Los trabajos presentados en esta tesis doctoral se han basado en el uso, diseño y optimización de herramientas moleculares para facilitar el diagnóstico de las leishmaniosis humanas y de reservorios animales, así como para favorecer el conocimiento del agente causal a nivel interespecífico e intraespecífico. Para el tipado interespecífico de Leishmania spp se ha optimizado un método basado en la lectura del tamaño de fragmentos marcados con fluorescencia, metodología denominada PCR-FFL (PCR-Fluorescent Fragment Length analysis). No sólo se han buscado mejoras en la técnica analítica, sino también en la sensibilidad evaluando la capacidad discriminatoria de la PCR-FFL sobre dos dianas distintas, las secuencias ribosómicas ITS-1 y 7SL, obteniéndose mejores resultados en cuanto a sensibilidad sobre 7SL. La comparación con la metodología clásica de PCR-RFLP nos ha permitido observar que a nivel metodológico la PCR-FFL presenta ventajas importantes, como la simplicidad y exactitud en la lectura de los resultados, gracias a la automatización del análisis. El uso de la PCR-FFL con ambas dianas sobre biopsia de piel o bien utilizando papeles de filtro representa una buena metodología para el diagnóstico y tipado interespecífico por su especificidad, exactitud, objetividad, elevada sensibilidad y rapidez en la obtención de los resultados. La aplicación de metodologías moleculares en estudios epidemiológicos se ha dirigido a la detección de Leishmania en dos especies de erizos presentes en la zona de alta endemia de M’sila (Argelia): Atelerix algirus y Paraechinus aethiopicus, con el objetivo de determinar su papel como posibles nuevos reservorios del parásito. El estudio serológico ha revelado contacto pasado o reciente con el parásito. La posterior detección de ADN de Leishmania en estos animales mediante una qPCR de género de alta sensibilidad nos ha permitido confirmar la infección activa de los erizos en el momento del estudio. El genotipado de Leishmania sobre muestra se ha determinado mediante PCR-FFL, permitiendo identificar la especie L. major en una muestra de piel de los erizos estudiados. Para aumentar la sensibilidad del análisis, se ha realizado una doble amplificación mediante nested-PCR que ha permitido la identificación de L. major en todas las muestras restantes. Estos resultados han señalado por primera vez la existencia de L. major en erizos, y el papel de éstos como posibles reservorios de esta especie en el área estudiada. El tercer objetivo de nuestro estudio ha consistido en analizar la diversidad intraespecífica de Leishmania infantum en sucesivos aislados del parásito obtenidos de pacientes co-infectados con Leishmania/VIH que presentan recaídas clínicas después del tratamiento, mediante el análisis de 20 microsatélites considerados polimorfos para L. infantum. El análisis de 25 aislados ha permitido detectar 18 genotipos distintos, indicando una gran diversidad a pesar de proceder de 8 pacientes co-infectados del área metropolitana de Barcelona. El bajo número de genotipos repetidos detectado ha indicado una baja proporción de recaídas clínicas entre los pacientes, no siendo las reinfecciones la única hipótesis, sino considerando otras posibilidades sobre el comportamiento del parásito en el hombre y la posible selección en los cultivos de laboratorio. En algunos casos, el análisis filogenético ha señalado una distancia genética próxima entre los aislados de un mismo paciente, que puede ser relacionado con mutaciones del parásito. La posibilidad de la infección mediante el uso de jeringas contaminadas ha sido considerada otra posible fuente de transmisión. / The work presented in this thesis is based on the design, use and optimization of molecular tools to improve the diagnosis of human leishmaniasis and the reservoir hosts, as well as to promote knowledge of the causal agent at interspecific and intraspecific levels. The optimization of interspecific typing of Leishmania spp is based on a fluorescent fragment length analysis methodology called PCR-FFL. The sensitivity of the technique was evaluated on two different targets, the ITS-1 and 7SL sequences, with high sensitivity observed in both sequences, particularly 7SL. Compared with PCR-RFLP methodology, the automated PCR-FFL analysis proved simpler and allowed more accurate readings of the results. The use of PCR-FFL with both targets on skin biopsies or filter papers is a good methodology for interspecific typing of Leishmania. Molecular techniques are usually applied for epidemiological purposes to identify new reservoir hosts. Our study is based on the detection of Leishmania in two hedgehog species of the highly endemic area of M'sila (Algeria), in order to determine their role as potential new reservoir hosts of the parasite. A serological study revealed contact with the parasite, and detection of Leishmania DNA by qPCR allowed us to confirm active infection. Genotyping of Leishmania was determined by PCR-FFL, and the species L. major was identified in one skin sample. A nested-PCR allowed the identification of L. major in all remaining samples. These results have revealed, for the first time, the existence of L. major in hedgehogs, and their role as potential reservoirs of this species. Molecular techniques were also used for the intraspecific analysis of Leishmania infantum in 25 successive isolates from 8 co-infected Leishmania/HIV patients with clinical relapses after treatment. The analysis of 20 polymorphic microsatellites for L. infantum indicated high genotype diversity with 18 genotypes, only 3 of which were repeated. Clustering and phylogenetic analysis allowed the evolution of the infection to be studied, revealing cases of confirmed relapse, parasite evolution in the patients, mixed infections followed by differential selection by the parasite culture, and reinfection.

La supervivencia en el cáncer infantil ha aumentado notablemente en las últimas décadas, y como consecuencia la calidad de vida relacionada con la salud (CVRS) de los supervivientes ha pasado a tener gran interés. Los resultados sobre dicha calidad de vida no son todavía concluyentes, las variables sociodemográficas y las secuelas en la supervivencia explican un porcentaje no muy grande en el resultado final de la CVRS. El objetivo del presente trabajo es evaluar la CVRS de los supervivientes de tumores en el sistema nervioso central (SNC), reportado tanto por los mismos supervivientes como por los progenitores, y explorar el papel de variables psicológicas en el resultado final de CVRS. Dichas variables son: estilos de afrontamiento del superviviente y del progenitor y malestar parental. Método: se obtiene una muestra de 38 supervivientes que habían sido diagnosticados de tumor en el SNC, y 44 progenitores, visitados todos ellos en el Hospital Universitari Vall d’Hebron. Los adolescentes tenían entre 12 y 19 años en el momento del estudio, y un mínimo de un año fuera de tratamiento oncológico. Resultados: la CVRS obtenida presenta unas medias similares a las de la población normativa, tanto las respuestas de los supervivientes como la de los padres, sin embargo, hay porcentajes altos (más del 40%) de supervivientes que están por debajo de una desviación típica de la media en diferentes dimensiones. Los estilos de afrontamiento parece que juegan un papel importante en el resultado final de la CVRS, especialmente el de resolución del problema, utilizado por el adolescente. Según las regresiones lineales múltiples, el valor explicativo de los estilos de afrontamiento es mayor en la versión auto-reportada. Conclusiones: los estilos de afrontamiento parecen tener un papel importante en el resultado de la CVRS del adolescente superviviente de un tumor en el SNC, por lo cual es necesaria una aproximación multidisciplinar que contemple también estas variables psicológicas en el seguimiento del superviviente de tumores en el SNC en la infancia, para detectar e intervenir en aquellos casos que presentan pobre CVRS. / Survival in childhood cancer has dramatically improved for the last decades. As a consequence, interest in the Health-Related Quality of Life (HRQoL) of survivors has increased. The results on HRQoL are still inconclusive, sociodemographic and late effects variables in the survivorship explain slightly percentage in the final outcome of the CVRS. Objective: this theses aims to evaluate the HRQoL in CNS tumor survivors, reported by both survivors and parents. In addition, this research explores the role of psychological variables on the final HRQoL. These psychological variables are: coping styles of adolescent and their parents and parental distress. Method: 38 survivors of CNS tumor and 44 parents who were treated in the Hospital Universitari Vall d’Hebron were assessed. Adolescent ages were between 12 and 19 at the time of the study and they were a minimum of one year free of cancer treatment. Results; survivors and parents reported an average HRQoL similar to healthy population. Nevertheless, more than 40% of survivors reported one standard deviation below the average in several dimensions. Coping styles could play an important role in the outcome of the HRQoL in teenager tumor survivor specifically, productive coping style, which is used by the adolescent. According with the multiple linear regressions, the coping style explanatory value of the variance is higher in the auto-reported version. Conclusions: coping styles could have a significant role in the HRQoL of CNS tumor adolescent survivor. Therefore, follow-up with a multidisciplinary approach is essential to detect and intervene in cases with poorer HRQoL.

El cáncer es una de las principales causas de muerte en la población humana del mundo desarrollado. Los avances en las terapias convencionales, cirugía, quimioterapia, radioterapia, detección y diagnóstico del cáncer han permitido una mejora en los niveles de supervivencia y calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, restan multitud de tipos de enfermedades oncológicas donde poco o nada se puede hacer por combatirlas. La viroterapia con adenovirus emerge como una aproximación esperanzadora para el tratamiento del cáncer. Esta terapia permite minimizar la dosis inicial administrada gracias a la replicación viral en el tumor, amplificando exponencialmente los niveles de virus. Además, los avances en el conocimiento biológico del adenovirus y de las técnicas moleculares, permiten conferir selectividad y potencia oncolítica a los adenovirus. Por otra parte, el gran número de vías implicadas en la replicación viral impide la aparición de las clásicas resistencias a los agentes quimioterapéuticos. De todas formas, al alcanzar los ensayos preclínicos in vivo y sobretodo las fases clínicas en pacientes humanos, se hacen patentes nuevas limitaciones relacionadas con esta terapia. Una de estas limitaciones es la falta de potencia oncolítica. Esta falta se debe, en parte, al ciclo viral del adenovirus salvaje, el cual está optimizado para maximizar su producción, limitando la liberación viral al medio inicialmente y disminuyendo la respuesta inmune antiviral. En los tumores existe, sin embargo, un estado de inmunidad deprimida. Además, el aumento y aceleración de la liberación adenoviral se correlaciona con mayor actividad antitumoral. En el primer capítulo de este trabajo hemos combinado los adenovirus con virus adeno-asociados ya que previamente se ha descrito un aumento de la apoptosis y necrosis celular al darse coinfecciones de ambos virus. Esta combinación ha resultado en un aumento de la liberación adenoviral al medio, aumentando la propagación y la citotoxicidad in vitro de los adenovirus y la actividad antitumoral in vivo tras la administración intratumoral de ambos virus. Otra limitación de la viroterapia adenoviral es la falta de modelos adecuados que reflejen fielmente la realidad que los adenovirus oncolíticos se encuentran en pacientes humanos. Los modelos murinos son ampliamente utilizados para los ensayos de toxicidad y eficacia. Sin embargo, son poco o nada permisivos a la replicación viral, disponen de sistemas inmunes comprometidos para permitir la implantación artificial de tumores humanos, que evolucionaran de forma muy diferente a los tumores espontáneos de los pacientes. Esto provoca bajas correlaciones de los índices terapéuticos y, a veces, de los efectos adversos, entre modelos y pacientes. En el segundo capítulo de este trabajo hemos generado y caracterizado preclínicamente un adenovirus canino oncolítico, ICOCAV17, para su uso como agente terapéutico en la clínica veterinaria y como modelo para la viroterapia en clínica humana. Su replicación esta ligada a la vía del Retinoblastoma, incorpora el gen de la hialuronidasa para aumentar su diseminación intratumoral y hemos insertado el motivo RGD en su cápside para aumentar la infectividad de células tumorales. Además, cinco pacientes caninos con diferentes tipos de tumores han sido tratados intratumoralmente. Los resultados obtenidos indican que ICOCAV17 parece seguro administrado por vía intratumoral y su actividad antitumoral ha sido comprobada en tres pacientes observando necrosis y reducciones tumorales. / Cancer remains as a main cause of death in the developed world. The improvements made in conventional therapies as chemotherapy, surgery, radiotherapy, detection, and diagnosis of cancer have led to increased survival indexes and higher patient quality of live. However, some tumor types have not effective treatments yet. Virotherapy with adenoviruses is as a promising therapy for cancer treatment as it allows minimizing the initial administered dose due to the amplification of the virus within the tumor. This amplification increases the amount of virus present in the tumor. Moreover, the knowledge about adenoviruses and new molecular technics allows us to confer the virus tumor selectivity and oncolytic potency. Further, due to the multiple pathways that are involved in the virus cycle, the development of tolerance is quite difficult, as it happens for the well-known chemotherapeutic agents. Nevertheless, when viruses reach preclinical in vivo assays or clinical phases in human patients, new limitations related with this therapy appear. Low oncolytic potency is an example of these limitations. Life cycle of wild type adenovirus is one of the reasons of this low potency as it is optimized to maximize the total production what needs of low levels of released virus at early times decreasing the immune response against virus. However, immune response in tumor environment is inhibited. Moreover, enhanced adenovirus release correlates with increased antitumor activity. In the first part of this work we have combined adenovirus with adeno-asociated virus as enhanced apoptosis and cell death is described when combination of both viruses is performed. This combination resulted in enhanced adenovirus release, increasing adenovirus propagation and cytotoxicity in vitro, and antitumor activity in vivo when both virus were injected intratumoraly. Another problem of virotherapy with adenovirus is the lack of good predictive models. Murine models are widely used for toxicity and efficacy assays. However, these models are poor permissive to adenovirus replication, they have compromised immune system to allow artificial implanted human tumors to grow subcutaneously, and these tumors show different clinical evolution compared to spontaneous tumors within patients. All these factors led to poor correlated therapeutic indexes when adenoviruses reach clinical phases and less frequently to unexpected adverse events. In the second part of this work we have generated and characterized in preclinical assays a canine oncolytic adenovirus named ICOCAV17. This virus was conceived as a therapeutic veterinary agent and a model to human virotherapy. ICOCAV17 is a retinoblastoma pathway controlled virus, expressing a hialuronidase to enhance virus spread through the tumor, and has an RGD motif in the fiber to increase tumor cell infectivity. Moreover, five canine patients with different tumor types have been treated intratumoraly. Results suggest a good safety profile injecting the virus intratumoraly and efficacy has been observed in three patients.

La transmisión de patógenos zoonósicos desde la fauna salvaje al ganado doméstico, y vice-versa, es una problemática global ya que los ungulados salvajes aumentan en número y distribución en toda Europa, incluso en áreas urbanas. Al mismo tiempo, en la Unión Europea la frecuencia de ciertas zoonosis de transmisión alimentaria aumenta cada año. Además, la resistencia antimicrobiana es una amenaza mundial que urge ser monitorizada para evitar su diseminación. El propósito de esta Tesis es investigar si ciertos patógenos zoonósicos se comparten entre el ganado doméstico en extensivo y los ungulados salvajes (el jabalí – Sus scrofa - y la cabra montés – Capra pyrenaica) de un entorno natural del noreste español. Adicionalmente, hemos analizado la presencia de resistencia antimicrobiana tanto en patógenos como en bacterias comensales de estos hospedadores. Por último, se exploró lo mismo en jabalíes urbanos de Barcelona (España). La prevalencia de Salmonella fue mayor en jabalíes que co-habitaban con ganado vacuno (35.67%, CI 95% 28.19 - 43.70) que en aquellos que no (17.54 %, CI 95% 8.74 - 29.91), de manera similar, la riqueza de serotipos fue mayor en el primer grupo. Además, la probabilidad de que un jabalí sea portador de Salmonella aumenta cuanto mayor es el rebaño de vacas con el que comparte el hábitat. El hallazgo una cepa de S. Enteritidis resistente a ciprofloxacina y ácido nalidíxico en jabalí es una causa de preocupación para la salud pública. La diferente prevalencia de Salmonella en ganado vacuno (21.92%, 95% CI 13.10-33.14) y cabra montés (0.96%, 95% CI 0.2-2.8) y la ausencia de serotipos compartidos sugieren la ausencia de nexo (más información en el Estudio I y II). La prevalencia de E. coli O157:H7 fue baja: 3.41% en jabalí (IC 95% 0.94 - 8.52) y 1.88% en cabra montés (IC 95% 0.39 - 5.38), mientras que este patógeno no fue aislado del ganado doméstico (Estudio III). Respecto a Campylobacter, las muestras de cabra montés fueron negativas. C. jejuni se aisló de un jabalí (0.67%, IC 95% 0.02 – 3.66), sin embargo, C. jejuni fue la especie predominante en el ganado vacuno: 9.09% (IC 95% 3.02 – 19.95). C. lanienae fue la especie más frecuente en jabalí (12%, IC 95% 7.27 – 18.3) y se encontró simultáneamente en una vaca. Este estudio (IV) indica que, de nuevo, la cabra montés parece no desempeñar un papel importante en la epidemiología de Campylobacter. Además, aunque el jabalí y el ganado vacuno tienen su propia especie predominante de Campylobacter, existe una potencial transmisión de C. lanienae y C. jejuni entre ambos hospedadores. Tanto los animales salvajes como domésticos parecen poco importantes como reservorio de resistencia antimicrobiana (Estudio III). La frecuencia de resistencia en E. coli indicador fue reducida (0 a 7.9%). Sin embargo, se detectó resistencia a una cefalosporina de tercera generación en jabalí, y a fluoroquinolonas tanto en éste como en ganado vacuno. Esto sugiere el potencial del jabalí como centinela de resistencia antimicrobiana en una gran variedad de ambientes. En jabalíes urbanos, Salmonella se encontró en un 5% (IC 5% 0.61-16.91) y Campylobacter coli en un 4.88% (IC 95% 0.6-16.53). Otros Campylobacter termófilos fueron moderadamente prevalentes (19.51%, 95% CI 8.82-34.87), mientras que C. jejuni y E. coli O157:H7 no fueron aislados. La frecuencia de resistencia antimicrobiana fue mayor en Enterococcus faecium (95% de los aislados era resistente a uno o más agentes), seguido por Enterococcus faecalis (50%) y E. coli (10%). Además, describimos por primera vez resistencia a linezolid en un aislado procedente de fauna salvaje. Ya que estos resultados tienen implicaciones en la salud pública, es necesario llevar a cabo un seguimiento sanitario de la fauna en entornos urbanos.

El comportamiento delictivo genera una gran alarma social en la población general, los operadores sociales y las diferentes instituciones, y más aún cuando tal comportamiento es realizado por menores de edad. En correspondencia con esta preocupación social y científica por la delincuencia de los jóvenes, en este trabajo se ha analizado el fenómeno de la delincuencia juvenil en dos contextos italianos diferentes –uno rural y otro urbano– a través del método del autoinforme. El objetivo general del presente estudio es analizar los comportamientos antisociales y delictivos realizados por adolescentes, en una muestra de estudiantes italianos con edades comprendidas entre los 12 y los 18 años. Asimismo, se analizan los factores de riesgo que podrían estar asociados a las diferentes conductas referidas por los jóvenes. Como se ha comentado con anterioridad, la metodología empleada en esta investigación empírica es el autoinforme, ya que es la técnica que permite conocer de una manera más amplia y detallada la delincuencia de los jóvenes. Además, posibilita conocer también la cifra oscura de la delincuencia, las tipologías de las infracciones y delitos cometidos, y las características socio-demográficas de los individuos. La muestra de este estudio se compone de 490 sujetos que asisten a escuelas secundarias de primer y segundo grado, residentes en el territorio italiano. Concretamente se evaluaron el Instituto Secundario de primer grado de las ciudades de Oliena y Orgosolo, cuatro Institutos Secundarios de secundo grado de Nuoro, dos Institutos Secundarios de primer grado de la ciudad de Forlì, dos institutos secundarios de secundo grado de Forlì y un Instituto Secundario de segundo grado de Casalecchio di Reno. La elección de los dos contextos geográficos de ubicación (uno más rural, Cerdeña, y otro más urbano, Emilia Romagna) de los institutos y escuelas seleccionadas no fue casual, sino de conveniencia, ya que en ellos se habían realizado con anterioridad estudios sobre delincuencia juvenil. Por esta razón este estudio presenta sin duda una limitación metodológica relevante derivada del hecho de que nuestra muestra es parcial y no representativa del conjunto del territorio italiano. Los resultados pueden afirmar que la mayoría de los jóvenes evaluados en este estudio han llevado a cabo comportamientos antisociales de entidad leve, como consumir alcohol y descargar música ilegalmente, mientras que los comportamientos delictivos graves que se cometen con mayor frecuencia son participar en peleas, robar en un centro comercial, poseer un arma y realizar actos vandálicos. Así mismo, en esta investigación se han destacado una serie de factores de riesgo vinculados a las conductas delictivas realizadas por los chicos, y en particular los siguientes: ser varón, actuar impulsivamente, pertenecer a grupos delictivos, vivir en barrios problemáticos, y haber presenciado peleas-conflictos entre los padres. Otro resultado evidenciado en este estudio es que el territorio de pertenencia –zonas urbanas o rurales– no resulta una variable decisiva (con alguna pequeña excepción) a la hora de explicar la comisión de conductas delictivas por parte de los adolescentes. La constatación de estos factores de riesgo es relevante para la prevención de la delincuencia juvenil, sugiriéndonos que deberían llevarse a cabo las intervenciones sociales necesarias para paliar algunos de los factores de riesgo que aumentan la probabilidad de que un joven se vea envuelto en la comisión de un delito. En concreto, en este estudio se sugieren ciertas medidas orientadas a contrarrestar diversas necesidades criminógenas, o factores de riesgo dinámicos, como por ejemplo las siguientes: el que los jóvenes que lo necesiten reciban entrenamientos apropiados para el control de su impulsividad; que aquellos jóvenes que viven situaciones familiares difíciles cuenten con asistencia psicológica de apoyo para ellos mismos y sus padres; y, desde un enfoque más comunitario, la necesidad de intervenir adecuadamente sobre los barrios degradados. / Criminal behavior creates a great social alarm among the population and the different institutions, and especially when such behavior is performed by minors. Therefore, the overall objective of this study is to analyze the antisocial and criminal behavior by adolescents conducted in a sample of Italian students aged between 12 and 18 years. Also, the risk factors that might be associated with different behaviors reported by youth are analyzed. As discussed above, the methodology used in this research is the self report, as it is the technique to meet a broader and detailed youth crime. It also allows to know the dark figure of crime and socio-demographic characteristics of individuals. The study sample consists of 490 subjects attending secondary schools in first and second grade, living in Italy. The choice of the two geographical contexts location (one more rural, Sardinia and other more urban, Emilia Romagna) of the institutes and schools selected was not accidental, but of convenience, as they had done in earlier studies on crime youth, a fact that our sample is biased and not representative of the whole Italy. Results can say that most of the young evaluated in this study have been conducted SLIGHT antisocial behavior such as drinking and download music illegally, while serious criminal behavior committed most frequently are involved in fights, steal in a shopping center, possessing a weapon and vandalize. Also, in this research we have highlighted a number of risk factors linked to criminal behaviors of the boys, and in particular the following: being male, acting impulsively, belonging to criminal groups, live in problematic neighborhoods, and have witnessed fights-parental conflict. Another finding evidenced in this study is that the territory of rural-urban-zones or membership is not a decisive variable (with some minor exceptions) to explain the commission of criminal behavior by adolescents.

Els virus de la influença tipus A (VIA) són patògens zoonòtics que poden infectar un ampli nombre d’hostes incloent-hi les aus, els porcs i els homes, entre altres. Anualment es documenten milions d’infeccions en humans causades per virus de la influença estacionals. Les pandemies causades pel virus influença també tenen una elevada repercussió pel que fa a la sanitat i l’economia. Tot i que determinats subtipus de VIA s’adapten millor en espècies d’aus que en humans, hi ha hagut casos d’infeccions en humans per virus de la influença de tipus aviars. La susceptibilitat dels porcs per infectar-se amb virus de la influença tant d’origen aviar com humà és també important pel que fa a la salut pública. El genoma del virus influença és segmentat in consta de vuit molècules de ARN de cadena senzilla i sentit negatiu que codifiquen per 11 o 12 proteïnes. Per tant, si una cèl·lula s’infecta simultàniament per dos VIA diferents, pot succeir un reagrupament amb la conseqüent generació d’una nova soca de virus. A més, mutacions a les glicoproteïnes de superfícies (sobretot a l’hemaglutinina, HA) són les responsables de l’elevada variabilitat de VIA. Tot i que les vacunes front a les epidèmies estacionals són eficaces, no produeixen resposta immunològica front una amplia varietat de VIA. És a dir, les vacunes estacionals només protegeixen front a les soques virals circulants durant una determinada estació. Aquest fet, junt amb el risc de possibles pandèmies, han fet encara més important i urgent el desenvolupament d’una vacuna universal capaç de produir immunitat front a múltiples subtipus virals. En la present tesis s’ha estudiat la resposta immunitària front a la infecció i vacunació del VIA en el context de VIA d’alta patogenicitat (vIAAP) A/H5N1 i A/H7N1 i el virus pandèmic A/H1N1 (pH1N1). El treball s’ha dividit en tres parts i cada part s’ha subdividit en capítols. Part I (capítols 1 i 2), conté la introducció general i els objectius de la tesi doctoral. L’objectiu d’aquesta primera part és donar una visió global i introduir informació per entendre (i) la infecció pel virus de la influença, (ii) la resposta immunològica provocada després de la infecció per VIA i (iii) un breu resum de les vacunes actuals front a influença. A continuació, s’exposen els objectius a aconseguir. Part II, és el cos de la tesis i conté els quatre treballs (del capítol 3 al 6) duts a terme durant els quatre anys que ha durat el programa de doctorat. Tots els capítols presentats han estat publicats o sotmesos a publicació en revistes indexades internacionals. Per tant, cada estudi manté l’estructura estàndard de: resum, introducció específica, materials i mètodes, resultats i breu discussió. Estudiar el paper dels determinants virals i caracteritzar la infecció pel VIA en diversos hostes pot ser de gran interès a l’hora de dissenyar vacunes òptimes. S’ha descrit la proteïna NS1 com a un dels principals determinants de virulència en mamífers, però no s’ha estudiat gaire el paper d’aquesta en aus. En el capítol 3 es va avaluar la implicació de la proteïna NS1 en la patogenicitat viral en pollets. Es van infectar pollets amb vIAAP H7N1 que contenien el segment NS de vIAAP H5N1. Les manifestacions patològiques i la resposta immunològica conseqüència de la infecció amb cada un dels virus van ser avaluades. També és molt important el paper de la immunitat prèvia durant un brot perquè pot ser determinant de la mort o supervivència de l’animal. En el capítol 4 es van exposar pollets a un virus H7N2 de baixa patogenicitat (vIABP) i a continuació es van infectar amb un vIAAP H7N1. Posteriorment es van infectar amb un vIAAP H5N1. Els animals que havien estat infectats prèviament amb vIABP quedaven protegits a la posterior infecció letal amb el vIAAP H7N1. No obstant, la resposta immunitària produïda no era suficient per a protegir els pollets front a la infecció amb un virus heterosubtípic (vIAAP H5N1). La presència o absència d’anticossos inhibitoris front a H7- i H5- correlacionaven amb la presència o absència de protecció, respectivament. Conèixer els programes de vacunació actuals i la seva eficàcia és útil per a planificar i dissenyar futures estratègies de vacunació. Les aus aquàtiques són el reservori dels VIA; per tant, són extremadament importants pel que fa a l’ecologia del virus. Aprofitant els programes de vacunació es va testar el sèrum de diverses espècies d’aus de zoològics i centres de recuperació d’Espanya (capítol 5). Els sèrums es van utilitzar per a l’avaluació de la resposta humoral deguda a la vacuna. El principal objectiu del treball era determinar l’eficàcia de vacunes disponibles (inactivades en suspensió oliosa) en diverses espècies d’aus i comparar la variabilitat inter- i intra-espècie. Finalment, i tenint en compte el potencial risc del VIA, els esforços es van focalitzar en desenvolupar una vacuna capaç de protegir a un ampli nombre de subtipus de VIA. La pandèmia de 2009 amb el virus H1N1 (pH1N1) és un clar exemple que els porcs poden actuar com a “coctelera” i generar nous virus. En el capítol 6 es van immunitzar porcs amb pèptids derivats de l’HA i a continuació es van infectar amb el virus pH1N1. Tot i que els pèptids-HA produïen una molt bona resposta humoral i cel·lular, no es va detectar activitat neutralitzant i només es va obtenir un efecte parcial en l’eliminació del virus. Part III (Capítols 7 i 8), és la secció on es discuteixen les implicacions dels resultats obtinguts en els diferents estudis i on s’enumeren les conclusions principals. En una secció a part, s’han inclòs totes les referències bibliogràfiques utilitzades per a l’elaboració de la tesi. S’ha inclòs també un apèndix per afegir informació addicional. / Influenza A viruses (IAV) are zoonotic pathogens that can replicate in a wide range of hosts, including birds, pigs and humans, among others. Millions of human infections caused by seasonal influenza virus are reported annually. Influenza pandemics have also a significant health and economic repercussions. Although certain subtypes of IAV are better selected in avian species than in humans, there are reports that evidence cases of human infections with avian influenza viruses (AIV). The susceptibility of pigs to infection with influenza viruses of both avian and human origins is also important for public health. The genome of influenza virus is segmented and consists of eight single-stranded negative-sense ribonucleic acid (RNA) molecules encoding 11 or 12 proteins. Thus, if a single cell is simultaneously infected by two distinct influenza viruses, a reassortment can occur resulting in the generation of a novel virus strain. Moreover, mutations in the surface glycoproteins (mainly in the hemagglutinin, HA) are the responsible of the high variability of IAV. Influenza vaccines against seasonal epidemics, although have good efficacy do not elicit immune response against a wide variety of IAV. Thus, seasonal vaccines only confer protection against the circulating viral strains. This, together with the risk of potential pandemics, has highlighted the importance of developing a universal vaccine able to elicit heterosubtypic immunity against multiple viral subtypes. In this thesis the immune response to IAV infection and vaccination was evaluated in the light of the risk of highly pathogenic AIV (HPAIV) A/H5N1 and A/H7N1, and the pandemic IAV A/H1N1. The work is divided into three parts and each one is further divided into chapters. Part I (chapters 1 and 2) contains the general introduction and the objectives of the thesis. The aim of this first part is to give a global overview and to introduce information to understand (i) the influenza infection, (ii) the immune responses elicited after IAV infection and (iii) a brief summary of current vaccines against influenza. Afterwards, the initial objectives to be achieved are exposed. Part II is the body of the thesis and it contains four studies (from chapter 3 to 6) developed during the four-year period comprising the PhD program. All the chapters are published or submitted to publish in international peer-reviewed journals. Thus, each study contains an abstract, a specific introduction, the materials and methods section, the obtained results and a discussion. To study the role of IAV determinants and to characterize the influenza infection in different hosts could be of great importance to direct the efforts to the formulation of more efficient vaccines. The non structural 1 (NS1) protein is known to be a major determinant of virulence in mammals but little is known about its role in avian species. In chapter 3, the involvement of NS1 in viral pathogenicity was evaluated in chickens. Birds were challenged with two reassortant AIV carrying the NS-segment of H5N1 HPAIV in the genetic background of an H7N1 HPAIV. The pathological manifestations, together with the immunological outcome were evaluated. The role of pre-existing immunity during an outbreak is also important and can determine whether the animals succumbed to infection or not. In chapter 4, chickens pre-exposed to H7N2 low pathogenic AIV (LPAIV) were challenged with H7N1 HPAIV and subsequently infected with H5N1 HPAIV. Pre-exposed animals were protected against the lethal H7N1-challenge whereas naïve animals succumbed. However, pre-existing immunity did not provide protection against HA-heterosubtypic virus (H5N1 HPAIV). The presence or absence of H7- and H5-inhibitory antibodies correlate with the protection (or lack of it) afforded. The control of current vaccination programs and their efficacy is useful to plan and design better vaccines. It is well known that wildfowl are the reservoirs of IAV; thus they are extremely important concerning the ecology of the virus. Sera from several avian species from Spanish zoos and wildlife centers were collected during two successive vaccination programs and were tested to evaluate the vaccine-elicited humoral response (chapter 5). The main objective of this work was to determine the efficacy of current vaccines (inactivated water-in-oil) in several avian species and to compare the differences inter- and intra-specie. Finally, and taking into account the potential risk that IAV represent to our society, the efforts were focused on developing a broadly protective influenza vaccine. The 2009 human H1N1 pandemic (pH1N1) is a clear example that pigs can act as a vehicle for mixing and generating new assortments of viruses. In chapter 6 pigs were immunized with HA-derived peptides and subsequently infected with pH1N1 virus. Although the HA-peptides induced broad humoral and cellular responses no neutralization activity was detected and only a partial effect on virus clearance was observed. Part III (chapters 7 and 8) is where the implications of all the findings from the studies are discussed and the major conclusions are listed. A list of all the references used to develop the thesis is listed after the three parts, in an independent section. An appendix section is also included to give further information.

Aquesta tesi és el compendi de 14 treballs originals realitzats per l'autor dintre de l'àmbit dels factors genètics i ambientals que condicionen el rendiment físic. Entenem que el rendiment físic està influenciat per molts factors, que van des de l'aport energètic fins l'estat d'ànim, passant per factors genètics cada vegada més coneguts. Mitjançant estudis d'epidemiologia genètica, on s'estudia la importància dels gens en la contribució de determinats fenotips mitjançant estudis amb germans bessons, monozigots i dizigots , es va poder veure que diferents índexs d'heredabilitat (IH) permeten estimar la importància relativa de la influència genètica per cada fenotip determinat, és a dir ens dóna una idea de la proporció de la variació atribuïble a la genètica. També vam identificar un marcador genètic per l'associació entre els al·lels A2,A11 situat a la regió p21.3 del Cromosoma 6 humà i el rendiment físic, i més concretament amb la potència aeròbica màxima. Seguint amb aquesta línia dels estudis genètics, també s'han trobat diferencies tant interracials com intraracials . En els estudis interracials es van observar respostes fisiològiques diferents condicionades genèticament i marcadors d'elles i també diferències fisiològiques entre races diferents. En aquest cas es va estudiar el metabolisme aeròbic i la tolerància a càrregues físiques altes en un grup d'homes de l'ètnia xerpa que no seguien cap entrenament especial, però que tenien globalment el més gran historial alpinístic conegut. Es va estudiar els efectes de l'exercici de predomini aeròbic sobre la contractibilitat miocàrdica i l'aparició de signes de fatiga. Hi havia una diferència significativa entre el ritme cardíac bassal i la mitja del ritme cardíac postexercici. El temps sistòlic era significativament major després de la cursa (p<0,005). No hi havia una diferència entre la fracció d'expulsió en descans i postexercici. L'etiologia d'aquest fenomen és desconeguda.Tres treballs valoren els canvis produïts per l'entrenament intervàlic. L'objectiu d'aquests estudis van consistir en avaluar els canvis en el metabolisme aeròbic i anaeròbic produïts per dos programes d'entrenament curt i llarg., per tal de valorar com el factor repòs, o descans inter-sessió pot dur a canvis importants en l'adaptació i posterior sobrecompensació als estímuls. Des de sempre, el desenvolupament de programes d'entrenament sempre han estat associats a entrenament físic, però és clar que cal tenir en compte també els entrenaments psicològic per a potenciar el rendiment en esportistes d'alt nivell. Es va proposar el desenvolupament d'una sèrie d'estratègies adreçades a comprovar l'eficàcia de diferents tècniques d'entrenament psicològic en la millora del rendiment esportiu. Un altre factor determinat del rendiment físic es l'aport energètic per l'alimentació. Es va comparar la repercussió sobre el rendiment físic després de beure tres begudes amb diferent composició: una amb glucosa, una amb fructosa i l'altre amb placebo. La ingesta de la beguda amb glucosa va ser la que va presentar millores més significatives.Es va estudiar el metabolisme bassal (RBM) ja que per la laboriositat de la seva determinació sovint s'utilitzen els valors teòrics. Es va comparar el RMB entre atletes campions d'Espanya i de Brasil. Els de Brasil que habiten en una zona tropical presenten un menor RMB (p<0,05) que els campions espanyols que viuen en una temperatura no tropical.Per últim, mitjançant un estudi comparatiu de mostres de sang extretes de dos llocs: el lòbul de l'orella i la punta del dit i es va apreciar que no eren idèntiques. Queda prou clar que tan sols es poden comparar proves (valorades mitjançant el lactat) en les que les mostres hagin estat obtingudes del mateix lloc.Com a conclusió final podem dir que és evident la complexitat del rendiment físic així com la importància relativa dels factors genètics.

Des de l'any 1989 en que es va realitzar el primer trasplantament de cèl·lules hematopoiètiques procedents de la sang de cordó umbilical (SCU) a un pacient amb anèmia de Falconi, ha anat creixent l'interès per les característiques immunològiques de la sang de cordó umbilical. Un dels principals avantatges que presenta la SCU és la baixa incidència en la malaltia de l'injert contra l'hoste (GVHD) que es desencadena després del trasplantament entre pacients no emparentats. Fins el moment tots els treballs han demostrat que els limfòcits T de SCU presenten un fenotip CD45RA+ que indicaria en un principi la manca d'exposició prèvia a antígens i aquesta característica ha comportat que es considerés als limfòcits naive de SCU com immunològicament immadurs i amb una resposta peculiar enfront a diversos estímuls. L'ús de diferents condicions experimentals i sistemes d'activació han donat lloc a resultats no comparables i a vegades fins i tot contradictoris. Per una banda, l'ús de tècniques de separació que comportin la pèrdua sel·lectiva de poblacions cel·lulars o produeixin pertorbacions funcionals, i per l'altra la utilització de diversos agents per activar les cèl·lules que intervenen a diferents nivells de la cascada de senyalització, han donat lloc a resultats difícils d'interpretar. L'objectiu general d'aquest treball ha estat de caracteritzar la població majoritària CD4+CD45RA+ de SCU utilitzant un anticòs monoclonal anti-CD3 humà (OKT3), que permet una activació de tots els limfòcits independentment de la seva especificitat.Per abordar aquest objectiu, es va obtenir la població majoritària CD4+CD45RA+ de la sang de cordó umbilical i de sang perifèrica d'adult, utilitzant una selecció negativa, que consistia en l'obtenció dels limfòcits CD3+ a partir de les cèl·lules mononuclears obtingudes per gradient de Ficoll, i una segona selecció negativa a partir dels limfòcits CD3+ per poder obtenir la població CD4+CD45RA+ purificada. El grau de purificació es va determinar per citometria de flux.L'estudi fenotípic i funcional dels limfòcits CD4+CD45RA+ de sang de cordó umbilical va demostrar que aquesta població limfocitària presentava característiques que la diferenciava de la població CD4+CD45RA+ de la sang perifèrica d'adult. Així s'observà, que els limfòcits naive de SCU presentaven una major tendència a entrar en apoptosi espontània comparat amb la SPA, i que aquesta mort podia ser en part revertida per la presència d'interleuquina 2 (IL2). Una activació via TCR/CD3 amb una sola senyal anti-CD3 portà als limfòcits naive de SCU a activar-se, dividir-se i finalment a morir per apoptosi. Aquesta activació anava acompanyada d'una fosforilació diferencial en Tyr de proteïnes implicades en els primers processos de la cascada de senyalització via TCR, transformació blàstica, expressió de marcadors d'activació en superfície i divisió cel·lular. La coestimulació via CD28 feia que els dos tipus cel·lulars assolissin uns graus d'activació similars, excepte en l'coexpressió de CD45RO que només s'observava amb la SCU.No sabem si la resposta de les cèl·lules naive observada in vitro pot ser sobrepassada in vivo per altres factors i tampoc coneixem el paper de les cèl·lules de SCU en l'expansió perifèrica després del trasplantament. Després del trasplantament amb cèl·lules de SCU, la primera onada de reconstitució de cèl·lules T s'origina per les cèl·lules T donants madures presents en l'injert. L'estimulació de les cèl·lules de SCU a través del receptor per l'antigen sense coestimulació podria induir un estímul toleritzant mitjançant l'activació subòptima i la posterior eliminació d'una gran part de les cèl·lules activades. En aquest cas, l'apoptosi és possiblement sel·lectiva per cèl·lules reactives donants, fenomen que es contempla com la base de la tolerància en el trasplantament i que podria explicar l'aparent reducció del GVHD en els individus trasplantats amb SCU.

Environmental stress is increasingly wearing down crop productivity. Nowadays, one of the main aims of plant research is to elucidate tolerance mechanisms to diverse stresses, in order to provide solutions by generating stress-tolerant plants. In regard with this matter, polyamine signaling pathway is of crucial importance. The major polyamines in plants (putrescine, spermidine and spermine) tend to accumulate in response to stress and are associated with a protective role. The trend of their accumulation is related to the stress the plant is sensing; in fact, polyamine biosynthetic pathway is activated at different levels depending on the stimulus, which gives a selective role to these molecules. Spermine, one of the higher polyamines, is not essential for plant growth; however, it is presently known that this molecule plays diverse protective roles under several stress factors and triggers signaling cascades implicated in plant defense. Therefore, research on spermine down-stream targets has become necessary towards the elucidation of plant tolerance responses. By the use of model plant Arabidopsis thaliana this study demonstrated the implication of this polycation on enhancement of anti-oxidative capacity by signaling connections to central hub metabolites for sugar, lipid and amino acid metabolism such as pyruvate or myo-Inositol, as well as its involvement on root morphology. / El estrés medioambiental está afectando de forma paulatina la productividad de los cultivos. En la búsqueda de soluciones, uno de los principales objetivos de la investigación en fisiología de plantas, es dilucidar los mecanismos de tolerancia que se presentan ante diversos estreses, con la finalidad de generar plantas con fenotipos resistentes. En referencia a este asunto, las poliaminas y sus rutas señalizadoras son de importancia crucial. Las más abundantes en plantas (putrescina, espermidina y espermina) tienden a acumularse en respuesta al estrés por lo cual se les asocia a un rol protector, sin embargo, las tendencias de acumulación dependen del tipo de estrés que la planta es capaz de percibir. De hecho, su ruta biosintética se activa a diferentes niveles dependiendo del estímulo, lo cual les confiere un carácter selectivo. La Espermina (una de las poliaminas superiores) no es esencial para el crecimiento de la planta, no obstante, actualmente se sabe que esta molécula ejerce diversos roles protectores en una gran variedad de condiciones y además activa cascadas señalizadoras implicadas en la respuesta defensiva de la planta. En consecuencia, para dilucidar los mecanismos de tolerancia, se ha hecho necesario profundizar en las dianas de señalización por parte de la espermina. Empleando como modelo experimental Arabidopsis thaliana, el presente estudio ha demostrado la implicación de este policatión en el aumento de la capacidad anti-oxidativa a través de conexiones con metabolitos centrales en el metabolismo de azucares, lípidos y aminoácidos como es el caso del piruvato y el mio-Inositol, así como también, la implicación de esta poliamina en la morfología y ramificación de las raíces, reforzando la noción de implicación esencial por parte de esta poliamina, en la fisiología del estrés en plantas.

The number of zoonotic Bartonella species identified in the last 15 years has increased considerably, since the first HIV- infected patient with unusual vascular proliferative lesions of bacillary angiomatosis (BA) was described in 1983. Of the 21 species of Bartonella described until now, only 10 were acknowledged as human pathogen species. B. bacilliformis, B. quintana, and B. henselae are the most frequently described species, while B. elizabethae, B. vinsonii, B. washoensis, B. grahamii, B. clarridgeiae, B. koehlerae and B. alsatica were recently identified as responsible for a few cases of human infections. Cat scratch disease (CSD), bacillar angiomatosis, hepatic peliosis and some cases of bacteraemia, endocarditis, osteomyelitis, uveitis and neurologic disorders are directly caused by some species of the genus Bartonella. We realize three studies, the objective of cats study, the first aimed to evaluate the prevalence of Bartonella infections in Spain, was to know the seroprevalence against B. henselae in cats, the level of bacteremia and to assess the factors that could modify both prevalences. Since cats are the main reservoir of Bartonella, we have studied the infection by B. henselae in a sample of cats in our geographical area. We conducted microbiologic cultures and serology to a total of 115 cats, 33.05% of which were younger than one year. Of the 100 cultures performed (15 animals were rejected due to massive contamination), we isolated Bartonella in 7, with a prevalence of bacteriemic cats below one year of 12.12%. Isolated strains were identified as B. henselae by PCR, using the 16S-23S rRNA intergene region primers. Thirty-four cats (29.56%) showed antibodies against B. henselae with titers above 1/64. Of all the factors related to the bacteraemia rate studied (age, sex, habitat, contact with animals, parasites, and presence of antibodies against Bartonella) only the presence of antibodies against Bartonella henselae was statistically significant. To determine the real incidence of Bartonella infections, we must study the seroprevalence in the general population as well as the principal reservoirs and vectors of infection transmission. Serum samples from 218 patients were examined by indirect immunofluorescence assay (IFA). Significance levels for univariate statistical test were determined by the Mann-Whitney U test and χ2 test. Of 218 patients, 99 were women and 119 men, with a median age of 34.36 years (range 0--91 years). Nineteen (8.7%) reacted with B. henselae antigens. Of all the factors concerning the seroprevalence rate being studied (age, sex, contact with animals, residential area), only age was statistically significant. Our serological data seems to indicate that Bartonella henselae is present in our area and could be transmitted to humans. – And in the last study, serum samples were collected from HIV patients treated at Hospital de Sabadell. Antibodies to B. henselae and B. quintana from 340 patients were examined by indirect immunofluorescence assay (IFA). Significance levels for univariate statistical test were determined by the Mann-Whitney U test and χ2 test. – Of 340 patients, 82 were women and 258 men, with a median age of 42.21 ± 10.35 years (range 16 -86 years). Seventy-six (22.3%) patients reacted with one or more Bartonella antigens. Of all the factors concerning the seroprevalence rate being studied (age, sex, intravenous drugs use, alcohol consumption, CD4 levels, AIDS, HCV, HBV, residential area), only age was statistically significant. A high percentage of HIV patients presents antibodies to Bartonella and is increasing with age.