Orientador: Mauricio Barbanti Duarte José / Coorientador: Lawrence Charles Smith / Banca: Fabiana Fernandes Bressan / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: José Antonio Visintin / Banca: Eveline dos Santos Zanetti / Resumo: Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida ("induced pluripotent stem cells" - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Deer have been enduring pressures on their natural habitat, which causes segregation between populations and reduced genetic diversity. Although cryopreservation and storage of gamete and embryos can be used as a strategy for the preservation of wild populations, few studies have been successful due to difficulties to recover these materials. Recent studies in mice and humans have shown that induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from somatic cells can be differentiated into germ cells, oocytes, and spermatozoa. Thus, we hypothesize that viable gametes could also be obtained from somatic cells in deer. To date, iPSC cells have not been derived in cervids and therefore our main goal is to establish protocols to obtain stable iPSC lines from deer somatic cells. The process of reprogramming somatic cells into iPSC cells is facilitated by the use of adult stem cells that still have the multipotent capacity. As little is known about multipotent stem cells in deer, the first objective of this study was to obtain biopsies from various tissues with multipotent differentiation capacity. Among these tissues are the stem cells from adipose tissue, antler, and skin. Once primary cultures were established, cells from each tissue were evaluated for doubling time and then induced in vitro to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes lineages in order to assess their plasticity. Moreover, the expression of molecular markers was characterized by immunocytochemistry (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) and RT-PCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). The second objective of this study was to derive iPSC lineages from multipotent stem cells in deer. The derivation of iPSC lines was tested by transfection with four transcription factors (c-Myc, Klf4, Oct4, and Sox2) using nucleofection, lipofection or lentiviral re... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:14:39Z : No. of bitstreams: 1 donofrio_fc_me_arafcf.pdf: 611507 bytes, checksum: 2ca5a08dde5671c30f12d9904897bfcb (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), de causar doença com manifestações clínicas variadas, depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação celular. Neste estudo pretendeu-se isolar e caracterizar adesina(s) de P. brasiliensis ligante(s) de fibronectina relacionadas à interação do fungo com células epiteliais de origem pulmonar, comparando amostras de P. brasiliensis, antes (18a) e depois (18b) da passagem em animal, posteriormente cultivadas em meio de Fava Netto e em meio sólido (ágar base) e líquido (BHI) contendo 5% de sangue de carneiro. Os extratos 18a e 18b obtidos dos diferentes meios apresentaram proteínas variando de 106 a 12 kDa. Os extratos da amostra 18a e 18b cultivados em meios sólido e líquido acrescidos de sangue demonstraram maior expressão de algumas proteínas, quando comparado às amostras 18a e 18b cultivadas apenas em meio de Fava Netto. Aparentemente, o uso de meios de cultura acrescidos de sangue é semelhante ao verificado após a passagem em animal. As proteínas com massas moleculares de 54 kDa e pI de 5,6; 58 kDa e pI de 5,9 e 60 kDa com pI de 6,3 foram caracterizadas como adesinas ligantes de fibronectina. Uma delas, a proteína de 54 kDa foi purificada por cromatografia de afinidade e eluída por eletroeluição. O sobrenadante contendo a proteína purificada foi avaliado por eletroforese bidimensional, confirmando a presença da proteína de 54 kDa e pI de 5,6 e seu papel como adesina. Os extratos cell-free dos isolados 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 de P. brasiliensis... / The capacity of Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the cellular interaction. The present study was designed to isolate and characterize the adhesin fibronectin-binding related to the capacity of this fungus to adhere to the host by comparing P. brasiliensis samples, taken before (18a) and after (18b) animal inoculation and cultured on Fava Netto s medium and on blood base agar solid medium and liquid (BHI) medium with 5% sheep blood. The 18a and 18b extracts, independent of the medium, presented proteins with the molecular weights of 106 and 12 kDa. Extracts from Pb18a and 18b cultured in blood agar solid and liquid (BHI) medium showed higher levels of protein expression than that from samples cultured on Fava Netto. Apparently, the use of the sheep blood in the medium is similar to the animal passage. Ligand affinity binding assays showed that proteins of 54 kDa, pI 5.6; 58 kDa and pI of 5.9 and 60 kDa and pI de 6.3 were evident in all P. brasiliensis cell-free extracts, and all had properties of adhesin fibronectin-binding. A fibronectin-binding protein of 54 kDa was purified by affinity chromatography and by electro elution. The protein purified was evaluated by isoelectric focusing, confirming the presence of protein of 54 kDa and pI of 5.6 and its role as an adhesin. The cell-free extracts from 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 P. brasiliensis isolates, also showed the expression of 54 kDa protein, and it was more evident in 113 and 339 isolates. Our experiments... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-09Bitstream added on 2014-06-13T19:35:27Z : No. of bitstreams: 1 mitter_ek_me_rcla.pdf: 1516822 bytes, checksum: 3fde8b311a9cde9a2979893e0502ae2b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Com a revolução industrial ocorreu o crescimento do setor têxtil, o qual utiliza uma grande quantidade de água nos processos de tingimento e uma ampla variedade de corantes sintéticos. Uma pequena concentração destes corantes no meio ambiente já pode gerar uma poluição altamente visível e indesejável, provendo alterações nos ecossistemas aquáticos. Dentre os processos de remoção de corantes, a adsorção, biossorção e biodegradação apresentam-se como as técnicas mais vantajosas. A adsorção consiste em um processo de transferência de massa na qual se explora a capacidade de certos sólidos em concentrar determinadas substâncias existentes em soluções líquidas. A biossorção envolve interações físico-químicas entre a superfície celular de microrganismos e corantes através de difusão passiva. A biodegradação, por vez, ocorre através de enzimas produzidas por alguns microrganismos que são capazes de degradar a molécula do corante. De forma a aumentar a eficiência destes processos, a imobilização celular permite a reutilização das células imobilizadas, alta resistência mecânica permitindo que os processos metabólicos se realizem em condições dversas. Portanto, este trabalho propôs a imobilização de Saccharomyces cerevisiae em bagaço de cana ativado para promover a biossorção e biodegradação do corante Acid Black 48 (AB48) em solução aquosa. Para isso, o bagaço de cana de açúcar foi tratado com polietilenoimina (PEI), NaOH e água destilada. Concentrações de 0,25, 0,5 e 1 % de uma suspensão de Saccharomyces cerevisiae foram avaliadas para determinar as melhores taxas de imobilização celular. Uma vez estabelecida a imobilização, foram elaborados ensaios de biossorção/adsorção utilizando Saccharomyces... / Along with the industrial revolution, textile sec.tor growth is inserted. These industries use large amounts of water in dyeing processes and a wide variety of synthetic dyes. A small concentration of these dyes in the environment can generate a highly visible and undesirable pollution and also changes in aquatic ecosystems. Among dye removal processes, adsorption, biosorption and biodegradation are the most advantageous techniques. Adsorption is a mass transfer process in which exploits certain solids ability to concentrate other substances dissolved in liquid solutions. Biosorption involves physicochemical interactions between microorganism cell surface dye molecule through passive diffusion. Biodegradation occurs when enzymes produced by certain microorganisms are capable of breaking the dye molecule. In order to increase the efficiency of these processes, cell immobilization allows reuse of the immobilized cells and enables high mechanical strength in which metabolic processes can take place in adverse conditions. Therefore, this study aims the use of Saccharomyces cerevisiae immobilized in activated sugarcane bagasse to promote Acid Black 48 dye (AB48) biodegradation and biosorption in aqueous solutions. In order to achieve these results, sugarcane bagasse was treated with polyethyleneimine (PEI), NaOH and distilled water. Concentrations of 0.25, 0.5 and 1% of a Saccharomyces cerevisiae suspension were evaluated to determine best cell immobilization rates. Once the immobilization was established, biosorption/adsorption assays were developed using immobilized and free yeast cells and only treated sugarcane bagasse, after 2 hours dye contact at 30°C and at pH 2.50, 4.50 and 6 50. After discoloration rate, dye removal and adsorption capacity were determined, best results were established at pH 2.50, and... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador : Prof. Dr. Antonio Salvio Mangrich / Orientador : Prof. Dr. Ademir Carubelli / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa: Curitiba, 29/01/2010 / Inclui referências / Resumo: Células combustíveis microbianas (MFCs) são dispositivos capazes de converter energia química em energia elétrica, através de reações catalisadas por microorganismos. O grande diferencial destas células, em relação a outros tipos de aproveitamento de material orgânico na geração de energia, é de que as MFCs realizam esta conversão em uma única etapa, o que pode tornar o processo de obtenção de energia mais barato e eficiente. Foram montados e monitorados diferentes tipos de MFCs, utilizando substrato orgânico proveniente da agropecuária e também, em uma outra configuração, rejeitos de uma industria cervejeira da cidade de Curitiba. Foram obtidas quantidades substâncias de energia elétrica, capazes de manter pequenos dispositivos elétricos em funcionamento por um longo período de tempo. Foram estudadas também as modificações químicas do material orgânico presente nas câmaras anódica e catódica destas células, o que permitiu traçar um perfil das modificações químicas ocorridas com o material durante a evolução do experimento. / Abstract: Microbial fuel cells (MFCs) are devices capable of converting chemical energy into electrical energy through reactions catalyzed by microorganisms. The great advantage of these cells compared to other types of utilization of organic material for energy generation, is that the MFC perform this conversion in one step, which can make the process of obtaining energy cheaply and efficiently. Were constructed and monitored different types of MFCs using organic substrate from the agriculture and also, in another configuration, a waste of brewing industry in the city of Curitiba. We obtained substantial amounts of electricity, capable of maintaining small electrical appliances in operation for a long period of time. We also studied the chemical modification of organic material present in the anode and cathode chambers of these cells, which allowed us to draw a profile of the chemical changes occurring in the material during the course of the experiment.

Orientadora : Profª. Drª. Karin Braun Prado / Coorientador : Prof. Dr. Danillo G. Augusto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/03/2017 / Inclui referências : f. 92-102 / Resumo: A familia de genes KIR (do ingles, killer cell immunoglobulin-like receptors) desempenha um papel central na imunidade inata e adaptativa e seu polimorfismo tem sido associado a suscetibilidade diferencial a diversas doencas. Esses genes exibem extensa variabilidade, tanto em termos de ausencia e presenca de genes, quanto em nivel alelico. Os receptores codificados por esses genes sao expressos na superficie das celulas NK e de alguns subtipos de celulas T e podem transduzir sinais ativadores ou inibidores. Pouco se conhece a respeito dos seus niveis de expressao genica diferencial, tampouco dos mecanismos de regulacao. O gene KIR3DL2 codifica um receptor inibidor e e o segundo gene KIR mais polimorfico e polialelico do complexo, com mais de 80 alelos descritos. O objetivo desse trabalho foi analisar se o polimorfismo alelico de KIR3DL2 impacta na sua expressao genica diferencial. Para isso, caracterizamos a diversidade alelica de KIR3DL2 em uma populacao de euro-descendentes de Curitiba e regiao metropolitana (n = 235), atraves de sequenciamento de DNA. As frequencias genotipicas estavam de acordo com as esperadas pelo equilibrio de Hardy-Weinberg, sendo os genotipos mais comuns: 3DL2*001/007 (11,5%), 3DL2*001/002 (6,8%) e 3DL2*002/007 (6,8%). Os alelos mais frequentes encontrados nessa populacao foram 3DL2*007 (21,7%), 3DL2*001 (21,3%) e 3DL2*002 (20%). Um total de 40 individuos com genotipos especificos e comuns na populacao desse estudo foram selecionados para a analise de expressao diferencial por citometria de fluxo. A analise de expressao diferencial foi realizada com os individuos portadores dos alelos mais frequentes encontrados na populacao, sendo eles: 3DL2*001, 3DL2*002, 3DL2*003, 3DL2*005, 3DL2*007, 3DL2*009, 3DL2*010 e 3DL2*011. Verificamos que o polimorfismo alelico de KIR3DL2 esta associado nao somente com niveis de expressao diferencial, mas tambem com diferentes quantidades de celulas NK que exibem KIR3DL2 em sua superficie. O alelo KIR3DL2*002 foi associado ao maior nivel de expressao de KIR3DL2 e ao maior numero de celulas NK 3DL2 positivas. Ja 3DL2*010 foi associado ao menor nivel de expressao e a menor quantidade de celulas NK com KIR3DL2 presente na superficie celular. Alem disso, demonstramos que um polimorfismo na regiao 3' UTR, na posicao 16545A>G (rs1865095) marca os niveis de expressao de KIR3DL2. Sugerimos que esta expressao diferencial possa estar relacionada a ligacao de miRNAs nesta regiao, especificamente o miR-2114-3p. A presenca de ligantes especificos (HLA-A3, -A11 e -B27) nao esta associada a diferentes niveis de expressao de KIR3DL2 (p = 0,5739) nem a diferentes quantidades de celulas NK KIR3DL2 positivas (p = 0,7772). Alem disso, nenhuma correlacao foi encontrada entre a expressao diferencial dos alelos de KIR3DL2 e a expressao diferencial dos alelos de HLA-A. Como perspectivas futuras pretendemos analisar, atraves de co-cultivo celular, a atividade citotoxica das celulas NK de individuos com diferentes genotipos homozigotos, como KIR3DL2*001/KIR3DL2*001, KIR3DL2*002/KIR3DL2*002, KIR3DL2*007/KIR3DL2*007 e KIR3DL2*010/KIR3DL2*010 a fim de corroborar as hipoteses geradas. Palavras-chave: Celulas NK, KIR3DL2, variabilidade alelica, HLA-A3, HLA-A11, HLA-B27, expressao diferencial. / Abstract: The KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) gene family plays a central role in innate and adaptive immunity and has been associated with differential susceptibility to diseases. Besides the uncommon presence and absence polymorphism that occurs in KIR, these genes also exhibit an extensive allelic variation. The receptors encoded by these genes are expressed on the surface of NK cells and on some subset of T cells. They can transduce either activating or inhibiting signals. The differential expression levels and the mechanisms of genetic regulation of these receptors are poorly known. The KIR3DL2 gene encodes an inhibitory receptor and it is one of the most polymorphic and polyallelic KIR, with more than 80 alleles described so far. This study aimed to analyze if there are a profound impact of KIR3DL2 allelic polymorphism on its differential gene expression. Allelic diversity of KIR3DL2 was characterized in an euro-descendant population from Curitiba and metropolitan region, state of PR (n = 235), by sequencing-based typing. Genotype frequencies were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium and the most frequent genotype was 3DL2*001/007 (11.5%), followed by 3DL2*001/002 (6.8%) and 3DL2*002/007 (6.8%). The most frequent alleles in the population were 3DL2*007 (21.7%), 3DL2*001 (21.3%) and 3DL2*002 (20%). A total of 40 individuals with specific and commom genotypes were selected for differential expression analysis by flow citometry. The differential expression analysis was made for the most common alleles found in the population: 3DL2*001, 3DL2*002, 3DL2*003, 3DL2*005, 3DL2*007, 3DL2*009, 3DL2*010 and 3DL2*011. We verified that the allelic polymorphism of KIR3DL2 was associated not only with the differential expression but also with the different amount of NK cells that display KIR3DL2 on their surface. KIR3DL2*002 allele was associated with higher expression of KIR3DL2 and higher number of KIR3DL2 positive NK cells, while KIR3DL2*010 was related to the lowest expression and lowest level of KIR3DL2 positive NK cells. It has also been found that a polymorphism in the 3' UTR, 16545A>G (rs1865095), was associated with KIR3DL2 differential expression level. We suggest that it may be related to miRNAs binding, specifically miR-2114-3p. The presence of specific HLA class I ligands (HLA-A3, -A11 and -B27) was not associated with KIR3DL2 differential expression levels (p = 0.5739) nor with different amount of NK KIR3DL2+ cells (p = 0.7772). In addition, no correlation was found between the differential expression of the KIR3DL2 alleles and the differential expression of the HLA-A alleles. As future perspectives, it is intended to analyze the citotoxic activity of NK cells from individuals with different genotypes like KIR3DL2*001/KIR3DL2*001, KIR3DL2*002/KIR3DL2*002, KIR3DL2*007/KIR3DL2*007 and KIR3DL2*010/KIR3DL2*010 through co-culture to corroborate the hypotheses generated. Key-words: NK cells, KIR3DL2, allelic variability, HLA-A3, HLA-A11, HLA-B27, differential expression.

Orientadora : Profª Drª Andréa Emilia Marques Stinghen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 02/08/2013 / Inclui referências / Área de concentração: Microbiologia / Resumo: O p-cresol (PC) e seu conjugado p-cresilsulfato (PCS) sao toxinas uremicas de baixo peso molecular que quando ligadas a proteinas, sobretudo a albumina, podem desencadear via NF-ƒÈB a producao da quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Essa quimiocina e responsavel pela quimioatracao de monocitos para a camada intima do vaso durante os eventos que precedem a aterosclerose. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro o papel do PC e PCS na expressao de MCP-1, via fator de transcricao NF-ƒÈB p65. O PCS foi sintetizado a partir da sulfatacao do PC com acido clorosulfonico e caracterizado por cromatografia de camada delgada (CCD). As concentracoes de PC e PCS utilizadas nos experimentos seguiu o preconizado pelo European Group of Uremic Toxins (EuTox). Sendo assim, utilizaram-se as concentracoes normais, PC1 (0,60 mg/L) e PCS1 (2,87 mg/L), minimas uremicas PC2 (20,10 mg/L) e PCS2 (15,60 mg/L) e maximas uremicas PC3 (40,70 mg/L) e PCS3 (47,20 mg/L). Como modelo experimental foram utilizadas celulas musculares lisas humanas (VSMC) extraidas atraves de digestao enzimatica de veia de cordao umbilical. A fim de avaliar a viabilidade das celulas frente as toxinas foi realizado o ensaio de MTT. Para verificar a expressao de MCP-1, as celulas foram tratadas com PC e PCS em cinetica de 0 e 3 horas nas concentracoes descritas acima. Para fins de comparacao, as VSMC tambem foram tratadas com 1 ƒÊg/mL de lipopolissacarideo (LPS), outra conhecida toxina uremica de baixo peso molecular. Todos os ensaios foram realizados na presenca e ausencia de inibidor da via NF-ƒÈB p65. Atraves do ensaio de MTT verificou-se que nao houve diferenca significativa na viabilidade celular entre o controle e todas as concentracoes testadas de PC e PCS. As VSMC expostas a PC2 e PC3 produziram niveis significativos de MCP-1 apos 3h de tratamento (149,8 } 16 pg/mL, p<0,001 e 143,5 } 28,7 pg/mL, p<0,05 respectivamente) quando comparados ao tempo 0h. PCS3 estimulou de forma mais intensa a producao de MCP-1 do que as VSMC tratadas com PC3 (162,7 } 7,5 pg/mL vs 143,7 } 28 pg/mL, p<0,005) em 3h. Na presenca do inibidor de NF-ƒÈB p65, houve uma diminuicao significativa na producao de MCP-1 apos o tratamento por 3h com PC2 (149,8 } 16 pg/mL vs 36,4 } 10,5 pg/mL; p<0,001) e PC3 (143,6 } 28 pg/mL vs 50 } 18 pg/mL; p<0,05). Apos tratamento com PCS1 houve diferenca significativa nos niveis de MCP-1 na presenca de inibidor (156,49 } 15,9 pg/mL vs 102,3 } 4,6 pg/mL; p<0,05). Apos 3h de tratamento com LPS, nao houve producao significativa de MCP-1 em relacao ao controle (35,5 } 8,9 pg/mL vs 34 } 8,9 pg/mL). Ainda, na presenca do inibidor, verificou-se uma leve diminuicao nos niveis de MCP-1, porem nao significativa (35,5 } 8,9 pg/mL vs 25,6 } 6,5 pg/mL). Com base em nossos resultados, concluimos que apesar de PC e PCS nao serem citotoxicas, induzem a expressao de niveis significativos de MCP-1, sendo o PCS mais efetivo na inducao da expressao de MCP-1 que seu precursor PC. Assim como PC e PCS, LPS tambem ativa a producao de MCP-1 via NF-ƒÈB. Desta forma sugerimos que a inibicao da via NF-ƒÈB p65 poderia diminuir niveis de MCP-1 e consequentemente a progressao do desenvolvimento da aterosclerose na DRC. Palavras chave: doenca renal cronica, toxicidade uremica, p-cresol, p-cresilsulfato, LPS, MCP-1 e NF-ƒÈB. / Abstract: p-cresol (PC) and its conjugate p-cresyl sulfate are low molecular weight uremic toxins that when attached to proteins, especially albumin, can trigger via NF-êB the production of chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). This chemokine is responsible for monocytes chemoattraction to the vessel intimal layer during the events that precede atherosclerosis. Thus, the aim of this study was to investigate the in vitro role of PC and PCS in MCP-1 expression via transcription factor NF-êB p65. PCS was synthesized from PC sulfation with chlorosulphonic acid and characterized by thin layer chromatography (TLC). The PCS and PC concentrations were used according to the recommendations of the European Uremic Toxins Work Group (EuTox). So we used normal, PC1 (0.60 mg/L) and PCS1 (2.87 mg/L), uremic minimum PC2 (20.10 mg/L) and PCS2 (15.60 mg/L) and maximum uremic concentrations PC3 (40.70 mg/L) and PCS3 (47.20 mg/L). As experimental model we used human smooth muscle cells (VSMC) extracted by enzymatic digestion of umbilical cord vein. In order to assess the cells viability after toxins treatment, MTT assay was performed. To verify MCP-1 expression, cells were treated with PC or PCS in a kinetics of 0 and 3 h using the concentrations described above. For comparison purposes, the VSMC were also treated with lipopolysaccharide (LPS) (1 ìg/mL), other low molecular weight uremic toxin. All assays were performed in the presence and absence of NF-êB p65 inhibitor pathway. MTT assay showed that there was no significant difference in cell viability between control and all concentrations of PC and PCS tested. VSMC exposed to PC2 and PC3 produced significant levels of MCP-1 after 3h treatment (149.8 ± 16 pg/mL, p<0.001, and 143.5 ± 28.7 pg/mL, p<0.05 respectively) when compared to time 0h. PCS3 stimulated more intensively MCP-1 production in VSMC treated with the PC3 (162.7 ± 7.5 pg/mL vs 143.7 ± 28 pg/mL, p<0.005) after 3h. In the presence of NF-êB p65 inhibitor, there was a significant decrease in MCP-1 production after 3h treatment with PC2 (149.8 ± 16 pg/mL vs 36.4 ± 10.5 pg/mL, p<0.001) and PC3 (143.6 ± 28 pg/mL vs 50 ± 18 pg/mL, p<0.05). After PCS1 treatment there was a significant difference in MCP-1 levels in the presence of inhibitor (156.49 ± 15.9 pg/mL vs 102.3 ± 4.6 pg/mL, p<0.05). Finally after 3h treatment with LPS, there was no significant production of MCP-1 compared to control (35.5 ± 8.9 pg/mL vs 34 ± 8.9 pg/mL), and , in the presence of the inhibitor, there was a slightly decrease in MCP-1 levels, but not significantly (35.5 ± 8.9 pg/mL vs. 25.6 ± 6.5 pg/mL). Based on our findings, we concluded that in spite of PCS and PC are not cytotoxic, they induce significantly MCP-1expression and PCS is more effective than its precursor PC. As PC and PCS, LPS also activates MCP-1 production via NF-êB. Therefore, we suggest that the inhibition of NF-êB could decrease MCP-1 levels and hence the development of atherosclerosis progression of CKD. Keywords: chronic kidney disease, uremic toxicity, p-cresol, p-cresyl sulfate, LPS, MCP-1 and NF-êB.

Resumo: Receptores de células natural killer semelhantes à imunoglobulina (KIR) são expressos por células natural killer (NK) e subtipos de células T. Os genes KIR são altamente polimórficos e este complexo poligênico exibe variação em número de genes ativadores e inibidores, o que regula a atividade de células NK. Moléculas HLA de classe I servem como ligantes para KIR. As interações dos loci de KIR e HLA são importantes para o reconhecimento de alvos pelas células NK. Vários estudos de associação indicam que estes loci estão envolvidos em doenças infecciosas, desordens autoimunes/inflamatórias, câncer e reprodução. Dados funcionais suportam o mecanismo baseado na ação de receptores inibidores e ativadores através de diferentes combinações de genótipos KIR-HLA em doenças. A doença autoimune pênfigo vulgar (PV) é uma desordem bolhosa que afeta a pele em múltiplas camadas, causada por autoanticorpos contra desmogleína 1 e 3, já foi previamente associada com KIR. Neste estudo nós sugerimos que indivíduos KIR3DL2*001+ KIR3DL1+ e baixa frequência de genes ativadores em seu genótipo, exibem uma maior inibição de citotoxicidade quando na presença dos ligantes HLA-A*03/A*11 e HLA-Bw4. Resultados in vitro demonstraram que o cultivo de células NK de diferentes indivíduos com células T CD3 expressando HLA-A*03/A*11 e HLA-Bw4, levou a uma diminuição de citotoxicidade. Isto foi observado em indivíduos saudáveis e pacientes de pênfigo. O bloqueio com anticorpo anti-KIR3DL2 mostrou um aumento da citotoxicidade, corroborando para o potencial efeito inibidor deste gene nesta situação. Além disso, nós verificamos uma maior frequência de células NK (subtipo CD56bright) no sangue periférico de pacientes de PV quando comparado com indivíduos saudáveis. Estes dados em conjunto com a detecção de níveis aumentados de IL-6 e IFN-? nos ensaios de cultivo, contribuem para o entendimento e o papel de células NK na patogênese de pênfigo.

Resumo: As fosfolipases são uma família de enzimas encontradas em várias fontes biológicas incluindo os organismos procarióticos e eucarióticos. As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas popularmente como aranhas marrons, são eficazes em produzir em seus venenos uma grande proporção de fosfolipases-D. No veneno destas aranhas, estas enzimas estão relacionadas à dermonecrose, desregulação da resposta inflamatória, hemólise, nefrotoxicidade e agregação plaquetária. As fosfolipases-D catalizam a hidrólise de diferentes fosfolipídios gerando ácido fosfatídico, ou ácido lisofosfatídico, ou ceramida-1-fosfato, importantes mediadores nos eventos de sinalizações celulares. Alterações no padrão de expressão, atividade destas moléculas ou receptores para seus produtos tem sido relacionados com o desenvolvimento de muitos tumores. Desta forma, neste trabalho foi observado o efeito de uma fosfolipase-D exógena recombinante da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia (LiRecDT1) sobre as células das linhagens de melanoma murino B16-F10 e B16-F1. Por meio de experimentos de imunoblotting em duas dimensões com anticorpo contra a fosfolipase-D recombinante LiRecDT1 foi observada reatividade imunológica cruzada para pelo menos 25 spots no veneno bruto de L. intermedia, indicando alto nível de expressão para diferentes isoformas de fosfolipase-D. Experimentos de cinética de degradação de lipídios mostraram que esta toxina degrada de maneira tempo dependente tanto esfingomileina, gerando ceramida-1-fosfato e colina, quanto lisofosfatidilcolina, gerando ácido lisofosfatídico e colina e mostram menor atividade contra fosfatidilcolina. Através de experimentos de imunofluorescência com anticorpos contra LiRecDT1 e usando a toxina recombinante de fusão LiRecDT1-GFP foi observado a ligação direta de LiRecDT1 na membrana de células B16-F10. Também foi observado que a toxina recombinante LiRecDT1 tem acesso e degrada fosfolipídios das membranas das células B16-F10, observado em experimentos com extratos de membranas obtidos com detergente ou Ghosts de membrana pela geração de colina. Usando o Fluo-4 AM, um fluoróforo permeante sensível ao cálcio, foi possível observar que o tratamento das células B16-F10 e B16-F1 com a toxina LiRecDT1 induziu um aumento da concentração de cálcio no citoplasma. Em células B16-F10 também foram avaliadas a viabilidade e a morfologia após o tratamento com a fosfolipase-D recombinante e os resultados mostraram que não houve alterações sugerindo que a entrada de cálcio não foi decorrente a danos causados à membrana das células. Baseado no que é conhecido sobre a atividade de fosfolipases-D endógenas como indutores da proliferação celular e no fato de que LiRecDT1 se liga a superfície de células B16-F10 hidrolisando fosfolipídios e gerando lipídios bioativos, foi utilizada a toxina LiRecDT1 como uma fonte exógena de fosfolipase-D em células B16-F10. O tratamento destas células com a fosfolipase-D recombinante de aranha marrom foi efetivo no aumento da sua proliferação e de maneira tempo e concentração dependentes, especialmente na presença de esfingomielina sintética no meio. Estes resultados sugerem que a fosfolipase-D de aranha marrom pode ser usada como uma ferramenta bioativa para protocolos experimentais em biologia celular.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-12. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:05Z : No. of bitstreams: 1 000866509.pdf: 3246432 bytes, checksum: 945e3bc602891368ba892344ad34b88c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / O gene vasa codifica uma proteína que pertence a uma família de proteínas denominada DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box, constituída de RNA helicases ATP-dependente. Extremamente conservada entre os organismos, sua função está associada com o metabolismo do RNA. Na maioria das espécies investigadas, a expressão do vasa restringe-se a linhagem germinativa. Estudos realizados utilizando metodologias distintas (knockdown, knockout, mutação) para conhecer o papel do vasa, demonstraram que o vasa tem fundamental importância no desenvolvimento da linhagem germinativa dos invertebrados e vertebrados. Em nosso estudo, caracterizamos o cDNA do vasa de forma inédita em uma espécie nativa, R. quelen (Heptapteridae, Siluriformes). Análises comparativas da proteína foram realizadas, mostrando que a proteína é altamente conservada ao longo da evolução. Além disso, a expressão do Rqvasa (Rhamdia quelen vasa) por RT-PCR (transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase) e qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real) em diferentes tecidos mostra que o mesmo é expresso somente nas gônadas. Os sítios de expressão do Rqvasa localizam-se exclusivamente nas células da linhagem germinativa. Análises por RT-PCR e por qRT-PCR durante o desenvolvimento embrionário de R. quelen demonstram que o Rqvasa é herdado maternalmente e sua expressão diminui gradativamente ao longo do desenvolvimento embrionário e larval. Através da hibridização in situ nos embriões e larvas, foi possível visualizar o processo migratório das células germinativas primordiais (CGPs). Desta forma, este trabalho caracteriza de forma inédita, o cDNA do Rqvasa, descrevendo sua expressão durante o desenvolvimento assim como o processo migratório das CGPs. Os resultados obtidos neste estudo servirão de base para utilizar o gene vasa em diferentes abordagens biotecnológicas, como por exemplo, esterilidade, transgenia (vasa / The vasa gene encodes a protein that belongs to protein family called DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box, which is constituted of ATP-dependent RNA helicases. This protein is extremely conserved among the organisms, and its role is associated with RNA metabolism. In the majority of the investigated species, vasa expression is restricted to the germline cells. Different methods (such as knockdown, knockout and mutation) to address vasa's role have demonstrated that vasa is crucial for germ cell development. In this study, we have characterized the full cDNA of vasa from a native species, R. quelen (Heptapteridae Siluriformes). Comparative analysis using the protein sequence has demonstrated that Vasa is highly conserved along the evolution. Moreover, we have evaluated through RT-PCR and qRT-PCR Rqvasa expression in different tissues, showing that vasa transcripts are exclusively expressed in the R. quelen gonads, specifically in the germinal cells RT-PCR and qRT-PCR analysis during embryonic and larval development have shown that Rqvasa is maternally inherited and its expression decreased during development. in situ hybridization techniques performed in whole embryos and larvae allowed to study the primordial germ cells (PGCs) migratory process towards the gonadal ridge. This work has characterized for the first time the full length cDNA of vasa, describing its expression patterns during R. quelen embryonic development as well as the PGCs migratory process in this species. Our results will contribute for the basic reproductive biology of this native species, and will support studies using vasa in different biotechnological studies, such as sterility, transgenesis (vasa / CNPq: 482946/2012-1 / FAPESP: 2012/00423-6 / FUNDUNESP: 447/2014

Orientador: Carlos Renato Corso / Banca: Antonio Sérgio Spanó Seixas / Banca: Aurora Mariana Garcia de França Souza / Resumo: Com a revolução industrial ocorreu o crescimento do setor têxtil, o qual utiliza uma grande quantidade de água nos processos de tingimento e uma ampla variedade de corantes sintéticos. Uma pequena concentração destes corantes no meio ambiente já pode gerar uma poluição altamente visível e indesejável, provendo alterações nos ecossistemas aquáticos. Dentre os processos de remoção de corantes, a adsorção, biossorção e biodegradação apresentam-se como as técnicas mais vantajosas. A adsorção consiste em um processo de transferência de massa na qual se explora a capacidade de certos sólidos em concentrar determinadas substâncias existentes em soluções líquidas. A biossorção envolve interações físico-químicas entre a superfície celular de microrganismos e corantes através de difusão passiva. A biodegradação, por vez, ocorre através de enzimas produzidas por alguns microrganismos que são capazes de degradar a molécula do corante. De forma a aumentar a eficiência destes processos, a imobilização celular permite a reutilização das células imobilizadas, alta resistência mecânica permitindo que os processos metabólicos se realizem em condições dversas. Portanto, este trabalho propôs a imobilização de Saccharomyces cerevisiae em bagaço de cana ativado para promover a biossorção e biodegradação do corante Acid Black 48 (AB48) em solução aquosa. Para isso, o bagaço de cana de açúcar foi tratado com polietilenoimina (PEI), NaOH e água destilada. Concentrações de 0,25, 0,5 e 1 % de uma suspensão de Saccharomyces cerevisiae foram avaliadas para determinar as melhores taxas de imobilização celular. Uma vez estabelecida a imobilização, foram elaborados ensaios de biossorção/adsorção utilizando Saccharomyces... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Along with the industrial revolution, textile sec.tor growth is inserted. These industries use large amounts of water in dyeing processes and a wide variety of synthetic dyes. A small concentration of these dyes in the environment can generate a highly visible and undesirable pollution and also changes in aquatic ecosystems. Among dye removal processes, adsorption, biosorption and biodegradation are the most advantageous techniques. Adsorption is a mass transfer process in which exploits certain solids ability to concentrate other substances dissolved in liquid solutions. Biosorption involves physicochemical interactions between microorganism cell surface dye molecule through passive diffusion. Biodegradation occurs when enzymes produced by certain microorganisms are capable of breaking the dye molecule. In order to increase the efficiency of these processes, cell immobilization allows reuse of the immobilized cells and enables high mechanical strength in which metabolic processes can take place in adverse conditions. Therefore, this study aims the use of Saccharomyces cerevisiae immobilized in activated sugarcane bagasse to promote Acid Black 48 dye (AB48) biodegradation and biosorption in aqueous solutions. In order to achieve these results, sugarcane bagasse was treated with polyethyleneimine (PEI), NaOH and distilled water. Concentrations of 0.25, 0.5 and 1% of a Saccharomyces cerevisiae suspension were evaluated to determine best cell immobilization rates. Once the immobilization was established, biosorption/adsorption assays were developed using immobilized and free yeast cells and only treated sugarcane bagasse, after 2 hours dye contact at 30°C and at pH 2.50, 4.50 and 6 50. After discoloration rate, dye removal and adsorption capacity were determined, best results were established at pH 2.50, and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre