Friedreich ataxia (FRDA) is a recessive human disease of central and peripheral nervous system that affects children and young adults. FRDA is a peripheral neuropathy characterized by a initial degeneration of the large neurons of the dorsal root ganglia (DRG) or proprioceptive neurons. Most of the patients with FRDA have a homozygous guanine-adenine-adenine (GAA) expansion within the first intron of the gen that codifies for a small mitochondrial protein, frataxin (FXN). This mutation leads to a reduction of frataxin expression in all human cells, which produces changes in both the cell and mitochondrial physiology, resulting in a dysfunction of the mitochondrial energetic metabolism linked to the increase of oxidative stress and calcium dyshomeostasis. These cellular proceses are tightly related with the regulation of the actin and microtubule cytoskeletons and with vesicle trafficking. Here, we show how the absence of frataxin in the mouse models YG8R and YG8sR affects the axonal cytoskeleton of adult sensory neurons. Changes of actin and microtubule cytoskeletons and the failure of Ca 2+ signaling induce alterations of dynamics growth cones of sensory neurons, which in turn produce a reduction of their capacity to grow and regenerate their axons. This study shows how these events can lead to the neurodegeneration in Friedreich's ataxia. / La Ataxia de Friedreich (FRDA) es una enfermedad autosómica recesiva del sistema nervioso central y periférico que afecta a niños y adultos jóvenes. Esta neuropatía sensitiva está caracterizada por una degeneración primaria de las neuronas sensitivas largas del ganglio dorsal (DRG). En la mayoría de los pacientes con FRDA, la mutación consiste en una expansión homocigota del trinucleótido guanina-adenina-adenina (GAA) en el intrón 1 del gen que codifica para una proteína mitocondrial, la frataxina (FXN). La consecuencia de la mutación es la deficiencia de la frataxina, lo cual condiciona cambios en la fisiología mitocondrial y celular, teniendo como resultado una disfunción del metabolismo energético mitocondrial asociado con el incremento del estrés oxidativo en la célula y a una alteración de la homeostasis del calcio. Estos procesos están estrechamente relacionados con la regulación del citoesqueleto de actina, microtúbulos, y con el tráfico de vesículas. En este trabajo de tesis se demuestra cómo la estabilidad del citoesqueleto axonal de las neuronas sensitivas de dos modelos murinos YG8R e YG8sR están afectados debido a la falta de frataxina. Cambios en el citoesqueleto de actina y microtúbulos, unido al fallo en la señalización por Ca 2+ provocan una alteración en la dinámica de la forma del cono de crecimiento, disminuyendo el crecimiento y la regeneración axonal y afectando a la guía axonal en las neuronas sensitivas adultas. Este estudio muestra cómo estos eventos conducen a la neurodegeneración en la ataxia de Friedreich. / L'Ataxia de Friedreich (FRDA) és una malaltia autosómica recessiva del sistema nerviós central i perifèric que afecta a xiquets i adults joves. Aquesta neuropatia sensitiva ve caracteritzada per una degeneració primaria de les neurones sensitives llargues del gangli dorsal (DRG). En la majoria dels pacientes de FRDA la mutació consisteix en una expansió homozigòtica del trinucleòtid guanina-adenina-adenina (GAA) en l'intró 1 del gen que codifica per a la proteïna mitocondrial frataxina (FXN). La conseqüència d'aquesta mutació és la deficiencia de frataxina, aquest fet condiciona canvis en la fisiologia mitocondrial i cel.lular, tenint com a resultat una disfunció del metabolisme energètic mitocondrial associat a l'increment de l'estrés oxidatiu en la cèl.lula i una alteració de la homeòstasi del calci. Aquestos processos estàn íntimament relacionats amb la regulació del citoesquelet d'actina, microtúbuls i el tràfic de vesícules. En aquest treball de tesi doctoral es mostra com l'estabilitat del citoesquelet axonal de les neurones sensitives de dos models murins YG8R i YG8sR es troben afectats a causa de la deficiencia de frataxina. Canvis en el citoesquelet d'actina i microtúbuls, juntament a la fallida en la senyalitzación per Ca2+ provoquen una alteració en la dinámica de la forma del con de creixement, disminuint-lo junt amb la regeneració axonal i afectat la guia axonal en les neurones sensitives adultes. Aquest estudi posa de manifest com aquestos events condueixen a la neurodegeneració en la ataxia de Friedreich. / Muñoz Lasso, DC. (2017). Fisiopatología de la ataxia de Friedreich: Transporte y degeneración axonal [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/92842 / TESIS

Orientador: Classius de Oliveira / Resumo: Peixes e anfíbios estão vulneráveis a diversos poluentes. O benzo[a]pireno (BaP) é um contaminante com propriedades tóxicas. Metabolizado pela enzima P450 (CYP1A1), de fase I EROD (Etoxiresorufina-O-deetilase), produz subprodutos tóxicos. Conhecida como um inibidor da CYP1A1, α-naftoflavona (aNF) impede o metabolismo do BaP e a geração de metabólitos tóxicos. A aNF é um composto exógeno e não se tem conhecimento do efeito dela em órgãos e tecidos. O fígado é a maior fonte de enzimas catalizadoras de reações de biotransformação. A suscetibilidade do órgão a danos por agentes químicos é uma conseqüência de seu papel no metabolismo. Porém, animais desenvolveram mecanismos para detectar e responder a esses produtos químicos. Melanomacrófagos (MMs) hepáticos são células que contém melanina e que estão envolvidos nesse processo, devido a sua função de detoxificação. Dessa forma, nossos objetivos foram avaliar os efeitos do BaP e/ou aNF nos MMs e efeitos genotóxicos dos compostos. Os animais foram expostos a 2mg/kg de BaP e/ou 20mg/kg de aNF por 48 horas e 7 dias. Após os experimentos o fígado passou por procedimentos histológicos para quantificação da área de melanina dos MMs e fagocitose na microscopia de luz; microscopia de fluorescência para análise do citoesqueleto dos MMs; espectrofotometria para quantificar a atividade EROD e síntese de melanina dos MMs; e análise genotóxica dos eritrócitos. Em peixes, após 7d houve diminuição da área de melanina, devido a uma inibição do BaP... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fish and amphibians are vulnerable to various pollutants. Benzo[a]pyrene (BaP) is a contaminant with toxic properties. Metabolized by the enzyme P450 (CYP1A1) produces toxic byproducts. Known as a CYP1A1 inhibitor, α-naphtoflavone (aNF) prevents BaP metabolism and the generation of toxic metabolites. aNF is an exogenous compound and is not known for its effect on organs and tissues. The liver is the major source of catalyzing enzymes for biotransformation reactions. The susceptibility of the organ to damage by chemical agents is a consequence of its role in metabolism. However, animals have developed mechanisms to detect and respond to these chemicals. Melanomacrophages (MMs) are involved in this process due to their detoxification function. Thus, our objectives were to evaluate the effects of BaP and/or aNF on MMs and genotoxic effects of compounds. The animals were exposed to 2mg/kg BaP and/or 20mg/kg aNF for 48 hours and 7 days. After the experiments, the procedures for light microscopy, fluorescence, spectrophotometry and genotoxic analysis were followed. In fish, after 7d there was a decrease in melanin area, due to a inhibition of BaP in the melanogenic pathway; melanosome aggregation by interference in actin filaments; and increased frequency of micronucleus by the genotoxic potential of the compound. In anurans, at 48h, there was an increase in melanin production in BaP treatments, due to the antioxidant role of melanin; decreased phagocytosis by interfering with this... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. / The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells

A proteína de matriz do Virus Respiratório Sincicial humano foi o foco deste trabalho. Verificamos que o gene de matriz possui sítios internos de poliadenilação, sinais de instabilidade de RNA, baixo índice de adaptação de codons (CAI) e conteúdo GC, que podem impedir a expressão gênica vitro. Quando clonado sob controle do promotor de CMVie, o gene selvagem não apresenta expressão detectável, enquanto um gene sintético com a sequência do gene de matriz otimizada apresenta altos níveis de expressão em células transfectadas. Esse alto nível de expressão permitiu a confirmação da presença da proteína M no núcleo no início de sua expressão, por análise em microscopio confocal de varredura a laser, além de sua associação a membranas em regiões conhecidas como lipid rafts. Também foi observado que a proteína M é capaz de associar à proteína tropomiosina. Ainda foram analisados os possíveis domínios funcionais através de expressão de variantes da proteína M com deleções de trechos da proteína. Finalmente foi analisada a capacidade de indução de resposta imune. / The Human Respiratory Syncytial Vírus was the focus of this work. We found that matrix gene has internal polyadenilation sites, RNA instability motifs, low codon adaptation index (CAI) and GC content, that may impair its expression in vitro. When cloned under control of the ieCMV promoter, the wild-type M gene expression was not detectable, whereas a synthetic optimized matrix gene was highly expressed in transfected cells. This high level of expression made possible to follow M nuclear localization in the beginning of its expression by confocal laser scanning microscopy, and its association with membranes in regions known as lipid rafts. It has also been found that the matrix protein associates with tropomyosin. It was further analyzed the possible functional through expression of deviations of the M protein that lack portions of the protein. Finally it was analyzed its capacity to induce an immune response.

O mecanismo de formação e origem das alterações nucleares ainda é pouco conhecido, sendo o micronúcleo a mais estudada. As células tumorais geralmente apresentam vários tipos de alterações nucleares que estariam associadas à instabilidade genética. O objetivo deste trabalho foi analisar as possíveis associações entre alterações nucleares e citoesqueleto em células HK2 e A549, derivadas de carcinoma de pulmão humano. Otimizamos a metodologia de uso do MCVL para redefinir as alterações nucleares e caracterizar os principais filamentos do citoesqueleto em preparações coradas por Feulgen ou imunofluorescência. As células da linhagem HK2 apresentaram fibras de actina dispostas concentricamente e em "clusters" e os filamentos de tubulina apareceram de forma radial, enquanto que o padrão de distribuição em A549 foi mais semelhante ao das células normais (BRL3A). Os filamentos de lamina B foram os mais importantes para evidenciar as alterações nucleares, porém essas alterações não puderam ser relacionadas com alterações do citoesqueleto. / The origin and mechanism of formation of the nuclear alterations is largely unknown, with the micronucleus being the most well studied alteration. Tumor cells generally present various types of nuclear alterations witch can be associated with genetic instability. The propose of this study was to analyze the possible association between nuclear alterations and the cytoskeleton in the human lung carcinoma cells HK2 and 549. The method of LSM was optimized to redefine the nuclear alterations and to characterize the principal cytoskeletal filaments in preparations stained with Feulgen’s reagent or submitted to imunofluorescent methods. The HK2 cells presented actin fibres arranged either concentrically or in clusters and tubulin filaments arranged radially, while in the A549 cells the distribution pattern was similar to that of normal cells (BRL3A). The lamin B filaments were the most important to identify nuclear alterations, as these alterations could not be related to cytoskeletal alterations.

Infecções por Plasmodium sp. podem levar a um quadro respiratório grave, com complicações pulmonares denominadas lesão pulmonar aguda e síndrome do desconforto respiratório agudo (LPA/SDRA). Inflamação aguda, lesão do endotélio alveolar e do parênquima pulmonar, disfunção e aumento da permeabilidade da barreira alvéolo-capilar e, consequente, formação de edema, caracterizam esta síndrome. O modelo experimental, que utiliza o parasita murino Plasmodium berghei ANKA e camundongos da linhagem DBA/2, é empregado no estudo de mediadores imunológicos e fatores que propiciam o estabelecimento das lesões pulmonares associados à LPA/SDRA. Diversos estímulos podem atuar diretamente no aumento da permeabilidade endotelial por meio da desestabilização dos microtúbulos, rearranjo dos microfilamentos de actina e contração das células endoteliais, via sinalização de Rho-GTPases, causando disfunção da barreira endotelial. Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar as alterações do citoesqueleto em células endoteliais primárias pulmonares de camundongos DBA/2 (CEPP-DBA/2), as vias de sinalização das principais Rho-GTPases e o estresse oxidativo, causados pela presença de eritrócitos parasitados com esquizontes de P. berghei ANKA (EP-PbA). As CEPP-DBA/2 foram estimuladas com TNF, VEGF ou IFN&#947;, em diferentes tempos de exposição, seguido da incubação com EP-PbA. Assim, foram realizados ensaios de imunofluorescência para análise do rearranjo de microfilamentos de actina e da desestabilização de microtúbulos. As vias de sinalização das Rho-GTPases foram avaliadas por Western blot, para as expressões proteicas de RhoA, Cdc42 e MLC. Além disso, ensaio fluorométrico foi realizado para detectar a produção de espécies reativas de oxigênio, resultantes do estímulo com eritrócitos parasitados. CEPP-DBA/2 estimuladas por EP-PbA, VEGF, TNF ou IFN&#947;, em associação ou não, apresentaram alterações morfológicas nos microfilamentos de actina e aumento dos espaços interendoteliais. Imagens de imunofluorescência também mostram desestabilização de microtúbulos e desfosforilação de FAK, causadas por EP-PbA. Os ensaios de permeabilidade validam que os eritrócitos parasitados com formas maduras de P. berghei induziram aumento da permeabilidade microvascular nas CEPP-DBA/2. Além disso, estas células, estimuladas com EP-PbA, demonstraram elevada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que pode estar contribuindo com o desenvolvimento de estresse oxidativo e com a injúria endotelial, assim como, com o aumento da permeabilidade vascular. O mais interessante é que estas alterações endoteliais podem estar relacionadas ao aumento da razão RhoA/Cdc42, da expressão proteica de MLC fosforilada e do sinal de ativação de RhoA. Em conjunto, estes resultados mostram envolvimento dos eritrócitos parasitados com esquizontes de Plasmodium berghei ANKA na desorganização do citoesqueleto e na disfunção da barreira alvéolo-capilar, via RhoA/Rho-kinase, o que pode estar contribuindo com a patogênese da LPA/SDRA associada à malária. / Infections by Plasmodium sp. can lead to a serious respiratory condition with pulmonary complications, named acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS). Acute inflammation, alveolar endothelium and lung parenchyma injuries, dysfunction and increased permeability of the pulmonary alveolar-capillary barrier and consequent formation of edema characterize this syndrome. Several stimuli can directly increase endothelial permeability through actin microfilaments rearrangement, via Rho- GTPases signaling, leading to endothelial barrier dysfunction. DBA/2 mice infected with Plasmodium berghei ANKA develop ALI/ARDS similar to that observed in humans. The purpose of this research was to assess cytoskeletal changes in DBA/2 mice primary microvascular lung endothelial cells (PMLEC), verify the signaling pathways of the Rho- GTPases and analyze the oxidative stress on these cells in the presence of P. berghei ANKA-infected red blood cells (PbA-iRBC). PMLEC were stimulated by TNF, VEGF or IFN&#947; followed by incubation with PbA-iRBC. Immunofluorescence assays were performed to analyze actin microfilaments rearrangement and microtubules destabilization. Western blot for RhoA, Cdc42 and MLC proteins were conducted to assess alterations in signaling pathways of Rho-GTPases. In addition, a fluorimetric assay was performed to detect the production of reactive oxygen species resulting from PbA-iRBC stimulus. P. berghei ANKA, VEGF, TNF and IFN&#947; stimuli, in association or not, caused morphological disturbances in actin microfilaments of PMLEC and an increase of intercellular spaces. Moreover, immunofluorescence images showed microtubules destabilization and FAK dephosphorylation in these cells, caused by PbA-iRBC. The permeability assay showed that PbA-iRBC induced an increase of microvascular permeability in PMLEC. In addition, PMLEC stimulated by PbA-iRBC, showed elevated production of ROS, which may be contributing to oxidative stress and increasing the damage of endothelial cells, as well as an increase of vascular permeability. Interestingly, these endothelial changes may be related to the increased RhoA/Cdc42 protein expressions ratio, augmented protein expression of phosphorylated MLC and RhoA activation signal. Taken together, these data demonstrate the involvement of P. berghei ANKA-infected red blood cells in cytoskeleton disorganization and alveolar-capillary barrier dysfunction, through of RhoA / Rho-kinase signaling pathway, which may contribute to ALI/ARDS pathogenesis.

O T3 aumenta a poliadenilação e estabilidade do GH mRNA. O citoesqueleto (Cy) participa da estabilidade e tradução de mRNAs, pois fatores, como o EF 1a, ligam alguns transcritos a ele, aumentando sua estabilidade e tradução. Cy também participa dos processos secretores celulares. Observamos que no hipotiroidismo (Tx), há um desarranjo do Cy nos somatotrofos que é revertido pela administração aguda de T3. Neste estudo avaliamos a ligação do EF 1a e do GH mRNA ao Cy e, deste aos polissomos, na hipófise, e a expressão do IGF-I mRNA hepático, em ratos controle e Tx tratados com T3 ou salina, e sacrificados após 30 min. Observamos redução da F-actina, da ligação do EF 1a e GH mRNA a ela, do GH mRNA nos polissomos, e da expressão de IGF-I mRNA hepático, nos ratos Tx, o que indicou redução da síntese e secreção do GH. A administração de T3 estimulou esses processos, aumentando a estabilidade, tradução do GH mRNA e a secreção de GH, o que ocorreu em paralelo ao rearranjo do Cy, indicando uma ação não genômica do T3. / T3 increases GH mRNA poly-A tail and stability. Cytoskeleton (Cy) plays a part on mRNA stability and translation, since factors, like EF 1a, can bind some transcripts to it, improving stability and translation efficiency. Cy is also involved in cellular secretory process. We showed that somatotropes Cy is disrupted in hypothyroidism (Tx), and rearranged by acute T3 treatment. In this study we investigated the binding of EF 1a and GH mRNA to Cy and of GH mRNA to polysomes in pituitary, as well as the liver IGF-I mRNA content, in control and Tx rats treated with T3 or saline, and killed 30 min thereafter. We observed that Tx reduced F-actin content, EF 1a and GH mRNA binding to it, GH mRNA recruitment to polysomes, in pituitary, and IGF-I mRNA expression in liver, which indicates that GH synthesis and secretion are impaired. Acute T3 treatment stimulated all these process, indicating that stability, translation of GH mRNA and GH secretion were restored. These events occurred in parallel to the Cy rearrangement, which strongly indicates a non genomic effect of T3.

A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, estes biomateriais sofrem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com sua superfície, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto. O objetivo deste estudo foi avaliar se as alterações no padrão de marcação para as proteínas citoesqueléticas actina e tubulina observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Células osteogênicas foram obtidas a partir da digestão enzimática de calvárias de ratos Wistar recémnascidos e plaqueadas sobre superfícies de Bioglass® 45S5, Biosilicato® e borosilicato (controle bioinerte) para a avaliação dos seguintes parâmetros: 1) detecção de actina e tubulina por microscopia de fluorescência; 2) expressão de RNAm para actina e tubulina por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real time PCR); 3) quantificação de actina e tubulina por ensaio imunoenzimático direto (ELISA), e 4) análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Aos 3 e 7 dias, células crescidas sobre borosilicato exibiam padrões de marcação para actina e tubulina típicos de células aderidas e espraiadas sobre substratos planos in vitro, enquanto que sobre Bioglass® 45S5 e Biosilicato® as células apresentavam áreas circulares destituídas de marcação para essas proteínas. Nos mesmos períodos, culturas crescidas sobre os materiais bioativos apresentavam alterações significantes da expressão de RNAm para actina e tubulina, embora fossem observadas apenas discretas variações na quantidade das proteínas correspondentes em relação ao borosilicato. Além disso, apenas para culturas crescidas sobre borosilicato observava-se correlação positiva entre RNAm e proteína e correspondência entre as observações por epifluorescência e os dados quantitativos. Aos 3 dias, imagens de MEV revelaram células aderidas e espraiadas sobre os materiais bioativos, parcial ou totalmente recobertas por acúmulos de material de aspecto semelhante ao da topografia do substrato, por vezes impedindo a visualização dos limites celulares. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as superfícies bioativas de Bioglass® 45S5 e Biosilicato® afetam a expressão de RNAm para actina e tubulina, mas não de proteína. Assim, as alterações nos padrões de marcação por fluorescência para essas proteínas devem ser atribuídas, pelo menos em parte, a acúmulos de material sobre as células, possivelmente decorrentes das reações de superfície a que estão submetidos Bioglass® 45S5 e Biosilicato® quando em contato com fluidos biológicos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been successfully applied in various therapeutic strategies to promote the formation of mineralized matrix in bone defects. The exposure of these materials to biological fluids results in chemical and topographical modifications that may affect the interactions of cells with the biomaterial surface, with potential effects on cytoskeletal protein expression and/or organization and cell spreading. The aim of the present study was to evaluate whether changes in the labelling pattern for the cytoskeletal proteins actin and tubulin in osteogenic cells cultured on bioactive Bioglass® 45S5 and Biosilicate® are due to altered mRNA and protein expression levels. Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn Wistar rat calvarial bone and plated on Bioglass® 45S5, Biosilicate® and borosilicate (bioinert control) for periods of up to 7 days. The following parameters were assayed: i) qualitative epifluorescence analysis of actin and tubulin distribution; ii) quantitative mRNA expression for actin and tubulin by real time polymerase chain reaction (real time PCR); iii) quantitative actin and tubulin expression by enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA), and iv) qualitative analysis of cell morphology by scanning electron microscopy (SEM). At days 3 and 7, cells grown on borosilicate showed typical actin and tubulin labeling patterns of adherent and spread cells on flat, rigid substrates, whereas those on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® showed dark areas devoid of fluorescent signals for the cytoskeletal proteins. At the same time points, cultures grown on the bioactive materials showed significant changes in mRNA expression for actin and tubulin, although only slight differences in the amount of actin and tubulin were detected compared with borosilicate. Moreover, a positive correlation between mRNA and protein expression levels as well as a correspondence between epifluorescence imaging and the quantitative data were only detected for cultures grown on borosilicate. SEM analysis revealed that cells cultured on bioactive surfaces were partly or totally covered with material accumulations, whose characteristics resembled the ones for the substrate topography, and which, in some cases, prevented the visualization of the cell limits. In conclusion, Bioglass® 45S5 and Biosilicate® affect actin and tubulin mRNA levels, but not the corresponding protein expression, in osteogenic cell cultures. Thus, the observed changes in the labeling pattern for these proteins should be attributed, at least in part, to the accumulation of materials on the cell surface, likely due to substrate reactions that take place on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® when exposed to the cell culture medium.

No processo de metástase os movimentos de migração e invasão tem um papel essencial e em ambos a função dos microfilamentos é de grande importância. Neste contexto, o presente trabalho buscoui analisar os efeitos da droga jaspamídeo e após a determinação das concentrações de IC50 para as linhagens HT144 e NGM foram estudados os efeitos da droga. Os tratamentos mostraram que o fármaco atua desorganizando o citoesqueleto de modo dependente de sua concentração. Os ensaios de ferida mostraram diminuição da taxa de fechamento da área livre após os tratamentos e os ensaios de migração com placas de transwell mostraram que os grupos tratados sofrem aumento desse parâmetro. Nos ensaios de invasão com câmara de Boyden o tratamento mostrou-se efetivo apenas para a célula NGM quando tratadas com 75 nM de jaspamídeo e 30 <font face=\"Symbol\">mM de Y-27632. Quanto à migração, a linhagem NGM não completava este processo quando tratada com as concentrações do IC50 e do IC50/2 acrescido de Y-27632 e a linhagem HT144 apresenta aumento deste parâmetro quando tratado com jaspamídeo e 200 <font face=\"Symbol\">mM de NSC23766. / Many signaling ways are involved in metastasis and the cellular migration and invasion are important in this context. The role of microfilaments is essential in mesenchymal and amoeboid migration. In this context, the present work aimed to analyze the effects of the drug jaspamide and. after the determination of the IC50 concentrations for the HT144 and NGM cell lines, the effects of the treatment with jaspamide were studied. The wound assays indicated a decrease in the free area after the treatments, and the migration assays with transwell showed that, after the inoculation with the drug, the cells increased the process of migration. In the invasion assays with Boydens chamber, the treatment with jaspamide was effective only in NGM cells, when they are treated with 75 nM of the drug plus 30 <font face=\"Symbol\">mM of Y-27632. Regarding the migration process, the NGM cell line did not show movement when treated with the IC50 concentration and the IC50/2 concentration plus Y-27632, and the HT144 cell line increases this parameter when treated with jaspamide and 200 <font face=\"Symbol\">mM of NSC23766.

Muitas evidências indicam que a tumorigênese em humanos é um processo com várias etapas. A progressão de um tumor em direção a malignidade ocorre de maneiras muito distintas entre os diferentes tipos de câncer. Entender os processos celulares que levam a tumorigênese é importante para se delinear tratamentos mais adequados contra os diversos tipos de câncer. Drogas antimitóticas (ou venenos de fuso) são utilizadas no tratamento de alguns cânceres, e entre eles está o câncer de mama. A ação dessas drogas reside sobre a mitose, e têm como alvo os fusos mitóticos, estruturas essenciais que dirigem o ciclo celular na divisão das células. Recentemente, pesquisadores têm delineado possíveis respostas da célula aos venenos de fuso, e essas respostas são dependentes da concentração da droga. Baixas concentrações de venenos de fuso provocam o aparecimento de populações celulares aneuplóides, que ocorrem quando a célula sai do bloqueio mitótico. O presente trabalho utilizou as drogas vincristina e paclitaxel sobre linhagens celulares de mama humana (células normais e tumorais) para pesquisar se as drogas são capazes de induzir células aneuplóides. Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que baixa concentração de vincristina e paclitaxel pode induzir o aparecimento de população aneuplóide através de mitoses aberrantes. Os venenos de fuso induzem a formação de mitoses contendo múltiplos fusos mitóticos, e essas mitoses não ficam bloqueadas, dando origem a células aneuplóides. O papel da aneuploidia na tumorigênese não foi ainda estabelecido, mas indiferente da sua importância no desenvolvimento do tumor, encontrar maneiras de inibir sua formação ou de super induzir seu aparecimento podem ter implicações significativas para as terapias contra o câncer. / Several lines of evidence indicate that tumorigenesis in humans is a multistep process and that these steps reflect genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into highly malignant derivatives. Understanding the cellular processes that lead to tumorigenesis is important to devise more appropriate treatments against various types of cancer. Antimitotic drugs are used in the treatment of some cancers, and among them is breast cancer. The action of these drugs lies on the mitotic spindles, essential structures that drive the cell cycle in the division of cells. Recently, researchers have outlined possible responses to the antimitotic drugs on cells, and these responses are dependent on the concentration of the drug. Low concentrations of drugs can cause the appearance of aneuploid population, which occur when a cell leaves the mitotic block. This study used the drug vincristine and paclitaxel on human breast cancer cell lines (normal and tumoral cells) to find if the drugs are capable of inducing cell aneuploidy. The results of this study indicate that low concentration of vincristine and paclitaxel can induce the emergence of aneuploidy population through aberrant mitosis. The drugs induce the formation of mitosis containing multiple mitotic spindles, resulting in aneuploidy population of cells. The role of aneuploidy in tumorigenesis has not yet been established, but indifferent to this is important find ways to inhibit its formation or the super-induce their appearance. These questions may have significant implications for therapies against cancer.