Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, como agente etiológico de la enfermedad de Chagas, es uno de los principales problemas de salud pública en diversos países latinoamericanos. De acuerdo con la Organización Panamericana de la Salud (OPS), existirían alrededor de 18 millones de personas infectadas en el continente. A su vez, la Organización Mundial de la Salud (OMS) indica que en el cono sur alrededor de 50 millones de personas están expuestas al riesgo de infectarse. El conocimiento de la magnitud de la infección chagásica, su repercusión sobre la salud y la economía de los países latinoamericanos, varía grandemente, en especial, sus formas clínicas. La caracterización genética de las variedades de T. cruzi es de suma importancia, debido a la considerable heterogeneidad genética y biológica en las poblaciones de este parásito. Se han descritos previamente dos linajes filogenéticos importantes, ambos muy heterogéneos; T.cruzi I y T.cruzi II. En la presente memoria se han caracterizado nueve cepas a través de la secuenciación del gen para citocromo b y su posterior análisis filogenético, el cual se realizó junto al total de cepas descritas en GenBank para citocromo b de T. cruzi. Los resultados obtenidos muestran una topología que divide las diferentes cepas en tres Clados principales (Clado A, B y C), lo cual reafirma resultados obtenidos en diversos estudios previos. Las muestras chilenas se distribuyen en los tres clados, pero principalmente en el Clado A, cuyas cepas están clasificadas como T. cruzi I según la nomenclatura internacional

Neste trabalho foi investigado o potencial de modelos metaloporfirínicos em mimetizar a ação do citocromo P450 na oxidação de um herbicida, a atrazina. Foram utilizadas as metaloporfirinas comerciais de segunda geração solúveis em solvente orgânico, cloreto de 5,10,15,20-tetrakis(2,6-diclorofenil)porfirina metal(III) [M(TDCPP)Cl] e cloreto de 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorofenil) porfirina metal(III) [M(TFPP)Cl] (metal = ferro e manganês), tanto em solução homogênea como suportadas em montmorilonita K-10 aminofuncionalizadas; e metaloporfirinas solúveis em água, como a cloreto de 5,10,15,20-tetrakis-(N-metil-4-piridil) porfirina ferro(III), [Fe(TMPy)Cl], e cloreto de [5,10,15,20-tetra(4-carboxifenil)porfirina] ferro(III), [Fe(TCPP)Cl]. Os oxidantes testados foram iodosilbenzeno, ácido metacloroperbenzóico e peróxido de hidrogênio em água, metanol e acetonitrila. Os produtos de oxidação da atrazina foram identificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os resultados mostraram que as metaloporfirinas foram capazes de oxidar a atrazina, um herbicida com características de persistência no meio ambiente, e mimetizar a ação da enzima in vivo e in vitro com formação de dois metabólitos: DEA e DIA, resultado da N-desalquilação das cadeias etila e propila do substrato, respectivamente. O DEA correspondeu a um dos principais produtos da reação, e formou-se apenas traços de DIA, mostrando a preferência das metaloporfirinas em oxidar a cadeia etila da atrazina. Verificou-se também a formação de cinco produtos desconhecidos, sendo possível a identificação de apenas um deles por espectrometria de massas, devido à baixa concentração dos demais, o qual corresponde à formação de uma amida na cadeia etila da atrazina (COA). Esse composto correspondeu ao produto de maior rendimento na maioria das reações. O monitoramento das reações em diferentes intervalos de tempo e a variação nas condições reacionais mostraram que os principais produtos de oxidação do herbicida, DEA e COA, são formados por mecanismos independentes e por espécies catalíticas distintas. O DEA é formado via espécie ativa Me(V)OP [Mn(V)OP ou Fe(IV)OP+], enquanto o COA é originado via Me(IV)OP [Mn(IV)OP ou Fe(IV)OP]. Estudos de intermediários por UV-Vis e EPR mostraram que a espécie ferril predomina como intermediário de reação para os sistemas Fe(TFPP)Cl/ACN com os dois oxidantes, iodosilbenzeno e ácido metacloroperbenzóico. Para as metaloporfirinas Fe(TCPP)Cl e Fe(TMPy)Cl o estudo da oxidação do herbicida ficou comprometido devido à baixa solubilidade da atrazina em água, o que provocava sua precipitação e destruição do catalisador. Para as metaloporfirinas suportadas em montmorilonita K-10 aminofuncionalizada também não foi observada formação de produtos, resultado atribuído à dificuldade do substrato, considerado bastante inerte, atingir o sítio catalítico. Todos esses resultados mostraram o potencial de aplicação desses modelos biomiméticos em estudos que buscam elucidar o metabolismo de herbicidas in vivo, tendo em vista a dificuldade de se trabalhar com as enzimas in vitro, e resultaram na proposição de um esquema de reação da oxidação da atrazina catalisada pelas metaloporfirinas nas condições estudadas. / In this work we investigated the ability of metalloporphyrin model systems to mimic the action of cytochrome P450 in the oxidation of a herbicide, atrazine. To this end, we employed the second generation commercially available metalloporphyrins metal (III) 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrin chloride [M(TDCPP)Cl] and metal (III) 5,10,15,20- tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin chloride [M(TFPP)Cl] (metal = iron or manganese), all soluble in organic solvents, as well as the water soluble metalloporphyrins iron (III) 5,10,15,20-tetrakis(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin chloride [Fe(TMPy)Cl] and iron (III) 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin chloride [Fe(TCPP)Cl]. These metalloporphyrins were used both in homogeneous solution and supported on montmorillonite K-10. Iodosylbenzene, metachloroperbenzoic acid, and hydrogen peroxide were tested as oxidants, using one of the following reaction media: water, methanol, and acetonitrile. Products generated during atrazine oxidation were identified by high performance liquid chromatography. Our results show that the metalloporphyrins are able to oxidize atrazine, a highly persistent herbicide in the environment, as well as mimic the action of P450 enzymes both in vivo and in vitro, with formation of two metabolites, namely DEA and DIA, which result from the N-dealkylation of the ethyl and propyl chains of the substrate, respectively. We also detected the formation of five unknown products, and we were able to identify only one of them by means of mass spectrometry, which corresponds to the formation of an amide on the atrazine ethyl chain (COA) and was the compound obtained in highest yields in most of the reactions. The other four unknown products were obtained in very low concentrations, which prevented us from determining their structures. By monitoring the reactions at different time intervals and varying the reactional conditions, we were able to see that the main herbicide oxidation products, DEA and COA, are generated via distinct mechanisms and different active catalytic species. DEA is formed via the species Me(V)OP [Mn(V)OP or Fe(IV)OP.+], while COA results from the action of the species Me(IV)OP [Mn(IV)OP or Fe(IV)OP]. Studies of the reaction intermediates by UV-VIS and EPR showed that the ferryl species is the main reaction intermediate in the case of Fe(TFPP)Cl/ACN systems and the oxidants, iodosylbenzene and metachloroperbenzoic acid. Studies of herbicide oxidation were difficult to carry out in the case of the metalloporphyrins Fe(TCPP)Cl and Fe(TMPy)Cl due to the low solubility of atrazine in water, which led to its precipitation and catalyst destruction. With respect to the metalloporphyrins supported on montmorillonite K-10, no reaction products were obseved because of the difficult diffusion of the inert substrate into the catalytic site. All these results demonstrate the potential application of these biomimetic model systems in studies that pursue the elucidation of herbicide metabolism in vivo, especially when one bears in mind the difficulty in working with enzymes in vitro. Our data enabled the proposition of a scheme for metalloporphyrin-catalyzed atrazine oxidation under the conditions used herein.

A associação lipídio/citocromo c é importante e deve ser estudada, pois repercute na atividade peroxidática da proteína abordada e pode contribuir para o processo apoptótico, ou morte programada da célula, e também desempenha um papel significativo na cadeia respiratória. A natureza e a especificidade da interação do citocromo c com bicamadas lipídicas têm sido bastante investigadas ultimamente, mas informações detalhadas e precisas sobre tais assuntos ainda não existem. É aceito que ocorre primeiramente uma interação eletrostática entre a proteína citocromo c e as membranas fosfolipídicas. Em seguida, há uma interação hidrofóbica. Entretanto, ainda não é bem compreendido o papel da cadeia fosfolipídica. A associação do citocromo c com membranas lipídicas induz mudanças no estado de spin do átomo de ferro. A interação entre as vesículas carregadas e o citocromo c induz mudanças estruturais na proteína, as quais são refletidas no seu centro ativo, ou grupo heme. As mudanças do campo cristalino no sítio do ferro hemínico de forte para fraco são acompanhadas por mudanças do estado de spin de baixo para alto, respectivamente. Neste trabalho, estuda-se sistematicamente a natureza da interação entre o citocromo c e a cadeia fosfolipídica. As mudanças estruturais no grupo heme foram correlacionadas com a natureza do lipídio, ou seja, com a carga da cabeça e com o tamanho e o tipo da cadeia fosfolipídica. Foram utilizados treze lipídios diferentes, naturais e sintetizados, com cabeças polares negativas e neutras e com cadeias carbônicas saturadas e insaturadas de diferentes comprimentos. Para tal investigação, utilizamos as técnicas: Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) Onda Contínua (CW) e Pulsada (PW) e Dicroísmo Circular Magnético (MCD). As técnicas enunciadas avaliam as mudanças de estado de spin e a simetria do citocromo c nos seus estados férrico e ferroso. A interação lipoprotéica lipídio/citocromo c foi avaliada com lipídios diferentes, inclusive com o lipossomo PCPECL, que mimetiza a membrana interna da mitocôndria nos eucariontes. A partir dos resultados experimentais, sugerimos um modelo para esse tipo de associação. / This association lipid/cytochrome c is interesting to study in order to understand the peroxidase activity of this protein, that plays an important role in the respiratory chain and in the apoptosis process or the programmed cell death. The nature and specificity of the interaction of cytochrome c with lipid bilayers have been major goals in recent studies, but detailed information on that issue is not yet widely available. In this regard, it is generally accepted that the electrostatic interaction is an important factor in the association of cytochrome c with phospholipid membranes, followed by a hydrophobic interaction. However, the role played by the phospholipid chain is not well understood. The association of cytochrome c with negative membranes induces a change in the heme iron spin state. The interaction between the charged vesicles and cytochrome c leads to structural changes in the active central or heme group. The changing of the crystalline field of the heme iron from strong to weak is accompanied by spin states changes from low to high spin, respectively. These facts concerned us to investigate more systematically the nature of the interaction between cytochrome c and the phospholipid chains. The lipid-induced effects in the heme iron crystalline field are correlated to the nature of the charged head group and to the size and type of the phospholipid chain. Thirteen different lipids, nature and synthetic, were used, with negative and neutra1 polar head group and saturated and unsaturated acyl chains with different length. This work investigates the change of heme iron spin state and symmetry of ferric cytochrome c using Continuous Wave (CW) and pulsed (PW) Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Magnetic Circular Dichroism (MCD) techniques. These techniques analyze the spin state change and the symmetry of the iron cytochrome c in its ferric and ferrous states. The effect of the different lipids were analyzed, including PCPECL membrane that mimetics the inner mitocondrial membrane in eukaryotes.

Espécies silvestres com grande potencial zootécnico devem ser exploradas de forma racional a fim de se evitar a extinção das mesmas. Assim se dá a importância de pesquisas voltadas à reprodução daquelas criadas em cativeiro, como a cutia (Dasyprocta sp.). Este animal é um mamífero e roedor vivente, em sua maioria, na Caatinga brasileira. A ultraestrutura é a base para determinar os estágios celulares e, assim, facilitar as comparações dos processos entre cutias e roedores silvestres ou outros mamíferos. As enzimas P450 aromatase e P450c17 são responsáveis pela regulagem da produção de estrógenos e andrógenos, respectivamente. Considerando a hipótese de que o comportamento de expressão das enzimas do complexo citocromo P540 permanece o mesmo no testículo e na via espermática de cutias durante as fases de desenvolvimento sexual, objetivou-se observar a atuação das enzimas P450 aromatase e P450c17 (17-α-hidroxilase/17,20-liase) nas diferentes fases do desenvolvimento sexual, detalhar a ultraestrutura dos componentes desta via e constatar o desenvolvimento do processo espermatogênico. Segmentos do ducto deferente, epidídimo e testículo de 28 cutias machos em diferentes idades (um dia, 2-14 meses) foram fixados em paraformoldeído e glutaraldeído. O material foi coletado no Centro de Multiplicação da Universidade Federal Rural do Semiárido, Mossoró, RN (Autorização IBAMA nº 2028236/2008). Foram feitos: histologia, seguindo o protocolo padrão para hematoxilina e eosina; processamento para corte semifino (azul de toluidina); microscopia eletrônica de transmissão e varredura; e imunohistoquímica. Este trabalho foi pioneiro ao observar que o epidídimo de cutias é composto por células basais, células principais, células haloides e, quando impúbere, por células \"limpas\", e por células apicais, quando a partir da puberdade. O ducto deferente de cutias antes da puberdade era caracterizado por duas camadas musculares, possivelmente devido à falta de trânsito espermático. No epitélio germinativo foram encontradas, em sua maioria, células em prófase I, principalmente em paquíteno. A espermiogênese é completa quando na pré-puberdade, entretanto, a espermiação ocorre a partir dos 9 meses de idade. A expressão da enzima P450 aromatase variou ao longo do desenvolvimento sexual, sendo na puberdade seu pico de atividade. A P450c17 não mostrou nenhuma ação em qualquer fase sexual. Pode-se concluir que o epitélio germinativo testicular e intersticial, bem como o epitélio pseudoestratificado estereociliado do epidídimo e do ducto deferente de cutias criadas em cativeiro sofrem mudanças morfológicas e funcionais ao longo do desenvolvimento sexual. As atividades androgênicas preponderantes em cutias criadas em cativeiro ocorrem no período da puberdade. / Wild species with great potential livestock should be explored rationally in order to prevent the extinction of the same. Thus is the importance of research aimed at reproducing those bred in captivity, such as agouti (Dasyprocta sp.). This animal is a mammal and rodent living mostly in the Brazilian Caatinga. The ultrastructure is the basis for determining the stages and thus facilitates comparisons of cases between agouti and wild rodents or other mammals. The enzymes P450 aromatase and P450c17 are responsible for regulating the production of estrogens and androgens, respectively. On the assumption that the behavior of expression of the enzymes of complex cytochrome P540 remains the same in the testis and excurrent canals of the agouti during the stages of sexual development, aimed to observe the activity of the enzymes P450 aromatase and P450c17 (17-α- hidroxilase/17,20-lyase) in different stages of sexual development, detail the ultrastructure of the components of this pathway and observe the development of spermatogenesis. Segments of the vas deferens, epididymis and testis of 28 agouti males at different ages (1 day, 2-14 months) were fixed in glutaraldehyde and paraformoldehyde. The material was collected on Center of Multiplication of Federal Rural University of the Semi-arid, Natal, RN (IBAMA Authorization No. 2028236/2008). Were made: histology following the standard protocol for hematoxylin and eosin; processing to semithin (blue toluidine), electron microscopy of transmission and scanning; and immunohistochemistry. This work was pioneered by observing that the epididymis is composed by basal cells, principal cells, haloids cells; and for clean cells when impubertal and apical cells after puberty in agoutis. The vas deferens before puberty was characterized by two muscle layers, possibly due to the lack of sperm transit. In the germinal epithelium were found mostly cells in prophase I, mainly in pachytene. Spermiogenesis is complete when prepubertal phase; however, spermiation takes place from 9 months of age. The expression of enzymes of the cytochrome complex varied over sexual development and peak activity of P450 aromatase was at puberty. The P450c17 showed no action at any stage of sexual development. It can be concluded that the testicular germinal epithelium and interstitial epithelium as well as the pseudostratified estereociliated epithelium of the epididymis and vas deferens undergo morphological and functional changes during the sexual development. Androgenic activities prevalent in agoutis kept in captivity occur during puberty.

A interação do citocromo c com a cardiolipina ocorre por interações eletrostáticas e hidrofóbicas. A formação do complexo citocromo c/ cardiolipina promove uma pequena mudança estrutural na proteína, que proporciona atividade peroxidásica ao citocromo c e consequentemente capacidade de oxidar substratos orgânicos, incluindo a cardiolipina. A oxidação da cardiolipina acompanhada da inserção de um grupo peróxido vem sendo relacionada à perda da interação hidrofóbica entre o complexo citocromo c/cardiolipina, que resulta no desligamento do citocromo c da membrana e na sua saída do espaço intermembranas para o citosol, onde essa proteína induz a cascata de apoptose. Neste trabalho foi avaliada a ligação do citocromo c a lipossomos contendo cardiolipina oxidada e a reatividade desta proteína com o mono-hidroperóxido da cardiolipina (TLCL(OOH)1) presente na membrana. Nossos dados mostraram que ocorre uma diminuição significativa na ligação do citocromo c a membrana oxidadas apenas quando 100% da cardiolipina presente na membrana está na forma de TLCL(OOH)1, condição que extrapolaria o que seria esperado para o sistema biológico. Análises por SDS-PAGE revelaram que o citocromo c sofre agregação na presença de membranas contendo TLCL(OOH)1, indicando que a proteína reage com este peróxido. De fato, determinamos a velocidade de reação do citocromo c com o TLCL(OOH)1 e com hidroperóxido do ácido linoléico, inseridos em membrana contendo cardiolipina (9,58 ± 0,16 x 102 M-1.s-1 e 6,91 ± 0,30 x 102 M-1.s-1, respectivamente). As velocidades de reação com os peróxidos de lipídio foram pelo menos 10 vezes superiores à velocidade medida com o peróxido de hidrogênio (5,91 ± 0,18 x101 M-1.s-1). Assim, mostramos que o citocromo c liga-se à membrana contendo hidroperóxido de cardiolipina e que reage com o mesmo promovendo a formação de agregado protéico de alto peso molecular / The interaction of cytochrome c with cardiolipin is promoted by electrostatic and hydrophobic interactions. The cytochrome c / cardiolipin complex formation causes structural changes in the protein that activates cytochrome c peroxidase activity, giving it the ability to oxidize organic substrates, including cardiolipin. The oxidation of cardiolipin coupled with a peroxide group insertion has been related to the loss of hydrophobic interactions between the cytochrome c / cardiolipin complex, resulting in cytochrome c release from the membrane and in its translocation from intermembranes space to cytosol, where this protein induces apoptosis cascade. In this work the binding of cytochrome c to liposomes containing oxidized cardiolipin and its reactivity with the membrane mono-hydroperoxides (TLCL(OOH)1) were evaluated. Our data showed a significant decrease in cytochrome c binding to oxidized membranes only when 100% of the membrane cardiolipin is in the TLCL(OOH)1 form, a condition that would extrapolate the expected concentrations that would be found in a biological system. SDS-PAGE analysis revealed that cytochrome c undergoes aggregation in the presence of membranes containing TLCL(OOH)1, indicating that this protein reacts with the peroxide. In fact, we determined the rate of cytochrome c reaction with TLCL(OOH)1 and linoleic acid hydroperoxide inserted into cardiolipin containing membranes (9.58 ± 0.16 x 102 M-1s-1 and 6.91 ± 0.30 x 102 M-1s-1,respectively). The reaction rates obtained with lipid peroxides were at least 10 times higher than that obtained with hydrogen peroxide (5.91 ± 0.18 x 101 M-1s-1).Thus we show that cytochrome c binds to membrane containing cardiolipin hydroperoxides and reacts with it promoting the formation of high molecular weight protein aggregates.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O emprego das tÃcnicas de eletroquÃmica, microbalanÃa de cristal quartzo (QCM â Quartz Crystal Microbalance) e ressonÃncia de plÃsmons de superfÃcie (SPR â Surface Plasmon Resonance) mostram que as espÃcies 1,4-ditiano (1,4-dt), 4-mercaptopiridina (pyS), 5-(4-piridil)-1,3,4-oxadiazol-2-tiol (Hpyt), tionicotinamida (TNA) e isotionicotinamida (iTNA) experimentam adsorÃÃo espontÃnea formando SAMs (Self-Assembled Monolayers) como resultado da imersÃo de substratos de ouro em soluÃÃo contendo estas espÃcies. As imagens obtidas por microscopia de varredura por tunelamento (STM â Scanning Tunneling Microscopy) indicam um arranjo prÃximo do hexagonal com exceÃÃo da iTNA cujas imagens nÃo foram conclusivas. Adicionalmente, as imagens indicam a existÃncia de defeitos nas SAMs mesmo apÃs longos perÃodos de imersÃo (24 h). Os estudos termodinÃmicos e cinÃticos dos processos de adsorÃÃo foram realizados por desorÃÃo redutiva em meio alcalino e QCM. Os valores dos potenciais de desorÃÃo redutiva, Edr, foram observados em −0,9, −0,8 e −0,5 V vs. Ag/AgCl/Cl- para a desorÃÃo de iTNA, TNA e Hpyt, respectivamente. Comparativamente Ãs espÃcies 1,4-dt (−0,8 V) e pyS (−0,5 V), o valor de Edr da SAM de Hpyt indica uma interaÃÃo sigma ao passo que aqueles observados para iTNA e TNA sugerem uma contribuiÃÃo pi adicional. Os valores de quantidade de material adsorvido (gama) e da taxa de recobrimento da superfÃcie (teta), calculados por desorÃÃo redutiva e impedÃncia eletroquÃmica, respectivamente, foram consistentes com as imagens de STM. Comparativamente aos resultados de desorÃÃo, os maiores valores de gama determinados por QCM foram atribuÃdos à presenÃa de molÃculas de Ãgua co-adsorvidas visto que foi observada uma relaÃÃo linear entre o excesso de massa e o momento de dipolo das espÃcies modificadoras. As curvas de desorÃÃo obtidas para pyS indicam a decomposiÃÃo da monocamada nÃo possibilitando, portanto, a determinaÃÃo dos parÃmetros termodinÃmicos e cinÃticos de adsorÃÃo. A correlaÃÃo com os resultados obtidos apÃs imersÃo do eletrodo de ouro em soluÃÃo de Na2S sugere que este processo està associado à quebra da ligaÃÃo C─S com formaÃÃo de uma camada de enxofre atÃmico e/ou oligomÃrico. As isotermas de adsorÃÃo obtidas para os processos de formaÃÃo das SAMs de Hpyt, TNA e iTNA, adequaram-se ao modelo de Langmuir permitindo a determinaÃÃo da variaÃÃo da energia livre de adsorÃÃo, ΔGads, como −35,9, −38,5 e −34,9 kJ mol−1, respectivamente. Estes valores sÃo indicativos de interaÃÃo forte sendo caracterÃsticos de processos de quimissorÃÃo. Para o modelo de Frumkin, os dados apresentaram melhores correlaÃÃes quando o parÃmetro de interaÃÃo (g) foi fixado em −0,45, −0,30 e −0,10, respectivamente, para as SAMs de Hpyt, TNA e iTNA indicando interaÃÃes repulsivas entre as molÃculas adjacentes. Os valores de pKa das SAMs de Hpyt (4,2), TNA (5,0 e 8,5) e iTNA (4,5 e 7,9) foi determinado por voltametria utilizando-se o Ãon complexo [Fe(CN)6]3−. Neste estudo, foram sugeridas modificaÃÃes, uma vez que o mÃtodo proposto na literatura dificulta a determinaÃÃo de mais de um valor de pKa como observado para as molÃculas de TNA e iTNA. As reaÃÃes de transferÃncia de elÃtrons (TE) das metaloproteÃnas citocromo c (cyt c) e mioglobina (Mb) foram estudadas utilizando-se as SAMs de Hpyt, TNA, iTNA, pyS e 1,4-dt. Para as SAMs de TNA e iTNA, o deslocamento positivo de 0,2V no valor do potencial de meia-onda do cyt c (pH~7,0) em relaÃÃo a forma nativa, foi atribuÃdo à densidade de carga positiva resultante da protonaÃÃo do grupo NH2 (pKa ~ 8,0). Resultados de QCM e SPR indicaram que hà a formaÃÃo de uma monocamada de cyt c sobre as SAMs estudadas. Esta monocamada, embora nÃo sendo redox ativa, permite o estudo da reaÃÃo de TE das molÃculas de cyt c em soluÃÃo sugerindo que este processo pode envolver os orbitais das molÃculas modificadoras. Para a metaloproteÃna Mb, utilizou-se uma SAM formada pelo aminoÃcido L-cisteÃna (cys), uma vez que nenhuma das SAMs estudadas acessou a reaÃÃo de TE. O processo redox foi observado em 0,086 V o que sugere a forma nativa. Os dados de QCM e SPR indicaram, tambÃm, a formaÃÃo de uma monocamada sobre a SAM de cys (Au/cys/Mb). Valores de â49,67 kJ mol−1 e −0,15 para ΔGads e g, respectivamente, foram calculados para a formaÃÃo da monocamada de Mb sobre a SAM de cys. O eletrodo Au/cys/Mb apresentou atividade catalÃtica em relaÃÃo a reaÃÃo de oxidaÃÃo do Ãcido ascÃrbico com uma diminuiÃÃo de 400 mV no sobrepotencial e uma reaÃÃo cineticamente controlada com uma constante de velocidade, kf, de ~2,0 x 10^4 L mol-1 s-1. / Electrochemical techniques, quartz crystal microbalance (QCM) and surface plÃsmons resonance (SPR) were used to study the formation of self-assembled monolayers (SAMs) of 1,4-ditiano (1,4-dt), 4-mercaptopyridine (pyS), 5-(4-piridinyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol (Hpyt), thionicotinamide (TNA) and thioisonicotinamide (iTNA) as a result of the immersion of gold substrates into the respective solutions. STM (Scanning Tunneling Microscopy) images indicate the sulfur atom as the adsorption site of these molecules and a hexagonal conformation on surface. For the iTNA molecule, the images were not conclusive. In addition, the images indicated the existence of defects even after longer immersion times (24 h). Thermodynamic and kinetic aspects of the adsorption process were evaluated by reductive desorption in alkaline media and QCM. The reductive desorption potentials, Edr, were observed at −0.9, −0.8, and −0.5 V vs. Ag/AgCl for the desorption of iTNA, TNA and Hpyt, respectively. In comparison to 1,4-dt (−0.8 V) and pyS (−0.5 V) species, the Edr value of Hpyt indicates a sigma interaction whereas those of iTNA and TNA indicate an additional pi contribution. The values of the concentration of adsorbed material, gama, and fractional coverage (teta ~ 0.9), determined, respectively, by reductive desorption and impedance are consistent with the STM images. In comparison to the desorption data, the higher values of gama calculated by QCM were assigned to the presence of water molecules since a linear relation was observed between the dipole moment and the mass change calculated by QCM. The desorption curves acquired for the pyS SAM indicated the decomposition of the monolayer thus not allowing the determination of the thermodynamic and kinetic parameters of adsorption. In comparison with the results obtained for the electrode modified after immersion in Na2S solution, it was suggested that this process is associated to the cleavage of the C─S bond which results in the formation of an adlayer composed of atomic and/or oligomeric sulfur species. The adsorption isotherms for Hpyt, TNA and iTNA fitted the Langmuir model of adsorption allowing the determination of the free energy of adsorption, ΔGads, as −35.9, −38.5 and −34,9 kJ/mol, respectively. These values are indicative of strong interaction being typical of chemisorption. For the Frumkin model, the best correlation was found when the interaction parameter, g, was established as −0.45, −0.20 and −0.10 for Hpyt, TNA and iTNA, respectively, indicating repulsive interactions between the adjacent molecules. Cyclic voltammetry was used to determinate the pKa of the SAMs of Hpyt (4.2), TNA (5.0 and 8.5) and iTNA (4.5 and 7.9) by using [Fe(CN)6]3− as a probe molecule. For this study, some changes were suggested since in the method proposed in the literature the existence of more than one protonation site was not considered thus not allowing the determination of more than one pKa value as was observed for TNA and iTNA molecules. Electron transfer reactions (TE) of cytochrome c (cyt c) and myoglobin (Mb) metalloproteins were studied by using the SAMs of Hpyt, TNA, iTNA, pyS and 1,4-dt. For the SAMs formed with TNA and iTNA, the positive shift of 0.2V on the half-wave potential of cyt c in relation to that of the native protein, was assigned to the positive charge density on surface in consequence of the protonation of NH2 groups (pKa~8.0) since these measurements were carried out in physiological medium. QCM and SPR data indicated the formation of a monolayer of cyt c on the studied SAMs. This monolayer, although not being electroactive, allows the study of the TE reaction of the cyt c molecules in solution suggesting that this process involves the orbitals of the modifier molecules. For the Mb metalloprotein, a SAM of L-cysteine amino acid was used since none of the studied sulfur molecules was able to access the TE reaction. The redox process was observed at 0.086 V suggesting the native form of Mb. QCM and SPR data indicated, also, the formation of a monolayer of Mb on the cys SAM (Au/cys/Mb). Values of â49.67 kJ mol−1 and −0.15 for ΔGads and g, respectively, were calculated for the formation of the monolayer of Mb on the cys SAM. The electrode Au/cys/Mb presented catalytic activity toward the oxidation reaction of ascorbic acid presenting a decrease of 400 mV in the overpotential and a kinetic controlled with a rate constant, kf, of 2.0 x 104 L mol-1 s-1.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T21:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270587.pdf: 3722917 bytes, checksum: 5fca0f886701d91246cca285d114360f (MD5) / O recente avanço da biologia molecular tem ampliado o conhecimento relacionado a invertebrados marinhos e peixes, gerando inúmeras possibilidades de novas aplicações biotecnológicas. No presente estudo foram identificados e caracterizados novos genes em organismos modelo para estudos ecotóxicológicos. No capítulo I, foram estudados aspectos moleculares, bioquímicos e químicos, da ostra-do-mangue Crassostrea rhizophorae, uma espécie de importância econômica, ecológica e social que ocorre amplamente em estuários e manguezais na costa brasileira, áreas de risco constante de contaminação. Ostras expostas a efluentes contendo esgoto doméstico na Baía Norte da Grande Florianópolis mostraram aumento na atividade da enzima catalase, um biomarcador clássico de contaminação aquática. Bibliotecas subtrativas em ostra, comparando local contaminado e referência, possibilitaram a identificação de 36 novos genes de interesse para estudos ecotoxicológicos em C. rhizophorae, alguns deles codificam proteínas possívelmente envolvidas em biotransformação de xenobiótico, metabolismo de lipídeo, defesa imune, estresse oxidativo e ligante de metais. No capítulo II, bibliotecas públicas de sequências nucleotídicas expressas (ESTs) foram pesquisadas a fim de identificar novos genes de citocromo P450 (CYP) em moluscos bivalves dos gêneros Mytilus (mexilhões) e Crassostrea (ostras). Um total de 113 sequências CYP foram encontradas, a maioria em M. californianus (58). A caracterização preliminar do sistema complemento CYP em M. californianus, mostra que assim como é observado em deuterostômios, há uma expansão do Clan 2 neste organismo. Sequências similares as famílias CYP1, CYP3 e CYP26 de vertebrados foram clonadas em M. edulis, e a expressão órgão-específica e indução por contaminantes para estes genes foram avaliadas. Os genes CYP1-like, similares a CYP1A, que é proposto há décadas como biomarcador para agonistas do receptor AHR em vertebrados, não foi induzida por estas substâncias em M. edulis. Interessantemente, genes CYP3-like e CYP26-like foram induzidos por beta-naftoflavona, o que indica que diferentes mecanismos de ativação gênica, e provavelmente de biotransformação, ocorra nos CYPs em moluscos, quando comparados às famílias CYP similares de vertebrados. Este é o primeiro estudo a mostrar a diversidade do sistema complemento CYP (mesmo que de forma preliminar); clonar genes CYP1-like, CYP3-like e CYP26-like; e caracterizar a expressão destes genes em um molusco bivalve. No capitulo III foram identificados três novos genes CYP1 no peixe-modelo ambiental Fundulus heteroclitus. O set completo de genes CYP1 de peixe (CYP1A, CYP1B1, CYP1C1, CYP1C2 e CYP1D1), mostraram diferentes padrões de distribuição órgão-específica e indução por PCB 126, o que permitiu a escolha das combinações órgão/CYP1 mais apropriadas para detecção de contaminantes agonistas do receptor AHR. Estudos em uma população de F. heteroclitus proveniente de um local historicamente contaminado por PCB mostrou diferenças na expressão de alguns desses novos genes que podem estar relacionadas à adaptação para viver nestes locais. Os genes mais apropriados para detecção de contaminantes agonistas do AHR (CYP1A, CYP1B1 e CYP1C1) também foram clonados no peixe Poecilia vivipara, e poderão servir como biomarcadores de contaminação aquática nesta espécie amplamente distribuída em ambientes contaminados da costa Brasileira. Este trabalho apresenta um estudo sobre a aplicabilidade da técnica óptica shearografia para caracterizar a localização e profundidade de defeitos em materiais compósitos. Foi desenvolvido através de experimentos controlados tendo como base conjuntos de corpos de prova contendo falhas artificiais quadradas, propositalmente introduzidas entre as lâminas de um material compósito fabricado com resina epóxi e fibras de vidro unidirecionais e cruzadas. Defeitos de diferentes tamanhos foram dispostos em diferentes profundidades ao longo da espessura do material. O principal tipo de carregamento utilizado foi do tipo vibracional associado às técnicas de Média-Temporal, com iluminação contínua do laser para se obter a resposta da amplitude de modulação através de franjas de interferência e à técnica com iluminação Estroboscópica de forma a conseguir mapas das diferenças de fases referentes à superfície analisada. Foram produzidos conjuntos de corpos de prova com e sem falha de adesão artificialmente provocada. As respostas em freqüência foram relacionadas às profundidades das diferentes falhas. As relações freqüência x profundidade apresentaram bom comportamento, conforme descrevem as bibliografias consultadas. Também foram comparados os resultados obtidos através do modelamento matemático com os obtidos experimentalmente. Os resultados alcançados neste trabalho são encorajadores e abrem as portas para novos estudos com outros tipos de falhas e materiais compósitos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T04:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 293478.pdf: 4302778 bytes, checksum: 611d76a72761188aacb1fd93c9c65820 (MD5) / A ecotoxicologia é um dos ramos da ciência que cada vez mais ganha relevância internacional por ter como objeto de estudo intoxicação ambiental em todas as suas nuances e consequências. A utilização de biomarcadores moleculares se destaca como uma das principais ferramentas ecotoxicológicas, por serem extremamente sensíveis e anteciparem efeitos gerados pela poluição. A ostra do Pacífico, Crassostrea gigas, é um invertebrado marinho que habita os ecossistemas costeiros (estuários), onde se encontra alta densidade demográfica e alta contaminação por efluentes domésticos. Esse bivalve representa um bioindicador de poluição ao responder à presença de xenobióticos pela variação de diversos biomarcadores. Um destes parâmetros são as enzimas citocromo P450 (P450), as quais podem participar tanto da via de biotransformação quanto na desregulação endócrina. Recentemente, foi identificada em C. gigas uma isoforma de P450, CYP356A1, grandemente induzida por esgoto doméstico não tratado. A sequência codificante para este gene foi determinada e clonada, e neste trabalho, utilizada para realização de expressão heteróloga, visando a produção de anticorpos policlonais. Estes seriam importantes no desenvolvimento de uma nova estratégia de avaliação de contaminação ambiental e contribuiriam para investigação da provável função biológica de CgCYP356A1, através de detecção imumológica. Imunodetecção é proposta como alternativa para estudos de proteínas com função desconhecida. Ensaios imunoquímicos com anticorpo anti- CgCYP356A1 mostraram um padrão com banda única, sem ocorrência de reações inespecíficas, corroborando a idéia de que esta metodologia poderá permitir avanços em estudos ecotoxicológicos com C. gigas e na caracterização bioquímica de CgCYP356A1. Nas análises de contaminação ambiental por imunodetecção, glândula digestiva teve uma quantidade de proteína significativamente maior depois de prolongada exposição in situ de C. gigas ao esgoto. O RNAm de CYP356A1 também foi avaliado, visando remontar o que poderia estar ocorrendo na célula, no que diz respeito a expressão desse gene, em resposta a xenobióticos, mas os resultados não foram muito conclusivos. Contudo, o método de análise aqui apresentado ampliam as perspectivas de estudo referentes a novos genes P450 identificados, especialmente CgCYP356A1, bem como o estabelecimento de novos biomarcadores.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-13T14:18:21Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 468813 bytes, checksum: 5f47861b9adc0a6469d64eae05091b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T14:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 468813 bytes, checksum: 5f47861b9adc0a6469d64eae05091b03 (MD5) Previous issue date: 2001-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho foram estudados os efeitos do Al sobre alguns aspectos da respiração e sobre a atividade de algumas enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e do processo fermentativo, em dois cultivares de milho, um sensível (AG 122) e outro tolerante (AG 5011) ao Al. As plântulas dos dois cultivares, cultivadas em solução nutritiva, pH 4,0, durante 3 dias, foram tratadas com Al (0 e 185 μM) durante 0, 12, 24, 48 e 72 h. Determinaram-se, então, o crescimento radicular, o teor de Al, a taxa respiratória e a atividade da rota citocromo e da rota alternativa em ápices radiculares. Em mitocôndrias, isoladas de plântulas tratadas ou não com Al, durante 72 h, determinaram-se o consumo de oxigênio nos estados 3 e 4, a relação ADP/O e o coeficiente de controle respiratório, na presença ou não de Al adicionado ao meio de reação. Em mitocôndrias isoladas de plântulas crescidas na ausência de Al determinou-se, também, o efeito do Al sobre a atividade de algumas enzimas ligadas à cadeia transportadora de elétrons, ao ciclo dos ácidos tricarboxílicos e ao processo fermentativo. O tratamento com Al resultou em redução do crescimento radicular nos dois cultivares, principalmente no cultivar sensível, tendo a diferença entre eles aumentada com o tempo de exposição a este elemento. O Al acumulou-se, predominantemente, no sistema radicular, mas os cultivares não diferiram entre si. A respiração total nos ápices radiculares destacados foi severamente reduzida na presença de Al e sua intensidade aumentou com o tempo de exposição das plantas, tendo o cultivar sensível sido, em geral, mais afetado. A atividade da rota citocromo nos ápices radiculares decresceu na presença de Al nos dois cultivares, especialmente no cultivar sensível. A atividade da rota alternativa decresceu, também, na presença de Al, mas apenas no cultivar sensível. O Al, de maneira geral, inibiu a respiração no estado 3 e o coeficiente de controle respiratório nas mitocôndrias isoladas de plântulas crescidas na presença de Al, tendo sido o cultivar sensível, em geral, mais afetado. O Al, aplicado apenas no meio de reação, praticamente não teve efeito significativo sobre a atividade mitocondrial. A única exceção ocorreu quando se utilizou o L-malato como substrato. Neste caso, na presença de Al, observou-se redução na atividade respiratória durante o estado 3 e da rota citocromo nos dois cultivares. Todas as variáveis de respiração analisadas, na presença de Al, foram mais elevadas no cultivar tolerante, exceto a relação ADP/O. As plântulas dos dois cultivares, crescidas na presença de Al, apresentaram as atividades das enzimas NADH e da succinato citocromo c oxidoredutase inibidas pelo Al. Sob esta condição, o cultivar tolerante apresentou maior atividade da NADH citocromo c oxidoredutase, mas não se observou diferença estatística entre os cultivares quanto à succinato citocromo c oxidoredutase. De modo geral, a absorção de fosfato por mitocôndrias, isoladas de plântulas crescidas na presença de Al ou naquelas preparações em que o Al foi adicionado apenas ao meio de reação, decresceu na presença de Al. A velocidade de inchamento mitocondrial reduziu com o aumento da concentração do Al no meio de reação, mas os dois cultivares não diferiram entre si. A atividade da desidrogenase do malato no extrato enzimático bruto decresceu na presença do Al, nos dois cultivares. Quando o Al foi adicionado apenas no meio de reação, a atividade da isoforma mitocondrial, contudo, não foi significativamente alterada nos dois cultivares. A atividade da fumarase aumentou na presença de Al, mas os cultivares não diferiram entre si. A atividade da desidrogenase alcoólica decresceu fortemente na presença de Al e o cultivar tolerante, independentemente da presença de Al, apresentou maior atividade do que o cultivar sensível. / The effects of Al on some aspects of the respiratory metabolism and on the activity of some enzymes of the tricarboxylic acid cycle and of the fermentative process in two corn cultivars, one Al-sensitive (AG 122) and other Al-tolerant (AG 5011) were studied. Seedlings of the two cultivars, grown in nutrient solution, pH 4,0, for 3 days, were exposed to Al (0 and 185 μM) for 12, 24, 48 and 72 h and the root growth, the Al content, the respiratory rate and the activities of the cytochrome and of the alternative pathway were determined in root apices. In isolated mitochondria of previously Al treated seedlings for 72 h, the oxygen uptake in the coupled and uncoupled state, the ADP/O ratio and the respiratory control ratio, in the presence or not of added Al to the reaction medium were determined. In isolated mitochondria from seedlings grown in the absence of Al, the effect of this ion on the activity of some enzymes of the electron transfer chain of the tricarboxylic acid cycle and of the fermentative process was also determined. Aluminum reduced the root growth in both cultivars, mainly in Al-sensitive cultivar, and the difference among them increased with the time of exposition to this ion. Aluminum accumulated, predominantly in the root system, but there was no statistical difference between cultivars. The total respiration in the root apices was severely reduced in the presence of Al and the reduction intensity increased with the time of exposition to Al and, generally, the Al-sensitive cultivar was more affected. The activity of the cytochrome pathway in the root apices decreased in the presence of Al in both cultivars, especially in Al-sensitive cultivar. The activity of the alternative pathway also decreased in the presence of Al, but only in the Al- sensitive cultivar. Generally, Al reduced the respiration rate in the coupled state and the respiratory control ratio in isolated mitochondria of seedlings grown in the presence of Al. The Al-sensitive cultivar, most of the time, was more affected than the Al-tolerant one. When added only to the reaction medium, Al practically did not have significant effect on the mitochondrial activity. The only exception occurred when the L-malate was used as substrate. In this case, it was observed a reduction on the respiration rate during the coupled state and on the activity of cytochrome pathway in both cultivars. In the presence of Al, all studied respiratory variables were higher in Al-tolerant cultivar, except the ADP/O ratio. When the seedlings were grown in the presence of Al, the activities of both NADH and succinate cytochrome c oxidoreductase were inhibited by Al. Under this condition, the Al-tolerant cultivar exhibited larger NADH cytochrome c oxidoreductase activity, but no statistical difference between cultivars was found with respect to succinate cytochrome c oxidoreductase activity. In general, the phosphate uptake by isolated mitochondria from seedlings previously treated with Al or just added to the reaction medium was reduced by Al. The mitochondrial swelling velocity reduced with the increase of Al concentration in the reaction medium, but the two cultivars did not show statistical difference. The malate dehydrogenase activity in the crude enzyme extract decreased in the presence of Al in both cultivars. The activity of the mitochondrial malate dehydrogenase isoform, however, in which Al was only added to the reaction medium, was not affected in both cultivars. The fumarase activity increased in the presence of Al, but there was no difference between cultivars. The alcoholic dehydrogenase activity was strongly reduced in presence of Al and the Al-tolerant cultivar, independent of the presence of Al, exhibited larger enzyme activity than the Al- sensitive cultivar. / Tese antiga

Made available in DSpace on 2012-09-05T18:24:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 316.pdf: 1405673 bytes, checksum: 442a2a93e9c2d02b5b4d40ef2bbfe3a1 (MD5) Previous issue date: 2008 / (...) O objetivo deste estudo é fornecer informações para essas lacunas. Nós investigamos a cinética do antimoniato de meglumina (AM) em macacos Rhesus; avaliamos a transferência para o leite materno e lactentes quando ratas lactantes foram tratadas com AM; e estudamos a expressão e atividade de citocromos P450 (CYP) hepáticos em ratos machos tratados com AM. Macacos Rhesus foram tratados com injeções diárias intramusculares durante 21 diasconsecutivos e os níveis de antimônio no sangue, durante e após o tratamento, foram determinados. Níveis de antimônio residual (24 ou 48 horas) após a última injeção foram maiores em hemácias que no plasma. Tireóide, fígado, baço, vesícula, pulmões, pele e rins apresentaram níveis detectáveis de antimônio 60 dias após o fim dotratamento. Níveis detectáveis de antimônio foram encontrados no leite materno de ratas Wistar tratadas por via subcutânea com AM. As ninhadas das mães tratadas também apresentaram níveis detectáveis de Sb, sugerindo que o antimônio é transferido para o leite e absorvido pelos filhotes. Ratos machos adultos foram tratados com AM (300 mgSbV/ kg peso corpóreo/dia por via subcutânea) ou apenas com o veículo, durante 20 dias. As atividades de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD), benziloxiresorufina-Odesbenzilase(BROD) erithromicina N-desmetilase (END) (marcadores de CYP1A1/2,CYP2B1/2 e CYP3A, respectivamente) estavam diminuídas nos microssomos hepáticos de ratos tratados com AM. Uma vez que as atividades de N-nitrosodimeilamina desmetilase (NDMA) e anilina 4-hidroxilase (A4H), marcadores de CYP2E1, estavamdiminuídas e a de p-nitrofenol-hidroxilase (PNPH) estava aumentada, sugerimos que a PNPH no fígado de ratos seja catalisada não somente CYP2E1, mas outras isoformas deCYP. As alterações encontradas e os resultados de immunoblotting e PCR real-time sugerem que o tratamento com AM altera as atividades de CYP através de mecanismos pós-traducionais.