Neste trabalho foi investigado o potencial de modelos metaloporfirínicos em mimetizar a ação do citocromo P450 na oxidação de um herbicida, a atrazina. Foram utilizadas as metaloporfirinas comerciais de segunda geração solúveis em solvente orgânico, cloreto de 5,10,15,20-tetrakis(2,6-diclorofenil)porfirina metal(III) [M(TDCPP)Cl] e cloreto de 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorofenil) porfirina metal(III) [M(TFPP)Cl] (metal = ferro e manganês), tanto em solução homogênea como suportadas em montmorilonita K-10 aminofuncionalizadas; e metaloporfirinas solúveis em água, como a cloreto de 5,10,15,20-tetrakis-(N-metil-4-piridil) porfirina ferro(III), [Fe(TMPy)Cl], e cloreto de [5,10,15,20-tetra(4-carboxifenil)porfirina] ferro(III), [Fe(TCPP)Cl]. Os oxidantes testados foram iodosilbenzeno, ácido metacloroperbenzóico e peróxido de hidrogênio em água, metanol e acetonitrila. Os produtos de oxidação da atrazina foram identificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os resultados mostraram que as metaloporfirinas foram capazes de oxidar a atrazina, um herbicida com características de persistência no meio ambiente, e mimetizar a ação da enzima in vivo e in vitro com formação de dois metabólitos: DEA e DIA, resultado da N-desalquilação das cadeias etila e propila do substrato, respectivamente. O DEA correspondeu a um dos principais produtos da reação, e formou-se apenas traços de DIA, mostrando a preferência das metaloporfirinas em oxidar a cadeia etila da atrazina. Verificou-se também a formação de cinco produtos desconhecidos, sendo possível a identificação de apenas um deles por espectrometria de massas, devido à baixa concentração dos demais, o qual corresponde à formação de uma amida na cadeia etila da atrazina (COA). Esse composto correspondeu ao produto de maior rendimento na maioria das reações. O monitoramento das reações em diferentes intervalos de tempo e a variação nas condições reacionais mostraram que os principais produtos de oxidação do herbicida, DEA e COA, são formados por mecanismos independentes e por espécies catalíticas distintas. O DEA é formado via espécie ativa Me(V)OP [Mn(V)OP ou Fe(IV)OP+], enquanto o COA é originado via Me(IV)OP [Mn(IV)OP ou Fe(IV)OP]. Estudos de intermediários por UV-Vis e EPR mostraram que a espécie ferril predomina como intermediário de reação para os sistemas Fe(TFPP)Cl/ACN com os dois oxidantes, iodosilbenzeno e ácido metacloroperbenzóico. Para as metaloporfirinas Fe(TCPP)Cl e Fe(TMPy)Cl o estudo da oxidação do herbicida ficou comprometido devido à baixa solubilidade da atrazina em água, o que provocava sua precipitação e destruição do catalisador. Para as metaloporfirinas suportadas em montmorilonita K-10 aminofuncionalizada também não foi observada formação de produtos, resultado atribuído à dificuldade do substrato, considerado bastante inerte, atingir o sítio catalítico. Todos esses resultados mostraram o potencial de aplicação desses modelos biomiméticos em estudos que buscam elucidar o metabolismo de herbicidas in vivo, tendo em vista a dificuldade de se trabalhar com as enzimas in vitro, e resultaram na proposição de um esquema de reação da oxidação da atrazina catalisada pelas metaloporfirinas nas condições estudadas. / In this work we investigated the ability of metalloporphyrin model systems to mimic the action of cytochrome P450 in the oxidation of a herbicide, atrazine. To this end, we employed the second generation commercially available metalloporphyrins metal (III) 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrin chloride [M(TDCPP)Cl] and metal (III) 5,10,15,20- tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin chloride [M(TFPP)Cl] (metal = iron or manganese), all soluble in organic solvents, as well as the water soluble metalloporphyrins iron (III) 5,10,15,20-tetrakis(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin chloride [Fe(TMPy)Cl] and iron (III) 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin chloride [Fe(TCPP)Cl]. These metalloporphyrins were used both in homogeneous solution and supported on montmorillonite K-10. Iodosylbenzene, metachloroperbenzoic acid, and hydrogen peroxide were tested as oxidants, using one of the following reaction media: water, methanol, and acetonitrile. Products generated during atrazine oxidation were identified by high performance liquid chromatography. Our results show that the metalloporphyrins are able to oxidize atrazine, a highly persistent herbicide in the environment, as well as mimic the action of P450 enzymes both in vivo and in vitro, with formation of two metabolites, namely DEA and DIA, which result from the N-dealkylation of the ethyl and propyl chains of the substrate, respectively. We also detected the formation of five unknown products, and we were able to identify only one of them by means of mass spectrometry, which corresponds to the formation of an amide on the atrazine ethyl chain (COA) and was the compound obtained in highest yields in most of the reactions. The other four unknown products were obtained in very low concentrations, which prevented us from determining their structures. By monitoring the reactions at different time intervals and varying the reactional conditions, we were able to see that the main herbicide oxidation products, DEA and COA, are generated via distinct mechanisms and different active catalytic species. DEA is formed via the species Me(V)OP [Mn(V)OP or Fe(IV)OP.+], while COA results from the action of the species Me(IV)OP [Mn(IV)OP or Fe(IV)OP]. Studies of the reaction intermediates by UV-VIS and EPR showed that the ferryl species is the main reaction intermediate in the case of Fe(TFPP)Cl/ACN systems and the oxidants, iodosylbenzene and metachloroperbenzoic acid. Studies of herbicide oxidation were difficult to carry out in the case of the metalloporphyrins Fe(TCPP)Cl and Fe(TMPy)Cl due to the low solubility of atrazine in water, which led to its precipitation and catalyst destruction. With respect to the metalloporphyrins supported on montmorillonite K-10, no reaction products were obseved because of the difficult diffusion of the inert substrate into the catalytic site. All these results demonstrate the potential application of these biomimetic model systems in studies that pursue the elucidation of herbicide metabolism in vivo, especially when one bears in mind the difficulty in working with enzymes in vitro. Our data enabled the proposition of a scheme for metalloporphyrin-catalyzed atrazine oxidation under the conditions used herein.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8_1.pdf: 1293352 bytes, checksum: 746673d69958e017a467483837256871 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A caça predatória ilegal é o segundo maior fator de impacto em populações de animais silvestres no Brasil, ficando atrás apenas da perda de habitat por desmatamento. Apesar de ser proibida no Brasil (Leis n° 5.197/1967 e n° 9.605/1998), o poder público ainda não dispõe de recursos eficientes e cientificamente testados que possam ser utilizados em análises forenses visando comprovar o ato da caça, seja ela desportiva ou com finalidade comercial. A análise baseada no DNA tem sido utilizada em várias situações, com a finalidade de detectar fraudes comerciais e outras ilegalidades. Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi à identificação e a utilização de perfis de PCR/RFLP espécieespecíficos para diagnóstico forense de 15 espécies da fauna brasileira e sua diferenciação de quatro espécies domésticas (bovino, suíno, caprino, ovino), totalizando 19 espécies. Para tanto foram realizadas análises de seqüências de nucleotídeos com os programas Sequencher 4.9, BioEdit 6.0.7, CLEAVER, pDRAW e Gene Runner 3.0.5, tendo sido identificados vários SNPs associados à criação de sítios de enzimas de restrição discriminantes. Com apenas 9 enzimas foram obtidos os perfis de PCR/RFLP discriminantes para as 19 espécies. A validação do protocolo in vitro foi realizada com amostras biológicas de 6 espécies silvestres (Agouti paca, Cebus apella, Dasyprocta leporina, Dasypus novemcinctus, Euphractus sexcinctus, Tayassu tajacu) juntamente com 4 espécies domésticas (Bos taurus, Capra hircus, Ovis aries and Sus scrofa), e os perfis detectados na analise in silico foram confirmados em gel de agarose 2%. O presente estudo reforçou o potencial de polimorfismos do gene Citocromo b como poderosos marcadores para identificação de espécies. Os dados produzidos aqui podem ser úteis como ferramentas em conservação no combate a caça predatória e monitoramento do comércio ilegal de carne de caça e de seus produtos

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_martins_ioc_mest_2008.pdf: 2240776 bytes, checksum: 22f0d88555ae7a38778dfd03f1dd7c9c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os citocromos P450 (CYP) desempenham importantes papéis na biotransformação de xenobióticos e no metabolismo de substâncias endógenas. A subfamília CYP1A foi bem conservada ao longo da evolução dos vertebrados, tendo sido encontrada em todas as espécies de peixes mandibulados estudadas até o momento. Em trabalho anterior, verificamos que algumas espécies de cascudos da família Locariidae não apresentavam atividade da etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em microssomos hepáticos. Como EROD é atividade catalisada predominantemente por CYP1A em diversos vertebrados, esse achado nos motivou a investigar em detalhe os CYP, em especial da subfamília 1A, em cascudos. Este trabalho é um estudo comparativo da capacidade de cascudos (Hyposthomus luetkeni e H. affinis), tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus; Cichlidae) e camundongos, controles e tratados com indutores conhecidos de CYP1A [50 mg/kg ip; B-naftoflavona (BNF), ou 7-12 dimetil-benzoantraceno (DMBA)] de: i - catalisar diversas reações químicas sabidamente mediadas por CYP, ii - expressar a proteína CYP1A no tecido hepático, e iii - ativar o pró-mutágeno DMBA. Nos microssomos hepáticos das tilápias e dos camundongos, detectamos atividades constitutivas de EROD e também de desalquilação de outros ésteres da resorufina (MROD, PROD e BROD). Nessas duas espécies, as atividades dessas monooxigenases foram induzidas pelos tratamentos com BNF e DMBA. Nos cascudos, controles e tratados com os indutores de CYP1A, as atividades das alcoxi-resorufina-O-desalquilases não foram detectadas. A atividade da etoxicumarina desetilase (ECOD) foi cerca de cinco vezes maior no fígado de cascudos e de camundongos do que no das tilápias. O CYP1A não parece ter papel importante na catálise de ECOD nessas duas espécies de peixes Os resultados também mostraram que dois anticorpos anti-CYP1A de peixe reconheceram proteínas com massa moleclar compatível com o de CYPs nos microssomos hepáticos de tilápias e camundongos tratados com indutores de CYP1A. Nos cascudos, entretanto, a detecção de CYP1A por immunoblotting com esses anticorpos não foi consistente. Com o emprego de espectrometria de massas, identificamos o CYP1A em microssomos hepáticos de tilápias induzidas, mas não nos cascudos controles ou induzidos. Em conjunto, os resultados sugerem que, em contraste com o observado com tilápias e camundongos, os cascudos não exibem atividade catalítica de CYP1A e não expressam as proteínas correspondentes no fígado, ou as expressam apenas em níveis constitutivos extremamente baixos. Apesar de não apresentarem atividade catalítica de CYP1A, os cascudos foram capazes de ativar o pró-mutágeno DMBA que, em outras espécies, é ativado por enzimas da família CYP1, em especial das subfamílias 1A e 1B / The cytochrome P450 (CYP) superfamily plays im portant roles in the biotransformation of xenobiotic and endogenous compounds. The CYP1A subfamily is well conserved in vertebrates and has been found in all jawed fish studied to date. In a previous study, we had found that suckermouth armored catfishes of the Loricariidae family ( Hyposthomus luetkeni and H.affinis ) did not show ethoxy-resorufin- O -deethylase (EROD) activity in liver microsomes. Since EROD is a marker of CYP1 A catalytic activity in vertebrates, this unexpected finding prompted us to investigate in depth the CYP system of loricariid catfishes, particularly the CYP1A subfamily. In this study, we compared the capacities of suckermouth armored catfishes (Loricariidae), Nile tilapias ( Oreochromis niloticus , Cichlidae) and mice (Swiss Webster), control and treated with CYP1A-inducing agents (50 mg/kg ip ß- naphthoflavone, BNF, and 7-12 dimethyl-benzoanthracene, DMBA) to: i - catalyze several activities that are known to be catalyzed by CYPs, ii - express CYP1A protein in liver tissue and iii – activate the pro-mutagen DMBA. In liver microsomes of tilapias and mice, constitutive activities of EROD, and of other alkoxy-resorufin- O -dealkylases (XROD: MROD, PROD and BROD) were found. In the two species, activities of these monooxygenases were induced after treatment with BNF and DMBA. In suckermouth armored catfishes (control and induced) no XROD activities were noted. In liv er microsomes of suckermouth catfishes and mice, the ethoxycoumarin-deethylase activity (ECOD) was found to be approximately five- fold the ECOD activity recorded in tilapias. CYP1A apparently did not take part in the catalysis of ECOD reaction in the two fish species. Results also showed that two antibodies against- fish CYP1A recognized liver microsomal proteins with a CYP-compatible molecular weight in induced tilapias and mice. These putative CYP1A proteins, however, were not consistently detected in suckermouth catfish liv er microsomes. Taken together, findings from this study suggested that, in contrast to t ilapias and mice, suckermouth catfishes do not show CYP1A catalytic activity and do not express, or do express only tiny amounts of constitutive CYP1A proteins in the liver. Alt hough not showing CYP1A catalytic activity in the liver, armored suckermouth catfishes were able to convert the pro-mutagen DMBA into its genotoxic metabolites, a metabolic activation us ually mediated by CYP1 family enzymes, in particular, CYP1A and 1B.

El hierro y el Cobre son dos micronutrientes necesarios para la generación de energía en nuestro organismo y los encontramos como componentes estructurales y funcionales de la citocromo c oxidasa, ubicada en la membrana interna de la mitocondria, sitio de producción de adenosintrifosfato para la actividad del músculo esquelético. Objetivo: Demostrar que la deficiencia simultánea de hierro y cobre disminuye la actividad de la citocromo c oxidasa del músculo esquelético en ratas. Diseño de investigación: Analítico, Experimental, prospectivo de causa - efecto, transversal. Metodología: Se utilizaron ratas de la raza Holtzman, machos de 21 días de edad, destetadas, las cuales fueron distribuidas en forma aleatoria en 4 grupos de 7 animales cada uno según las características de la dieta: grupo control (valores de hierro y cobre, 50mg/kg de dieta y 6 mg/kg de dieta, respectivamente), grupo deficiente de hierro (valor de hierro fue de 6mg/kg de dieta), grupo deficiente de cobre (valor de cobre fue de 1 mg/kg de dieta) y grupo deficiente en hierro y cobre (valores de hierro y cobre, 6 mg/kg de dieta y 1mg/kg de dieta, respectivamente) por 8 semanas, al término de este período los animales, previo ayuno de 14 horas, fueron anestesiadas con cloroformo. La sangre se extrajo por punción cardíaca y se procedió a la extracción del músculo cuadríceps de la extremidad posterior para proceder al homogenizado y así obtener la fracción mitocondrial, y realizar la medición de la actividad de la citocromo c oxidasa, que fue estudiada midiendo la disminución en la densidad óptica a 550nm del citocromo c reducido a medida que es oxidado por la enzima siguiendo el método de Prohaska y Wells. Análisis estadístico: Se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis, luego para la comparación de medianas se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney, para el procesamiento de datos se usó el programa SPSS v. 12.0 Resultados: Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en la actividad de la citocromo c oxidasa de músculo esquelético de ratas entre los grupos con dieta control comparado con la dieta deficiente en cobre (p=0,006), los grupos con dieta control comparado con la dieta con deficiencia simultánea de hierro y cobre (p=0,006), los grupos con dieta deficiente en hierro comparado con la dieta deficiente de cobre (p=0,009) y, los grupos con dieta deficiente de hierro comparado con la dieta con deficiencia simultánea de hierro y cobre (p=0,013). Conclusión: La actividad de la citocromo c oxidasa disminuye significativamente en la deficiencia simultánea de hierro y cobre seguida de la deficiencia de cobre. Palabras clave: hierro, cobre, citocromo c oxidasa, músculo esquelético. / Iron and copper are two micronutrients necessary for the generation of energy in our body and are found as structural and functional components of cytochrome c oxidase, located in the inner membrane of mitochondria, adenosine triphosphate production site to active skeletal muscle. Objective: Demonstrate isolate and simultaneous iron and copper deficiency diets decrease cytochrome c oxidase activity in skeletal muscle of rats. Research Design: Analytical, experimental, transversal and prospective. Methodology: Male Holtzman rats , 21 days of age, were used and randomly assigned in 4 groups of 7 animals to a control diet (containing 50mg of iron/kg of diet and 6mg of copper/kg of diet), an iron-deficient diet (containing 6mg of iron/kg of diet), a copper-deficient diet (1mg of copper/kg of diet), or an iron and copper deficient diet (containing 6mg of iron/kg of diet and 1mg of copper/kg of diet), respectively. The rats were fed for eight weeks, after a 14 hours fast, were anesthetize with chloroform. The blood samples were taken by cardiac puncture, and cuadriceps muscles were dissected out for measurement of cytochrome c oxidase activity. Muscle homogenates were prepared in order to isolate mitochondria by differential centrifugation and then the cytochrome c oxidase activity was assayed by measuring the decrease in optical density at 550 nm of reduced cytochrome c as it is oxidized by the enzyme following the method of Prohaska and Wells. Statistical analysis: The Kruskal-Wallis test was applied, then nonparametric Mann-Whitney test was used to compare medians. Program SPSS v 12.0 was used for data processing. Results: Statistically significant differences (p <0.05)in the cytochrome c oxidase activity of skeletal muscle were found, between the control diet group compared with copper deficient diet group (p = 0.006), control diet group compared with simultaneous iron and copper deficiency diet (p = 0.006), iron deficient diet group compared with copper deficient diet group (p = 0.009),and iron deficient diet group compared with simultaneous iron and copper deficient diet group (p = 0.013). Conclusion: The cytochrome c oxidase activity decreased significantly in skeletal muscle of rats fed with simultaneous iron and copper deficient diet and copper-deficient diet. Key words: Iron, Copper, Cytochrome c oxidase, skeletal muscle.

A síntese dos hormônios esteroides é feita através da ação de um complexo enzimático chamado citocromo P450. As enzimas 3&#946;-HSD (3&#946;-hidroxiesteroide desidrogenase), P450c17 (citocromo P450 17&#945;-hidroxilase/17,20-liase) e P450arom (citocromo P450 aromatase), fazem parte desse complexo e são responsáveis pela síntese dos hormônios progestágenos, andrógenos e estrógenos, espectivamente. Essas enzimas já foram identificadas em inúmeros tecidos, inclusive em embriões em período pré-implantação. Por isso, acredita-se que o blastocisto seja uma fonte de produção de progesterona e estrógeno, hormônios essenciais para implantação e manutenção da gestação. Em roedores, as informações sobre a capacidade esteroidogênica dos embriões são controversas e também restritas apenas a estudos com espécies laboratoriais. Para trazer mais informações sobre a capacidade esteroidogênica em blastocistos de roedores utilizamos o preá (Galea spixii), uma espécie de roedor silvestre encontrada nas regiões de Caatinga e Semiárido do Nordeste brasileiro e muito utilizado na alimentação de famílias de baixa renda como fonte proteica. Diante o exposto, o objetivo deste trabalho é fazer um apanhado histórico sobre os dados publicados a cerca da capacidade dos embriões de diversas espécies de produzir os hormônios esteroides além de identificar e quantificar a expressão das enzimas esteroidogênicas em embriões de preá através das técnicas de imunohistoquímica e PCR em tempo real. As análises morfológicas indicam que o desenvolvimento inicial do preá se assemelha com os demais roedores, porém o tempo de desenvolvimento difere das espécies usadas em laboratório. As marcações da imunohistoquímica foram positivas nos tecidos maternos, mas os embriões não tiveram marcação para nenhuma das três enzimas do estudo. No entanto, os dados obtidos pelo PCR indicam que os genes CYP11, CYP17 e CYP19 foram expressos nos embriões e, portanto, o concepto de G. spixii tem capacidade de produzir hormônios esteroides, assim como visto em várias outras espécies que já foram estudadas / The synthesis of steroid hormones is made through the action of an enzyme complex called cytochrome P450. 3&#946;-HSD (3&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase), P450c17 (cytochrome P450 17 &#945;-hydroxylase/17,20-lyase) and P450arom (cytochrome P450 aromatase), are present in this complex and are are responsible for the synthesis of progestins, androgens and estrogens hormones, respectively. These enzymes have been identified in numerous tissues, including embryos in pre-implantation period. Therefore, it is believed that the blastocyst is a source of production of progesterone and estrogen, hormones essential for the implementation and maintenance of pregnancy. In rodents, the information about the steroidogenic capacity of embryos are controversial and confined to studies with laboratory species. To get more information about the steroidogenic capacity in blastocysts of rodents we used the spix yellow-toothed cavy (Galea spixii), a species of wild rodent found in the northeastern of Brazil, and used in the feeding of low-income families as a source of protein. On the above, the aim of this work is to make a historic about the data published about the ability of embryos of various species to produce steroid hormones and identify and quantify the expression of steroidogenics enzymes in embryos of spix yellow-toothed cavy by immunohistochemical and real-time PCR techniques. The morphological analyses indicate that the G. spixii early development resembles other rodents, but development time differs from the species used in laboratory. The immunohistochemical stainning was positive in maternal tissues, but the embryos did not have stainnig for any of the three enzymes of the study. However, the data obtained by PCR indicate that CYP11, CYP17 and CYP19 genes were expressed in embryos and, therefore, the concept of G. spixii has capacity to produce steroid hormones, as seen in several other species that have been studied

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos. Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima. Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico, como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade. / The aim of this work is to study the electrochemical behavior of biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor, methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also studied. Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and viscosity.

Saccharomyces cerevisiae tem sido empregada como modelo experimental em testes de mutagenicidade, devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias promutagênicas a sua forma ativa. O grande número de linhagens e as diferenças na capacidade de produção de citocromo P-450 dificultam a definição das condições ideais de cultivo para obtenção de células com alto conteúdo desta enzima, sendo que poucos são os trabalhos publicados a este respeito. O objetivo deste trabalho é avaliar as melhores condições de cultivo para produção de citocromo P-450 em S. cerevisiae. Para tanto, quatro diferentes linhagens foram cultivadas sob diferentes condições, a fim de avaliar a influência de fatores como fonte de carbono, tempo de incubação e adição de etanol ao meio de cultura. Foi verificado que células cultivadas na presença de fontes de carbono altamente fermentáveis e coletadas no final da fase de crescimento exponencial apresentavam o maior conteúdo da enzima. Observou-se também que o nível de citocromo P-450 variou entre as linhagens estudadas, bem como o tempo de incubação para atingir a concentração máxima, sendo que o conteúdo mais alto foi encontrado na linhagem ATCC 44953. A adição de 2 % de etanol (v/v) ao meio de cultura contendo 2 % de glicose (p/v) resultou em aumento do nível de citocromo P-450, indicando o efeito indutor do etanol. Os resultados deste trabalho mostram a importância de estabelecer condições de cultivo para obtenção de células com altas concentrações da enzima, uma vez que fatores como a composição do meio de cultura, o tempo de incubação e a linhagem empregada podem influenciar a produção de citocromo P-450 por S. cerevisiae. / Saccharomyces cerevisiae has been employed as experimental model in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system capable of metabolizing promutagens to its active form. The large number of S.cerevisiae strains and their different capacity of producing cytochrome P-450 make the definition of the ideal cultivation conditions to obtain cells with high enzyme content difficult. Moreover, there are only a few reports related to this subject. The aim of this work is evaluate the ideal cultivation conditions to produce cytochrome P-450 by S. cerevisiae. For this purpose, four different S. cerevisiae strains were cultured under different cultivation conditions in order to evaluate the influence of factors such as carbon source, incubation time and addition of ethanol to the culture media. It was found that the cytochrome P-450 content was higher in cells growth on strongly fermentable carbon source and harvested at the end of the exponential growth phase. Our results also showed that the cytochrome P-450 concentration varied among the strains studied, as well as the incubation time to reach the maximum level. The highest content was found in the ATCC 44953 strain and the addition of 2 % ethanol (w/w) to the culture media containing 2 % glucose (w/v) increased the cytochrome P-450 amount, indicating the induction of cytochrome P-450 production by ethanol action. These results show the importance of establishment of the cultivation conditions to obtain cells with high cytochrome P-450 concentrations, considering that factors such as the culture media, incubation time and strain employed can influence the cytochrome P-450 production by S.cerevisiae.

Os gliomas representam o tipo de tumor primário mais comum do sistema nervoso central. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas e de radioterapia e nos protocolos de quimioterapia, não há tratamento eficiente disponível. O ácido retinóico na forma all-trans (atRA) é um agente anti-proliferativo utilizado para o tratamento de alguns tipos de lesões pré-malígnas e tumores, como a leucemia promielocítica. Entretanto, sua utilização no tratamento clínico de tumores sólidos, incluindo os gliomas, é limitada, devido ao rápido desenvolvimento de resistência aos efeitos anti-tumorais do atRA. Para endereçar este problema, foi proposto: a) clonar e analisar a função de cyp26b1 de rato, uma enzima da família dos citocromos P450 envolvida na metabolização de ácido retinóico, previamente descrito em nosso laboratório como potencialmente envolvido na resposta de células de glioma ao tratamento com atRA; b) gerar e caracterizar uma variante da linhagem celular C6 de glioma de rato resistente aos efeitos anti proliferativos de atRA. O cDNA de cyp26b1 de rato, até então desconhecido, foi amplificado, clonado e seqüenciado com sucesso. A seqüência protéica correspondente é conservada e agrupa-se no dendrograma com outras proteínas Cyp26B1, mesmo de organismos distantes como zebrafish, em detrimento de outras proteínas parálogas da família Cyp26. Cyp26b1 é fortemente induzida por atRA em células de glioma de rato e humano, de forma dose-dependente. Embora seja expresso em amostras de cérebros humanos normais e de glioma, não foram encontradas diferenças significativas entre os diferentes graus de matlignidade tumoral, ou em comparação com cérebro normal. A super-expressão de cyp26b1 de rato através de transfecção estável de células de glioma de rato e humano, bem como de células P19 de teratocarcinoma de camundongo, não alterou significativamente as características de crescimento celular, tanto em substrato sólido quanto em substrato semi-sólido. O tratamento prolongado de células C6 de glioma de rato com atRA levou à obtenção de uma população policlonal resistente aos efeitos anti-proliferativos de atRA, a partir da qual uma linhagem celular clonal resistente foi isolada com sucesso. Esta variante clonal, denominada linhagem celular C6R, apresenta inibição de crescimento por atRA diminuída, quando comparada com a linhagem celular C6 parental e com a variante ST1. Além disso, esta variante também mostrou uma tendência, embora não significativa estatisticamente, de gerar tumores maiores quando injetados no subcutâneo de camundongos do tipo nude. A expressão de genes previamente descritos como induzidos pelo tratamento com atRA em células ST1 é fortemente inibida na linhagem celular C6R. Além disso, menor expressão de RAR&#946;, RAR&#947; e CRABP-1 foi também observada em células C6R, enquanto que expressão muito maior de RXR&#947; e CRABP-2 foi encontrada nas células resistentes a atRA, em comparação com as células C6 parentais. Como conclusões gerais deste trabalho, foi proposto que cyp26b1 parece estar envolvido no metabolismo e detoxificação de atRA e parece não ser efetor da inibição de crescimento induzida por atRA, nem estar relacionado com a resistência de células de glioma ao tratamento com atRA. Por outro lado, o isolamento e caracterização de uma linhagem celular resistente ao tratamento com atRA sugere que a resistência está relacionada à expressão diferencial de receptores de retinóides e de proteínas de ligação ao ácido retinóico. / Gliomas are among the most common primary tumors of the central nervous system. Despite the advances in surgical and radiotherapy procedures and chemotherapy protocols, efficient treatment is still not available. Retinoic acid is a anti-proliferative agent used for treatment of a number of pre-malignant lesions and tumors, as promyelocytic leukemia. However, its clinical use in treatment of solid tumors, including gliomas, is impaired by the rapid development of resistance to the anti-tumoral effects of atRA. In order to address this problem, we proposed: a) to clone and analyze the role of rat cyp26b1, a member of cytochrome P450 superfamily envolved in the metabolization of retinoic acid, which has previously been described by our group as being potentially involved in the response of glioma cells to retinoic acid treatment; b) to generate and characterize a variant of rat C6 glioma cell line resistant to anti proliferative effects of atRA. The previously unknown cDNA of rat cyp26b1 was successfully amplified, cloned and sequenced. The protein is conserved and clustered in dendrograms with other cyp26b1 proteins, even from distant organisms as zebrafish, in detriment of other cyp26 paralogs. Cyp26b1 is strongly induced by atRA in rat and human glioma cells, in a dose-dependent fashion. Although expressed in human normal brains and glioma samples, no significant differences were found among different tumor grades nor comparing to normal brain. Stable-transfection and overexpression of rat cyp26b1 in rat and human glioma cell lines, as well as P19 mouse teratocarcinoma cell line, did not significantly modified cell growth properties, either on solid or semi-solid substrates. Prolonged treatment of C6 rat glioma cell line with atRA leads to isolation of an atRA-resistant polyclonal cell population, from which a resistant clonal cell line was successfully isolated. This clonal variant, named C6R cell line, displayed diminished growth inhibition by atRA compared to the parental C6 cell line and the variant ST1 cell line. In addition, this variant also showed a trend, although not quite statistically significant, to generate larger tumors when xenografted s.c. into nude mice. Expression of genes previously described as being induced by atRA-treatment in ST1 cells is strongly impaired in the C6R resistant cell line. In addition, lower expression of RAR&#946;, RAR&#947 and CRABP-1 was also observed in C6R cells, whereas a much higher expression of RXR&#947; and CRABP-2 was found in the resistant cells when compared to the parental C6 cells. As general conclusions of this work, we found that cyp26b1 is more likely to be involved in primary atRA metabolism and detoxification and does not seem to be an effector of atRA-induced cell growth arrest nor to be related to the resistance of glioma cells to atRA treatment. On the other hand, isolation and characterization of an atRA-resistant cell line suggests that atRA resistance is more likely to be due to differential expression of retinoid receptors and retinoic acid binding proteins.

Orientador: Daniel Zanetti de Flório. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2013

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos. Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima. Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico, como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade. / The aim of this work is to study the electrochemical behavior of biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor, methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also studied. Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and viscosity.