PEREIRA, Ticiana Praciano. Efeito tripanocida da L-amino ácido oxidaseisolada do veneno da Bothrops marajoensis. 2015. 84 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-19T13:13:10Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_tppereira.pdf: 8126214 bytes, checksum: 9f53ffec393de789a339481a46476c8f (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-19T13:50:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_tppereira.pdf: 8126214 bytes, checksum: 9f53ffec393de789a339481a46476c8f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-19T13:50:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_tppereira.pdf: 8126214 bytes, checksum: 9f53ffec393de789a339481a46476c8f (MD5) Previous issue date: 2015 / Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, remains a p ublic health problem in the Americas. In the present study, we evaluated th e effects of L-amino acid oxidase from Bothrops marajoensis venom (BmLAAO) on the all evolutive forms of T. cruzi . Epimastigote forms of T. cruzi , were cultived in LIT medium, at 28ºC in BmLAAO pr esence for 48 and 72h. Trypomastigote were obtained from the supernat ants of infected LLC-MK 2 cells, resuspended in MEM with 2% FBS and treated for 24 h . BmLAAO showed significant activity against the epimastigote (IC 50 48h = 6.31μ g/mL; IC 50 72h = 5,85μ g μ g/mL.) and trypomastigote (LC 50 24h= 0.17μ g/mL) forms and decrease the amastigote s urvival within LLC-MK 2 . Analysis of the possible involvement of hydrogen peroxide was performed by catalase addition in medium, an enzyme that acts as H 2 O 2 scavenger. The cell death showed that the cytotoxic effect of BmLAAO is reduced but not completely abolished by the catalase presence. Confocal microscopy analysis of epimastig otes treated with BmLAAO showed staining with propidium iodide (PI), indicative of loss of membrane integrity, and loss of mitochondrial membrane potential, as observed by st aining of treated cells with Rhodamine 123 (Rho123). Besides, the flow cytometry with anne xin V and propidium iodide suggest decrease of membrane permeability. Ultrastructural analysis showed drastic morphological changes on the parasite mitochondrion with ruptured kDNA network. Increase of endoplasmic reticulum profiles, enhanced electrondensity of mit ochondrion and endoplasmic reticulum membranes, loss of the parasite inner organization, swelling of cell body with the appearance of dismantling organelles, formation of myelin-like structures indicative of autophagic activity, were also observed in treated parasites. In conclusion, the BmLAAO showed cytotoxic effects on T. cruzi and this action is only partially dependent on H 2 O 2 production by the BmLAAO. In addition, BmLAAO induced morphologic al and physiological alterations compatible with loss of viability and cell death / Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, continua a ser um problema de saúde pública nas Américas. No presente estudo, foram avaliados os efeitos da L-aminoácido oxidase isolatada do veneno da Bothrops marajoensis (LAAOBmar) sobre todas as formas evolutivas do T. cruzi. A atividade antiparasitária foi avaliada através da cultura de parasitas tratados com diferentes concentrações da fração em estudo. Epimastigotas foram cultivados em meio LIT, a 28ºC na presença LAAOBmar por 48 e 72 horas. Tripomastigotas foram obtidos a partir dos sobrenadantes de células LLC-MK2 infectadas, ressuspensos em meio MEM com 2% de FBS e tratados durante 24 h. LAAOBmar mostrou uma atividade significativa contra epimastigota (CI50 48h = 6,31μg/mL; CI50 72 h = 5,85μg/ml) e tripomastigotas (CL50 24h = 0,17μg/mL) e diminuiu a sobrevivência das formas amastigotas intracelular em células LLC-MK2. A análise do possível envolvimento do peróxido de hidrogênio foi realizada por adição de catalase no meio, uma enzima que atua como retirador de H2O2. A morte celular mostrou que o efeito citotóxico da LAAOBmar é reduzido, mas não completamente abolido pela presença da catalase. A análise por microscopia confocal de epimastigota tratados com LAAOBmar mostrou coloração com iodeto de propídio (IP), indicativo de perda de integridade da membrana, e perda do potencial de membrana mitocondrial, observado por coloração de células tratadas com rodamina 123 (Rod123) . Além disso, nos ensaios de citometria de fluxo com anexina V e iodeto de propídio sugerem diminuição da permeabilidade da membrana. A análise ultraestrutural de epimastigotas e tripomastigotas, mostrou alterações morfológicas drásticas na mitocôndria do parasita com a rede de kDNA rompido. O aumento de perfis de retículo endoplasmático, aumento da eletrondensidade das membranas mitocondriais, a perda da organização interna do parasita, inchaço do corpo da célula com o aparecimento de organelas deformada, formação de estruturas de mielina-like indicativo de atividade autofágica, também foram observados nos parasitas tratados. Em conclusão, o LAAOBmar mostrou efeitos citotóxicos em T. cruzi e esta ação é apenas parcialmente dependente da produção de H2O2 pela LAAOBmar. Além disso, LAAOBmar induziu alterações morfológicas e fisiológicas compatíveis com perda de viabilidade e a morte.

TESSAROLO, L. D. Estudo in vitro da atividade tripanocida de nanopartículas de benzonidazol em carbonato de cálcio sobre cepa y de Trypanosoma cruzi. 2016. 83 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-05-24T12:51:25Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_lstessarolo.pdf: 3165613 bytes, checksum: 6ddc54bf2a20e523a76900a0fe202bd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-05-24T12:51:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_lstessarolo.pdf: 3165613 bytes, checksum: 6ddc54bf2a20e523a76900a0fe202bd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-24T12:51:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_lstessarolo.pdf: 3165613 bytes, checksum: 6ddc54bf2a20e523a76900a0fe202bd4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / The Chagas disease is a major public health problem, affecting about 6 million people worldwide and causes high morbidity and mortality in affected populations. The benznidazole (BZ), the drug used in the treatment has limited effectiveness and cause serious adverse effects. The drug transport by nanoparticles has demonstrated efficacy as the controlled and targeted release of pharmacological molecules, in addition to its desirable properties such as good biocompatibility and biodegradability. The objective of this study was to evaluate the cytotoxicity of benznidazole nanoparticles of calcium carbonate (CaCO3 @ BZ) on host cells LLC-MK2; determining the trypanocidal effect on epimastigotes, trypomastigote and amastigotes of T. cruzi Y strain and comparing the effect of BZ as well as to characterize the mechanism of death. The cytotoxicity tests using the MTT method conducted with LLC-MK2 cells grown in DMEM with 10% FBS showed IC50 of 55 ug / ml for BZ @ CaCO3 and 160 g / mL for BZ. epimastigotes were cultured in LIT 10% FBS at 28 ° C in the presence of CaCO3 @ BZ for 24, 48 and 72 hours. BZ @ CaCO3 showed trypanocidal activity against epimastigotes the three treatment times (24h IC50 = 8.72 mg / ml, 48 h IC50 = 8 ug / ml, 72 h IC50 = 4.8 ug / ml) this being more significant effect the BZ (IC50 = 24h 56.7 g / ml IC50 = 48h 15.9 g / ml, 72 h IC50 = 4.3 ug / ml). trypomastigotes were obtained from LLC-MK2 cells infected supernatants, resuspended in DMEM with 2% FCS and treated for 24 h. The trypomastigotes were more likely BZ @ CaCO3 (IC50 = 1.8 ug / ml) than the BZ (IC50 = 67 ug / ml). These assays were also performed with calcium carbonate nanoparticles free drug (@ CaCO3) used as negative control. In the tests with the amastigote forms obtained by infecting LLC-MK2 cells BZ @ CaCO3 was able to reduce the% of infected cells, the number of amastigotes per infected cells and the survival rate at 24 hours of incubation. Flow cytometric assays using fluorescence markers 7-amino actinomycin D, annexin V-PE and rhodamine 123 demonstrated that the trypanocidal effect of both BZ @ CaCO3 as BZ associated death by necrosis with altered mitochondrial potential. Thus, it is concluded that the CaCO3 has BZ @ trypanocidal effect in vitro on the three forms of Trypanosoma cruzi, this being potentially greater effect than that observed for BZ. / A doença de chagas é um grande problema de saúde pública, afeta cerca de 6 milhões de pessoas em todo o mundo e causa altos índices de morbidade e mortalidade nas populações afetadas. O benzonidazol (BZ), fármaco utilizado no tratamento apresenta eficácia limitada e provoca sérios efeitos adversos. O transporte de fármacos por meio de nanopartículas tem demonstrado eficiência quanto à liberação controlada e direcionada de moléculas farmacológicas, além de apresentar propriedades desejáveis, como boa biocompatibilidade e biodegradabilidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a citoxicidade de nanopartículas de benzonidazol em carbonato de cálcio (BZ@CaCO3) sobre células de hospedeiras LLC-MK2; determinar o efeito tripanocida sobre as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas da cepa Y de T. cruzi e comparar ao efeito do BZ, bem como, caracterizar o mecanismo de morte. Os testes de citotoxicidade utilizando o método do MTT realizados com células LLC-MK2 cultivadas com meio DMEM a 10% de SBF demonstraram IC50 de 55 µg/mL para BZ@CaCO3 e 160 µg/mL para BZ. Formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT a 10% de SBF a 28ºC na presença de BZ@CaCO3 por 24, 48 e 72 horas. BZ@CaCO3 mostrou atividade tripanocida sobre formas epimastigotas nos três tempos de tratamento (CI50 24h = 8,72 µg/mL; CI50 48h = 8 µg/mL; CI50 72 h = 4,8 µg/ml) sendo esse efeito mais significativo que o do BZ (CI50 24h = 56,7 µg/mL CI50 48h = 15,9 µg/mL; CI50 72h = 4,3 µg/ml). Formas tripomastigotas foram obtidas a partir dos sobrenadantes de células LLC-MK2 infectadas, ressuspensas em meio DMEM com 2% de SBF e tratadas durante 24 h. As formas tripomastigotas foram mais susceptíveis a BZ@CaCO3 (IC50 = 1,8 µg/mL) do que ao BZ (CI50= 67 µg/mL). Esses ensaios também foram realizados com nanopartículas de carbonato de cálcio livres de fármacos (@CaCO3) utilizadas como controle negativo. Nos ensaios com as formas amastigotas obtidas por infecção de células LLC-MK2 BZ@CaCO3 foi capaz de reduzir o % de células infectadas, o número de amastigotas por células infectadas e o índice de sobrevivência em 24h de incubação. Ensaios de citometria de fluxo utilizando os marcadores de fluorescência 7- amino actinomicina D, anexina V- PE e rodamina 123 mostraram que o efeito tripanocida tanto da BZ@CaCO3 quanto do BZ está relacionado a morte por necrose com alteração do potencial mitocondrial. Assim, conclui-se que a BZ@CaCO3 apresenta efeito tripanocida in vitro sobre as três formas de Trypanossoma cruzi, sendo esse efeito potencialmente maior do que o observado para BZ.

Tesis para optar al grado de Magíster en Química área de Especialización Tópicos en Química Medicinal y Memoria para optar al Título de Química / El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (radicales libres) y una disminución en los antioxidantes. Con el tiempo, este desajuste en el equilibrio entre radicales libres y antioxidantes puede provocar daño a moléculas biológicas como lípidos, proteínas y ácidos nucleídos. La degeneración biomolecular, seguido de la iniciación y propagación de reacciones oxidativas, provoca el envejecimiento acelerado y muchas enfermedades crónicas, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, cáncer y enfermedades cardiovasculares. Es por esta razón, que el estudio y desarrollo de nuevos compuestos antioxidantes es un tema de gran interés con el objetivo de generar nuevas y mejores moléculas con capacidad antioxidante. Por otro lado, la Tripanosomiasis americana, también llamada enfermedad de Chagas, es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad se encontraba limitada a América del Sur, América Central y partes de América del Norte (México y sur de Estados Unidos); sin embargo, en la última década la enfermedad se ha propagado a otras áreas no endémicas, presentando un problema emergente de salud pública de importancia global. El tratamiento actual se limita a dos fármacos; nifurtimox y benznidazol. Estos compuestos nitroheterocíclicos se consideran alejados de lo óptimo, debido a que causan múltiples efectos secundarios y presentan una eficacia limitada, especialmente en pacientes con la forma crónica de la enfermedad. En consecuencia, es necesario y urgente el desarrollo de nuevos fármacos menos tóxicos y más eficaces. De acuerdo a lo expuesto anteriormente, en esta tesis se estudiaron nuevos compuestos hidroxilados de cumarinas, con el fin de evaluar su capacidad antioxidante y su actividad tripanocida. A través de voltametría cíclica, se evidenció que los derivados cumarínicos que presentan grupos catecoles y los que poseen un grupo hidroxilo en el anillo cumarínico tienen menores potenciales de oxidación que las cumarinas con grupo resorcinol en su estructura. La generación de radicales libres producto de la oxidación de estos compuestos fue comprobada a través de resonancia de espín electrónico (REE). Todos los derivados presentaron mayor capacidad antioxidante frente a radicales peroxilos (ROO●) que el estándar Trolox. Siendo los derivados JLG15B, JLG5B y JLG14B los que presentaron mayor índice ORAC, con valores de 5,47, 5,38 y 5,30, respectivamente. Por el contrario, los derivados que poseen grupo catecol en la posiciones 7 y 8 del anillo cumarínico presentaron los índices ORAC más bajos. En los estudios de actividad tripanocida el derivado JLG3B resultó ser el más activo contra las dos formas del T. cruzi, presentando una mayor actividad en epimastigotes que nifurtimox y actividad moderada contra tripomastigotes. Además, al evaluar la citotoxicidad en células RAW, se obtuvo un IC50 de 68,85± 0,65 μM, mostrando de esta manera una citotoxicidad moderada. Por otra parte, la detección de radicales a través de REE en medio epimastigote demostró que estos compuestos podrían actuar por medio de la generación de estrés oxidativo. Mediante la realización de esta tesis se encontraron derivados hidroxilados cumarínicos que presentan gran capacidad antioxidante y actividad tripanocida moderada, los cuales nos servirán como base y punto de partida para el diseño racional de nuevos fármacos que tengan como finalidad curar o prevenir diversas patologías que afectan a un gran número de personas / Oxidative stress is caused by an imbalance between the production of reactive oxygen species (free radicals) and a decrease in antioxidant. Over time, this imbalance in the equilibrium between free radicals and antioxidants can cause damage to biological molecules such as lipids, proteins and nucleic acids. The biomolecular degeneration, followed by the initiation and propagation of oxidative reactions, causes accelerated aging and many chronic diseases, including neurodegenerative diseases, cancer and cardiovascular diseases. It is for this reason that the study and development of new antioxidant compounds is a subject of great interest in order to generate new and better molecules with antioxidant capacity. On the other hand, the American trypanosomiasis, also known as Chagas disease is a parasitic disease caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. This disease was limited to South America, Central America and parts of North America (Mexico and the southern United States); however, in the last decade the disease has spread to other non-endemic areas, presenting an emerging public health problem of global importance. Current treatment is limited to two drugs; nifurtimox and benznidazole. These nitroheterocyclic compounds are considered far from optimal, because they cause multiple side effects and have limited efficacy, particularly in patients with the chronic form of the disease. Consequently, the development of new, less toxic and more effective drugs are urgently needed. According to the foregoing, in this thesis were studied new hydroxylated coumarin compounds in order to evaluate its antioxidant capacity and its trypanocidal activity. Using cyclic voltammetry, it was shown that coumarin derivatives that presents catechols groups and who possess an hydroxyl group in the coumarin ring has lower oxidation potential than coumarins with resorcinol group in her structure. The generation of free radicals from the oxidation product of these compounds was verified by electron spin resonance (ESR). All derivatives had higher antioxidant capacity against peroxyl radicals (ROO●) than the Trolox standard. JLG15B, JLG5B and JLG14B was the derivatives that showed higher ORAC index, with values of 5.47, 5.38 and 5.30, respectively. Conversely, the derivatives possessing catechol group at positions 7 and 8 of the coumarin ring showed lower ORAC rates. In studies of the trypanocidal activity, JLG3B was the most active against the two forms of T. cruzi, showing increased activity in epimastigotes that nifurtimox and moderate activity against trypomastigotes. Furthermore, in assessing cytotoxicity in RAW cells, it was obtained a IC50 of 68.85 ± 0.65 μM, thus showing a moderate cytotoxicity. Moreover, detection of radicals through ESR in epimastigote medium showed that these compounds could act through the generation of oxidative stress. By performing this thesis they found hydroxylated coumarin derivatives which have high antioxidant capacity and moderate trypanocidal activity, that will serve us as the basis and starting point for the rational design of new drugs that have as finality cured or prevented various diseases affecting a large number of people

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / La enfermedad de Chagas (ECh), causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, representa un importante problema de salud pública en Latinoamérica y, debido a la globalización, en países donde no existe el vector biológico. Los criterios de curación para evaluar la eficacia terapéutica durante la etapa crónica, no han sido hasta ahora, establecidos. La PCR en Tiempo Real o PCR cuantitativa (qPCR) constituye una promisoria herramienta para monitorear la carga parasitaria en pacientes con ECh crónica, dado que éstos presentan parasitemias bajas y fluctuantes. En esta tesis, se estandarizó la reacción de qPCR mediante el sistema de detección TaqMan® para la cuantificación de T. cruzi, junto con el desarrollo de un sistema de control interno endógeno (CIE) basado en la detección del cromosoma 12 humano (X12), que permite descartar resultados falsos negativos relacionados con ausencia de ADN en las muestras evaluadas mediante qPCR debido a pérdidas durante el proceso de extracción o problemas con la reacción interna de qPCR. Se evaluó además, la condición parasitológica mediante qPCR en 44 pacientes con ECh crónica en condiciones pre y post-terapia con Nifurtimox (NFX) y se comparó con las técnicas de xenodiagnóstico (XD), PCR convencional de muestras de deyecciones de triatominos de XD (PCR-XD) y sangre venosa (PCR-S). La estandarización de la reacción de qPCR dirigida a la detección de T. cruzi tuvo como resultado una sensibilidad y especificidad del 92% y 100 %, respectivamente. Mientras que el sistema CIE basado en X12 permitió descartar resultados falsos negativos. En cuanto a la evaluación de eficacia quimioterapéutica de NFX mediante qPCR, fue posible determinar que el 86,36% del universo de individuos evaluados eliminó T. cruzi o persiste con parasitemias detectables de muy bajo nivel que no son cuantificables en el rango dinámico establecido (<1 parásito/mL). Estos resultados representan un hallazgo positivo, pues si bien la mayoría de las metodologías convencionales dan cuenta de la persistencia de T. cruzi, qPCR evidencia el real y actual nivel de parasitemia circulante, por lo que debería ser considerado el principal indicador de evaluación de eficacia quimioterapéutica en el tratamiento de la ECh crónica / Chagas disease (ChD), caused by the hemoflagellate protozoon Trypanosoma cruzi, is an important public health problem in Latin America, and due to globalization, also in countries where the biological vector does not exist. Cure criteria, to be able to evaluate the efficacy of therapy during the chronic stage, so far have not been established. Real time PCR or quantitative PCR (qPCR) is a promising tool to monitor the parasite load in patients with chronic ChD, given that these patients have low and fluctuating parasitemia. In this thesis it was standardized the qPCR reaction using the TaqMan® detection system for the quantification of T. cruzi, along with the development of an endogenous internal control (EIC) system based on the detection of human chromosome 12 (X12), which eliminates false negative results related to the absence of DNA in samples evaluated with qPCR due to losses during the extraction process or problems with the internal reaction of qPCR. Furthermore, the parasitological condition of 44 patients with chronic ChD was evaluated using this method in pre and post-therapy conditions with Nifurtimox (NFX), and compared to the techniques of xenodiagnosis (XD), conventional PCR of dejection samples of XD triatomines (PCR-XD) and venous blood (PCR-B). The standardization of the qPCR reaction directed to the detection of T. cruzi showed a sensitivity and specificity of 92% and 100%, respectively, while the EIC system based on X12 allowed discounting false negatives. In terms of the evaluation of the chemo-therapeutic efficacy of NFX, qPCR showed that 86.36% of the individuals evaluated eliminated T. cruzi or had detectable parasitemia of levels too low to be quantified in the dynamic range established (<1 parasite/mL). These results represent a positive finding, since although the majority of the conventional methods detect the persistence of T. cruzi, qPCR detects the real current level of circulating parasitemia; thus this method should be considered the principal indicator of the evaluation of the chemo-therapeutic efficacy in the treatment of chronic ChD / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1100768.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-08-29T17:40:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InfluênciaReinfecçãoDiferentes.pdf: 2091635 bytes, checksum: 69f0c3e3e0a81e034878f8f2c832ddf1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-09-29T23:49:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InfluênciaReinfecçãoDiferentes.pdf: 2091635 bytes, checksum: 69f0c3e3e0a81e034878f8f2c832ddf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-29T23:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InfluênciaReinfecçãoDiferentes.pdf: 2091635 bytes, checksum: 69f0c3e3e0a81e034878f8f2c832ddf1 (MD5) Previous issue date: 2013 / A diversidade e severidade dos sintomas observados na doença de Chagas estão relacionados a inúmeros fatores, dentre eles: cepa do parasito, imunidade do hospedeiro, tempo de infecção e reinfecções. Considerando que a reinfecção está presente no ciclo natural da doença de Chagas e que a diversidade genética de populações do Trypanosoma cruzi apresenta influência no desenvolvimento da infecção, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência de reinfecções por dois clones em camundongos experimentalmente infectados e/ou reinfectados, por meio de análises parasitológicas, fenotipagem de células mononucleares do sangue periférico e histopatologia dos músculos cardíaco e esquelético. Os animais foram agrupados conforme as características a seguir: 1) não infectados (NI); 2) infectados pelo clone P209 (AP1); 3) infectados pelo clone IVV (AP2); 4) primoinfectados pelo clone P209 e posteriormente reinfectados (RE1); 5) primoinfectados pelo clone IVV e posteriormente reinfectados (RE2). O nível de parasitemia foi estimado diariamente e 155 dias após o inóculo inicial os animais foram eutanasiados. Foi observada mortalidade apenas entre os animais primoinfectados com o clone P209 (AP1 e RE1). Houve prolongamento da parasitemia entre os animais reinfectados, não sendo os níveis parasitêmicos característicos da fase aguda, sugerindo o desenvolvimento de uma resistência após a primoinfecção. A imunofenotipagem do sangue periférico mostrou aumento no percentual de monócitos entre os animais primoinfectados com o clone P209 (AP1 e RE1) e redução no percentual de linfócitos TCD4+ entre os primoinfectados com o IVV (AP2 e RE2). Animais dos grupos primoinfectados pelo clone IVV (AP2 e RE2), apresentaram infiltrado inflamatório (músculos cardíaco e esquelético), em comparação com o grupo controle (NI), o que pode estar relacionado ao recrutamento dos linfócitos TCD4+ para o foco inflamatório. Os camundongos do grupo RE2 também apresentaram maior deposição de colágeno em ambos os tecidos, processo que indica a reparação do tecido lesionado pela inflamação. Em conjunto estes dados sugerem que a sequência de inoculações, bem como a genética do parasito, possuem grande importância, influenciando diretamente o curso da infecção. ____________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The diversity and severity of symptoms observed in Chagas disease are related to different factors, including: parasite strain, host immunity, time of infection and reinfections. Considering the role of reinfection and genetic diversity of populations of Trypanosoma cruzi as factors that influence the disease development, the aim of this study was to evaluate the influence of reinfections by two clones of T. cruzi (P209 and IVV) in experimentally infected/reinfected mice through parasitological, phenotyping of peripheral blood mononuclear cells and histopathology of cardiac and skeletal muscles. The animals were grouped in five groups: 1) uninfected (NI), 2) infected with P209 (AP1), 3) infected with IVV (AP2), 4) primoinfected by P209 and subsequently reinfected (RE1), 5) primoinfected by IVV and then reinfected (RE2). The level of parasitemia was evaluated daily and after 155 days after first inoculum the animals were euthanized. Mortality occurred only among animals primoinfected with P209 (AP1 and RE1). There was a prolongation of parasitemia among reinfected animals, being the parasitemia levels smaller than the acute stage levels, suggesting the development of resistance after the first infection. Immunophenotyping of peripheral blood showed an increase in the percentage of monocytes among animals primoinfected with P209 (AP1 and RE1) and reduction in the percentage of CD4+ T cells among primoinfected with IVV (AP2 and RE2). Animal groups primoinfected by IVV (AP2 and RE2), presented inflammatory infiltrate (cardiac and skeletal muscles) compared with the control group (NI), which may be related to the recruitment of CD4+ T cells to the inflammatory site. The mice RE2 group also presented collagen deposition in both tissues, a process that indicates the repair of injured tissue by inflammation. Based on these data we suggest that the sequence of inoculations as well as the genetic of parasite have great importance directly influence the course of infection.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-09-23T21:13:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_PerfisInflamaçãoCitocinas.pdf: 1861113 bytes, checksum: 382f39fca6707f1a59d56311026cead8 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:46:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_PerfisInflamaçãoCitocinas.pdf: 1861113 bytes, checksum: 382f39fca6707f1a59d56311026cead8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:46:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_PerfisInflamaçãoCitocinas.pdf: 1861113 bytes, checksum: 382f39fca6707f1a59d56311026cead8 (MD5) Previous issue date: 2011 / O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, apresenta ampla variabilidade intra-específica e sua interação com o hospedeiro pode resultar no desenvolvimento de diferentes manifestações clínicas, que podem ser relacionadas a determinadas características do parasito e do hospedeiro. Em relação ao hospedeiro, fatores genéticos e imunológicos também podem se relacionar às manifestações patológicas. Dessa maneira a avaliação do perfil de células inflamatórias, bem como de citocinas produzidas por estas, podem permitir uma melhor compreensão da gênese das lesões crônicas, determinando quais fatores direcionam para as distintas formas clínicas da doença. Nesse trabalho, cães da raça Beagle foram infectados pelas cepas Y ou Berenice-78 (Be-78), que apresentam tropismo tecidual distinto. Posteriormente estes animais foram necropsiados durante as fases aguda (30 dias após infecção) ou crônica (730 dias após infecção) da doença de Chagas experimental e fragmentos do esôfago foram coletados para quantificação do processo inflamatório, realização de reações imuno-histoquímicas (linfócitos T CD4+ e CD8+) e de PCR em tempo real para quantificação das citocinas IL-6, IL-12, TNF-, IFN-, IL-4, IL-10, TGF-e iNOS. Na fase aguda o processo inflamatório foi predominantemente mononuclear, significativamente maior nos animais infectados quando comparado aos animais não infectados, com distribuição focal ou difusa nos animais infectados pelas cepas Y e Be- 78, respectivamente. Na avaliação imuno-histoquímica, nos cortes histológicos dos animais infectados pelas cepas Y ou Be-78, a maioria das células inflamatórias foram positivas para linfócitos T CD4+ ou CD8+ sendo observados em proporções semelhantes. Entretanto, na fase crônica, o infiltrado inflamatório mostrou-se focal e reduzido em relação à fase aguda, sendo observado apenas nos animais infectados pela cepa Be-78, constituído predominantemente por linfócitos e também com proporções semelhantes das subpopulações de células T. Na fase aguda da infecção também foi observado um aumento na expressão do mRNA das citocinas pró-inflamatórias TNF-e IFN-nos animais infectados pela cepa Y do T. cruzi em relação aos demais grupos. Já na fase crônica houve um aumento na expressão do mRNA das citocinas IL-6, IL-12 e TNF-e da enzima iNOSnos animais infectados pela cepa Be-78 tanto em relação ao grupo de animais infectados pela cepa Y quanto ao grupo de animais não-infectados. Em relação às citocinas anti-inflamatórias, observou-se um aumento significativo apenas na expressão do mRNA da IL-10 nos animais infectados pela cepa Y em relação ao grupo de animais não-infectados na fase aguda. Na fase crônica da infecção não foi observado aumento de nenhuma das citocinas anti-inflamatórias avaliadas nesse trabalho em ambos os grupos infectados. Portanto, conclui-se que a infecção experimental de cães da raça Beagle pelas cepas Y ou Be-78 do T. cruzi promove uma resposta inflamatória aguda, predominantemente linfocítica com proporções similares de linfócitos TCD4+ e TCD8+ restrita, na fase crônica, à infecção pela cepa Be-78. Além disso, foi observado um perfil distinto de citocinas, sendo que nos animais infectados pela cepa Y a inflamação focal aguda está associada à expressão de citocinas próinflamatórias, enquanto que nos animais infectados pela cepa Be-78 a inflamação difusa aguda não está associada à expressão de citocinas pró-inflamatórias, mas evolui para uma inflamação focal crônica associada à expressão destas citocinas, bem como da enzima iNOS. ___________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, presents a wide intraspecific variability and its interaction with the host may result in the development of clinical manifestations, which may be related to certain characteristics of the parasite and host. In relation to the host, genetic and immunological factors may be related to pathological manifestations. Thus the evaluation of inflammatory cells and cytokines produced by them, may allow a better understanding of the genesis of chronic injuries, determining what factors lead to the different clinical forms of the disease. In this study, Beagle dogs were infected with Y or Berenice-78 (Be-78) strains, which have distinct tissue tropism. Subsequently, these animals were necropsied during the acute phase (30 days after infection) or chronic phase (two years after infection) of experimental Chagas disease and esophagus fragments were collected to perform inflammation quantification, immunohistochemistry to detect T lymphocytes (CD4+ and CD8+) and real-time PCR for quantification of cytokines IL-6, IL-12, TNF-, IFN-, IL-4, IL-10, TGF-, and iNOS. In the acute phase inflammatory process observed was predominantly mononuclear and the quantification of the inflammatory infiltrate demonstrated that it was significantly higher in the infected groups compared to uninfected animals, with focal or diffuse distribution in animals infected by Y and Be-78 strains, respectively. In immunohistochemical analysis tissue sections of animals infected by Y or Be-78 strains, the vast majority of inflammatory cells were positive for CD4+ or CD8+ and was observed in similar proportions. However, in the chronic phase, the inflammatory infiltrate was focal, showing a reduction when compared to the acute phase and it was observed only in animals infected with Be-78 strain, consisting predominantly of lymphocytes and also with similar proportions of T cells subpopulations. Data analysis revealed that in the acute phase of infection was observed an increase in mRNA expression of proinflammatory cytokines TNF- and IFN- in animals infected with the Y strain of T. cruzi compared to the other groups. In the chronic phase there was an increase in mRNA expression of IL-6, IL-12 and TNF- and iNOS enzyme in animals infected with Be-78 strain in relation to the groups of animals infected with the Y strain and the uninfected animals. Regarding anti-inflammatory cytokines, there was only a significant increase in mRNA expression of IL-10 in animals infected with the Y strain compared to the group of uninfected animals in the acute phase. We did not observe any increase of the anti-inflammatory cytokines evaluated in this work, at the chronic phase of infection, on both infected groups. Thus we may conclude that the experimental infection of Beagle dogs with the Y or Be-78 strains of T. cruzi showed that both promote an acute inflammatory response, predominantly lymphocytic with similar proportions of T cells CD4+ and CD8+, restricted, in the chronic phase of infection, to the Be-78 strain. In addition, there was a distinct profile of cytokines, and the animals infected with the Y strain the focal acute inflammation was associated with expression of proinflammatory cytokines, whereas in animals infected with Be-78 strain the diffuse acute inflammation is not associated with expression of proinflammatory cytokines evolving to chronic focal inflammation associated with expression of these cytokines and iNOS enzyme.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-11-10T17:02:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InovaçõesDiagnósticoMonitoração.pdf: 2809852 bytes, checksum: 5e2dc6ce18b064089906e87dc171d3a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-18T14:41:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InovaçõesDiagnósticoMonitoração.pdf: 2809852 bytes, checksum: 5e2dc6ce18b064089906e87dc171d3a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-18T14:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InovaçõesDiagnósticoMonitoração.pdf: 2809852 bytes, checksum: 5e2dc6ce18b064089906e87dc171d3a6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Um dos desafios em relação ao tratamento na fase crônica da doença de Chagas (DCh) são as limitações dos métodos disponíveis para detectar a cura parasitológica nessa fase da infecção. Sendo assim, esse trabalho visa estabelecer uma inovação metodológica na monitoração da cura parasitológica pós-tratamento etiológico da DCh, por meio da técnica de FC-ATE-Triplex, analisando IgG1 anti-T. cruzi. Como metodologia desse trabalho, foi proposto um modelo de pesquisa de anticorpos IgG1 anti-formas evolutivas vivas do T. cruzi (amastigota (AMA), tripomastigota (TRIPO) e epimastigota (EPI) fixada) por citometria de fluxo, empregando um modelo de segregação fluorescente diferencial (fluorescência 1- isotiacianto de fluoresceína) e um sistema de revelação fluorescente complementar (fluorescência 2- estreptoavidina-ficoeritrina). Avaliando a reatividade de IgG1 anti-AMA, TRIPO e EPI em amostras de soros dos grupos tratado curado (TC) e tratado não curado (TNC), as amostras do grupo TC apresentaram uma baixa reatividade e as dos grupo TNC uma alta reatividade com as três formas evolutivas do T. cruzi. Após análise de desempenho dessa nova metodologia, os critérios de interpretação foram: diluição 1:000 e ponto de corte de 40% para AMA e diluição 1:250 e ponto de corte de 20% para TRIPO e EPI. Avaliando a reatividade de IgG1 anti-AMA, TRIPO e EPI pela técnica proposta, em amostras de soros dos grupos não tratado (NT) e não infectado (NI), as amostras do grupo NT apresentaram valores de reatividade positivo e as do grupo NI valores de reatividade negativos com as três formas evolutivas. A reatividade de 28 amostras de soro do grupo tratado em avaliação (TEA) pela técnica de FC-ATE-Triplex revelou que 15 (53,6%) foram negativas com AMA, 11 (39,3%) com TRIPO e 8 (28,6%) com EPI. Avaliando a reatividade de IgG1 anti-AMA, TRIPO e EPI, em amostras de soros dos grupos TC e TNC em novas amostragens populacionais, todas as amostras do grupo TNC foram positivas com as três formas evolutivas, enquanto todas as amostras do grupo TC foram negativas com AMA, 5 das 7 amostras foram negativas com TRIPO e 6 das 7 foram negativas com EPI. Das 24 amostras do grupo TEA de uma nova amostragem populacional testadas pela FC-ATE-Triplex, 7 (29,2%) foram negativas com AMA, 1 foi negativa com TRIPO (4,2%) e 7 foram negativas com EPI (29,2%). A reatividade da FC-ATE-Triplex com o soro de pacientes com leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA) revelou que das 10 amostras de pacientes com LV, uma (10%) foi positiva com AMA, uma (10%) com TRIPO e duas (20%) com EPI, enquanto que dos 20 pacientes com LTA, 4 (20%) foram positivas com AMA, 6 (30%) com TRIPO e 10 (50%) com EPI. Sendo assim, a técnica de FC-ATE-Triplex apresentou um excelente desempenho na monitoração de cura parasitológica pós-tratamento etiológico, no diagnóstico e no controle de cura parasitológica precoce da doença de Chagas, mesmo quando testada em novas amostragens populacionais. Além do mais, essa nova metodologia, mesmo apresentando resultados falso-positivos, mostrou ser útil na segregação sorológica de pacientes chagásicos e de pacientes portadores de LV e de LTA. A reatividade diferencial observada em AMA, TRIPO e EPI sugere que na técnica de FC-ATE-Triplex existe a segregação de anticorpos pela afinidade pelo antígeno. As formas amastigotas do T. cruzi apresentaram uma maior reatividade, especificidade e mostraram ser boas fontes antigênicas na monitoração da cura parasitológica pós-tratamento etiológico e no controle de cura parasitológica precoce da doença de Chagas. _________________________________________________________________________ / ABSTRACT: One of the challenges regarding treatment in the chronic phase of Chagas disease (DCH) are the limitations of methods available to detect the parasitological cure at this stage of infection. In the present study, we have developed an innovative method to monitoring the parasitological cure after Chagas’ disease etiologic treatment. This method, named FC-ATE-Triplex, is based in simultaneous detection of IgG1 anti-T. cruzi by flow cytometry. It was proposed a model of antibody IgG1anti-live T. cruzi evolutive forms (live amastigotes (AMA) + live trypomastigotes (TRYPO) + fixed epimastigotes (EPI) fixed, using a model of differential segregation fluorescent (Fluorescence 1 - isotiacianto fluorescein) and a system of complementary fluorescence revelation (fluorescence 2 - streptavidin-phycoerythrin). The patients used in this study were divided in five groups: uninfected (NI), untreated (NT), treated cured (TC), treated not-cured (TNC) and treated under evaluation (TUE). The TC group samples showed a low reactivity and the TNC group a high reactivity with the three evolutive forms of T. cruzi. After performance analysis of this new approach, the interpretation criteria established were: 1:000 dilution and cutoff of 40% for AMA and 1:250 dilution and cutoff of 20% for EPI and TRYPO. The NT group samples showed values of positive reactivity and the NI group values of negative reactivity with the three evolutive forms of T. cruzi. The reactivity of 28 sera samples from the group TUE through the technique FC-ATE-Triplex revealed that 15 (53.6%) were negative with AMA, 11 (39.3%) with TRYPO and 8 (28.6%) with EPI. Assessing the reactivity of IgG1anti-AMA, TRYPO and EPI in sera samples of groups TC and TNC in new population samples, all samples of TNC group were positive with the three T. cruzi evolutive forms, while all samples of TC group were negative with AMA, 5 of 7 samples were negative with TRYPO and 6 of 7 were negative with EPI. Of the 24 samples of TUE group of a new population tested by FC-ATE-Triplex, 7 (29.2%) were negative with AMA, 1 was negative with TRYPO (4.2%) and 7 were negative with EPI (29.2%).). The reactivity of FC-ATETriplex with sera from patients with visceral leishmaniasis (VL) and American cutaneous leishmaniasis (ACL) revealed that of the 10 samples from patients with VL one (10%) was positive with AMA, one (10%) with TRYPO and two (20%) with EPI, while from 20 patients with ACL tested, 4 (20%) were positive with AMA, 6 (30%) with TRYPO and 10 (50%) with EPI. Thus, these results showed that FC-ATE-Triplex presented an excellent performance in monitoring of the parasitological cure after etiological treatment, in diagnosis and control of early parasitological cure of Chagas disease, even when tested on new sampling population. Moreover, this new methodology, even with false-positive results, proved to be useful in serological segregation of chagasic patients and patients with VL and ACL. The differential reactivity observed in AMA, TRYPO and EPI suggests that in the technique of FCATE-Triplex there is segregation of antibodies by antigenic affinity. The amastigotes of T. cruzi showed greater reactivity, specificity and to be good antigenic sources in monitoring parasitological cure after etiological treatment and control of early parasitological cure of Chagas disease.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-03-24T18:46:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AvaliaçãoEfeitoTratamento.pdf: 1895948 bytes, checksum: 850a1ef1d8d7ea3c49179c8548ee9282 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-03-25T16:00:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AvaliaçãoEfeitoTratamento.pdf: 1895948 bytes, checksum: 850a1ef1d8d7ea3c49179c8548ee9282 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-25T16:00:10Z (GMT). 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Inicialmente foi avaliada a eficácia do Ps em combinação com Bz durante a infecção aguda de camundongos pela cepa Y de T. cruzi. O tratamento combinado, utilizando doses subótimas, foi mais eficaz em induzir cura parasitológica quando comparado com a utilização de cada fármaco isoladamente, indicando uma interação positiva entre Bz e Ps. Quando avaliada a eficácia do tratamento sequencial com Bz ou Ps administrados em doses ótimas durante um curto intervalo de tempo (10 dias cada), verificou-se que a ordem de administração dos fármacos interfere no resultado do tratamento, sendo a sequência Bz seguido de Ps mais eficaz. Além disso, a terapia combinada induziu uma redução significativa da carga parasitária em camundongos infectados pela cepa VL-10 de T. cruzi, altamente resistente ao Bz, quando comparada às drogas administradas em monoterapia. Considerando esses resultados promissores, foi a seguir investigada a atividade da combinação do Bz com o Rv. Inicialmente foram realizados experimentos in vitro para definir a natureza da interação entre esses fármacos. A princípio, foram determinados os valores de IC-50 do Bz e do Rv sobre formas epimastigotas e amastigotas das cepas Y e Colombiana de T. cruzi. A seguir, o efeito de combinações de Rv e Bz, preparadas de acordo com o método de proporções fixas, foi avaliado nesses modelos. A análise dos resultados foi feita por meio do cálculo das concentrações inibitórias fracionárias (FICs) e do somatório das FICs (ΣFICs) para cada combinação. A natureza da interação foi classificada em função do ΣFICs: sinergismo se ΣFIC≤0,5; indiferença (aditividade) se 0,5<ΣFIC<4 e antagonismo se ΣFIC>4. As combinações de Rv e Bz mostraram-se aditivas, com valores de ΣFIC próximo a 1 para ambas as cepas e diferentes formas evolutivas do parasito estudadas. Dessa forma, o próximo passo foi avaliar o efeito do Rv (em forma de pró-fármaco, o E1224) em combinação com o Bz na infecção por T. cruzi in vivo. Inicialmente foi realizado um experimento para definição das doses de E1224 a serem utilizadas em monoterapia. O pró-fármaco foi efetivo em curar camundongos infectados pela cepa Y de T. cruzi de forma mais eficiente do que o composto precursor, o ravuconazol. Não foi observado efeito dose-dependente; os tratamentos com doses de 10 a 50mg/kg de peso induziram 71 % a 100 % de cura. De forma diferente, o tratamento dos animais infectados pelas cepas Colombiana e VL -10 foi eficaz em induzir uma intensa redução da carga parasitária, mas não em induzir cura. Finalmente, o tratamento com combinações de Bz e E1224 administrado a camundongos infectados pela cepa Colombiana resultou em maior taxa de cura, em relação às monoterapias, quando a terapêutica foi iniciada aos 4 dias após a infecção. Entretanto, quando usado um protocolo mais estringente, no qual o tratamento foi iniciado aos 10 dias após a infecção, houve redução significativa da carga parasitária, mas ausência de cura parasitológica. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram o benefício da terapia da combinação usando derivados azólicos e benznidazol no tratamento da infecção experimental por T. cruzi e ampliam os dados pré-clínicos relacionados ao uso de combinações de fármacos no tratamento de protozooses. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Chagas disease, caused by the protozoan pathogen Trypanosoma cruzi, remains a challenging infection due to the unavailability of safe and efficacious drugs. Combined therapy is envisioned as an ideal approach since it may improve treatment efficacy whilst decreasing toxicity and the likelihood of resistance development. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with Bz when combined with sterol 14α-Demethylase (CYP51) inhibitors posaconazole (Ps) and E1224 (pro-drug of ravuconazole - Rv) in experimental infection with T. cruzi. Initially, we evaluated the efficacy of Ps in combination with Bz during acute infection of mice with T. cruzi Y strain. The drugs were administered individually or in combination for 20 consecutive days. Bz/Ps combined treatments were found to be significantly more efficacious in inducing higher parasitological cure rates than those observed when the drugs were used alone, indicating a positive interaction between Bz and Ps. In addition, the combined therapy induced a significant reduction of parasite load in mice infected with VL-10, a benznidazole-resistant T. cruzi strain, compared to single administration of drugs. Subsequently, sequential therapy experiments were carried out with Bz or Ps over a short interval (10 days), followed by the second drug administered for the same period of time. It was found that the sequence of Bz followed by Ps provided cure rates comparable with those obtained with the full treatments with either drug alone, with no cures observed for the short treatments with drugs given alone. Considering these promising results, the next step was to investigated the activity of Bz and Rv combinations. First, we performed in vitro experiments to define the nature of interaction between Bz and Rv. IC-50 values for Bz and Rv were determined upon epimastigotas and amastigotes of Y and Colombian strains of T. cruzi. The drug combinations were evaluated on the same models. Drug susceptibility was assessed with a modified fixed ratio isobologram method. Fractional inhibitory concentrations (FICs), sum FICs (ΣFICs) and an overall mean ΣFIC were calculated for each combination. The nature of interaction was classified on the basis of the mean ΣFIC as follows: synergy as mean ΣFIC<0.5, indifference as mean between 0.5 and 4.0 and antagonism as mean ΣFIC>4. The interaction between Bz and Rv was indifferent with ΣFIC near to 1 for both strains. In this way, it was evaluated the effect of Rv (pro-drug, E1224) in combination with Bz upon in vivo infection. First, an experiment to define the optimal dose of E1224 in monotherapy was performed. The pro-drug of Rv, showed activity higher than demonstrated previously for the parent compound in the model of acute murine infection by strain Y. There was no dose-dependent effect, the treatments with 10 up to 50mg/kg weight for 20 consecutive days induced 71% to 100% of cure. Differently, the treatment of animals infected with Colombian or VL-10 strains was very effective in reducing the parasitemia, but led to nil cure rates. Finally, the effect of the E1224 and Bz combination against epimastigote and amastigote of Y and Colombian strains was evaluated. Additionally, the treatment of mice with E1224 in combination with Bz induced higher cure rate in mice infected with Colombian strain when the treatment started 4 days after infection or a significant reduction of parasite load in treatments started 10 days after infection, compared to single administration of drugs. This study expands the preclinical data on drug combinations and provides the basis for further studies as anti-T. cruzi chemotherapy is moving towards multidrug treatment regimens.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T18:41:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_ProdutionExpressionInflamattion.pdf: 3309907 bytes, checksum: 979c5e6d2df78ca5fd04916f54b09924 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-15T16:02:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_ProdutionExpressionInflamattion.pdf: 3309907 bytes, checksum: 979c5e6d2df78ca5fd04916f54b09924 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-15T16:02:30Z (GMT). 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Assim, o objetivo desse estudo é estudar a participação do T.cruzi na produção de fatores inflamatórios e angiogênicos em animais C57BL/6 infectados com diferentes cepas desse parasito. Demonstrou-se a formação de novos vasos sanguíneos na matriz da esponja culminando no 14º dia pos-implante dorsal. Demonstrou-se, ainda, alta produção de mediadores inflamatórios no plasma de animais infectados com as cepas Y e Colombiana do T.cruzi. Esses animais também apresentaram elevados níveis plasmáticos de VEGF. Além disso, observou-se que a cepa Colombiana do T.cruzi foi capaz de induzir elevado infiltrado leucocitário e parasitos no tecido cardíaco. Possivelmente, devido ao alto parasitismo induzido pela cepa Colombiando do parasito, houve baixa produção (VEGF, ANG-1 e ANG-2) e expressão (VEGF) de fatores angiogênicos no tecido cardíaco. De forma interessante, animais infectados pela cepa VL-10 do T.cruzi demonstraram reduzida parasitemia, produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas, bem como de infiltrado celular no tecido cardíaco. Além disso, o Benznidazol, a droga de escolha para o tratamento da doença de Chagas com alta citotoxicidade, foi capaz de manter os parâmetros angiogênicos similares aos animais não infectados. Também, o Enalapril e a Sinvastatina (fármacos utilizados para o tratamento de doenças cardioavasculares) foram capazes de reduzir citocinas inflamatóras em camundongos infectados, mas não a produção e a expressão de VEGF que mostrou-se similar aos animais infectados não tratados. Em suma, este estudo apresenta mediadores da angiogênese locais (coração) e sistêmicos durante a infecção pelo T.cruzi, sendo esses mediadores definidos pela genética e pela quantidade de parasitos presente no tecido cardíaco. _____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Inflammation is a key immune-pathophysiological characteristic of cardiomyopathy induced by Trypanosoma cruzi. Different inflammatory cells can contribute to the release of pro- and anti-inflammatory mediators which can directly or indirectly promote inflammatory angiogenesis. Mammalian cardiac cells are important targets to the protozoan T. cruzi driving an immune system that attempts to eliminate parasites. This inflammation culminates in cellular destruction, fibrosis, hypoxia and heart disturbances. Hypoxia and releasing of inflammatory mediators are well-defined stimuli to initiate angiogenesis. Therefore, we aimed to study the participation of T. cruzi in the production of inflammatory and angiogenesis mediators in C57BL/6 mice infected with different strains of this parasite. We found that in sponge matrix from infected mice, formation of new blood vessels were abrogated on day 14. Our data also demonstrated higher production of inflammatory mediators in plasma from mice infected with Y and Colombian strains of T.cruzi. These mice also demonstrated increase plasma VEGF. In addition, Colombian strain induced higher leukocyte infiltration and tissue parasites in cardiac tissue. However, possibly by the Colombian strain-associated higher tissue parasites, there were low production (VEGF, ANG-1 and ANG-2) and mRNA expression (VEGF) of angiogenic factors in cardiac tissue. It is very interesting that VL-10 infected C57BL/6 mice demonstrated decreased circulating parasite, production of inflammatory cytokines and chemokines, cellular infiltration in cardiac tissue. Furthermore, Benznidazole, a drug of choice for the treatment of Chagas disease, although exhibits numerous side effects, we observed that treament with this drug maintained angiogenic parameters similar to uninfected mice. Enalapril and Simvastatin (used for the treatment of cardiovascular diasease) treatment to infected mice diminished inflammatory cytokines but not VEGF expression and production which was similar to untreated infected mice. In summary, this study demonstrates angiogenesis mediators in local tissue (heart) and systemically during T. cruzi infection may be defined by the genetic and the load of tissue parasites.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-22T19:39:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_BenznidazolCombinaçãoAlopurinol.pdf: 1210676 bytes, checksum: b86fb203a1ae60b811ad4d83b65ea6ff (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-26T13:01:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_BenznidazolCombinaçãoAlopurinol.pdf: 1210676 bytes, checksum: b86fb203a1ae60b811ad4d83b65ea6ff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T13:01:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_BenznidazolCombinaçãoAlopurinol.pdf: 1210676 bytes, checksum: b86fb203a1ae60b811ad4d83b65ea6ff (MD5) Previous issue date: 2014 / O tratamento da doença de Chagas apresenta limitações relacionadas à sua eficácia variável, particularmente na fase crônica, e aos efeitos adversos frequentes, que podem levar à interrupção do tratamento. A terapia de combinação de fármaco parece ser uma estratégia ideal, já que pode contribuir para o aumento da eficácia do tratamento, diminuição da toxicidade e da probabilidade de desenvolvimento de resistência. No presente estudo foi avaliada a atividade do alopurinol (Al) em combinação com o benznidazol (Bz) na infecção experimental por T. cruzi. Inicialmente, foi verificada a atividade da combinação Bz/Al sobre a infecção de células H9c2 infectadas pela cepa Y de T. cruzi, incubando-as com diferentes concentrações de cada composto isoladamente ou em combinação. Foi utilizado, in vitro, o método de diluição “tabuleiro de dama” (checkerboard) e os resultados foram analisados utilizando índice de combinação (CI) calculado pelo software Calcusyn. A avaliação global dos resultados demonstrou que os CI variaram no intervalo de 0,62 a 1,76, o que sugeriu um efeito aditivo resultante da associação in vitro dos compostos avaliados. Posteriormente, foi realizada a avaliação in vivo da combinação Bz/Al. Para isso, camundongos Swiss fêmeas foram inoculados com 5000 formas tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de T. cruzi. O tratamento foi administrado por via oral durante 20 dias consecutivos, iniciado quatro dias após a inoculação. Os animais foram tratados com Bz (100, 75, 50 e 25 mg/kg) ou Al (90, 60 e 30 mg/kg) isoladamente ou em combinação (Bz/Al: 75/90 75/60 75/30, 50/90 , 50/60, 50/30, 25/90 , 25/60 e 25/30 mg/kg ). Os seguintes parâmetros foram utilizados para determinação da cura parasitológica: exame de sangue a fresco durante e até 60 dias após o tratamento e ensaio de PCR em tempo real de amostras de sangue (30 e 180 dias após o tratamento). A análise dos níveis de parasitemia após o tratamento com Bz mostrou um efeito tripanocida dose-dependente. Entretanto, mesmo havendo uma redução significativa do nível de parasitemia após o tratamento, a cura parasitológica foi identificada apenas nos animais tratados com 75 e 100mg de Bz por kg de peso corporal (20 e 70 % de cura, respectivamente). De forma diferente, não foi verificada efeito dose-dependente resultante do tratamento com Al. Além disso, não foi observada redução da parasitemia nem cura entre os animais que receberam diferentes doses desse fármaco. Posteriormente, foi avaliado o efeito das combinações entre Bz/Al, in vivo. O efeito benéfico das combinações dos fármacos foi demonstrado pela redução significativa da parasitemia detectada em todos os animais que receberam a terapia de combinação. Além disso, foi observado um aumento no índice de cura entre os animais tratados com os fármacos em combinação, uma vez que a administração de Bz-75 mg/kg + Al-90 mg/kg ou Bz-75 mg/kg + Al-60 mg/kg induziu 100 % de cura, e a combinação de Bz-75 mg/kg + Al-30 mg/kg ou Bz-50 mg/kg + Al-60 mg/kg induziu, respectivamente, 80 e 20 % de cura. Em conclusão, a combinação de Bz e Al apresentou um efeito benéfico, uma vez que foi identificada cura parasitológica em uma proporção maior de animais tratados com os medicamentos em associação do que naqueles que receberam as mesmas doses de cada fármaco em monoterapia. Nossos resultados reforçam a importância da identificação de combinações de compostos já comercializados que apresentem uma interação positiva no tratamento da infecção por T. cruzi. Esta abordagem pode contribuir para otimizar os custos e tempo investidas na pesquisa relacionada à toxicidade e a biodisponibilidade de novas drogas para o consumo humano. ___________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Current chemotherapy for Chagas disease is unsatisfactory due to its limited and variable efficacy, particularly in chronic phase, and frequent side effects that can lead to treatment discontinuation. Combined therapy is envisioned as an ideal approach since it may improve treatment efficacy and decrease toxicity and resistance likelihood. In this work, we evaluated the activity of the alopurinol (Al) in combination with the benznidazole (Bz) upon T. cruzi infection. First, we investigated the activity of the Bz/Al combination on intracellular parasites of Y stain by incubating T. cruzi-infected H9c2 cells with different concentrations of each compound alone or in combination. In vitro drug interactions were assessed using a “checkerboard method” and the results were analyzed by calculating of the combination index (CI) using Calcusyn software.The overall assessment of the results demonstrated CI (0,62 a 1,76) suggesting an in vitro additive effect between the evaluated drug combination. Subsequently, the in vivo evaluation of the Bz/Al combination was performed in mice infected with 5000 blood tripomastigotes of Y stain. Treatment was administered orally for 20 consecutive days, beginning at 4 days after inoculation. Animals were treated with Bz (100, 75, 50 e 25 mg/kg) or All (90, 60 e 30 mg/kg) alone or in combination (Bz/Al: 75/90, 75/60, 75/30, 50/90, 50/60, 50/30, 25/90, 25/60 e 25/30 mg/kg). The parameters chosen to determine parasitological cure were parasitaemia during and up to 60 days after treatment and blood real time PCR assay (30 and 180 days post treatment). First, the effects of several doses of each drug alone on the evolution of the infection in mice were evaluated. The analysis of parasitemia levels after Bz-treatment showed a dosedependent trypanocidal effect. Although there was significant reduction in the level of parasitemia after treatment, parasitological cure was documented only in animals treated with 75 and100 mg of Bz per kg of body weight (20 and 70 % of cure, respectively). Differently, a dose-dependent effect was not observed among treated animal and the parasitemia reduction or cure was not verified among animals that received different doses of Al. In a second series of data analyses, the activities of the combinations of the Bz/Al were compared. Here the beneficial effect of the drug combinations was demonstrated by a significant reduction of parasitemia detected in all animals that received the combination therapy. Besides increase in rate of cure among animals treated with combination therapy was observed, since the combination of the Bz-75 mg/kg + Al-90 mg/kg or Bz-75 mg/kg + Al-60 mg/kg induced 100% of cure, and the combination of 75 mg/kg + Al-30 mg/kg or Bz-50 mg/kg + Al-60 mg/kg induced, respectively, 80 and 20% of cure. In conclusion, the combination of Bz and Al suggest a beneficial effect, as parasitological cure was observed in a higher proportion of animals treated with the drugs in association than in animals receiving the same dose of each of the drugs in monotherapy. Our results reinforce the importance of identifying alreadymarketed compounds with synergistic effects. This approach may help avoid expensive and time-consuming research on the toxicity and biological availability of drugs for human consumption.