leucocytes in vitro et in vivo nommée ALCAM. A l'aide de test de transactivation, nous avons pu démontrer que miR-126-5p était capable de se fixer au 3'UTR de l'ARNm d'ALCAM afin de réprimer l'expression de la protéine. De plus, l'augmentation de la transmigration induite par la chute d'expression de miR-126-5p dans les cellules endothéliales est inhibée suite au blocage direct de la protéine ALCAM montrant ainsi que l'effet répresseur de miR-126-5p sur ce mécanisme est établi via ALCAM. Une étude par microarray, réalisée sur des HUVECs où miR-126-5p a été inhibé, a permis d'identifier une seconde cible pour miR-126-5p nommée SetD5 pour laquelle aucune fonction n'est connue à ce jour. Des tests de transactivation ont permis de confirmer que SetD5 était une cible de miR-126-5p. De plus, l'effet de miR-126-5p sur l'adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales est directement lié à la modulation d'expression de ce gène. Enfin, l'analyse de l'inhibition de miR-126-5p in vivo a permis de montrer que notre microARN d'intérêt contrôle effectivement les expressions d'ALCAM et de SetD5. Cependant, alors que miR-126-5p régule uniquement l'expression d'ALCAM dans les poumons, celle de SetD5 est sous le contrôle de miR-126-5p dans la rétine.Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence l'expression endothéliale de miR-126-5p et d'identifier deux de ses cibles lui permettant de jouer un rôle dans le recrutement des leucocytes au niveau de l'endothélium.

Malgré l'efficacité thérapeutique avérée des agents anti-angiogéniques et des agents anti-vasculaires (VDA), le mécanisme d'action précis des stratégies ciblant les vaisseaux sanguins tumoraux, les raisons de leur efficacité ainsi que les mécanismes de résistance à ces drogues sont encore mal compris. Il est rapidement apparu essentiel d'identifier des biomarqueurs capables de refléter l'angiogénèse tumorale ou les effets sur la vascularisation tumorale de ces traitements. Compte tenu de leur importance dans des pathologies vasculaires, les cellules endothéliales matures circulantes (CEC) et les progéniteurs endothéliaux circulants (CEP) ont d'emblée été pressenties comme des candidats intéressants pour être des biomarqueurs de réponse aux stratégies ciblant la vascularisation tumorale. Nous avons exploré l'intérêt de ces cellules en tant que biomarqueurs de l'angiogénèse dans des tumeurs pédiatriques, et leur rôle en tant que biomarqueurs de traitement par des agents anti-angiogéniques chez des sujets adultes atteints de cancer. Ces travaux ont mis en lumière l'intérêt des CEP et ont été à la source d'un travail plus " mécanistique " où nous avons étudié dans différents modèles murins le rôle des CEC et CEP dans le mécanisme d'action des agents anti-vasculaires et plus particulièrement le rôle fonctionnel des CEP dans la résistance à ces molécules. Par des stratégies d'association d'agents anti-angiogéniques aux VDA destinées à inhiber les CEP, nous montrons l'augmentation de l'activité anti-tumorale des VDA et offrons un rationnel mécanistique pour optimiser les schémas thérapeutiques actuels des traitements anti-vasculaires. Nos données apportent des arguments en faveur du rôle potentiel de ces cellules en tant que biomarqueurs de l'angiogénèse, des traitements anti-angiogéniques et de la résistance aux traitements anti-vasculaires.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par un intense remodelage de la microcirculation pulmonaire affectant principalement les artérioles pulmonaires musculaires. Lorsqu'elle survient en l'absence de condition associée, l'HTAP est considérée comme idiopathique (HTAPi). L'HTAP représente une pan-vasculopathie au cours de laquelle chaque type cellulaire (cellules endothéliale, musculaire lisse, fibroblaste) constituant la paroi vasculaire joue un rôle spécifique dans la réponse à l'agression. Les buts de ce travail étaient d'explorer l'implication de différentes voies de signalisation dans l'initiation ou la progression de la maladie. Les différentes études ont été réalisées à partir de cultures de cellules musculaires lisses (CML) d'artère pulmonaire et de cellules endothéliales (CE) pulmonaires obtenues à partir de prélèvements pulmonaires humains obtenus lors de transplantation chez des patients souffrant d'HTAP réfractaire.Des études antérieures avaient souligné le rôle majeur de la sérotonine au cours de l'HTAP idiopathique. Dans une première étude, nous avons étudié le rôle respectif de la sérotonine (5-HT), de son transporteur (5-HTT) ou de ses récepteurs (5-HT1B, 5-HT2A et 5-HT2B) dans le remodelage vasculaire pulmonaire mis en évidence dans l'HTP associée à diverses conditions. Les résultats de cette première étude montraient qu'une surexpression du 5-HTT dans les CML d'artère pulmonaire est une voie physiopathologique commune impliquée dans le remodelage vasculaire pulmonaire observé dans l'HTAP idiopathique, la maladie veino-occlusive et l'HTAP associée à différentes pathologies.Des mécanismes inflammatoires jouent probablement un rôle important dans la physiopathologie du remodelage microvasculaire pulmonaire. En effet, des infiltrats composés de cellules inflammatoires mononucléées (macrophages, lymphocytes T et B et cellules dendritiques) sont fréquemment mis en évidence autour des lésions vasculaires pulmonaires de patients présentant une HTAP idiopathique. Les mécanismes impliqués dans le recrutement de ces cellules mononucléées demeurent mal compris et nous avons étudié le rôle d'une chimiokine, CC chemokine ligand 2 (CCL2). Les résultats de cette seconde étude montraient que CCL2 était surexprimée au cours de l'HTAP idiopathique. La source de cette surexpression semblait provenir des cellules endothéliales pulmonaires. CCL2 agissait non seulement sur le recrutement des monocytes mais également sur les cellules musculaires lisses vasculaires pulmonaires en stimulant leur prolifération et leur migration.Des mutations germinales de gènes codant pour des membres de la famille des récepteurs du TGF tels que BMPR2 (Bone Morphogenic Protein Receptor type 2) sont retrouvées dans près de 70% des cas d'HTAP familiale mais également chez 10 à 30 % des cas d'HTAPi apparemment non familiales. Ces patients sont regroupés sous le terme d'HTAP " héritable " (HTAPh). Nous avons, dans une troisième étude, évalué si la dysfonction des voies de signalisation secondaires aux mutations de BMPR2 pouvait avoir des conséquences sur la voie de l'endothéline 1 (ET-1) qui représente l'une des cibles thérapeutiques de choix au cours de l'HTAP. Les résultats de cette troisième étude montraient que l'ET-1 était surexprimée au cours de l'HTAP avec ou sans mutation de BMPR2. En revanche, une surexpression des récepteurs ET-A dans les CML était mise en évidence au cours de l'HTAPh et était associée à une augmentation de l'effet pro-proliférant de l'ET-1 sur les CML.Ces résultats révèlent que des facteurs vaso-actifs (ET-1, 5-HT) et inflammatoires jouent un rôle déterminant dans la physiopathologie de l'HTAP et pourraient représenter de nouvelles cibles thérapeutiques.

Les biomarqueurs sanguins peuvent être utilisés pour définir le pronostic des patients ou permettre de déterminer les altérations moléculaires des cancers, et peut-être pouvoir guider les traitements de thérapies ciblées.Les cellules tumorales circulantes sont le reflet de la cascade métastatique et de la progression tumorale. La détection et la caractérisation des CTC est un domaine clé de la recherche dans le cancer. Cependant, il n'existe pas de méthode standard pour la détection des CTC, et le premier objectif de notre étude a été de comparer deux systèmes de détection des CTC basé sur l'expression de l'antigène EpCAM (CellSearch), ou la taille des cellules (ISET). Nos résultats montrent qu'il existe une bonne corrélation pour la détection des CTC dans les cancers du sein ou de la prostate, mais pas dans les cancers bronchiques. Ces résultats suggèrent qu'il est nécessaire de développer d'autres techniques de détection des CTC pour l'énumération et la caractérisation pour permettre une médecine de précision.A ce jour il n'existe aucun marqueur validé pour prédire l'efficacité des antiangiogéniques. Les CEC et CEP sont des marqueurs prometteurs. Dans notre étude, nous avons fait l'hypothèse que les CEC et les CEP pouvaient être pronostic de la survie des patients inclus dans les études de phases précoces. Nos résultats montrent qu'un taux élevé de CEP est associé à un mauvais pronostic, et que les CEP pourraient permettre de mieux sélectionner les patients. En conclusion, les marqueurs sanguins comme les CTC, les CEC ou les CEP peuvent être utilisés comme des facteurs pronostiques ou permettre une caractérisation moléculaire, et être une partie intégrante des programmes de médecine de précision.

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

L’adrénomédulline (AM) est un des principaux facteurs de croissance impliqués dans la formations de nouveaux vaisseaux. L’AM est responsable de la formation de jonctions adhérentes stables entre cellules endothéliales vasculaires via le maintien d’un état déphosphorylé du complexe d’adhésion VE-cadhérine/caténines. La phosphorylation de tyrosines est un évènement régulé par un équilibre entre protéine tyrosine kinases et protéine tyrosine phosphatases (PTP). Peu de choses sont encore connues sur le rôle des PTPs dans les voies de signalisation de l’AM au niveau des cellules endothéliales. La SHP2 a été décrite comme étant capable de déphosphoryler le complexe d’adhésion. Son association avec la β-caténine lui permet de contrôler le niveau de phosphorylation du complexe et de maintenir l’association entre VE-cadhérine et caténines. Nous avons ainsi émis l’hypothèse selon laquelle l’AM puisse agir sur la SHP2 permettant ainsi le contrôle de la formation du complexe d’adhésion VE-cadhérine-β-caténine. Nos travaux ont mis en évidence une augmentation de l’activation de la SHP2 induite par l’AM dans les cellules endothéliales entrainant sa localisation au niveau de la membrane et la stabilisation de l'adhésion cellulaire induite par la VE-cadhérine en réduisant le niveau de phosphorylation de cette dernière. Le blocage de la SHP2 entraine des effets opposés avec une inhibition de la déphosphorylation induite par l’AM de la VE-cadhérine sur les tyrosines 731 et 658. En résumé, l’AM régule l’activité de la SHP2 via sa phosphorylation sur la tyrosine 542 ce qui entraine une stabilisation des contacts cellules-cellules via une diminution de la phosphorylation de la VE-cadhérine. / Adrenomedullin (AM) is one of the main factors in the formation of tumor neo-vessels. It's responsible for stable adherent junction formation between vascular endothelial (VE) cells by maintaining VE-cadherin/catenins adhesion complex in a dephosphorylated status. Indeed, AM blockade induces phosphorylation of VE-cadherin in tyrosine 731, which is followed by disruption of VE-cadherin-mediated cell-cell contacts of endothelial cells (ECs), thereby leading to EC adhesion loss and tumor vessels disruption. Tyrosine phosphorylation events are controlled by the balance of activation of protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases (PTPs). Little is known about the role of endogenous PTPs in AM signaling in ECs. SHP2 is capable of dephosphorylating the complex. Its association with β-catenin allows it to control the dephosphorylated steady state of the complex and to maintain the VE-cadherin/β-catenin association. To study the mechanism of AM on the inter-endothelial junction stabilization, we hypothesized that AM may act on SHP2 allowing a control upon formation of VE-cadherin-β-catenin complex. In this study, we found that SHP2 activity is markedly increased by AM. In ECs, AM-induced phospho-SHP2 Y542 activity to localize at the human umbilical vein endothelial cell membrane and stabilizes VE-cadherin-mediated cell-cell adhesions by reducing VE-cadherin tyrosine phosphorylation. SHP2 inhibition causes opposite effects with inhibiting AM-induced dephosphorylation of VE-cadherin at Y731 and Y658. In summary, AM regulates SHP2 activity through phosphorylation of Y542, which stabilizes cell-cell adhesions through reducing tyrosine phosphorylation of VE-cadherin.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par un intense remodelage de la microcirculation pulmonaire affectant principalement les artérioles pulmonaires musculaires. Lorsqu'elle survient en l'absence de condition associée, l'HTAP est considérée comme idiopathique (HTAPi). L'HTAP représente une pan-vasculopathie au cours de laquelle chaque type cellulaire (cellules endothéliale, musculaire lisse, fibroblaste) constituant la paroi vasculaire joue un rôle spécifique dans la réponse à l'agression. Les buts de ce travail étaient d'explorer l'implication de différentes voies de signalisation dans l'initiation ou la progression de la maladie. Les différentes études ont été réalisées à partir de cultures de cellules musculaires lisses (CML) d'artère pulmonaire et de cellules endothéliales (CE) pulmonaires obtenues à partir de prélèvements pulmonaires humains obtenus lors de transplantation chez des patients souffrant d'HTAP réfractaire.Des études antérieures avaient souligné le rôle majeur de la sérotonine au cours de l'HTAP idiopathique. Dans une première étude, nous avons étudié le rôle respectif de la sérotonine (5-HT), de son transporteur (5-HTT) ou de ses récepteurs (5-HT1B, 5-HT2A et 5-HT2B) dans le remodelage vasculaire pulmonaire mis en évidence dans l'HTP associée à diverses conditions. Les résultats de cette première étude montraient qu'une surexpression du 5-HTT dans les CML d'artère pulmonaire est une voie physiopathologique commune impliquée dans le remodelage vasculaire pulmonaire observé dans l'HTAP idiopathique, la maladie veino-occlusive et l'HTAP associée à différentes pathologies.Des mécanismes inflammatoires jouent probablement un rôle important dans la physiopathologie du remodelage microvasculaire pulmonaire. En effet, des infiltrats composés de cellules inflammatoires mononucléées (macrophages, lymphocytes T et B et cellules dendritiques) sont fréquemment mis en évidence autour des lésions vasculaires pulmonaires de patients présentant une HTAP idiopathique. Les mécanismes impliqués dans le recrutement de ces cellules mononucléées demeurent mal compris et nous avons étudié le rôle d'une chimiokine, CC chemokine ligand 2 (CCL2). Les résultats de cette seconde étude montraient que CCL2 était surexprimée au cours de l'HTAP idiopathique. La source de cette surexpression semblait provenir des cellules endothéliales pulmonaires. CCL2 agissait non seulement sur le recrutement des monocytes mais également sur les cellules musculaires lisses vasculaires pulmonaires en stimulant leur prolifération et leur migration.Des mutations germinales de gènes codant pour des membres de la famille des récepteurs du TGF tels que BMPR2 (Bone Morphogenic Protein Receptor type 2) sont retrouvées dans près de 70% des cas d'HTAP familiale mais également chez 10 à 30 % des cas d'HTAPi apparemment non familiales. Ces patients sont regroupés sous le terme d'HTAP « héritable » (HTAPh). Nous avons, dans une troisième étude, évalué si la dysfonction des voies de signalisation secondaires aux mutations de BMPR2 pouvait avoir des conséquences sur la voie de l'endothéline 1 (ET-1) qui représente l'une des cibles thérapeutiques de choix au cours de l'HTAP. Les résultats de cette troisième étude montraient que l'ET-1 était surexprimée au cours de l'HTAP avec ou sans mutation de BMPR2. En revanche, une surexpression des récepteurs ET-A dans les CML était mise en évidence au cours de l'HTAPh et était associée à une augmentation de l'effet pro-proliférant de l'ET-1 sur les CML.Ces résultats révèlent que des facteurs vaso-actifs (ET-1, 5-HT) et inflammatoires jouent un rôle déterminant dans la physiopathologie de l'HTAP et pourraient représenter de nouvelles cibles thérapeutiques. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by intense pulmonary vascular remodelling affecting mainly the muscular pulmonary arteries and leading to increased pulmonary vascular resistance. When it occurs in the absence of associated conditions, PAH is regarded as idiopathic (iPAH). PAH represents a panvasculopathy in which each cell type constituting the vascular wall (endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblast) plays a specific role. The aims of this work were to explore the implication of various pathways in the initiation or the progression of the disease. The various studies were carried out using pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) and pulmonary endothelial cells (PEC) obtained during lung transplantation from patients with refractory PAH.Former studies have emphasized the major role of serotonin (5-HT) in the process of pulmonary vascular remodelling in iPAH. In a first study, we studied the respective role of 5-HT, the 5-HT transporter (5-HTT) and several 5-HT receptors (5-HT1B, 5-HT2A and 5-HT2B) on PASMC proliferation in cells from patients with PH associated with various conditions. The results of this first study showed that 5-HTT overexpression in PASMC is a common pathogenic mechanism in various forms of PH.Inflammatory cytokines may affect pulmonary vascular remodelling in iPAH. Indeed, iPAH frequently reveals inflammatory infiltrates corresponding to macrophages, lymphocytes and dendritic cells in the range of plexiform lesions as well as in other vascular lesions. The mechanisms underlying pulmonary vessel infiltration by monocytes / macrophages are unclear and the role for inflammatory cells in pulmonary vascular remodeling remains to be elucidated. This second study showed that iPAH is associated with an overexpression of CCL2. PEC are a major source of CCL2, which behaves as chemoattractant for circulating inflammatory cells and as growth factor for PASMC.Germline mutations of bone morphogenetic protein (BMP) receptor type 2 (BMPR-2), a member of the transforming growth factor (TGF)-β receptor family, have been reported in nearly 70% of patients with the heritable form of the disease (hPAH), and in 10–30% of patients with sporadic iPAH. In a third study, we evaluated the functional consequences of BMPR-2 mutations on the endothelin 1 (ET-1) pathway which represents one of the therapeutic targets on PAH. The results of this third study showed that iPAH and hPAH were associated with a similar overexpression of ET-1. In contrast, ETA receptor mRNA levels which were increased in PASMC from patients with iPAH and hPAH compared to controls were much higher in hPAH than in iPAH cells. Consequently, the growth promoting effect of ET1 on PASMC was higher in PASMC from patients with iPAH, and was markedly elevated in PASMC from patients with hPAH. No changes in ETB receptor mRNA levels could be detected in PASMC from patients with iPAH or hPAH in comparison with controls.These results reveal that vasoactive factors (ET-1, 5-HT) and inflammatory factors play a determining role in the pathophysiology of PAH and could represent new therapeutic targets.