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\"Enyalius (Leiosauridae, Squamata): o que os dados moleculares e cromossômicos revelam sobre esse gênero de lagartos endêmico do Brasil\" / Enyalius (Leiosauridae, Squamata): molecular and chromosomal data of this endemic genus of lizards from BrazilBertolotto, Carolina Elena Viña 06 November 2006 (has links)
Estudos citogenéticos e moleculares realizados em 116 exemplares de lagartos do gênero Enyalius, provenientes de 58 localidades do Brasil, revelam grande variação cariotípica (2n=36 a 2n=46) e significativa diversidade de espécies. Segundo a última grande revisão, o gênero Enyalius estaria composto por seis espécies, duas delas politípicas: E. bilineatus, E. brasiliensis (E. b. boulengeri e E. b. brasiliensis), E. catenatus (E. c. catenatus, E. c. bibroni e E. c. pictus), E. iheringii, E. leechii e E. perditus. A partir de reconstruções filogenéticas utilizando seqüências combinadas de regiões parciais dos genes mitocondriais cyt b, ND4 e16S e do gene nuclear c-mos, com os métodos de máxima parcimônia, máxima verossimilhança e inferência bayesiana, é proposta uma hipótese filogenética para o gênero. Dois grandes clados são observados: clado 1 composto pelas espécies E. brasiliensis, E. iheringii e E. perditus e o clado 2 formado por E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. leechii, E. pictus e três novas espécies. Delimitando geograficamente a ocorrência desses 2 clados está o Rio Doce: ao sul deste está o clado 1 e ao norte, o clado 2. Os rios Jequitinhonha e o Rio São Francisco também delimitam a ocorrência das espécies E. pictus e E. catenatus, respectivamente. De acordo com essa filogenia molecular, associada a dados morfológicos, o gênero Enyalius está composto de, pelo menos, 11 espécies, considerando as subespécies de E. catenatus como espécies válidas e as populações de Mucugê (BA), Serra da Jibóia (BA) e Ibateguara e São José da Laje (AL) como três espécies novas. Resultados cariotípicos inéditos são apresentados para duas espécies deste gênero: E. pictus (2n=36, 12M+24m) e a espécie nova de Mucugê (BA), com o surpreendente número diplóide 2n=46, 22M+24m. Este cariótipo é muito distinto da maioria das espécies de Enyalius, sendo composto por 22 macrocromossomos acrocêntricos e 24 microcromossomos. / Cytogenetic and molecular studies were performed in 116 lizard of the genus Enyalius, from 58 localities of Brasil. A large karyotype variability with diploid number ranging from 2n=36 to 2n=46 and a conspicuous diversity of species were detected. Based on the last major revision on the genus, six species, two of the them with subspecies, were recognized: E. bilineatus, E. brasiliensis (E. b. boulengeri and E. b. brasiliensis), E. catenatus (E. c. catenatus, E. c. bibroni and E. c. pictus), E. iheringii, E. leechii and E. perditus. Here, a molecular phylogeny was reconstructed for the genus using mitochondrial (cytochrome b, ND4 and 16S) and nuclear (c-mos) DNA sequences. Maximum parsimony and maximum likelihood criteria, as well as Bayesian analyses, were carried out on separate and combined sequences. According to this hypothesis, the species of Enyalius are grouped into two major clades: clade 1 assembling E. brasiliensis, E. iheringii and E. perditus, and clade 2 that includes E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. leechii, E. pictus and three new species. The geographical distribution of these two clades coincides with the limits of Rio Doce at south (clade 1) and north (clade 2). The Jequitinhonha and São francisco rivers also delimit the occurrence of E. pictus and E. catenatus respectively. Based on our phylogenetic hypothesis and morphological data, we propose that the genus Enyalius is actually comprised of, at least, 11 species. Chromosomal results for two species are here described for the first time: E. pictus (2n=36, 12M+24m) and a new species from Mucugê (BA) that present a surprising diploid number 2n=46, 22M+24m. This karyotype with 2n=46 formed by 22 acrocentric macrochromosomes is very distinct from those found in most species of the genus.
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Uso do Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A) na investigação de alterações citogenéticas em pacientes com síndromes mielodisplásicas / Use of Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A) in the investigation of cytogenetics abnormalities in patients with myelodysplastic syndromesSilva, Fernanda Borges da 01 November 2016 (has links)
As síndromes mielodisplásicas (SMD) constituem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas de origem clonal, caracterizado por hematopoese ineficaz, citopenia e risco de evolução para leucemia mieloide aguda (LMA). As anormalidades citogenéticas adquiridas são marcadores prognósticos bem estabelecidos em SMD. No entanto, a técnica de citogenética metafásica apresenta limitações, incluindo baixa resolução e necessidade de divisão celular, sendo que defeitos cromossômicos podem não ser detectados. Tecnologias baseadas em microarranjo (array) de DNA, como o Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A), são importantes para avaliação do genoma normal e neoplásico. O SNP-A foi desenvolvido para o estudo de todo o genoma, apresenta uma resolução superior a citogenética metafásica convencional, pode ser realizado em células na interfase, e detecta alterações cromossômicas não visualizadas pela citogenética metafásica. Além disso, o SNPA fornece dados de genotipagem para detecção de perda neutra de heterozigose, também denominada de dissomia uniparental somática. Regiões cromossômicas com deleção, perda neutra de heterozigose ou ganho são comuns em pacientes com neoplasias hematológicas e sugeriu genes candidatos a supressores de tumor e oncogenes. O objetivo do presente estudo foi a caracterização da coorte de pacientes com suspeita clínica de SMD e o uso integrado do método de citogenética convencional e SNP-A no serviço de hematologia da nossa instituição na investigação de alterações citogenéticas em pacientes com SMD e doenças relacionadas. Durante o período do estudo, foram recebidas um total de 114 amostras de pacientes com suspeita clínica de SMD. A análise clínica, morfológica e citogenética permitiu confirmar o diagnóstico de SMD ou doenças relacionadas em 43 pacientes (SMD [n=34], SMD/NMP [n=5], LMA com alterações mielodisplásicas [n=4]). Vinte e um pacientes foram classificados como citopenia idiopática de significado indeterminado (CISI) e 50 indivíduos apresentaram outros diagnósticos. SNP-A foi realizado em 17 pacientes com SMD e doenças relacionadas. Dentre os pacientes selecionados para o SNP-A, anormalidades cromossômicas foram observadas em 6/17 (35%) casos pelo cariótipo convencional e em 8/17 (47%) casos pela técnica de SNP-A. SNP-A não detectou quatro alterações cromossômicas previamente identificadas pela citogenética convencional: duas translocações balanceadas e duas alterações numéricas. SNP-A confirmou os demais achados identificados pela citogenética convencional e detectou um total de 32 novas lesões (1 ganho, 19 perdas e 12 UPDs) em 6 pacientes com SMD ou doenças relacionadas. SNP-A pode complementar a citogenética convencional na detecção de anormalidades cromossômicas em neoplasias mieloides. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of clonal hematopoietic diseases, characterized by inefficient hematopoiesis, peripheral blood cytopenias and a risk to progress to acute myeloid leukemia (AML). Acquired chromosomal abnormalities have prognostic value in MDS. However, metaphase cytogenetics has some limitations including low resolution and the requirement of cell division, and chromosomal abnormalities may not be detected. New technologies based on array, the Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A), are able to evaluate the whole genome. The SNP-A has superior resolution compared to metaphase cytogenetics, may be used in interphase cells, and may detect chromosomal abnormalities not detected by metaphase cytogenetics. In addition, the SNP-A read-out includes genotyping calls and hybridization signal strength, corresponding to gene copy number, allowing detecting copy neutral loss of heterozigosity (CN-LOH), also known as uniparental dissomy (UPD). Deletions, copy neutral loss of heterozigosity or gain are frequent in patients with haematopoietic neoplasms and has already suggested the location of tumor suppressor genes and oncogenes. The aim of this study was to characterize the cohort of patients with clinical suspicion of MDS and to establish the integrative use of the conventional cytogenetic and the SNP-A in the investigation of chromosomal abnormalities in patients with MDS and related diseases followed at our institution. The clinical, morphological and cytogenetic evaluation allowed us to confirm the diagnosis of MDS or related disease in 43 patients (MDS [n=34], MDS/MPN [n=5], AML with myelodysplastic changes [n=4]). Twenty-one patients were diagnosed with idiopathic cytopenia with undetermined significance (ICUS) and 50 patients had other diagnosis. SNP-A were performed in 17 patients with MDS and related disease. Chromosomal abnormalities were observed in 6/17 (35%) cases by metaphase cytogenetics, and in 8/17 (47%) of the cases by SNP-A. SNP-A did not detected two balanced translocations and two numerical alterations previously observed by metaphase cytogenetics. SNP-A confirmed all the other findings observed by metaphase cytogenetics and SNP-A detected a total of 32 new lesions (1 gain, 19 losses and 12 UPDs) in 6 MDS and related diseases. SNP-A may complement metaphase cytogenetics to improve the detection of chromosomal abnormalities in myeloid neoplasms.
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Análise do padrão de metilação do gene SOX17 e expressão de microRNAs ao diagnóstico de síndrome mielodisplásica e citopenia idiopática de significado indeterminado /Monteiro, Fernanda de Souza. January 2018 (has links)
Orientador: Agnes Cristina Fett-Conte / Banca: Ana Elizabeth Silva / Banca: Paula Rahal / Banca: Ana Luiza Bossolani Martins / Banca: Flávio Naoum / Resumo: Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) é a denominação de um grupo de doenças neoplásicas clonais das células hematopoéticas, mais frequentemente observadas em idosos, caracterizadas por citopenias, displasia, hematopoese ineficaz e risco elevado para leucemia mielóide aguda (LMA). Citopenia(s) persistente(s), por mais de seis meses, e ausência de critérios diagnósticos para SMD, caracteriza a Citopenia Idiopática de Significado Indeterminado (ICUS). ICUS foi definida recentemente e é pouco conhecida quanto aos fatores etiológicos. Já as SMDs são consideradas protótipos de doenças epigenéticas, uma vez que distúrbios na metilação de alguns genes que regulam proliferação e diferenciação celular têm sido considerados fatores causais. O gene SOX17, por exemplo, é um supressor de tumor expresso em vários tecidos e alterações no seu padrão de metilação já foram observadas em tumores sólidos e neoplasias hematológicas, entretanto, foram pouco estudadas nas SMDs e não há descrições de estudos em ICUS. Do mesmo modo, alguns microRNAs vem sendo utilizados como marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico para diversas anormalidades hematológicas, mas seu papel na etiologia e desenvolvimento das SMDs também é pouco conhecido. Neste contexto, este estudo propos investigar o padrão de metilação do gene SOX17 por MSP-PCR em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD e ICUS ao diagnóstico, e analisar alterações no padrão de expressão de microRNAs por RT-PCR em células da MO de... / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) denominates a group of neoplastic diseases of the hematopoietic cells, most commonly observed in elderly patients, characterized by cytopenias, dysplasia, ineffective hematopoiesis and high risk of acute myeloid leukemia (AML). Persistent cytopenia (s), for more than six months, and absence of diagnostic criteria for MDS, characterizes Idiopathic Cytopenia of Undetermined Significance (ICUS). ICUS has been recently defined, and little is known about its etiological factors. The MDSs are considered as prototypes of epigenetic diseases, due to the fact that methylation disorders of some genes that regulate cell proliferation and differentiation have been considered as causal factors. The SOX17 gene, for example, is a tumor suppressor expressed in several tissues and changes in its methylation pattern have already been observed in solid tumors and hematological malignancy, however, these changes have been little studied in MDS and there are no descriptions of studies in ICUS. Similarly, some microRNAs are being used as molecular markers for diagnosis and prognosis for various hematological abnormalities, but its role in the etiology and development of MDS is also poorly understood. In this context, this study aimed to investigate the methylation pattern of the SOX17 gene by MSP-PCR in bone marrow (BM) cells of patients diagnosed with MDS and ICUS, and to analyze changes in the expression pattern of microRNAs by RT-PCR in cells of BM for adults and ... / Doutor
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Interacción MNSV-planta de melón : una aproximación transcriptómica y celularGómez Aix, Cristina 24 July 2015 (has links)
El Virus de las manchas necróticas del melón (Melon necrotic spot virus, MNSV; género Carmovirus; Familia Tombusviridae) es un virus de ARN de sentido positivo endémico en cultivos de melón. Este virus ha sido empleado como modelo de estudio de aspectos relacionados con la superación de resistencias recesivas, la traducción de ARNs virales carentes de estructuras cap o el movimiento intercelular. Sin embargo, se sabe poco acerca de las respuestas que la infección por este virus induce en las plantas o los genes alterados como consecuencia del desarrollo de su ciclo viral en su huésped natural, el melón. Así mismo, se desconocen los lugares, dentro de la célula vegetal, donde este virus lleva a cabo su replicación viral. Todos estos procesos podrían aportar conocimiento sobre los genes necesarios en la interacción planta-virus que permiten el establecimiento de una infección satisfactoria por parte del virus, o los factores necesarios para la puesta en marcha de una respuesta de defensa eficaz para contrarrestar la infección y que podrían ser utilizados en estrategias antivirales. Con el objetivo de ahondar en el conocimiento de la interacción MNSV-melón, esta tesis ha sido estructurada en dos capítulos. En el primer capítulo, utilizando los microarrays como herramienta principal de análisis, se ha llevado a cabo un estudio de las alteraciones transcriptómicas inducidas por MNSV en melón, con especial énfasis en aquellos cambios asociados con: (i) una región no codificante del genoma del virus, (ii) diferentes cultivares de melón (iii) diferentes tejidos de la planta, (iv) y con el desarrollo de infecciones de tipo local o sistémico. Los resultados obtenidos han permitido identificar la desregulación específica de dos grupos de genes asociados con una región no traducible del genoma viral, así como genes que responden de forma específica de cultivar. La comparación entre tejidos ha mostrado una respuesta cuantitativa diferente entre hoja y cotiledón, pero cualitativamente muy similar, aportando validez a los resultados obtenidos en cotiledón. Así mismo, una aproximación tradicional al estudio de la posible activación de una respuesta sistémica adquirida por parte de la planta, ha descartado la activación de la misma. Finalmente, la comparación entre estos resultados con los obtenidos en trabajos previos para otros virus, ha permitido identificar un sólo gen compartido por los tres virus analizados, que podría ser importante en las infecciones virales al menos en melón. Por otro lado, estos análisis han puesto de manifiesto la importancia de utilizar diferentes tiempos de muestreo a la hora de realizar comparaciones entre los cambios transcriptómicos inducidos por diferentes virus. En el segundo capítulo, se ha llevado a cabo el análisis tisular de las lesiones inducidas por MNSV para delimitar las regiones de interés donde realizar los análisis ultraestructurales. Este análisis identificó una región idónea para tales efectos. El estudio ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión de la región identificada como Z2, ha puesto de manifiesto la existencia de grandes orgánulos originados como consecuencia de la infección por MNSV. Estos orgánulos han sido identificados como mitocondrias modificadas estructuralmente y representan los lugares donde el virus lleva a cabo su replicación ya que, a través de experimentos de hibridación in situ e inmunocitoquímica, se han localizado los ARNs virales, la proteína de la cápsida viral (CP) así como el dsRNA (intermediario de replicación) en estos orgánulos. La reconstrucción tridimensional de las mitocondrias modificadas mostró la presencia de grandes dilataciones internas, interconectadas entre ellas y con el citoplasma circundante a través de poros y/o estructuras complejas así como su conexión con cuerpos lipídicos. Así mismo, se llevó a cabo el estudio de la implicación de la proteína p29 de MNSV en la localización y generación de los sitios de replicación de MNSV. Para ello se generaron construcciones de la proteína p29 fusionada a GFP que fueron localizadas mediante microscopía laser confocal en mitocondrias. El análisis de la ultraestructura de las células que expresaron la proteína de fusión p29-GFP y su localización por inmunocitoquímica identificó la presencia de esta proteína en mitocondrias, así como la inducción de modificaciones estructurales en estos orgánulos muy semejantes a las inducidas por el virus. / Melon necrotic spot virus (MNSV) (genus Carmovirus, family Tombusviridae) is a single-stranded, positive-sense RNA virus endemic of cucurbit crops worldwide. This virus has become an experimental model for the analysis of cell-to-cell virus movement and translation of uncapped viral RNAs, whereas little is known about its replication or the transcriptome changes induced in melon plant by the virus during the viral cycle and in response to the infection. So far it is unknown the cellular compartment in which this virus carries out its viral replication. Addressing all these processes could provide information about genes involved in the plant-virus interaction that lead to a successful viral infection and the cellular factors involved in the defense response to counteract the infection. This knowledge may be used in future antiviral strategies. To clarify all these questions about MNSV-melon interaction this thesis has been structured into two chapters. The first chapter is focused on transcriptomic alterations induced by MNSV in melon plants, with special emphasis on those changes associated with: (i) a non-coding region of the genome virus, (ii) different melon cultivars, (iii) different plant tissues, and, (iv) development of local or systemic infections. Microarray analyses have led to identify a specific deregulation of two groups of genes associated with an untranslated region of the viral genome, and also several sets of genes that respond specifically in each cultivar. The comparison between tissues has shown a different quantitative response between leaf and cotyledon, but qualitatively similar, providing validity to the results obtained in cotyledon. Also, a traditional approach to the study of the putative activation of a systemic acquired response from the plant has dismissed the activation of such response. Finally, the comparison of these results with those obtained in previous work for other viruses, has identified one gene shared by all the three viruses tested. This gene could play a key role in melon viralinfection. On the other hand, these results have shown the need of using different sampling times when comparing transcriptome changes induced by different viruses. In the second chapter, an histological analysis of the MNSV infected tissues was performed in order to define the most adequate region where to focuses the ultrastructural analysis. This analysis identified an ideal region for this purpose. The ultrastructural study by transmission electron microscopy of the region identified as Z2, has revealed the existence of large organelles originated as a result of MNSV infection. Immunolocalization of the glycine decarboxylase complex (GDC) P protein in these organelles confirmed their mitochondrial origin. In situ hybridization and immunolocalization experiments showed the specific localization of positive-sense viral RNA, capsid protein (CP), and double-stranded (ds)RNA (a replication intermediate) in these organelles meaning that replication of the virus takes place in association with them. The three-dimensional reconstructions of the altered mitochondria showed the presence of large, interconnected, internal dilations which appeared to be linked to the outside cytoplasmic environment through pores and/or complex structures, and with lipid bodies. Transient expression of MNSV p29 revealed that its specific target is mitochondria. Our data document the extensive reorganization of host mitochondria induced by MNSV, which provides a protected environment to viral replication, and show that the MNSV p29 protein is the primary determinant of this effect in the host.
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Bases genètiques en la malformació de Chiari tipus iUrbizu Serrano, Aintzane 13 June 2013 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Vall d'Hebron - Grup de Recerca en Neurologia Pediàtrica / La malformació de Chiari de tipus I (MCI) s'ha definit tradicionalment com una alteració congènita caracteritzada pel descens de les amígdales cerebel.loses a travès del forat magne en 3 o més mm. Es creu que és conseqüència d'una fosa cranial posterior (FCP) hipoplàstica, amb un os occipital anormalment curt, que resulta d'un mesoderma paraxial insuficient. La simptomatologia descrita pels pacients és molt variada: mals de cap occipitals, cervicàlgies, marejos, vertígens, pèrdua de sensibilitat i de força a les extremitats, alteracions de la son i problemes en la deglució entre d'altres, atribuïts a la compressió de les estructures neurològiques contingudes en la FCP i a l'alteració de la circulació del líquid cefaloraquidi.
S'ha estimat la seva prevalença en 1/1280 i, tot i que es desconeix la seva etiologia, diversos estudis apunten a una component genètica com la causa més probable. En la MCI molts dels casos són esporàdics, però s'han identificat famílies amb diversos individus afectats en diferents generacions. Per aquest motiu, aquest treball va tenir com a objectiu principal estudiar les bases genètiques de la patologia. Es van reclutar més de 530 pacients, pertanyents a 450 famílies, i es van desenvolupar dues estratègies: 1) estudi de les formes
aparentment complexes de la patologia mitjançant un estudi d'associació genètica, en què es van avaluar variants de susceptibilitat en gens implicats en el desenvolupament del mesoderma paraxial, somites, endoteli vascular i os occipital; i 2) estudi de les formes aparentment monogèniques, mitjançant un estudi mutacional del gen SUZ12 que, en haploinsuficiència en un model murí, produeix fenotips similars als de les malformacions de Chiari tipus I i II. Es van seqüenciar també els exornes de dos pacients pertanyents a una mateixa família.
Donat que el descens amigdalar cerebel.lós pot ser produït per diferents causes, es va realitzar també un estudi morfomètric de la FCP en imatges de ressonància magnètica amb la finalitat de definir un mètode de diagnòstic més específic que l'existent, i que permetés diferenciar els pacients amb MCI produïda per una FCP hipoplàstica de la produïda de forma secundària, per altres mecanismes. Es va caracteritzar també la cavitat orofaríngia dels pacients. Els resultats que es van obtenir demostren que és necessari establir un nou criteri diagnòstic que permeti diferenciar els pacients amb MCI en funció de la seva causa, la qual cosa facilitaria l'estudi de la base genètica d'aquesta malformació. S'ha trobat correlació entre certes alteracions a la cavitat orofaríngia i símptomes típics de MCI com les apnees de la son o problemes en la deglució. També s'han identificat variants de susceptibilitat en diferents gens implicats en la via de síntesi de l'àcid retinoic. Però els estudis de cribatge mutacional del gen candidat i de seqüenciació d'exornes en casos familiars no han permès identificar gens responsables de la MCI. / Chiari malformation type I (CMI) is a congenital disease that has been traditionally defined as the chronic tonsillar herniation of at least 3 mm below the foramen magnum. It is characterized by an overcrowding of a normally developed hindbrain within a hypoplastic PCF, although both age at presentation and symptoms show high variability. The etiology of the disease remains unknown, but the most accepted hypothesis is that CMI is the result of an insufficient development of the paraxial mesoderm. Several evidences suggest that, at least in a subset of CMI patients, genetic factors may play an important role. This project focused on the identification of genetic risk factors for CMI, including genes responsible for the mendelian and also the complex forms of the disease. To achieve this goal, two different strategies were followed: 1) Identification of susceptibility genetic variants in CMI patients using a casecontrol association approach. 2) Genetic analyses of monogenic forms by a mutational screen of the candidate gene SUZ12 and by exome sequencing in two CMI patients ofthe same family.
We recruited 530 CMI patients from 450 unrelated families. Given that tonsilar herniation can be caused by five distinct mechanisms, we developed a probability model to establish a diagnosis with 93% confidence in those patients with a hypoplastic PCF. This diagnostic tool allowed to define a clinical homogeneous group for further genetic studies. A cephalometric oropharynx morphometric study was also performed to identify the possible underlying anatomical anomalies leading to less known symptoms. The results of the genetics association study paint to a putative role for defective retinoic acid signalling and fetal vasculogenesis in causing hypoplasia of the basichondrocranium. However, when we studied the monogenic forms, we did not find any causal variant.
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Identificación y caracterización de mutantes de tomate (Solanum lycopersicum) afectados en el desarrollo reproductivo y en la tolerancia a estreses abióticosMeco Martínez, Victoriano 15 July 2015 (has links)
El siglo XXI plantea un nuevo reto para la agricultura: las predicciones de aumento de la población mundial exigen aumentar la productividad de los cultivos. La incidencia del cambio climático sobre regiones históricamente agrícolas es causa ya del descenso en el rendimiento agrícola, al estar afectados por el impacto creciente de estreses abióticos como la sequía y la salinidad. Una de las estrategias para abordar este desafío es la generación y análisis de colecciones de mutantes de especies vegetales de gran importancia agro-alimentaria como tomate para la identificación de genes y la disección de mecanismos implicados en el desarrollo y la producción así como en la tolerancia a estreses abióticos. Dentro del programa de mutagénesis insercional con T-DNA en tomate que se lleva a cabo entre los grupos de investigación del IBMCP, UAL y CEBAS, en este trabajo nos hemos centrado en la identificación de mutantes afectados en el desarrollo reproductivo, que en último extremo afecta a la producción de fruto, y en la respuesta a la salinidad y la sequía, por ser estreses abióticos tan importantes por su incidencia en el rendimiento final. En el primer caso se aborda la identificación y caracterización de un mutante de gran interés agronómico por su fenotipo afectado en el desarrollo reproductivo, denominado afs1 (abnormal fruit set-1). El mutante afs1 se caracteriza por presentar una mayor tasa de cuajado de fruto, reflejada en un marcado aumento del número de frutos que, aunque de menor tamaño, promueven una mejora significativa de la producción. Entre las características de afs1 cabe destacar que sus frutos son partenocárpicos y destacan por su mayor calidad debido a una mayor concentración de glucosa y fructosa, así como de ácido cítrico, que dan lugar a un incremento del índice de sabor. La mutación responsable de dicho fenotipo no se debe a una inserción de T-DNA si no a una mutación somaclonal generada durante la transformación y cultivo in vitro, algo ya observado en otras colecciones de mutantes insercionales, y se está procediendo a su localización genómica. En el segundo caso se aborda la caracterización de un mutante alterado en la respuesta al estrés salino e hídrico. El mutante se ha denominado wak1 (Wall-associated kinase 1), ya que la mutación responsable ha sido etiquetada por un inserto T-DNA que se sitúa en la región promotora del gen SlWAK1, que forma parte de un clúster génico de cuatro isoformas que están localizadas en el cromosoma 9, que codifican para unas proteínas quinasas asociadas a pared celular (cell wall-associated kinases). Aunque la expresión del gen SlWAK1 está anulada en el mutante, no lo están sin embargo los genes flanqueantes SlWAK2 y SlWAK3. El mutante wak1 presenta un fenotipo similar a la planta no transformada cuando se cultiva sin estrés, muestra un fenotipo sutil en condiciones de estrés hídrico y salino a medio plazo, y finalmente reduce significativamente el rendimiento en términos de producción de fruto en estrés a largo plazo. A nivel fisiológico, el mutante wak1 presenta mayor tolerancia al estrés iónico inducido por salinidad, con menor acumulación de Na+ en hoja. Sin embargo, el mutante es sensible al estrés osmótico inducido tanto por estrés salino como hídrico. Además, la anulación del gen SlWAK1 provoca una acumulación de sacarosa en raíz, relacionada con una alteración en la expresión de genes implicados en el metabolismo de sacarosa. Considerados en conjunto, los resultados de la caracterización de estos mutantes fenotípicamente tan diferentes demuestran el gran interés que tiene el análisis de mutantes para avanzar en el conocimiento de los procesos y los genes clave en el desarrollo y en la tolerancia a estreses abióticos. / The XXI century poses new challenges to agriculture: the predictions of global population growth invite us to focus all our efforts on increasing crop yields. In turn, the impact of climate change on historically farming regions promotes the decrease of the performance of these vegetable species with high agronomic interest, such as the tomato, which is one of the most important global vegetable species. Among the strategies proposed to address the problems exposed, generating mutant collections is one of the most widespread strategies and it has provided much information about processes, pathways and relevant mechanisms. To this end, a collection of insertional mutants using an enhancer trapping has been created in the commercial cultivar of the tomato "Moneymaker" and we have directed our interest in selecting mutants affected in the reproductive development and in the response to abiotic stresses (salinity and drought) to be key processes that directly affect the final crop yield. Within the collection, we have identified a mutant with high agronomic interest related to reproductive development, which we have named afs1 (abnormal furit set-1), characterized by an increased vegetative growth rate and higher rate of fruit set. Their flowers show an opening in the base of the stamen caused by the early fruit set, initiated before the anthesis. The higher fruit set rate is reflected in the increase in fruits number, despite the smaller size, leading to a significant improvement in the production and final yield in greenhouse conditions. Among the characteristics of production, it is noteworthy that this afs1 produces parthenocarpic fruits with improved organoleptic characteristics, brought about by an increase in glucose and fructose, and citric acid therefore, leads to an increased rate of flavor. It has also been selected and characterized by a mutant response to salt and water stresses, named wak1 (Wall-associated Kinase 1) which carries a T-DNA inserted in the promoter region for canceling the SlWAK1 gene expression in the mutant. This gene is part of a gene cluster consisting of four total WAK isoforms genes in chromosome 9. qPCR expression analysis has indicated that the SlWAK1 expression is root specific and reduces its expression levels in response to salt stress . The two flanking SlWAK1 isoforms genes (referred to SlWAK3 and SlWAK2 in this paper) are not affected by the T-DNA insertion and have a similar pattern to the described for SlWAK1 response. At a phenotypic level, this mutant has a WT phenotype in standard culture conditions and displays a subtle phenotype under water and salt stresses, characterized by a significant reduction in the height rate of the aerial part, and the reduction of shoot water content. Paradoxically, despite the reduction in development, salt stress experiences have shown that the wak1 mutant has an increased tolerance to the accumulation of toxic concentrations of Na+ in the shoot. Furthermore, it has been shown that this mutant is sensitive to osmotic effect, which occurred in both the water stress and in the first phase of the salt stress. The results indicate that the basis of this sensitivity is an alteration in osmotic adjustment ability and in the sugar metabolism promotes an increased sucrose transport to the root at the expense of the growth rate and the transport of water toward the apex.
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Estudio del papel del polimorfismo Val108/158 Met del gen humano de la catecol-O-metiltransferasa y su producto, el 2-metoxiestradiol, en el origen y fisiopatología de la preeclampsiaPertegal Ruiz, Miriam 12 June 2015 (has links)
Los objetivos de esta tesis fueron por un lado evaluar la asociación entre el polimorfismo funcional Val108/158Met de la catecol-O-metiltransferasa (COMT) fetal y materno y el riesgo de desarrollar preeclampsia (PE), examinando la influencia de dicho polimorfismo en la expresión, la actividad enzimática placentaria de la COMT y en los niveles maternos de su producto, el 2-metoxiestradiol (2ME), en gestantes control y preeclámpticas. Por otra lado, analizamos si los niveles del 2ME están relacionados con diferentes índices de gravedad clínica y biomarcadores de la enfermedad. Llevamos a cabo un estudio caso-control observacional, analítico y prospectivo en 126 gestantes (53 preeclámpticas y 73 gestaciones normales) reclutadas en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia entre enero de 2010 y enero de 2012. Se extrajeron muestras de sangre de las gestantes antes del parto y, una vez producido el mismo, se tomó sangre del cordón umbilical (fetal) y fragmentos de tejido placentario. Las muestras sanguíneas se utilizaron para realizar los estudios de genotipado, y para medir los niveles maternos de 2ME, y de diferentes biomarcadores relacionados con la PE (homocisteína, sFlt1, PlGF). Por otra parte, en el tejido placentario se realizaron los análisis de expresión y actividad enzimática de la COMT. Finalmente, obtuvimos datos clínicos y analíticos de la historia clínica de las pacientes. Los principales resultados de este trabajo muestran que el genotipo met-met fue el doble de frecuente en la sangre fetal de gestantes preeclámpticas que en las controles. La odds ratio ajustada (ORajt) para el riesgo de PE en dichas mujeres fue de 3.22 [intervalo de confianza (IC) 95%: 1.01, 10.28]. Los análisis del polimorfismo materno de la COMT no revelaron un aumento significativo del riesgo de PE, y tampoco añadió nada el estudio de los haplotipos de la COMT. Al analizar la actividad enzimática in vitro, ésta se vio determinada por el polimorfismo fetal Val108/158Met, siendo menor para el genotipo met-met que para el val-met y el val-val tanto en población total como en la preeclámptica. La actividad de la COMT in vitro no difirió entre controles y preeclámpticas dentro de cada genotipo. En cuanto a la expresión de la COMT soluble, ésta fue menor para el genotipo met-met en ambas subpoblaciones y dicha expresión se correlacionó inversamente con los valores de actividad in vitro, pudiendo por tanto estar determinada dicha actividad por la cantidad de proteína. La expresión placentaria de la COMT soluble no difirió entre controles y preeclámpticas dentro de cada genotipo. En lo que respecta a la actividad in vivo, no encontramos ninguna asociación entre el polimorfismo estudiado y los niveles de 2ME en plasma materno; no obstante los valores de 2ME sí estuvieron significativamente disminuidos en las gestantes con PE frente a las controles (1818.41±189.25 pg/ml vs 2906.43±200.69 pg/ml). Además, las gestantes con PE presentaron unos niveles plasmáticos mayores de homocisteína, condicionando éstos un mayor riesgo de PE, y correlacionándose inversamente con los valores de 2ME, lo que podría contribuir a la menor actividad observada de la COMT in vivo en PE. Por otra parte, los valores plasmáticos de 2ME se correlacionaron con parámetros clínicos y analíticos de gravedad del síndrome como la mayor tensión arterial sistólica pico, la necesidad de una mayor agresividad terapéutica antihipertensiva, el menor peso neonatal o la precocidad de la PE. Finalmente, los niveles maternos de 2ME también se correlacionaron, tanto en la población total como en la preeclámptica, con conocidos factores de desequilibrio angiogénico en PE como el sFlt1 o el PlGF, sugiriendo que el 2ME podría ser un factor clave en el mantenimiento del equilibrio angiogénico necesario para el correcto desarrollo de la gestación. / The objectives of this thesis were on one hand to assess the association between fetal and maternal catechol-O-methyltransferase (COMT) Val108/158Met functional polymorphism and the risk of developing preeclampsia (PE), examining the influence of this polymorphism in expression and activity of placental COMT enzyme and in maternal plasma levels of its product, 2-methoxyestradiol (2ME), in both control and preeclamptic pregnant women. On the other hand, we analyze whether 2ME levels are associated with different clinical severity index and biomarkers of PE. We conducted an observational, analytical and prospective case-control study in 126 pregnant women (53 preeclamptic and 73 normal pregnancies) recruited at the Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca in Murcia from January 2010 to January 2012. Blood samples of pregnant women were taken before delivery and, immediately after, cord blood (fetal) and placental tissue fragments were taken. Blood samples were used for genotyping studies, and to measure maternal levels of 2ME, and different biomarkers related to PE (homocysteine, sFlt1, PlGF). Moreover, we made the analysis of expression and enzymatic activity in vitro of COMT in placental tissue. Finally, we obtained clinical and laboratory data from the clinical history of patients. The main results of this work show that the genotype met-met was twice as frequent in fetal blood from patients with PE as in controls. The adjusted odds ratio (ORajt) for the risk of PE in these women was 3.22 [95% confidence interval (CI): 1.01 -10.28]. Analyses of maternal COMT polymorphism did no reveal a significant increased risk of PE, and either added nothing COMT haplotypes analysis. When analyzing the enzyme activity in vitro, it was determined by fetal Val108/158Met polymorphism, being lower for met-met genotype than for val-met and val-val both the total population and preeclamptic. The COMT activity in vitro did not differ between control and preeclamptic pregnant women within each genotype. The expression of soluble COMT was lower for the met-met genotype in both subpopulations and this expression was inversely correlated with in vitro activity values, then such activity may be determined by the amount of protein. Placental expression of soluble COMT not differ between controls and preeclamptic within each genotype In respect to in vivo activity, we found no association between the polymorphism studied and levels of 2ME in maternal plasma, however those values were significantly decreased in women with PE compared to control (1818.41±189.25 pg/ml versus 2906.43±200.69 pg/ml). In addition, there were a higher plasma homocysteine levels in preeclamptic women conditioning them at increased risk of PE, and correlated inversely with the values of 2ME in total population, which could contribute to the lower COMT activity in vivo observed in PE. On the other hand, plasmatic 2ME values were significantly correlated with different clinical and laboratory parameters of severity of the syndrome such as higher peak systolic blood pressure, the need for more aggressive antihypertensive therapeutic, lower birth weight or early onset of PE. Finally, maternal 2ME levels were also correlated (in patients with PE and in total population) with known angiogenic imbalance factors present in PE as sFlt1 or PlGF, suggesting that 2ME could be a key factor in maintaining the balance angiogenic necessary for the proper development of gestation.
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Regulación de la expresión de genes endógenos por la maquinaria de silenciamiento génico mediado por RNA en Mucor circinelloidesVila Martínez, Ana 07 July 2014 (has links)
Mucor circinelloides es un hongo filamentoso utilizado como modelo para el estudio del mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Una vez caracterizado dicho mecanismo y los principales genes implicados, se pretende determinar el papel de la ruta de silenciamiento en la regulación de genes endógenos, así como identificar otros posibles elementos genéticos que participen en dicha ruta. Para ello, se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Identificación del gen implicado en la eliminación de la cadena pasajera de los siRNAs y estudio de la existencia de interacciones entre las proteínas de la maquinaria de silenciamiento. 2. Estudio de la participación de Ago-1 en la biogénesis de los distintos tipos de ex-siRNAs de M. circinelloides. 3. Identificación de los genes regulados por el mecanismo de silenciamiento mediante el análisis de los perfiles transcriptómicos de la estirpe silvestre y de mutantes en genes de silenciamiento. 4. Caracterización fenotípica detallada de los mutantes afectados en la ruta de silenciamiento, para identificar los procesos celulares regulados mediante dicho mecanismo. Para desarrollar estos objetivos se ha utilizado la siguiente metodología: 1. La identificación de otros genes implicados en el mecanismo de silenciamiento se llevó a cabo mediante la disrupción de los genes candidatos por recombinación homóloga y su posterior análisis fenotípico. Para ello, se utilizaron técnicas de amplificación de DNA mediante PCR, clonación, transformación de protoplastos e hibridaciones tipo Southern y Northern. Las interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento se analizaron mediante el sistema de doble híbrido de levaduras. 2. La participación de Ago-1 en la biogénesis de los ex-siRNAs se analizó mediante la secuenciación de librerías de sRNAs. Ago-1 fue purificada mediante FLPC para el aislamiento y secuenciación de los sRNAs unidos a ella. Los datos obtenidos fueron validados experimentalmente mediante hibridaciones tipo Northern. 3. El análisis transcriptómico de las distintas estirpes se realizó mediante hibridaciones con micromatrices y secuenciación de RNA (RNA-seq). 4. El análisis fenotípico de los mutantes en genes de silenciamiento incluyó la cuantificación de la producción de esporas vegetativas y zigosporas, el estudio de la respuesta frente a diferentes situaciones de estrés, la cuantificación del proceso de autolisis y el análisis de la virulencia en Galleria mellonella. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar las siguientes conclusiones: 1. El gen qip es esencial para el eficaz funcionamiento del mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes, sugiriendo un papel en la activación del complejo RISC. No se detectaron interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento de M. circinelloides, lo que podría deberse a la necesidad de modificaciones post-traduccionales específicas de las proteínas de silenciamiento o a la formación de complejos multiproteicos. 2. El gen ago-1 está implicado en el mecanismo de silenciamiento endógeno de M. circinelloides, siendo necesario para la biogénesis y/o estabilidad de las cuatro clases de ex-siRNAs. Las clases I y II de ex-siRNAs se unen específicamente a Ago-1 para llevar a cabo la identificación y degradación de sus mensajeros diana. Las clases III y IV son generadas por una ruta de silenciamiento no canónica, en la que se requiere la participación de Ago-1, pero no la unión específica de estos ex-siRNAs a dicha proteína. 3. Los análisis transcriptómicos ponen de manifiesto que el mecanismo de silenciamiento posee un papel modulador de la expresión de un gran número de genes endógenos a lo largo del crecimiento vegetativo. Las funciones de las proteínas cifradas por estos genes están relacionadas con la biogénesis y modificación de la pared celular, el control de la división celular y el crecimiento, metabolismo de carbohidratos, envejecimiento celular o respuesta a estrés. 4. La ruta canónica de silenciamiento está implicada en la regulación del proceso de esporulación vegetativa y en la activación del programa de autolisis inducido por estrés nutricional. La regulación del desarrollo sexual debe ser llevada a cabo por una ruta no canónica independiente de Dicer. Los experimentos de patogénesis no revelan una clara participación del mecanismo de silenciamiento en el proceso de virulencia, aunque no se descarta una respuesta diferencial en otros organismos modelo, como el ratón. / Regulation of endogenous gene expression by the RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides. Mucor circinelloides is a filamentous fungus used as a model for studying the RNA silencing mechanism. Once the mechanism and main genes involved were characterized, the next goal is to determine the role of the RNA silencing pathway in the regulation of endogenous genes, and to identify other possible genetic elements that participate in the pathway. To do this, the following specific objectives were proposed: 1. Identification of the gene involved in the removal of the passenger strand of siRNAs duplex, and analysis of the interactions between silencing proteins. 2. Study of the participation of Ago-1 in the biogenesis of different classes of ex-siRNAs in M. circinelloides. 3. Identification the genes regulated by the RNA silencing mechanism by analyzing the transcriptome of the wild type and silencing mutants. 4. Phenotypic characterization of mutants affected in the silencing pathway to identify the cellular processes regulated by this mechanism. To develop these objectives the following methodology has been used: 1. Identification of other genes involved in the silencing pathway was addressed by disrupting candidate genes by homologous recombination and subsequent phenotypic analysis. To this end, PCR amplification of DNA fragments, cloning, transformation of protoplasts and Southern and Northern blot hybridizations were carry out. The study of interaction between RNA silencing proteins was performed using the yeast two-hybrid system. 2. cDNA libraries of sRNAs were generated and sequenced to analyze the participation of Ago-1 in the biogenesis of ex-siRNAs. Ago-1 was purified by FPLC for the isolation and sequencing of Ago-1 bound sRNAs. The sequencing data were validated by Northern-blot experiments. 3. Transcriptomic analysis of the different strains was carried out by hybridization methods using microarrays and RNA sequencing (RNA-seq). 4. Phenotypic analysis of silencing mutants included quantification of vegetative spore and zygospores, study of the response to different stresses, quantification of the autolysis process and virulence analysis of the different silencing mutants in Galleria mellonella. The results allowed reaching the following conclusions: 1. The qip gene is essential for transgene-induced gene silencing, suggesting a role in the activation of the RISC complex. No interactions were detected between proteins involved in the RNA silencing pathway of M. circinelloides. This could be due to the need for specific post-translational modifications of silencing proteins or the formation of multiprotein complexes. 2. Ago-1 is involved in endogenous RNA silencing in M. circinelloides, and it is necessary for the biogenesis and / or stability of all ex–siRNAs classes. Classes I and II of ex-siRNAs specifically bind to Ago-1 for the identification and degradation of their mRNA targets. Classes III and IV are generated by a non-canonical silencing mechanism that requires the participation of Ago-1, but there is not specific binding of these ex-siRNAs to Ago-1 protein. 3. Transcriptomic analysis showed that the silencing mechanism has a modulatory role in the expression of a large number of endogenous genes during vegetative growth. The functions of the proteins coded by these genes are linked to the biogenesis and modification of the cell wall, the control of cell division and growth, carbohydrate metabolism, cell aging or stress response. 4. The canonical RNA silencing pathway is involved in regulation of vegetative sporulation and autolysis induced by nutritional stress. Sexual development should be regulated by a non-canonical Dicer-independent RNA pathway. Pathogenesis experiments did not reveal a role of RNA silencing in the virulence process, but a differential response can’t be ruled out when using other model organisms, such as mouse.
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Bases genéticas y moleculares de la calidad del fruto en albaricoquero (prunus armeniaca L.)Salazar Martínez, Juan Alfonso 24 October 2014 (has links)
Los objetivos de esta tesis doctoral fueron la caracterización fenotípica y estudio del modo de herencia de los principales caracteres relacionados con la fenología y calidad del fruto en la especie albaricoquero, así como la caracterización genotípica mediante marcadores de ADN (SSRs y SNPs), construcción de mapas de ligamiento genético, identificación de QTLs asociados a caracteres de interés y localización de posibles genes candidatos. El material vegetal utilizado consistió en tres poblaciones segregantes de albaricoquero: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) y ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) con 160, 187 y 200 descendientes respectivamente. La caracterización fenotípica nos ha permitido la evaluación de fecha de floración, fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto, peso del fruto, peso del hueso, calibre, color del fruto, firmeza, contenido en sólidos solubles y acidez. Los resultados muestran una gran variabilidad y segregación en cada población, así como evidentes diferencias interanuales. Los histogramas de frecuencias revelan en general una distribución normal de los descendientes en la mayoría de los caracteres evaluados, lo que confirma el carácter poligénico y herencia cuantitativa para todos ellos. Sin embargo, fecha de floración y maduración llegan a mostrar distribuciones bi-modales o tri-modales debido a las diferencias climáticas inter-anuales. Se observa la presencia de valores transgresivos en los descendientes debido a la influencia del fondo genético de los parentales, así como de herencia intermedia. La mayoría de los caracteres evaluados muestran además una buena correlación entre años. En la población ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ se construyeron los mapas de ligamiento genético a partir de 160 descendientes, utilizando un total de 42 SSRs. Los mapas de ‘Z701-1’ y ‘Palsteyn’ cubren una extensión de 336,2 cM y 363,1 cM respectivamente. En el análisis de QTLs se identificaron QTLs significativos para los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los resultados mostraron la gran influencia del grupo de ligamiento (LG) 4 para fecha de maduración y ciclo de desarrollo del fruto. La presente tesis abordó un estudio de mejora en la eficiencia de la metodología para el desarrollo y análisis de SNPs, combinando la secuenciación masiva de ARN (RNA-Seq) y la técnica SNPlex mediante la plataforma SEQUENOM. Se diseñaron 136 SNPs procedentes del RNA-Seq de los genotipos ‘Rojo Pasión’ y ‘Z506-7’ siendo aplicados un total de 101 SNP para el genotipado de diferentes variedades de albaricoquero. A partir de los resultados del análisis de variaciones de nucleótidos, podemos decir que este enfoque proporciona alta flexibilidad, reproducibilidad y precisión en los ensayos, suponiendo una herramienta sólida para detectar diversidad de nucleótidos en regiones codificantes y no codificantes del genoma de Prunus. El genotipado con SNPs permitió asimismo establecer las relaciones fenéticas y distancias genéticas entre diferentes cultivares de albaricoquero con diversos orígenes. Finalmente se elaboraron los mapas de ligamiento genético de las poblaciones ‘B×C’ y ‘G×C’, utilizando un total de 130 y 166 descendientes respectivamente. Los mapas fueron construidos combinando marcadores tipo SSR y SNP, siendo mapeados 87 marcadores en la población ‘B×C’ y 89 en ‘G×C’, y cubriendo una extensión del genoma de 394,9 y 414,3 cM en los mapas de ‘Bergeron’ y ‘Currot’ respectivamente, mientras que en ‘Goldrich’ y ‘Currot’ fue de 353,5 y 422,3 cM respectivamente. El análisis de QTLs identificó diferentes QTLs ligados a los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los QTLs de mayor relevancia por su significación se dan en el LG 4, considerando este grupo de vital importancia para el control de fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto y contenido en sólidos solubles. En el caso del color de piel y pulpa fueron identificados importantes QTLs al final del LG 3 de ‘Goldrich’. / The objective of this thesis has been to carry out a phenotypic characterization of apricot by studying the inheritance of the major traits related to phenology and fruit quality. In addition, a genotypic characterization using DNA markers (SSRs and SNPs) has been performed to develop genetic linkage maps for QTL detection and identification of potential candidate genes and markers. The plant material used comes from three segregating populations of apricot: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) and ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) with 160, 187 and 200 seedlings respectively. The phenotipyc characterization has allowed us to evaluate blooming date, ripening time, fruit development period, fruit weight, stone weight, fruit diameter, fruit colour, firmness, soluble solids and acidity. Results show a great variability and segregation in each population as well as the obvious differences between years. The histograms frequencies usually reveal in the three populations a normal distribution in the majority of the traits which confirms the polygenic character and quantitative inheritance for all of them. Nevertheless, blooming and ripening date showed bi-modal or tri-modal distribution due to inter-annual climatic conditions. We should also note the presence of many transgressive trait values, probably due to the influence of the genetic background of the parents as well as intermediate inheritance of seedlings. We can affirm that there was good correlation between years for all traits evaluated. In the population ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ was constructed a genetic linkage maps assaying 160 seedlings with 42 SSR markers. ‘Z701-1’ and ‘Palsteyn’ maps covered a genome extension of 336.2 and 363.1 cM respectively. We subsequently carried out QTL analysis to identify significant QTLs for the most important phenological and fruit quality traits in apricot. Results show without any doubt the great influence of LG 4 on fruit quality traits, especially in the case of ripening time and fruit development period. The study has also been focused on improving the development and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) via an efficient and flexible method combining high throughput sequencing (RNA-Seq) and SNPlex technology using the SEQUENOM platform. 136 SNP markers were designed from the RNA-Seq genotypes 'Rojo Pasion' and 'Z506-7' being analyzed a total of 101 SNPs for genotyping of different apricot varieties. From the results of variations in nucleotide sequences (SNPs) we can say that this is an approach that provides high flexibility, reproducibility and accuracy and that it can be considered a robust tool for detecting nucleotide diversity in coding and non-coding regions of the Prunus genome. Moreover, logical phenetic relationships and genetic distance were shown among apricot cultivars tested according to the origin of each one. Finally, genetic linkage maps of populations ‘B×C’ and ‘G×C’ were realized using a total of 130 and 166 seedlings, respectively. Maps were constructed combining SSR and SNP markers, making it possible to map a total of 87 markers in the ‘B×C’ population and 89 markers in ‘G×C’. ‘Bergeron’ and ‘Currot’ covered a genome extension of 394.9 and 414.3 cM, while ‘Goldrich’ and ‘Currot’ covered 353.5 and 422.3 cM, respectively. In the phenotype and genotype integrated analysis, different QTLs were detected for the most important phenological and fruit quality traits. The most significant QTLs are localized in LG 4, showing that this group is of vital importance to ripening time, fruit development period and soluble solids content in both apricot populations. Regarding skin and flesh colour, the most important QTLs were detected at the end of LG 3 of ‘Goldrich’.
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Identificación y caracterización de mutantes alterados en la tolerancia a la salinidad en especies de tomate : papel del gen SICBL10 en los mecanismos de respuesta a salinidad señalizados por Ca2+ en tomatePlasencia Martínez, Félix Antonio 20 November 2015 (has links)
La salinidad está considerada como uno de los principales factores limitantes de la producción agrícola. Ante las predicciones del aumento de la población a nivel mundial con el consiguiente incremento de la demanda de alimentos, y los efectos negativos del cambio climático sobre la productividad de los cultivos de interés agronómico, como tomate (Solanum lycopersicum), un objetivo prioritario en la investigación en biología vegetal en la actualidad es avanzar en el conocimiento de los mecanismos y genes implicados en la tolerancia a la salinidad. Una de las estrategias más interesantes para abordar el anterior objetivo es el análisis de mutantes. Esta tesis se enmarca dentro del programa de mutagénesis insercional llevado a cabo por los grupos de investigación del IBMCP (Valencia), UAL (Almería) y CEBAS (Murcia), donde se han generado colecciones de mutantes de tomate cultivado y silvestre. Uno de los objetivos de este trabajo ha sido la identificación y caracterización de mutantes de la especie silvestre Solanum pennellii. La identificación de mutantes en una especie filogenéticamente relacionada con tomate, y que presenta características morfológicas muy diferentes al tomate cultivado y altos niveles de tolerancia al estrés abiótico, puede ser la mejor elección para identificar genes y procesos determinantes de la tolerancia a la salinidad. Respecto a los mutantes de S. pennellii, los cambios morfológicos y fisiológicos observados en el mutante sl-1 (succulent leaves-1) en ausencia de estrés están asociados a una menor perdida de agua por transpiración, y a un mantenimiento de la homeostasis de Na+ y K+ frente al estrés salino. Por el contrario, el mutante hipersensible a sal shp-1 (salt hypersensitive pennellii-1) experimentaba una mayor pérdida de agua por transpiración y una elevada acumulación de Na+ en las hojas durante el periodo de exposición a la sal. La caracterización de ambos mutantes ha puesto de manifiesto que la regulación de la pérdida de agua es un mecanismo clave en la tolerancia a la salinidad. En este trabajo también se ha abordado la caracterización de mutantes de tomate generados a partir del cultivar Moneymaker. A nivel fenotípico y fisiológico, el mutante hipersensible a la salinidad she-1 (salt hypersensitive esculentum-1) mostraba una respuesta similar a la observada en el mutante shp-1 de S. Pennellii, con alta acumulación de Na+ en sus hojas. Sin embargo, la sensibilidad a la sal del mutante she-1 parece estar relacionado con la alteración en los niveles de expresión de los genes SlHKT1s implicados en el transporte de Na+ a la parte aérea. Además, mediante injertos recíprocos se observó que la raíz es el órgano responsable de la sensibilidad a la sal del mutante she-1. Finalmente, se ha abordado la caracterización de un mutante que tiene anulada la expresión del gen CBL10 (CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN 10) de tomate. El mutante cbl10 es hipersensible al estrés salino a pesar de que la acumulación de Na+ en las plantas del mutante es menor que en las plantas no transformadas de Moneymaker y mantiene mayores niveles de K+ con la salinidad, lo que sugiere que la capacidad de acumular Na+ en vacuolas está alterada en el mutante y por tanto se alcanzan antes niveles citotóxicos del ion en el citoplasma. Además, el mutante tiene alterada la distribución de Na+ entre hojas jóvenes y adultas, produciéndose un mayor transporte de Na+ a los tejidos en desarrollo, que puede causar el colapso apical detectado en el mutante tras su exposición a la salinidad. Otra alteración fisiológica provocada por la anulación del gen SlCBL10 es una reducción de la pérdida de agua vía transpiración en condiciones de estrés. Además, la menor transpiración está asociada a una alteración en la homeostasis de Ca2+ y a cambios en el perfil de expresión del transportador de Ca2+ vacuolar SlCAX1, tanto en condiciones salinas como en ausencia de las mismas. Mediante injertos se ha demostrado que el principal órgano responsable de la sensibilidad del mutante cbl10 al estrés salino es la parte aérea, ya que solo muestran sensibilidad a sal las plantas injertadas con el mutante cbl10 como esqueje, pero no cuando éste es utilizado como portainjerto. Este resultado sugiere que SlCBL10 podría tener una función diferente en parte aérea y raíz, siendo su función en la parte aérea la implicada en la tolerancia a la salinidad en tomate. Además, la alteración de la homeostasis de Ca2+ en la parte aérea nos lleva a proponer como papel del gen SlCBL10 su participación en la regulación de la homeostasis de Ca2+, siendo esta función crucial para la tolerancia del tomate al estrés salino. / ABSTRACT Salinity is considered as one of the major limiting effects on agriculture production. Keeping in mind the predictions about the rise of world population resulting in an increase in food demand, and the negative effects of climate change on the productivity of plants of agronomic interest, such tomato (Solanum lycopersicum), one current critical aim in plant biology research is to advance in the knowledge of genes and mechanisms involved in salt tolerance in plants. One of the most interesting strategies to approach this goal is the analysis of mutants. This PhD thesis is framed within the insertional mutagenesis programme carried out by the Spanish research groups from IBMCP (Valencia), UAL (Almeria) and CEBAS (Murcia), where mutant collections have been generated in domesticated tomato and in wild-related species. One of the objectives of this research work has been the identification and characterization of mutants of the tomato wild species Solanum pennellii. The identification of mutants in a species phylogenetically related with tomato that exhibits so different morphological characteristics and high levels of tolerance to abiotic stress could be the best choice to identify genes and processes determining tolerance to salinity. Regarding S. pennellii mutants, the morphological and physiological alterations observed in the sl-1 (succulent leaves-1) mutant in absence of stress are associated to a lower transpirational water loss and a better maintenance of Na+ and K+ homeostasis when confronted to salt stress. On the contrary, the salt hypersensitive shp-1 (salt hypersensitive pennellii-1) mutant suffered a higher transpirational water loss and an elevated accumulation of Na+ in leaves during the period of exposition to salt stress. The characterization of both mutants has revealed that regulation of water loss is a key mechanism in salt stress tolerance. In this research work it has also been approached the characterization of tomato mutants generated in Moneymaker commercial cultivar. At phenotypical as well as physiological level the salt hypersensitive she-1 (salt hypersensitive esculentum-1) mutant showed a similar response to the one observed in shp-1 S. pennellii mutant: a remarkable increase in Na+ accumulation in leaves. However, the susceptibility to salt of she-1 mutant seems to be related to the alteration in the levels of expression of SlHKT1 genes involved in the Na+ transport from root to shoot. Moreover, it was observed by reciprocal grafting that the root was the responsible organ for the salt sensitivity of she-1 mutant. Finally, it has been approached the characterization of a mutant that exhibits a knock-out expression of CBL10 (CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN 10) tomato gene. The cbl10 mutant is hypersensitive to salt stress in spite of the fact that Na+ accumulation in mutant plants is lower than in untransformed WT ones and it upholds higher levels of K+ in salt stress condition. These observations suggest that ability to accumulate Na+ in vacuoles is compromised in the mutant and therefore cytotoxic levels of the ion in the cytoplasm are reached earlier in cbl10 than in WT. What is more, the distribution of Na+ between young and adult leaves is altered in the mutant, since a higher transport of the ion to developing tissues occurred in cbl10. This behavior could be the cause of the apical meristem collapse detected in the mutant plant after exposition to salt stress. Another physiological alteration induced by knocking out SlCBL10 gene is the reduction of water loss via transpiration in stressful conditions. Moreover, the lower transpiration is associated with a perturbation in Ca2+ homeostasis and with changes in the gene expression profile of the vacuolar Ca2+ carrier SlCAX1, in salt stress as well as in non-stressful conditions. Grafting experiments demonstrated that the main responsible organ for the salt stress sensitivity in cbl10 mutant is the shoot, as only grafted plants using cbl10 as scion exhibited such sensitivity, which is not observed when cbl10 is used as rootstock. This result suggests that SlCBL10 could have a different function in shoot and in root, being the function in shoot the one involved in salt tolerance in tomato. Also the alteration of the Ca2+ homeostasis in the shoot of cbl10 mutant lead us to propose a role for SlCBL10 in the regulation of Ca2+ homeostasis, being this potential function a crucial one for tolerance of tomato to salt stress.
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