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Abstract : Pro-inflammatory cytokines play a key role in pathogenesis of obesity and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). IL-15 is a pro-inflammatory cytokine, which signals through a receptor complex composed of the IL-15 receptor (IL-15R) alpha chain, the IL-2/IL-15R beta chain and the common gamma chain. The functions of IL-15 have been extensively described in immune cells but less is known about its functions in others tissues such as the liver. The aim of this thesis is to investigate the role of IL-15 in fatty liver disease. C57BL/6 wildtype (WT) and IL-15 knockout (Il15[superscript -/-]) mice were maintained on high fat diet (HFD) or normal control diet (NCD). After 16 weeks, body weight, liver mass, fat accumulation in the liver, serum lipid levels and gene expression in the liver were evaluated. Intrahepatic lymphocytes (IHL) were also analysed. Primary hepatocytes were stimulated with IL-15 and chemokines gene expression was studied. IHLs were examined in WT, Il15[superscript -/-] and Il15ra[superscript -/-], as well as in macrophage- and hepatocyte-specific Il15ra[superscript -/-] mice. We found that IL-15 deficiency prevents weight gain and accumulation of lipids in the liver. Circulating levels of cholesterol and non-esterified fatty acids were elevated in WT mice but not in Il15[superscript -/-] mice. Hepatic expression of chemokines such as Ccl2, Ccl5 and Cxcl10 was increased in WT mice under HFD, but not in Il15[superscript -/-] mice. The livers of Il15[superscript -/-] and Il15ra[superscript -/-] mice also showed decreased expression of Tnfa and iNOS, and macrophage markers Cd68 and F4/80. Accordingly, stimulation of primary hepatocytes with IL-15 induced chemokine gene expression in WT but not in Il15ra[superscript -/-] hepatocytes. Furthermore, hepatocyte-specific ablation of IL-15Rαreduced infiltration of NK and NKT cells in the liver, suggesting that IL15Rα expression in the hepatocytes is needed for the recruitment and/or maintenance of the NK cell population in the liver. In conclusion, IL-15 promotes fat accumulation in the liver, and this is associated with increased inflammatory response in the liver. Increased availability of IL-15 in obesity may stimulate hepatocytes to secrete chemokines that promote hepatic inflammation resulting in fatty liver disease. IL-15Rα expression in hepatocytes appears to play a role in the maintenance of NK, NKT and iNKT cells. // Résumé : Les cytokines pro-inflammatoires jouent un rôle important dans la pathogenèse de l’obésité et la stéatose hépatique. L'IL-15 est une cytokine pro-inflammatoire qui est trans-présentée par l'IL-15Rα aux chaines IL-2/IL-15Rβ et γc. La fonction de l'IL-15 a été largement décrite dans les cellules immunitaires, mais ses fonctions dans d'autres tissus sont moins connues. Le but de ce mémoire est d'élucider le rôle de l'IL-15 dans la stéatose hépatique. Les souris C57BL/6 de type sauvage (WT) et Il15[indice supérieur -/-] ont été soumises à un régimehyperlipidique (HFD) ou à un régime normal. Après 16 semaines, le poids corporel, lamasse hépatique, l'accumulation de lipides dans le foie, les taux de lipides sériques et l'expression des différents gènes reliés à l’inflammation et au métabolisme dans le foie ont été évalués. Les lymphocytes intra-hépatiques (IHL) ont été également étudiés. Des hépatocytes primaires ont été stimulés avec IL-15, et l'expression génique de chimiokines a été déterminée. Les populations de IHLs ont été également caractérisées chez les souris WT, Il15[indice supérieur -/-] et Il15ra[indice supérieur -/-], ainsi que chez des souris dont la déficience dans l’expression d’IL-15Rα est ciblée aux macrophages ou aux hépatocytes. Nos résultats montrent que la déficience en IL-15 empêche l'accumulation de lipides dans le foie. Les taux de cholestérol et d’acides gras non estérifiés dans le sang étaient élevés chez les souris WT, mais pas chez les souris Il15[indice supérieur -/-]. L'expression hépatique des chimiokines Ccl2, Ccl5, Cxcl10 et des marqueurs de macrophages était augmentée chez les souris WT sous HFD, mais pas chez les souris Il15[indice supérieur -/-]. La stimulation des hépatocytes primaires avec l'IL-15 induit l'expression des gènes des chimiokines chez les hépatocytes WT, mais pas chez les Il15ra[indice supérieur -/-]. En outre, nous avons trouvé une infiltration réduite des cellules NK et NKT dans le foie des souris déficientes en Il15ra[indice supérieur -/-] dans les hépatocytes, ce qui suggère que l'expression d’IL15Rα chez les hépatocytes est nécessaire aurecrutement des cellules NK, NKT et / ou à leur maintien. En conclusion, nous proposons que l’IL-15 favorise l'accumulation de lipides dans le foie, et que ceci est associée à une réponse inflammatoire accrue. La disponibilité accrue de l'IL-15 dans l'obésité pourrait stimuler les hépatocytes à secréter des chimiokines ce qui favorise l'inflammation hépatique et conduirait à la stéatose hépatique. L’expression de l'IL-15Rα dans les hépatocytes semble jouer un rôle principal dans l’infiltration des cellules NK, NKT et iNKT dans le foie.

Ce travail examine les mécanismes de l’immunité innée impliqués dans l’hépatite aiguë virale du modèle murin d’infection par le virus de l’hépatite virale murine de type 3 (MHV-3). Afin de déterminer le rôle du TLR2 dans l’aggravation de l’hépatite, des infections avec le virus MHV-3 ont été réalisées in vivo chez des souris C57BL/6 et des souris déficientes pour le gène tlr2 et in vitro dans des macrophages et des hépatocytes infectés avec le virus MHV-3 et le virus moins virulent MHV-A59. Les niveaux de transcription et de traduction des senseurs microbiens, des interférons (IFN) de type I, des cytokines et/ou des chimiokines ont été évalués par qRT-PCR et ELISA. Les cellules ont été traitées avec des petits ARNs interférants (siRNAs) pour le TLR2 et le CEACAM1a ou mises en présence d’inhibiteurs des voies d’endocytose. Les résultats révèlent le rôle stimulateur du TLR2 pour la réplication virale, la production de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α et des chimiokines CXCL1, CXCL10 et CCL2. Un nouveau mécanisme d’échappement aux senseurs viraux dépendant du TLR2 a également été mis en évidence dans les macrophages et les hépatocytes lors de l’infection de ces cellules avec le virus MHV-3, et non pas avec le virus moins virulent MHV-A59. Ces différents travaux révèlent un nouveau rôle du TLR2 lors d’infections virales dans l'aggravation de la réponse inflammatoire tout en protégeant le virus des autres senseurs de la réponse immune innée. / This work investigates the innate immunity mechanisms involved in the Murine Hepatitis Virus type 3 (MHV-3) acute hepatitis disease model. In the goal of determining the role of the TLR2 receptor in aggravating the hepatitis disease, in vivo infections with the MHV-3 virus were performed on C57BL/6 mice or tlr2-/- gene knockout mice as well as in vitro infections of murine macrophages and hepatocytes with the MHV-3 and less virulent MHV-A59 serotypes. The levels of transcription and translation of different microbial sensors, type I interferons (IFN), cytokines and/or chemokines were measured by qRT-PCR and ELISA tests. Cells were treated with small interfering ARN (siRNA) for the TLR2 and/or CEACAM1a genes or treated with the different endocytosis inhibitors before infection. Our results reveal the stimulatory role of the TLR2 receptor on viral replication, production levels of the IL-6 and TNF-α cytokines and chemokines CXCL1, CXCL10 and CCL2. This study also reveals a new immune evasion mechanism via TLR2 in macrophages infected with MHV-3, but not with the lesser virulent MHV-A59 serotype. These different experiments have revealed a new role for the TLR2 receptor in viral infections wherein inflammatory responses are aggravated whilst shielding viral detection by other pathogens sensors of the innate immunity.

Résumé : Contrairement à ce que l'on pourrait croire, les douleurs chroniques ne constituent pas uniquement des symptômes, mais bien une pathologie à part entière. La pharmacopée actuelle ne permettant pas de les soulager efficacement, il y a maintenant un besoin de les considérer dans leur spécificité lors de la recherche de nouvelles thérapies. Dans cette optique, nous avons étudié le rôle des chimiokines et de leurs récepteurs dans le contrôle de la douleur. Connu pour leur rôle dans la réponse immunitaire, nous avons en particulier investigué le rôle du couple ligand-récepteur CCL2-CCR2 dans la régulation des douleurs d’origine arthritique. Nous avons d'abord évalué l'effet analgésique de notre molécule antagoniste du récepteur CCR2, l'INCB3344, dans un modèle de douleur inflammatoire où elle renverse d'environ 50% les douleurs provoquées et les douleurs spontanées lorsqu'administrée par voie spinale. Nous avons également pu observer que bloquer l'activation de CCR2 au niveau de la moelle épinière limite non seulement la neuroinflammation spinale, mais permet également de réduire la sévérité de l'atteinte inflammatoire périphérique en limitant le transport rétrograde de la substance P. Nous avons ensuite appliqué nos observations sur un modèle de douleur arthritique plus près de la réalité clinique des patients souffrant d'arthrite rhumatoïde. Nous y avons reproduit la majorité de nos effets analgésiques suite à une administration spinale. Le traitement est cependant demeuré sans effet sur l'œdème périphérique. Parallèlement à cela, l'administration périphérique du composé, sur une base de deux bolus par jour ou en libération continue par des mini-pompes osmotiques, n'a eu que de très faibles effets analgésiques, mais s'est révélé avoir un impact marquant sur l'œdème périphérique et le gain de poids des animaux. Finalement, c'est en combinant l'INCB3344 avec de l'ibuprofène qu'il a été possible d'avoir un impact positif sur le plus grand nombre de paramètres associés à la douleur chronique. Ces résultats suggèrent donc qu'un antagoniste du récepteur CCR2 possède un potentiel analgésique intéressant, d'autant plus lorsqu'il s'agit de douleur d'origine inflammatoire puisqu'il permet d'agir à la fois sur l'hypersensibilité nociceptive et sur la source même de la douleur inflammatoire. Ce potentiel devient d'autant plus intéressant que de le combiner à un anti-inflammatoire non-stéroïdien (l'ibuprofène) améliore l'efficacité des deux composés. // Abstract : Contrary to popular beliefs, chronic pain is not only a set of symptoms, but a bona fide pathology that the drugs currently available are not sufficient to efficiently relieve. There is thus a need to modify our approach to discover new analgesic agents, taking into consideration the specific physiopathology of chronic pain. With this in mind, we investigated the role of chemokines and their receptors in the modulation of pain. Also known for their participation in the immune response, we focused on the CCL2-CCR2 ability to regulate arthritic pain. We first evaluated the analgesic properties of INCB3344, a specific antagonist of the CCR2 receptor, in a model of inflammatory pain. It reverses both provoked and spontaneous pain by 50% when administered i.t. We also observed that spinally blocking CCR2 limited the expression of proinflammatory mediators. It also reduced peripheral inflammation by preventing peripheral transport of SP. We then translated our findings in a model of arthritic pain, closer to the clinical reality of patients with rheumatoid arthritis. Spinal administration of INCB3344 had similar analgesic actions, but did not altered peripheral inflammation. On the other hand, peripheral administration of INCB3344, either by subcutaneous injection or by continuous release assured by an osmotic pump, had almost no analgesic effects, but significantly reduced peripheral inflammation and reduced the weight loss. By combining INCB3344 with a daily administration of ibuprofen, we were however able to reduce both pain hypersensitivity and the severity of the peripheral inflammation. Taken together, these results suggest that CCR2 antagonism has promising analgesic properties; especially for inflammatory or arthritic pain as it can acts both on the sensibilized nociceptive network and on the peripheral source of the inflammatory pain. This become even more interesting as its mechanism is at least not completely redundant with those of classic non-steroidal anti-inflammatory drugs, which allow the combination of both class of molecule to yield even larger effect.

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH. / The chemokines and their counter receptors play an important role in regulating innate and adaptive immunity. The chemokine receptors serve as markers for distinct CD4+ T cell subsets with specific tissue homing potential, antigenic specificity, and polarization profile. There is limited knowledge on the identity of primary CD4+ T cell subsets selectively targeted by human immunodeficiency virus (HIV) infection. The recruitment in the intestinal mucosa of excess effector (CD8+ T) versus target (CD4+ T) cells predicts a good outcome for the simian immunodeficiency virus (SIV) infection, while the depletion of Th17 cells in the gut-associated lymphoid tissues (GALT) represents a marker for HIV disease progression. The regulatory role of chemokines on cellular activation and on HIV replication in different CD4+ T cell subsets remains poorly investigated. This M.Sc. project is dived in 3 parts: (1) the identification of chemokine receptors CCR4, CXCR3 and CCR6 as surface markers of CD4+ T cell subsets, with susceptibility to HIV replication (2); the phenotypic and functional characterization of HIV-specific CD4+ and CD8+ T cells in HIV-infected long-term-non progressor (LTNP) individuals and (3) the effect of chemokine ligands of CCR4, CXCR3 and CCR6 on cellular activation and viral replication in vitro. Our results reveal that CD4+ CCR4+CCR6+ T (Th17 cytokine profile) and CD4+ CXCR3+CCR6+ (Th1/Th17 cytokine profile) T cells are highly permissive to HIV replication. Also, our results suggest new correlates of immune protection against HIV in LTNP subjects: (i) the co-localization potential of HIV-specific CD4+ and CD8+ T cells in the intestinal mucosa via the integrin β7, (ii) the high ratio between effector (CD8+) versus target (CD4+) T cells, (iii) the Th17 cytokine profile and (iv) the ability of HIV-specific CD4+ and CD8+ T cells to produce CCR5 ligands blocking viral entry. Finally, our results on the co-stimulatory effect of chemokines on T cell activation and their opposite impact on HIV replication in CD4+ T cells demonstrate the role played by the chemokine network during HIV pathogenesis.

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La leishmaniose viscérale est une maladie systémique mortelle en l’absence de traitement. Elle est due aux protozoaires Leishmania donovani et L. infantum, parasites des phagocytes mononucléés, capables d’envahir les organes lymphoïdes et le foie. Le contrôle de l’infection hépatique repose sur la mise en place d’une réponse granulomateuse efficace, promue par une réponse immunitaire Th1, dans un environnement tissulaire Th2. L’objectif de ce travail était l'étude du rôle d’une cytokine Th2 récemment décrite, l’IL-33, dans cette réponse hépatique complexe encore partiellement incomprise. Des dosages d’IL-33 sur des sérums de patients et la détection de cellules IL-33+ dans le foie d’un patient rennais ont placé l’IL-33 comme un biomarqueur possible de la maladie active. L’IL-33 étant exprimée dans les cellules étoilées du foie au cours d’hépatites chroniques, ces cellules ont été exposées à L. donovani. Leur permissivité aux leishmanies sans toxicité apparente ni perturbation de leurs propriétés fonctionnelles, ainsi que la persistance des leishmanies sur une culture de plusieurs semaines, nous ont conduit à proposer les cellules étoilées comme cellules sanctuaires possibles pour les leishmanies viscérotropes, contribuant donc potentiellement au portage asymptomatique. En revanche, elles ne sont pas apparues comme une source majeure d'IL-33 au cours de la leishmaniose viscérale. Chez des souris C57BL/6 et BALB/c infectées par L. donovani, l'IL-33 a été observée dans des cellules ne s'apparentant pas à des cellules étoilées, et principalement localisées dans les granulomes. Des cellules exprimant son récepteur ST2 ayant été également observées dans le foie, un rôle de l’axe IL-33/ST2 a été recherché. Les résultats obtenus chez des souris BALB/c déficientes en ST2 ou traitées par de l'IL-33 recombinante suggèrent que l'IL-33 régule négativement l'expression de cytokines Th1 (IL-12, IFN-γ) et l'infiltrat de neutrophiles et monocytes dans le foie, limitant ainsi le contrôle de la charge parasitaire. Ainsi, l'IL-33 semble être un facteur de susceptibilité pour la leishmaniose viscérale. En parallèle, des travaux entrepris sur des souris C57BL/6 infectées par L. donovani suggèrent de possibles rôles différentiels de l'IL-33 en fonction de l'environnement immunitaire inhérent au fond génétique de l'hôte. / Visceral leishmaniasis is a life-threatening systemic disease caused by Leishmania protozoans, L. donovani and L. infantum, which invade mononuclear phagocytes in the lymphoid organs and the liver. The control of the hepatic parasite burden depends on the granuloma formation, which is favored by a Th1 immune response in a Th2 tissue microenvironment. The aim of this work was to study the role of the recently described Th2 cytokine IL-33 in this complex immune response, which remains partially misunderstood. IL-33 dosages in different patient sera and IL-33+ cells detected in the liver of a patient from Rennes suggested that IL-33 could be a biomarker for active visceral leishmaniasis. As IL-33 was described in hepatic stellate cells during chronic hepatitis, these cells were exposed to L. donovani in primary culture. The cell permissivity to L. donovani and the parasite persistence during a long term culture led us to propose hepatic stellate cells as a new type of sanctuary cells, which could partially explain asymptomatic carriage. However, these cells were apparently not the main source of IL-33 during visceral leishmaniasis. In infected BALB/c and C57BL/6 mice, IL-33 was detected in the liver in non stellate cells preferentially localized in granulomas. The presence of cells expressing its specific receptor ST2 in the liver led us to explore the role of the IL-33/ST2 axis. BALB/c mice deficient in ST2 or treated with recombinant IL-33 and infected with L. donovani revealed that IL-33 downregulates the expression of Th1 key cytokines (IL-12, IFN-γ) and the recruitment of neutrophils and monocytes. Finally, IL-33 acts as a susceptibility factor during visceral leishmaniasis. Besides, the model of L. donovani infected C57BL/6 mice deficient in IL-33 or treated with recombinant IL-33 suggests possible differential roles of IL-33 depending on the immune environment related to the host genetic background.

Le genre Entérovirus (EV) (famille des picornaviridae) est composé de petits virus à ARN non enveloppées classés en 12 espèces dont 7 sont pathogènes pour l'homme : 4 espèces (A-D) d'enterovirus humains (HEV) et trois espèces (A-C) de rhinovirus humains (HRV). Dans le genre enterovirus, les HRV et HEV sont reconnus comme des pathogènes respiratoires fréquemment responsables d'infections des voies aériennes supérieures et inférieures chez l'enfant et l'adulte. Entre 2009 et 2012, de nouveaux génotypes d'HEV à tropisme respiratoire (HEV-68, 104, 109, et le CVA-21) ont été décrits dans des cas isolés ou épidémiques démontrant la capacité des espèces A à D à induire des infections respiratoires basses humaines.La première phase de ce travail de thèse a eu pour objectifs de préciser le rôle étiologique des infections à EVs; d'identifier les génotypes potentiellement responsables des pathologies respiratoires pédiatriques nécessitant une hospitalisation, mais aussi d'analyser et de comparer les caractéristiques cliniques et épidémiologiques entre les différents groupes de génotypes identifiés. Nous avons réalisé une étude rétrospective sur une cohorte de 309 enfants hospitalisés au CHU de Reims entre septembre 2009 et juin 2010 pour une infection respiratoire aiguë non documentée microbiologiquement par la réalisation des tests virologiques et bactériologiques conventionnels. Nos résultats montrent que le génome des EVs (HEV et HRV) est retrouvé dans 60,5% (187/309) des aspirations naso-pharyngées des enfants hospitalisés, distinguant 15 infections à HEV (dont 10 souches HEV-68) et 172 à HRV. Les cas de bronchiolite et d'exacerbation de l'asthme (133/187) positifs pour la détection des souches HEV (12/133) étaient plus âgés (P=0,003) et plus fréquemment associés avec une détresse respiratoire (P=0,01) et un besoin en oxygénothérapie au moment de leur hospitalisation (P=0,01) que les cas infectés par un HRV. De plus, nous avons mis en évidence pour la première fois en France la circulation épidémique de souches d'HEV-68 (10/15 des souches d'HEV détectées) isolées au cours de l'automne 2009 chez des enfants hospitalisés pour une infection respiratoire aiguë. Nos résultats fournissent de nouvelles informations sur ce génotype ré-émergent qui semble présenter un tropisme respiratoire spécifique des voies respiratoires inférieures.La seconde phase de ce travail de thèse s'est intéressée à étudier les mécanismes liés au développent des processus inflammatoires de la muqueuse au cours de l'infection des voies respiratoires basses par HEV. A l'aide d'un modèle in vitro de cellules respiratoires humaines (A549) infectées par HEV-B (CVB5, Mitchell), nous avons observé que l'infection réplicative des HEV dans les cellules A549 induisait une augmentation dose et temps-dépendante des ARNm, et des protéines IL-8, MCP-1 et RANTES.En conclusion, nos résultats obtenus à partir de prélèvements respiratoires dans le cadre de notre étude de cohorte suggèrent que les EVs représentent une cause étiologique fréquente d'infections respiratoires basses chez l'enfant avec une pathogénicité supérieure des HEVs (principalement dans notre étude HEV-68) par rapport aux souches HRVs. De plus, nos résultats obtenus à partir d'expérimentation in vitro démontrent que les HEVs du groupe B sont capables d'induire au cours de l'infection des cellules épithéliales alvéolaires humaines (A459) une sécrétion spécifique d'IL-8, MCP-1 et RANTES. La production de ces chimiokines correspond à une réponse innée de la cellule épithéliale humaine infectée par les HEVs: nous avons montré pour la première fois que ce mécanisme était en partie régulé par l'activation de la voie non canonique de NF-kB via la protéine NIK dans la cellule épithéliale respiratoire humaine. / The Enterovirus (EV) genus (picornaviridae family) consists of small non-enveloped positive RNA viruses classified in 12 species of which 7 are pathogenic for humans: four species (A-D) of human enterovirus (HEV) and three species (A-C) of human rhinovirus (HRV). Among the EV genus, HEV and HRV are recognized as leading causes of acute respiratory tract infections (ARTIs) in human. Between 2009 and 2012, new HEV respiratory genotypes (e. g. HEV-68, 104, 109, 117 and CVA-21) have been described in isolated cases or outbreaks supporting the ability HEV species A to D to induce lower respiratory tract infections. This supports the hypothesis of an underestimation of the prevalence and etiological role of EVs in pediatric acute respiratory tract infections (ARTIs) (more specifically bronchitis, bronchiolitis and asthma exacerbation).To assess the etiological role and the clinical characteristics of HRV and HEV infections in pediatric patients hospitalized for ARTIs, we conducted a retrospective study of 309 hospitalized pediatric patients in University Hospital Centre of Reims with microbiologically unexplained ARTIs from September 2009 to June 2010. Among the 309 ARTIs, 15 HEV and 172 HRV strains were identified. Among bronchiolitis and asthma exacerbation cases (n=133), HEV infected cases were older (P=0.003) and were more frequently associated with a respiratory distress (P=0.01) and a need for oxygen therapy at the time of admission (P=0.01) than cases infected by HRV strains. Interestingly, during this retrospective study, we provided evidence that during the fall 2009 in France, HEV-D68 strains were responsible for a low proportion of pediatric cases hospitalized for acute airway diseases including bronchiolitis and asthma exacerbation.To identify the mechanisms that can regulate the development of airway mucosa inflammation during HEV respiratory lower tract infections, we investigated the production of chemokines by HEV infected human alveolar epithelial cells (A549). Using in vitro model A549 cells infected by HEV-B (CVB5, Mitchell), we demonstrated that HEV-B strains isolated from upper respiratory tract of child with bronchiolitis could actively replicate in various human airway epithelial cells, and that this replicative infection induced specific dose and time-dependent increases in mRNA and protein secretion of IL-8, MCP-1 and RANTES, but not of all other CC and CXC human chemokines tested. The protein secretion of these chemokines appeared to be significantly increased at 48 and 72 hours post-infection in culture treated by low-doses of IFN-γ in comparison with mock-infected cells (P <0.001), and was correlated to the viral replication activity. In second time, we explore the pathogenic mechanisms that can regulate inflammatory responses to HEV in lower respiratory airways. We show that HEV infection induced a time-dependent increase of NIK protein accumulation that peaks at 16 hours post-infection (H P-I). NIK protein accumulation mediated the processing of p100 in p52, which association with Rel B was evidenced in nuclear compartment between 16 and 48 H P-I.In conclusion, our findings indicate that EVs are a common cause of lower respiratory tract infections in pediatric patients with a potential higher pathogenicity of HEV strains (mainly HEV-68) by comparison to HRV strains. Moreover, our in vitro results demonstrated that HEV are capable to induce the release of specific chemokines (IL -8, MCP-1 and RANTES) by alveolar epithelial cells during a replicative infection. Finally, we demonstrated for the first time that this innate airway epithelial cell response against HEV infection was partly regulated by the activation of the non-canonical NF-kB via NIK protein.

INTRODUÇÃO: Pacientes pediátricos portadores de defeitos septais cardíacos não restritivos podem apresentar, em cerca de 5% a 10% dos casos, remodelamento vascular pulmonar progressivo, com evolução para hipertensão arterial pulmonar (HAP) de grau moderado ou acentuado. A inflamação e a imunidade exercem papel central na patogênese da HAP, porém são ainda pouco exploradas neste grupo específico de pacientes. O presente estudo, prospectivo, longitudinal e de coorte, teve como objetivo avaliar níveis circulantes de mediadores inflamatórios segundo grupos de pacientes hemodinamicamente distintos. Concomitantemente foram analisadas possíveis correlações com dados histopatológicos e com resposta à intervenção medicamentosa. MÉTODOS: Estabelecida a forte suspeita de hipertensão pulmonar por exame à beira leito, foram incluídos no estudo 47 pacientes, com idade de dois a 37 meses (mediana 10 meses), sendo 32 portadores de síndrome de Down. Pacientes classificados como Grupo 1 (n=16) apresentavam sinais clínicos de hiper-resistência pulmonar e foram aqueles submetidos ao cateterismo cardíaco, com níveis comprovadamente elevados de resistência vascular pulmonar (5,2 (4,2-8,9) U x m2, mediana e intervalo interquartílico). Pacientes classificados como Grupo 2 (n=31) apresentavam sinais clínicos de hiperfluxo com congestão pulmonar, não necessitando de cateterismo pré-operatório. A relação entre fluxo pulmonar e sistêmico (Qp/Qs), estimada por ecocardiografia, foi de 1,9 (1,3-2,6) no Grupo 1 e 2,8 (2,3-3,3) no Grupo 2 (p=0,008). Foram analisadas 36 citocinas séricas através de quimioluminescência. RESULTADOS: Observando-se os pacientes como um todo (n=47), os níveis séricos da quimiocina MIF (macrophage migration inhibitory factor) estavam aumentados (7510±2755 pixels x 5697±2051 pixels em controles pediátricos, média±desvio padrão). Entretanto, os níveis de MIF estiveram especificamente aumentados no Grupo 1 quando comparados ao Grupo 2 e controles (respectivamente, 8494±619 pixels, 6618±477 pixels e 6548±726 pixels, média ajustada para idade±erro padrão, p=0,037). Por outro lado, níveis da quimiocina RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) estavam aumentados especificamente no Grupo 2 quando comparados ao Grupo 1 e controles (respectivamente, 74183±3865 pixels, 60130±6455 pixels e 59332±3970 pixels, média±erro padrão, p=0,039). Este comportamento foi semelhante quando analisados apenas os pacientes com síndrome de Down. Em todos os pacientes, a quimiocina GRO-Alfa (growth-regulated oncogene alpha) esteve aumentada nos primeiros meses de vida, com subsequente declínio exponencial (R2= -0,47, p < 0,001), enquanto a interleucina 17E (também conhecida como IL-25) apresentou relação direta com a idade (R2=0,44, p=0,002). A interleucina 16 apresentou relação inversa com o fluxo sanguíneo pulmonar (rs= -0,34, p=0,018) e níveis mais elevados em pacientes com evidência de doença vascular avançada em biópsia realizada no intra-operatório (p=0,021). Pacientes do Grupo 1 receberam sildenafila no pré-operatório, o que resultou em aumento do fluxo sanguíneo pulmonar (p=0,012) e da saturação periférica de oxigênio (p=0,010), além de redução dos níveis de interleucina 6 (p=0,027) e ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) (p=0,011). Não foi observado comportamento particular em pacientes com síndrome de Down. CONCLUSÕES: Os dados apresentados indicam uma relação entre níveis séricos de algumas citocinas e gravidade da doença vascular pulmonar, com potenciais implicações fisiopatológicas e clínicas. Além disso, o envolvimento da interleucina 17E e do MIF enfatizam o papel da resposta imune Th2, já descritas na HAP. Os resultados também permitem um questionamento a respeito das generalizações correntes relacionadas à vasculopatia pulmonar na síndrome de Down, anteriormente considerada como fator de risco em todos os casos / INTRODUCTION: Pediatric patients with nonrestrictive cardiac septal defects may present progressive pulmonary vascular remodeling with progression to pulmonary arterial hypertension (PAH), which might range from moderate to severe in about 5% to 10% of the patients. Inflammation and immunity play a central role in the pathogenesis of PAH, but are still poorly explored in this specific group of patients. This current study - prospective, longitudinal and cohort - was aimed at evaluating circulating levels of inflammatory mediators according to hemodynamically distinct groups of patients. At the same time, possible correlations with histopathological data and response to vasodilator intervention were analyzed. METHODS: After the establishment of a strong suspicion of pulmonary hypertension at bedside, 47 patients aged 2 to 37 months (median 10 months) were included in the study, of which 32 had Down syndrome. Patients classified as Group 1 (n = 16) had clinical signs of elevated pulmonary vascular resistance and were subjected to cardiac catheterization, with proven levels of increased pulmonary vascular resistance (5.2 (4.2-8.9) U x m2, median and interquartile range). Patients classified as Group 2 (n = 31) presented clinical signs of increased blood flow with pulmonary congestion, requiring no preoperative catheterization. The pulmonary to systemic blood flow ratio (Qp/Qs), estimated by echocardiography, was 1.9 (1.3-2.6) in Group 1 and 2.8 (2.3-3.3) in Group 2 (p = 0.008). Thirty-six cytokines and related proteins were analyzed in serum by chemiluminescence. RESULTS: Observing patients as a whole (n = 47), serum levels of the chemokine MIF (macrophage migration inhibitory factor) were increased (7510 ± 2755 pixels x 5697 ± 2051 pixels in pediatric controls, mean ± standard deviation). However, MIF levels were specifically increased in Group 1 when compared to Group 2 and controls (respectively, 8494 ± 619 pixels, 6618 ± 477 pixels and 6548 ± 726 pixels, mean age adjusted ± standard error, p = 0.037). On the other hand, RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) levels were specifically increased in Group 2 when compared to Group 1 and controls (respectively 74183 ± 3865 pixels, 60130 ± 6455 pixels and 59332 ± 3970 pixels, mean ± standard error, p = 0.039). This behavior was similar when only patients with Down syndrome were analyzed. In all patients, GRO-Alpha (growth-regulated oncogene alpha) was increased in the first months of life, with subsequent exponential decline (R2 = -0.47, p < 0.001), while interleukin 17E (also known as IL-25) presented a direct relationship with age (R2 = 0.44, p=0.002). Interleukin 16 was negatively related to pulmonary blood flow (rs = -0.34, p = 0.018) and was higher in patients with evidence of advanced vascular disease by intraoperative lung biopsy (p = 0.021). Patients in Group 1 received sildenafil in the preoperative period, which resulted in increased pulmonary blood flow (p = 0.012) and peripheral oxygen saturation (p = 0.010), as well as decreased levels of interleukin 6 (p = 0.027) and ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) (p = 0.011). There was no particular behavior of subjects with Down syndrome at all. CONCLUSION: The presented data indicate a relationship between serum levels of some cytokines and the severity of pulmonary vascular disease, with potential pathophysiological and clinical implications. In addition, the involvement of interleukin 17E and MIF emphasizes the role of Th2 immune response, already described in PAH. The results also raise doubts if Down syndrome should be considered as a risk factor in a generalized way