A refrigeração é a forma mais utilizada para a preservação do sêmen suíno empregado na inseminação artificial. Apesar do constante aprimoramento de diluidores comerciais em favor da manutenção da viabilidade espermática, sabe-se que alterações estruturais e principalmente funcionais ocorrem nestas células em resposta às baixas temperaturas de armazenamento. Além disso, embora tais modificações muitas vezes não sejam identificadas pelas análises de rotina, seus efeitos diretos sobre a capacidade fertilizante do espermatozoide tem sido relatados. Em paralelo, uma gama de estudos buscando identificar possíveis ações do plasma seminal sobre a célula espermática in vitro gera ainda resultados bastante controversos. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar como a presença ou não do plasma seminal durante o processo de refrigeração pode influenciar sobre a resposta do espermatozoide suíno aos eventos de capacitação e hiperativação espermática. Para isso, após serem mantidos sobre refrigeração à 17°C por 72 horas, na presença ou não do plasma seminal, espermatozoides foram submetidos à capacitação in vitro e ao decorrer desta, avaliados quanto às características de motilidade pela análise computadorizada do sêmen; e funcionalidade celular por citometria de fluxo. Resultados obtidos à partir das análises de desordem lipídica, translocação da fosfatidilserina e permeabilidade da membrana plasmática mostraram que espermatozoides suínos refrigerados são capazes de responder à capacitação in vitro de forma semelhante, independente de prévia manutenção ou não, com o plasma seminal. Para os parâmetros de motilidade, bem como o estudo da população espermática hiperativada, foram apresentados resultados semelhantes entre ambos os grupos, o que demonstra a não influencia da prévia exposição ao plasma seminal sobre a mudança do padrão de motilidade espermática. Ainda, parâmetros qualitativos avaliados neste estudo suportam nossa afirmação de que, a ausência de contato entre o espermatozoide suíno e os componentes do plasma seminal durante seu armazenamento não reflete em qualquer efeito prejudicial sobre a qualidade espermática, além de oferecer uma maior resistência à estas células contra lesões de acrossoma (P < 0,05). Desta forma, o presente trabalho concluiu que a remoção do plasma seminal previamente ao armazenamento do espermatozoide suíno à 17 °C por 72 horas não é prejudicial à sua qualidade e funcionalidade, podendo ainda ser benéfica à sua capacidade fertilizante. / Liquid storage is the main form of preservation of boar sperm prior to its use in artificial insemination. Despite the constant improvement of commercial extenders in favor of maintaining sperm viability, it is known that structural and mainly functional alterations occur in these cells in response to low storage temperatures. Furthermore, although these modifications are often not identified by routine analyzes, their direct effects on the fertilizing capacity of spermatozoa have been reported. In view of this, in vitro studies aiming to identify possible actions of seminal plasma as modulator of sperm function have yielded controversial results. Therefore, the present work aimed to evaluate how the presence or absence of seminal plasma during liquid storage may influence the responsiveness of spermatozoa to capacitation and hyperactivation events. For this, liquid boar sperm stored at 17 °C for 72 hours in the presence or not of the seminal plasma were submitted to in vitro capacitation. During the course, sperm motility characteristics were evaluated by computer-assisted semen analysis; and sperm functionality by flow cytometry. Results obtained from lipid disorder, phosphatidylserine translocation and plasma membrane permeability analyzes have shown that liquid boar sperm stored in the presence or not of seminal plasma are able to respond to in vitro capacitation in a similar way. For motility parameters including the study of hyperactivated boar sperm, results were similar for both groups, demonstrating that previous exposure to seminal plasma was not able to influence on sperm motility pattern. In addition, semen quality parameters evaluated in this study support our current observations that the absence of contact between spermatozoa and components of seminal plasma during liquid storage does not reflect any detrimental effect on sperm quality, besides offering greater resistance to these cells against acrosome damages (P < 0.05). Therefore, the present study concluded that the removal of seminal plasma prior to liquid storage of boar spermatozoa at 17 °C for 72 hours is not detrimental to its quality and functionality, and may still be beneficial to its fertilizing capacity.

A refrigeração é a forma mais utilizada para a preservação do sêmen suíno empregado na inseminação artificial. Apesar do constante aprimoramento de diluidores comerciais em favor da manutenção da viabilidade espermática, sabe-se que alterações estruturais e principalmente funcionais ocorrem nestas células em resposta às baixas temperaturas de armazenamento. Além disso, embora tais modificações muitas vezes não sejam identificadas pelas análises de rotina, seus efeitos diretos sobre a capacidade fertilizante do espermatozoide tem sido relatados. Em paralelo, uma gama de estudos buscando identificar possíveis ações do plasma seminal sobre a célula espermática in vitro gera ainda resultados bastante controversos. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar como a presença ou não do plasma seminal durante o processo de refrigeração pode influenciar sobre a resposta do espermatozoide suíno aos eventos de capacitação e hiperativação espermática. Para isso, após serem mantidos sobre refrigeração à 17°C por 72 horas, na presença ou não do plasma seminal, espermatozoides foram submetidos à capacitação in vitro e ao decorrer desta, avaliados quanto às características de motilidade pela análise computadorizada do sêmen; e funcionalidade celular por citometria de fluxo. Resultados obtidos à partir das análises de desordem lipídica, translocação da fosfatidilserina e permeabilidade da membrana plasmática mostraram que espermatozoides suínos refrigerados são capazes de responder à capacitação in vitro de forma semelhante, independente de prévia manutenção ou não, com o plasma seminal. Para os parâmetros de motilidade, bem como o estudo da população espermática hiperativada, foram apresentados resultados semelhantes entre ambos os grupos, o que demonstra a não influencia da prévia exposição ao plasma seminal sobre a mudança do padrão de motilidade espermática. Ainda, parâmetros qualitativos avaliados neste estudo suportam nossa afirmação de que, a ausência de contato entre o espermatozoide suíno e os componentes do plasma seminal durante seu armazenamento não reflete em qualquer efeito prejudicial sobre a qualidade espermática, além de oferecer uma maior resistência à estas células contra lesões de acrossoma (P < 0,05). Desta forma, o presente trabalho concluiu que a remoção do plasma seminal previamente ao armazenamento do espermatozoide suíno à 17 °C por 72 horas não é prejudicial à sua qualidade e funcionalidade, podendo ainda ser benéfica à sua capacidade fertilizante. / Liquid storage is the main form of preservation of boar sperm prior to its use in artificial insemination. Despite the constant improvement of commercial extenders in favor of maintaining sperm viability, it is known that structural and mainly functional alterations occur in these cells in response to low storage temperatures. Furthermore, although these modifications are often not identified by routine analyzes, their direct effects on the fertilizing capacity of spermatozoa have been reported. In view of this, in vitro studies aiming to identify possible actions of seminal plasma as modulator of sperm function have yielded controversial results. Therefore, the present work aimed to evaluate how the presence or absence of seminal plasma during liquid storage may influence the responsiveness of spermatozoa to capacitation and hyperactivation events. For this, liquid boar sperm stored at 17 °C for 72 hours in the presence or not of the seminal plasma were submitted to in vitro capacitation. During the course, sperm motility characteristics were evaluated by computer-assisted semen analysis; and sperm functionality by flow cytometry. Results obtained from lipid disorder, phosphatidylserine translocation and plasma membrane permeability analyzes have shown that liquid boar sperm stored in the presence or not of seminal plasma are able to respond to in vitro capacitation in a similar way. For motility parameters including the study of hyperactivated boar sperm, results were similar for both groups, demonstrating that previous exposure to seminal plasma was not able to influence on sperm motility pattern. In addition, semen quality parameters evaluated in this study support our current observations that the absence of contact between spermatozoa and components of seminal plasma during liquid storage does not reflect any detrimental effect on sperm quality, besides offering greater resistance to these cells against acrosome damages (P < 0.05). Therefore, the present study concluded that the removal of seminal plasma prior to liquid storage of boar spermatozoa at 17 °C for 72 hours is not detrimental to its quality and functionality, and may still be beneficial to its fertilizing capacity.

Resumo: Considerando a importância da eubiota intestinal na saúde dos animais, o papel da dieta em sua composição e metabolismo tem sido estudado. Neste aspecto os prebióticos têm merecido destaque, incluindo-se a parede celular de leveduras (PCL), uma fonte natural de mananoligossacarídeos. Para o estudo de seu potencial prebiótico para cães, foram empregadas quatro dietas isonutrientes com inclusão de 0% (T0), 0,15% (T15), 0,30% (T30) e 0,45% (T45) de PCL. Foram utilizados oito Beagles adultos, divididos em dois quadrados latinos 4 X 4. Em cada período uma fase de adaptação de 15 dias precedeu 5 dias de coleta total de fezes para o ensaio de digestibilidade e 1 dia de coleta de fezes frescas para enumeração bacteriana, mensuração de pH e determinação das concentrações de ácidos graxos de cadeia curta e aminas bioativas. No dia 21 de cada período, amostra de sangue foi colhida para quantificação imunofenotípica por citometria de fluxo das subpopulações linfocitárias CD5+CD4+, CD5+, CD5+CD8+, CD45+ e CD45+CD21+. Os dados foram avaliados pelo Proc GLM do SAS, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey e por contraste polinomial e ortogonal (p<0,1). Os coeficientes de digestibilidade dos nutrientes não variaram com a inclusão de PCL (p>0,1). A inclusão de PCL não resultou em diferenças quanto às contagens de anaeróbios totais, aeróbios totais, bifidobactéria, lactobacilos, clostridios nas fezes dos cães (p>0.1). Verificou-se aumento linear na concentração fecal de butirato (p=0,055), redução linear das concentrações fecais de tiramina (P=0,1) e histamina (P=0,07) e redução quadrática de feniletilamina e triptamina (P=0,07). Os cães apresentaram, também, aumento linear na concentração de linfócitos CD5+ (P=0,10) e maior número de linfócitos CD45+CD21+ (P=0,053) mediante ingestão de PCL. Concluiu-se que a PCL apresenta efeito prebiótico... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Considering the importance of the intestinal microbiota to the animal health, the role of diet upon microbiota composition and metabolism have been studied. Prebiotics have been emphasized on this regard, including the yeasts cell walls (YCW), a natural source of mannanoligosaccharides. To study the prebiotic potential of this compound for dogs, four isonutrient diets were used with inclusion of 0% (T0), 0,15% (T15), 0,30% (T30) and 0,45% (T45) of YCW. Eight Beagles adults were used, arranged in two 4 X 4 Latin squares. In each replicate an adaptation phase of 15 days preceded a 5 days of total feces collection for digestibility trial and 1 day collection of fresh fecal samples for bacterial enumeration, pH measurement and determination of short chain fatty-acids and bioactive amines concentration. On day 21, a blood samples were collected for immunophenotypic quantification of lymphocyte subsets CD5+CD4+, CD5+, CD5+CD8+, CD45+ e CD45+CD21+ through flow cytometry. The data were evaluated using Proc GLM of SAS, means were compared by Tukey test and polinomial and orthogonal contrasts (p <0,1). The inclusion of YCW did not change the coefficient of total tract apparent digestibility of nutrients (p>0.1) nor the fecal bacterial enumeration (total aerobes and anaerobes, Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium and Escherichia coli) in dog's feces (p>0.1). Fecal butirate concentration increased linearly with YCW addition (p=0,055), fecal concentrations of tyramine (P=0,1) and histamine (P=0,07) decreased linearly, and phenylethylamine (P=0,07) and tryptamine (P=0,07) concentrations showed a quadratic reduction with YCW consumption. Dogs also presented a linear increase in lymphocytes CD5+ concentration (P=0,10) and a greater CD45+CD21+ lymphocytes number (P=0,053) with YCW addition. In conclusion YCW presents a prebiotic (changing bacterial end product formation) and immunostimulating effect for dogs. / Orientador: Aulus Cavalieri Carciofi / Coorientador: Ruben Pablo Schocken-Iturrino / Banca: Áureo Evangelista Santana / Banca: Maria Beatriz Abreu Glória / Mestre

Orientador: Aureo Evangelista Santana / Coorientador: Letícia Abrahão Anai / Banca: Andrigo Barboza De Nardi / Banca: Sabryna Gouveia Calazans / Banca: Thiago Demarchi Munhoz / Banca: Felipe Augusto Ruiz Sueiro / Resumo: O linfoma pode ser caracterizado pela proliferação clonal de linfócitos malignos nos órgãos linfóides, podendo, porém, atingir diversos tecidos entre os quais a pele, denominado linfoma cutâneo. No cão, o linfoma cutâneo pode apresentar-se clinicamente por lesões localizadas ou generalizadas, podendo evoluir para lesões em placas e nódulos, muitas vezes edemaciados, ulcerados e hemorrágicos. Segundo avaliação histopatológica, podem ser classificados em epiteliotrópico ou não epiteliotrópico, com linhagem imunofenotípica T ou B, sendo o T mais comum. Células T reguladoras são linfócitos com capacidade imunossupressora, com papel importante na manutenção de processos fisiológicos, impedindo respostas de autoimunidade. Além disto, estudos demonstraram a influência das mesmas na supressão de respostas anti-tumorais, permitindo o escape das células neoplásicas dos mecanismos de defesa. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a presença das células T reguladoras em 12 cães com linfoma cutâneo T e 12 animais saudáveis, no sangue periférico e pele, através das técnicas de citometria de fluxo, avaliando porcentagens de Tregs, células T CD4+ e CD8+, e imuno-histoquímica, com a expressão tecidual de Foxp3. Observou-se maior número de Tregs no sangue periférico de cães com linfoma cutâneo (10,84±1,18) em relação aos animais saudáveis (5,67±0,89), sem diferença quanto às porcentagens de células CD4+ (48,26±4,54; 51,01±4,92, respectivamente) e CD8+ (30,32±4,82; 31,78±5,65... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lymphoma can be characterized by clonal proliferation of malignant lymphocytes in the lymphoid organs, but may reach several tissues including the skin, called cutaneous lymphoma. In dogs, the cutaneous lymphoma may present clinically as localized or generalized lesions, wich may progress to plaque and nodules, often swollen, ulcerated and bleeding. Histologically, they can be classified as epitheliotropic or non-epitheliotropic, with immunophenotypic line T or B. Regulatory T cells are lymphocytes with immunosuppressive capacity, with a significant role in the maintenance of physiological processes, preventing autoimmunity responses. Furthermore, studies have demonstrated their influence in the suppression of anti-tumor responses, allowing the escape of neoplastic cells from the defense mechanisms. Thus, the present study aimed to evaluate the presence of regulatory T cells in 12 dogs with cutaneous T cell lymphoma and 12 healthy animals in peripheral blood and skin, through flow cytometry techniques, assessing blood concentration of Tregs, CD4+ and CD8+, and immunohistochemical, through tissue expression of Foxp3. A higher number of Tregs in the peripheral blood of dogs with cutaneous lymphoma (10,84±1,18) was observed in relation to the healthy animals (5,67±0,89), with no difference in the percentages of CD4 + (48,26±4,54; 51,01±4,92, respectively) and CD8 + (30,32±4,82; 31,78±5,65, respectively) cells. There was no difference in cellular values between the animals with ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Valeria Valente / Banca: Ana Lucia Fachin Saltoratto / Banca: Cleverton Roberto de Andrade / Resumo: O câncer é um conjunto de alterações celulares que favorecem a proliferação descontrolada e a aquisição de propriedades metastáticas. A ativação de oncogenes e/ou a perda de genes supressores tumorais leva a desbalanços nos mecanismos de controle do ciclo celular e/ou na inativação das vias apoptóticas, contribuindo para a instabilidade genômica presente em todos os tipos tumorais. Relatos na literatura têm sugerido que o estresse replicativo oriundo desse aumento proliferativo exacerbado é um fator importante na formação e progressão de muitos tipos de câncer. Dentro dessa perspectiva, é plausível pensar que as células tumorais tenham desenvolvido certas competências que as permitam lidar com o estresse replicativo para continuar se propagando. Resultados prévios de nosso laboratório sugerem que a proteína centromérica HJURP (Holliday Junction Recognizing Protein) esteja envolvida nesse ganho de competência. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo a análise do papel dessa proteína frente ao estresse replicativo em linhagens de glioblastoma. Nossos resultados demonstraram que a superexpressão de HJURP confere um aumento na capacidade proliferativa celular da linhagem U87MG. Além disso, vimos que em baixas concentrações de camptotecina as células superexpressoras de HJURP possuíam um comportamento proliferativo muito semelhante à condição não tratada. Os ensaios de citotoxicidade revelaram uma maior capacidade de recuperação frente ao estresse replicativo exógeno nas sit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cancer is characterized by a subset of features that supports uncontrolled cell proliferation and acquisition of metastatic properties. Oncogene activation and/ or the deactivation of tumor suppressor genes lead to disbalances in cell cycle control progression and/or inactivation of apoptotic pathways, followed by genomic instability present in all types of tumors. According to the literature, replicative DNA stress arising from uncontrolled cell growth is the major driver in the development and progression of many cancers. In this perspective, it is believed that cancer cells have developed some skills in order to deal with high levels of endogenous replicative stress for their continued proliferation. Previous results from our group suggest that the centromeric protein HJURP (Holliday Junction Recognizing Protein) is involved in this mechanism. Thus, in this work, we aimed to analyze the role of this protein in the cellular response to the replicative stress in glioblastoma U87MG cell line. Our data showed that cells who levels of HJURP were high, had an increase in cell growth. Besides that, we also observed that at lower camptothecin concentrations the curve proliferation of overexpressed HJURP cells had a similar behavior as the control cells. The cytotoxicity results demonstrated that cells overexpressing HJURP had a better replicative induced stress when compared to the control cells. Together, this data suggests... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introducció: El carcinoma de pulmó és un dels problemes de salut prioritari de la societat actual, amb una major presència en homes entre els 55 i 65 anys. És una neoplàsia molt agressiva i malgrat els esforços de crear noves teràpies de QT amb diferents combinacions de fàrmacs, o RT i QT conjuntament, s'han millorat poc les taxes de supervivència d'aquesta malaltia. Sabem, per altre banda, que el cicle cel·lular amb les seves diferents fases són objecte d'una regulació bioquímica molt complexa. En aquesta tesi ens vam centrar en l'estudi d'unes quantes proteïnes implicades en el cicle (PCNA, Ki-67, p53, ciclines D1 i E) i veure quin paper tenien. Objectius de la tesi: 1) Determinar mitjançant tècniques de citometria de flux (CMF) l'índex de DNA, la fase S i el percentatge de cèl·lules PCNA positives i també el grau d'heterogeneïtat per a cadascuna en el carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPNCP), tant en els tumors primaris com en les seves metàstasis ganglionars. 2) Investigar si existeix un patró o patrons d'índexs de DNA i/o de fase S i/o de percentatge de PCNA relacionables amb el fenomen metastàtic. 3) Determinar l'expressió de l'antígen de proliferació cel·lular PCNA a les diferents fases del cicle cel·lular i avaluar si hi ha alguna relació estadística amb altres paràmetres estudiats. 4) Quantificar per mitja de tècniques d'immunohistoquímica el grau d'expressió de marcadors de proliferació cel·lular (PCNA, Ki-67), els reguladors negatius (p53) i les ciclines (D i E). 5) Avaluar les possibles relacions entre les variables següents: clíniques, anatomopatològiques, variables de CMF i variables immunohistoquímiques. 6) Analitzar estadísticament les variables que puguin ser valorades com a factor pronòstic independent. Material i mètodes: Es varen seleccionar 99 mostres de CPCNP entre 1993-1997, 89 homes i 10 dones. Es van recollir 4 tipus de dades diferents i per separat, per garantir l'objectivitat en l'obtenció de les variables. dades clíniques, anatomopatològiques, immunohistoquímiques i de citometria de flux. Les dades clíniques es van recollir per calcular la supervivència lliure i la global de la malaltia. Les dades anatomopatològiques, immunohistoquímiques i de CMF s'obtingueren de les anàlisis de les recessions quirúrgiques remeses al laboratori durant la intervenció dels malalts. Cada mostra fou dividida en dues parts: una per a CMF per l'estudi del cicle cel·lular i expressió de l'antígen PCNA a les diferents fases del cicle i l'altre per a l'estudi histològic rutinari i per l'anàlisi amb tècniques d'immunohistoquímica. Resultats: Un 70% dels adenocarcinomes es van diagnosticar a l'estadi IIIA. Ki-67, PCNA i ciclina E estaven relacionades amb el tipus histològic de carcinoma indiferenciat de cèl·lula gran (CICG). La ciclina E també estava relacionada amb el CE. La ciclina D1 amb el grau de diferenciació. PCNA i ciclina E també estaven relacionades significativament amb Ki-67. A l'anàlisi univariable en relació amb la supervivència global de la malaltia, l'estadi, CV de l'íDNA i de la fase S assoleixen la significació estadística, com a variables relacionades amb l'evolució de la malaltia. Finalment a l'anàlisi multivariable per la supervivència global de la malaltia, l'estadi i el CV de la fase S assoleixen un valor pronòstic independent. Conclusions: Hi ha una relació directa entre l'estadi i la supervivència global dels malalts. Les variables determinades per immunohistoquímica no tenen implicacions pronostiques. Hi ha una relació entre el CICG i l'expressió augmentada de marcadors de proliferació. La sobreexpressió de ciclina D1 es relaciona directament amb els CPNCP pobrament diferenciats. La fase S es relaciona amb l'expressió augmentada del PCNA per CMF. L'heterogeneïtat en l'expressió del PCNA per CMF es relaciona amb el grau d'heterogeneïtat de l'íDNA i fase S. / Introduction: Lung carcinoma is one of the priority health problems in our society. It shows mainly in men from 55 to 65 years. Is a very aggressive neoplasm and in spite of the efforts done in chemotherapy or combined with radiotherapy, the survival rate has not improved much. On the other hand, we know that the cellular cycle with its different phases is object of a very complex biochemical regulation. In this thesis we pay attention to the study of some cell cycle proteins (PCNA, KI-67, P53, cyclin D1 and E) and to try to see their functions. Objects of thesis: 1) To determine by flow cytometry (FCM) DNA index, S phase, percentage of positive PCNA cells and the heterogeneity degree of every one in non-small-cell-lung carcinomas (NSCLC), in primary tumors and ganglionary metastases. 2) To research the existence of a model or models of DNA index and/or S phase and/or a percentage of PCNA related with metastatic phenomenon. 3) To determine the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression during the cell cycle and to evaluate if there are any other statistic relation with other study parameters. 4) To calculate by immunohistochemistry the degree of expression of cellular proliferating markers (PCNA, Ki-67), negative regulators (p53) and cyclins (D and E). 5) To assess the potential relations between the following values: clinics, anatomopathologics, FCM and immunohistochemistry. 6) To analyze statistically the values that might be important as an independent prognostic factor. Material and methods: We colleted 99 samples of NSCLC from 1993 to 1997, 89 men and 10 women. We collected four different types of data, in order to guarantee the objectivity when we obtain the values: clinical data, anatomopathologic, immunohistochemistry and FCM data. The clinical data was obtained to calculate the free survival and global survival of disease. The anatomopathologic, immunohistochemistry and FCM data was obtained by the analysis of surgically resected lung carcinomas that were sent to laboratory. Every sample was divided in two parts: one to study cell cycle and PCNA expression in different phases of cycle by FCM and the other to study the sample by histological study and immunohistochemical techniques. Results: 70% of adenocarcinomas were diagnosed as stage IIIA. Ki-67, PCNA and cyclin E were related with large cell carcinoma histological type, cyclin E was related too with squamous cell carcinoma type. Cyclin D1 was related with the degree of cell differentiation. PCNA and cyclin E were significantly correlated with Ki-67. A univariate analysis of global survival showed that study, variation coeficient of DNA index and variation coeficient of S phase were the most significant prognostic factors as variables related with disease evolution. Finally in a multivariate analysis to global survival disease, study and variability of S phase showed an independent prognostic value. Conclusions: There is a direct relationship between study and global survival of patients. The variables detected immunohistochemically do not have prognostic factors. There is a relationship between large cell carcinoma and high value of proliferative markers. Cyclin D1 over-expression is directly related with poorly differentiated NSCLC. S phase is related with a high PCNA expression by flow cytometry. Heterogeneity in PCNA expression by flow cytometry is related with heterogeneity degree of DNA index and S phase.

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una proliferación neoplásica de células inmaduras de estirpe mieloide que se produce por una alteración en la regulación del crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas. Durante las décadas de los 80 y 90 se produjo un avance muy importante en el diagnóstico de la leucemia aguda que ha permitido un mayor refinamiento diagnóstico y por tanto un tratamiento más individualizado de los enfermos. Aproximadamente el 60-80% de los adultos con LMA consiguen remisión completa, pero sólo el 30-40% de estos pacientes está vivo y libre de enfermedad a los 5 años. Estos datos indican que a pesar del avance conseguido en los últimos años es necesario continuar estudiando esta enfermedad tan heterogénea. Los principales factores pronósticos en la LMA pueden dividirse entre los relacionados con características del paciente y los relacionados con características de la leucemia. En la actualidad la citogenética en el momento del diagnóstico constituye el factor pronóstico más importante para predecir la evolución clínica de los pacientes. La identificación de diferentes alteraciones moleculares está permitiendo refinar el pronóstico de determinados grupos de LMA, como el de citogenética normal. Los datos inmunofenotípicos obtenidos por citometría de flujo también son de utilidad pronóstica, especialmente durante el seguimiento de los pacientes mediante la detección de la enfermedad residual mínima (ERM). En los trabajos incluidos en esta tesis se analiza el significado pronóstico de determinados aspectos inmunofenotípicos y moleculares. En el primer trabajo se analiza la inestabilidad de microsatélites (MSI) en pacientes jóvenes (<60 años) con LMA de novo. La MSI es un fenómeno que provoca inestabilidad genética y que juega un papel muy importante en la patogénesis de las neoplasias sólidas. Su implicación en la leucemogénesis es controvertida. En nuestro estudio se observa que la MSI no es infrecuente en pacientes jóvenes con LMA de novo. No se ha observado una asociación entre la presencia de la MSI y el pronóstico de los pacientes. La MSI no se asocia de forma significativa con ninguna lesión molecular concreta lo que sugiere que esta alteración no es dependiente de ninguna vía molecular específica. En el segundo trabajo se analiza el seguimiento de la ERM mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa en pacientes con LMA y citogenética de buen pronóstico [t(8;21)/inv(16)/t(16;16)]. Hemos observado que ambos métodos son útiles y eficaces para el seguimiento de la ERM en este grupo de pacientes. Se han podido definir unos valores críticos de ERM, tanto por citometría de flujo como por PCR cuantitativa, que permiten identificar pacientes con mayor riesgo de recaída al final del tratamiento quimioterápico y que serían, por tanto, candidatos a recibir un tratamiento más intensivo. Por último, se han analizado las características inmunofenotípicas al diagnóstico de pacientes jóvenes con LMA de novo y se ha estudiado la correlación de la expresión de determinados antígenos con las características clínicas, biológicas y con el pronóstico. CD2 es un marcador linfoide que se expresa con mayor frecuencia en LMA asociadas a la inv(16)/t(16;16), tal y como está descrito en la literatura. La expresión de CD2 no modifica el buen pronóstico de este tipo de leucemias, pero por el contrario, se asocia a una mayor tasa de refractariedad al tratamiento de inducción y por tanto, a una menor supervivencia cuando se expresa en otros tipos de LMA. CD36 se expresa en LMA con participación monocítica y, en nuestro estudio, se asocia con una menor supervivencia y un mayor riesgo de recaída. Este peor pronóstico es independiente de otros factores como la citogenética o la presencia de la FLT3-ITD. Por tanto, el perfil inmunofenotípico al diagnóstico puede aportar información pronóstica complementaria. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous group of diseases characterized by a neoplastic proliferation of immature myeloid lineage cells produced by an alteration in the regulation of growth and differentiation of hematopoietic cells. This alteration will cause the accumulation of immature myeloid precursors capable of replication, but has lost its ability to differentiate into mature hematopoietic cells. During the decades of 80 and 90 there was a major advance in the diagnosis of AML that has allowed a more refined diagnosis and therefore a more individualized treatment of patients. About 60-80% of adults with AML achieve complete remission, but only 30-40% of these patients are alive and free of disease at 5 years. These data indicate that despite the progress achieved in recent years in diagnosis and treatment of AML, it is necessary to continue studying this disease. Prognostic factors in AML can be divided into those related to patient characteristics and those related to leukemia features. Today cytogenetics at the time of diagnosis is the most important prognostic factor for predicting clinical outcome of patients. In recent years the identification of different molecular alterations are allowing to refine the prognosis of certain groups of AML, like normal cytogenetics. Immunophenotypic data obtained by flow cytometry are also of prognostic value, especially for the study of minimal residual disease (MRD) in patients in complete remission. The papers included in this thesis examine the prognostic significance of certain immunophenotypic and molecular aspects. In the first paper we analyzed the microsatellite instability (MSI) in young patients (<60 years) with de novo AML. The MSI is a phenomenon that causes genetic instability and plays an important role in the pathogenesis of solid tumors. Their involvement in leukemogenesis is controversial. Our study shows that MSI is not an uncommon finding in young patients with de novo AML. It was observed that the presence of the MSI does not affect the prognosis of patients. The MSI was not significantly associated with any particular molecular lesion suggesting that this alteration is not dependent on any specific molecular pathway. The second paper discusses the monitoring of MRD by flow cytometry and quantitative PCR in AML patients with good prognosis cytogenetic [t(8;21) and inv(16)]. We observed that both methods are useful and effective for monitoring MRD in these patients. It was possible to define a threshold of ERM, both by flow cytometry and by quantitative PCR, which can identify patients at increased risk of relapse at the end of chemotherapy. These patients would candidates for more intensive treatment. Finally, we have analyzed the immunophenotypic characteristics at diagnosis of young patients (<60 years) with de novo AML. We studied the correlation of the expression of specific antigens with the clinical and biological characteristics and prognosis. CD2 is a lymphoid marker that is expressed more frequently in AML associated with inv(16), as described in the literature. The expression of CD2 does not alter the good prognosis of this type of leukemia, but instead is associated with decreased survival when expressed in other types of AML due to a higher rate of refractory to induction therapy. CD36 is frequently expressed in AML with monocytic involvement and, in our study is associated with decreased survival and increased risk of relapse. A multivariate study shows that the prognostic value of CD36 is independent of other factors such as cytogenetics and FLT3-ITD. Therefore, the immunophenotypic profile of diagnosis may provide additional prognostic information in AML.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-11Bitstream added on 2015-04-09T12:48:10Z : No. of bitstreams: 1 000813832_20150711.pdf: 211442 bytes, checksum: ae09adc1e315a8f0dd0f3d34bcfd4f9b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:07Z: 000813832_20150711.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:20Z : No. of bitstreams: 1 000813832.pdf: 2665159 bytes, checksum: a88a775cdeb772a5823624b15944a8d7 (MD5) / O mastocitoma é uma neoplasia caracterizada pela proliferação de mastócitos e corresponde ao tumor cutâneo mais frequente em cães. Seu comportamento biológico extremamente variável dificulta a determinação prognóstica e terapêutica, o que torna necessário a busca por indicadores prognósticos mais confiáveis. As células T regulatórias (Tregs) constituem um subgrupo dos linfócitos T que expressam CD4 e CD25, e são transcritas pelo fator Foxp3. As Tregs, através de seu potencial imunossupressor, regulam as respostas imunes em diversas enfermidades. Do ponto de vista oncológico, elas são responsáveis pela limitação da resposta imune antitumoral, promovendo uma tolerância imunológica às células neoplásicas mastocitárias. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo quantificar, através da citometria de fluxo, a expressão de Tregs e a relação Treg/CD8+ no sangue periférico de cães portadores de mastocitoma cutâneo (n = 18) no momento do diagnóstico. Tais variáveis também foram avaliadas entre diferentes graus histológicos de mastocitoma, segundo classificação de Kiupel et al. (2011). Os resultados mostraram que cães portadores de mastocitoma (8,99 ± 1,15) apresentaram porcentagem significativamente maior (p<0,01) de Tregs do que cães saudáveis (4,71 ± 0,51). Não houve diferença nas quantidades de Tregs obtidas para cães portadores de mastocitoma de alto grau (5,55 ± 1,16) e baixo grau (4,96 ± 0,70). Cães com mastocitoma (0,27 ± 0,04) também apresentaram relação Treg/CD8+ significativamente maior (p = 0,04) do que os cães controle (0,12 ± 0,01). Concluiu-se que o mastocitoma em cães leva a um aumento na população de Tregs no sangue periférico, além de propiciar um aumento na relação Treg/CD8+ / Mast cell tumor is a neoplastic proliferation of mast cells which is the most frequent cutaneous tumor in dogs. Its extremely variable biological behavior makes the prognostic and therapeutic determination more difficult, which demands the search for more reliable prognostic indicators. The regulatory T cells (Tregs) are a subset of T lymphocytes that express CD4 and CD25, and are transcribed by Foxp3 factor. The Tregs, through their immunosuppressive potential, regulate the immune responses in several diseases. Regarding the oncological aspects, they are responsible for the limitation of the antitumoral immune response, promoting an immunological tolerance to the neoplastic mast cells. In this context, the current study had the objective to quantify, through flow cytometry, the expression of Tregs and the Treg/CD8+ ratio in the peripheral blood of dogs with cutaneous mast cell tumor (n = 18) at diagnosis. Such variables were also evaluated in different histologic grades of mast cell tumor, according to the grading system proposed by Kiupel et al. (2011). The results indicated that dogs with mast cell tumor (8,99 ± 1,15) showed significantly higher percentage (p<0,01) of Tregs when compared to healthy dogs (4,71 ± 0,51). There was not difference in the quantities of Tregs for dogs with high (5,55 ± 1,16) and low (4,96 ± 0,70) grade mast cell tumor. Dogs with mast cell tumor (0,27 ± 0,04) also presented significantly higher Treg/CD8+ ratio (p = 0,04) when compared to control dogs (0,12 ± 0,01). It was concluded that the mast cell tumor in dogs increases Tregs in the peripheral blood, and also leads to a higher Treg/CD8+ ratio

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / A sepse apresenta crescente incidência e elevada morbidade e mortalidade, sendo a principal causa de óbito nas unidades de terapia intensiva. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento dos microrganismos pelas células do hospedeiro e de resposta efetora competente. Paradoxalmente, na sepse, os mecanismos de proteção estão também envolvidos no processo de doença, sendo o limite entre resposta protetora e de lesão ainda impreciso. Objetivos: Avaliar a expressão de receptores de reconhecimento de patógenos na superfície de monócitos e a resposta a estímulos exógenos - LPS, IL-1 P e TNF-α - in vitro, medida pela produção de citocinas, em pacientes em diferentes estádios da sepse. Métodos: Foram incluídos 41 pacientes, classificados de acordo com as definições do consenso de 1992 sendo, 14 com sepse, 12 com sepse grave e 15 com choque séptico. Dezessete voluntários sadios foram incluídos como controle. Através da citometria de fluxo, a expressão de TLR2, TLR4, CD14, CD11b e CD11c foi analisada na superfície dos monócitos em sangue total. A forma solúvel do receptor CD14 (sCD14) também foi mensurada em soro através de ELlSA. A produção de citocinas inflamatórias (TNF-α e IL-6) e antiinflamatória (IL-10) foi mensurada em sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico após os estímulos de LPS, IL-1 P e TNF-α in vitro. Resultados: Foi detectado aumento do sCD14 sérico e uma queda expressão de mCD14 em monócitos periféricos nos pacientes em relação aos voluntários sadios (p<0,01). Entretanto não houve diferença entre os grupos estudados quanto à expressão dos receptores TLR2, TLR4, CD11b e CD11c. O grupo com sepse apresentou, comparado com os outros grupos, aumento da produção de IL-6 e TNF-α após o estímulo de LPS. Esta regulação positiva foi menos intensa com IL-1 p e ausente com TNF-α Uma regulação negativa da produção de citocinas inflamatórias foi observada na sepse grave e choque séptico. Não foi observada diferença significante na produção de IL-10 entre os grupos, todavia uma menor produção frente ao estímulo de LPS foi detectada nos pacientes em choque séptico em relação aos pacientes em sepse (p<0,05). A correlação entre receptores de superfície de monócitos e produção das citocinas frente ao LPS pode ser demonstrada quando os resultados obtidos dos pacientes sépticos foram agrupados. Surpreendentemente, detectou-se correlação da expressão dos mesmos receptores com os outros estímulos utilizados, IL-1 p e TNF-α., também foi observada. Conclusões: Neste estudo demonstramos que a resposta inflamatória está associada com o continuum de manifestações clinicas, com uma forte resposta na fase inicial (sepse) e quadro refratário nas fases tardias (sepse grave e choque séptico). A correlação observada entre os receptores de superfície e a produção de citocinas frente aos estímulos de TNF-α e IL-1p e o mesmo padrão de resposta observado com os diferentes estímulos sugere um padrão de resposta imunológica que não depende apenas da expressão dos receptores avaliados e provavelmente, tem uma regulação na via de sinalização intracelular. / Sepsis presents increasing incidence and high morbidity and mortality and is the main cause of death in the intensive care units. The infection control depends on the adequate microorganism recognition by the host cells and competent effector’s response. Paradoxically, in sepsis, the protective mechanisms are also involved in the illness process, with the limit between protective and harmful response still inexact. Purpose: To evaluate the expression of pathogen recognition receptors on monocytes surface and the response to exogenous stimulus - LPS, IL-1β e TNF-α - in vitro, measured by the cytokine production, in patients in different sepsis stages. Methods: Forty one patients, classified in accordance with the definitions of the Consensus of the 1992, had been enrolled: 14 with sepsis, 12 with severe sepsis and 15 with septic shock. Seventeen healthy volunteers were included as control. Through flow cytometry, the expression of TLR2, TLR4, CD14, CD11b and CD11c were analyzed on monocytes surface in whole blood. The soluble form of CD14 receptor (sCD14) also was measured in serum by ELISA. Inflammatory (TNF-α and IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) cytokine levels was measured in peripheral blood mononuclear cells supernatants following LPS, IL-1β e TNF -α - stimulus in vitro. Results: An increase in sCD14 in sera and a decreased mCD14 expression on peripheral monocytes were found in patients comparing to healthy volunteers (p<0,01). However, no differences in the expression of TLR2, TLR4, CD11b and CD11c were found among the groups. The sepsis group showed, compared with the others groups, higher IL-6 and TNF-α production after LPS stimulus. This positive regulation was less intense with IL-1β and absent with TNF- α. A negative regulation of the inflammatory cytokine production was observed in severe sepsis and shock septic patients comparing to the sepsis and healthy group, independent of the stimulus. No significant difference in the IL-10 production was found among the groups, yet a lower production after LPS challenge was detected in septic shock compared with the sepsis patients (p<0,05). A correlation between monocytes surface receptors and cytokine production after LPS challenge could be demonstrated when the results of the septic groups had been grouped. Surprising, correlation of the expression of the same receptors with the other stimulus used, IL-1β e TNF-α, were also observed. Conclusions: In this study we show that the inflammatory response is associated with the continuum of clinical manifestations of sepsis, with a strong inflammatory response in the early-phase (sepsis) and refractory picture in the late-phases (severe sepsis and septic shock). The correlation between the cell surface receptors and the cytokine production after IL-1β e TNF-α stimuli and the observation of one same standard response with the different stimulus suggest a pattern of immunology response that does not depend only of the expression of the evaluated receptors and, probably, has a regulation in the intracellular signaling pathways. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-22T14:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 226939.pdf: 3454383 bytes, checksum: 7d7e59308e868c47560d7e343508b37c (MD5)