Made available in DSpace on 2014-12-05T18:38:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) ana_fernandes_ipcec_dout_2011.pdf: 1168893 bytes, checksum: 8127e15ae5d45011b8d8ba254de4a33d (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A citotoxicidade mediada por células desempenha um importante papel na regulação da infecção pelo HPV e na formação de tumores. Apoptose é regulada por diferentes vias envolvendo genes que promovem (BAX) ou inibem (BCL2) a morte celular. Avaliamos a presença de células cervicais inflamatórias, marcadores apoptóticos (BAX, BCL-2, FasL, NOS2, perforina) e o marcador de degranulação (CD107a) em mulheres HPV e HPV/HIV através da técnica de imunohistoquimca. Uma alta porcentagem de células T CD4+ e CD8+ foram observadas em ambos os grupos, com baixa contagem de células T CD4+ em mulheres HPV/HIV. Houve poucas células expressando FasL, BAX e BCL-2 em ambos os grupos. A expressão de NOS2 estava presente especialmente em queratinócitos na camada basal do epitélio em ambos os grupos. Perforina foi idenficada em poucas células cervicais. Contudo, CD107a foi detectado na camada basal do epitélio e estroma, principalmente em mulheres HPV. Determinamos se os SNPs em promotores dos genes BCL2 (-938C>A) e BAX (-248G>A) estariam associados com o risco de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) A frequência observada desses SNPs estavam em equilíbrio de Hardy\2013Weinberg nos casos e controles. Nenhuma diferença estatística na frequência genotípica e alélica do polimorfismo de BCL-2 (-938C>A) foi observada entre casos e controles. Contudo, uma forte associação foi identificada na freqüência do genótipo GG de BAX (-248G>A) entre os casos e controles. Quando os grupos de LSIL e HSIL foram comparados, nenhuma diferença estatística foi observada, indicando que o genótipo GG pode influenciar no aparecimento de lesões cervicais, mas não na gravidade da doença. Analisamos a expressão de RNAm de genes associados a apoptose (BAX, BCL2, p53 e pRb) e citotoxicidade (perforina e Fas). Quando a expressão de RNAm de Perforina e Fas foram avaliadas, diferença estatística foi observadas em pacientes portadoras de NIC III e câncer Observamos diferença estatística entre os controles e todos os casos, quando analisamos a expressão de RNAm de p53, mas não de pRb, sendo observada diferença apenas nos controles e NIC II e III. Na analise de RNAm de BCL2, notamos uma baixa expressão no grupo de câncer quando comparado com NIC II, III e controle. Em conclusão, a infecção pelo HIV pode induzir redução na degranulação de células inflamatórias, corroborando para a progressão de infecção pelo HPV, e que carreadoras do alelo G na região promotora de BAX (-248G>A) pode estar associado ao desenvolvimento de NIC quando comparado com as carreadoras do alelo A, possuindo papel protetor; contudo o alelo G não está correlacionado com a gravidade da doença / Cell - mediated cytotoxicity plays an important role in the regulation of HPV infection, and in tu mor formation. Apoptosis is regulated by different pathways involving a number of genes that either prom ote ( BAX gene)or inhibit ( BCL2 gene) the cell death. We evaluated the presence of cervical inflammatory cells, apoptotic (Bax, Bcl - 2, FasL, NOS2, perforin) markers and the degranulating expressing cell marker (CD107a) from HPV and HPV/HIV women. Higher per centage of cervical CD4 + and CD8 + T cells were observed in both groups, with lower CD4 + T cells count observed in HPV/HIV women. There were few FasL, Bax and Bcl - 2 inflammatory cervical expressing cells in both groups. NOS2 expression was present especially in the epithelium basal layer on keratinocytes in both groups. Perforin was identified in few cervical cells. However, CD107a was detected in the epithelium basal layer and stroma, meanly on HPV women. We determined whether the SNPs of BCL2 ( - 938C>A) and BAX ( - 248G>A) promoters are associated with risk of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) outcome. The observed genotype frequencies of these SNPs were in agreement with Hardy – Weinberg equilibrium in cases and control groups. No statistical difference i n genotype and allelic frequency of BCL - 2 ( - 938C>A) polymorphism was observed between all cases and control groups. However, a strong association was identified in GG genotype frequency of BAX ( - 248G>A) polymorphism between cases and controls. When LSIL an d HSIL groups were compared, no statistical difference was observed, indicating that GG genotype may influence the risk of CIN but not the lesion severity. We analyzed the mRNA expression of apoptosis - associated genes ( BAX, BCL2, p53 and pRb ) and cytotoxic ity - related genes ( perforin and Fas ). When Fas and Perforin mRNA expressions were evaluated, the statistical difference between CIN III and cancer was seen. We observed a statistical difference between control and all cases, when we analyzed p53 mRNA, but in pRb mRNA, we observed difference between control group and CIN II or CIN III. In BCL2 mRNA evaluation, we observed low expression in cancer group when compare with CIN II, III and control. In relation to BAX mRNA, a statistical difference was evaluated with all cases and control. In conclusion, HIV infection may induce reduction on inflammatory cervical cells degranulation corroborating to HPV progression and allele G carriers in the promoter regions of BAX ( - 248G>A) can be related to CIN development whe n compared with allele A carriers that play a protective role; however, allele G was not correlated with the disease severity

Submitted by Gabriela Lopes Fernandes null (fernandesgabriela@hotmail.com) on 2016-04-26T02:15:37Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇAO corrigida apos defesa.pdf: 2381955 bytes, checksum: d2d0625873eb0adb534225cb634d70f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T12:35:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandes_gl_me_arafo.pdf: 2381955 bytes, checksum: d2d0625873eb0adb534225cb634d70f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T12:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandes_gl_me_arafo.pdf: 2381955 bytes, checksum: d2d0625873eb0adb534225cb634d70f9 (MD5) Previous issue date: 2016-04-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo geral desse estudo foi sintetizar e caracterizar nanobiomateriais compostos por nanopartículas de prata (AgNP) e glicerofosfato de cálcio (CaGP) sintetizados por rotas químicas utilizando-se borihidreto de sódio ou citrato de sódio e fitoquímica por meio de extrato da casca de romã, e avaliar seu efeito antimicrobiano contra cepas de referência de Candida albicans (ATCC 10231) e Streptococcus mutans (ATCC 25175) e sua citotoxicidade em células de fibroblastos (L929). Além do agente redutor, para as sínteses químicas variou-se a concentração de prata (1 ou 10%), a apresentação do CaGP (micro ou nanoparticulado), o solvente utilizado na síntese (água deionizada ou isopropanol) e a forma dos nanocompostos (em suspensão, seco em estufa ou liofilizado). Para a síntese fitoquímica utilizou-se o extrato da casca desidrata da romã, obtido por percolação em etanol (70%) e com os compostos totais fenólicos expressos em ácido gálico e a concentração de ácido elágico quantificados respectivamente por método colorimétrico e HPLC. A caracterização dos nanocompostos e dos controles contendo somente AgNP foi feita por UV-Vis, MEV, e EDX. A ação antimicrobiana foi avaliada por meio da mínima contração inibitória de acordo com o método da microdiluição (CLSI M27-A2 e M07-A9), enquanto que a viabilidade celular dos fibroblastos foi quantificada utilizando-se método fluorimétrico (Alamar Blue). Esses experimentos foram realizados em triplicata em três ocasiões diferentes e os dados de porcentagem de viabilidade celular foram analisados pela ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni (α=5%). Para todas as sínteses houve formação de AgNP associadas ao CaGP. Contudo pela microscopia somente na concentração de 10% de prata visualizou-se as AgNP decorando a superfície do CaGP (síntese com borihidreto de sódio e isopropanol) ou envolta pelo CaGP (síntese com borihidreto e água e com casca da romã). Os nanocompostos sintetizados quimicamente foram mais efetivos contra os microrganismos testados que os sintetizados pela rota fitoquímica, especialmente quando utilizou-se citrato de sódio como agente redutor. Pela rota fitoquímica com a romã, o nanocomposto AgNP-CaGP foi mais efetivo contra C. albicans que o controle AgNP e o contrário ocorreu para S. mutans. A utilização do extrato da romã para as sínteses reduziu significativamente (p < 0,05) a citotoxicidade tanto do nanocomposto AgNP-CaGP como das AgNP quando comparados com aqueles sintetizados quimicamente, independente do agente redutor utilizado na reação. Ainda, para todas as sínteses, o CaGP reduziu significativamente (p < 0,05) a citotoxicidade dos nanocompostos AgNP-CaGP quando comparados com as AgNP isoladas. Conclui-se que os nanocomposto formado por AgNP e CaGP apresenta efetividade antimicrobiana contra importantes patógenos relacionados a cárie dentária e que sua citotoxicidade foi reduzida quando utilizou-se a casca da romã como agente redutor da prata. / The aim of this study was to synthesize and characterize nanomaterials compounds by silver nanoparticles (AgNP) and calcium glycerophosphate (CaGP) synthesized by chemical route using sodium borihidreto or sodium citrate, and phytochemical through pomegranate peel extract, and evaluate its antimicrobial effect against reference strains of Candida albicans (ATCC 10231) and Streptococcus mutans (ATCC 25175) and its cytotoxicity in fibroblast cells (L929). Besides, reducing agent for chemical syntheses, is varied the silver concentration (1 or 10%), the form of CAGP (micro or nanoparticulate), the solvent used in synthesis (deionized water or isopropanol) and the form of the nanocomposite ( suspended, dry in incubator or lyophilized). For the phytochemical synthesis, utilized the peel extract of pomegranate obtained by percolation in ethanol (70%) and total phenolic compounds was expressed in gallic acid standard and ellagic acid concentration respectively quantified by colorimetric method HPLC. The characterization of nanocomposites and controls containing only AgNP was made by UV-Vis spectroscopy, SEM and EDX. The antimicrobial activity was evaluated by the minimum inhibitory concentration according to the microdilution method (CLSI M27-M07-A2 and A9), whereas fibroblast cell viability was quantitated using fluorimetric method (Alamar Blue). These experiments were performed in triplicate on three different occasions and the cell viability percentage data were analyzed by one-way ANOVA followed by Bonferroni test (α = 5%). For all syntheses were associated between AgNP and CaGP. However only by microscopy at a concentration of 10% silver visualized the AgNP decorating the surface of CaGP (synthesis with sodium borihidreto and isopropanol) shrouded by CaGP or (synthesis with borihidreto and water and pomegranate peel). The nanocompounds synthesized by chemical route, were more effective against the microorganisms than synthesized by the phytochemical route, especially when used sodium citrate as reducing agent. Through the phytochemical route with the pomegranate, the AgNP-CaGP nanocomposite was more effective against C. albicans that AgNP and the opposite occurred to S. mutans. The use of pomegranate extract for the synthesis significantly (p <0.05) cytotoxicity both AgNP-CaGP nanocomposite of AgNP as compared to those synthesized chemically, regardless of the reducing agent used in the reaction. Yet, for all the syntheses, the CaGP reduced significantly (p <0.05) the cytotoxicity of nanocomposites AgNP-CaGP when compared with the isolated AgNP. It concludes that the nanocomposite formed by AgNP and CaGP has antimicrobial effectiveness against important pathogens related with caries and their cytotoxicity was reduced when used the pomegranate peel as reducing agent of silver. / FAPESP: 2014/08648-2 / CAPES: 88887.068358/2014-00 / CAPES: 88881.030445/2013-01

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

INTRODUÇÃO: O objetivo do estudo foi avaliar o perfil de marcadores imuno-histoquímicos relacionados às células NK em biópsias de aloenxertos renais com diagnóstico anatomopatológico de rejeição aguda (mediadas por células T ou anticorpos) e estabelecer relações desses marcadores com parâmetros morfológicos de lesão à microcirculação e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Estudo retrospectivo histórico que revisou 74 biópsias realizadas entre janeiro de 2009 e dezembro de 2012, de pacientes com rejeição aguda mediada por células T (n=36), rejeição aguda mediada por anticorpos com expressão positiva (n=19) ou negativa (n=19) para o marcador C4d, juntamente com levantamento de dados clínicos e laboratoriais pertinentes ao estudo. Foram realizadas reações imuno-histoquímicas, para os marcadores CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 e CD4 com ênfase para os marcadores CD56 e CD16. Foi feita análise das células positivas em toda a cortical da biópsia nos compartimento intersticial, glomerular e vascular. Testes estatísticos foram aplicados conforme os pressupostos definidos no objetivo da pesquisa. RESULTADOS: No compartimento intersticial, células CD56+ (P = 0,004) e CD57+ (P < 0,001) foram expressas em maior quantidade em biópsias negativas para dosagem sérica de anticorpos específicos anti-doador (DSA) com diagnóstico de rejeição aguda mediada por células T. CD56 intersticial foi associado estatisticamente com presença de glomerulite (g >= 1) (P = 0,02) e ausência / leve capilarite peritubular (ptc <= 1) (P = 0,003). Células intersticiais positivas para o marcador CD56 com média superior a 0,56 céls/mm2 tiveram uma pior sobrevida do enxerto renal (P = 0,028). Biópsias com contagem inferior ou igual a 0,56 cél/mm2 tiveram associação estatisticamente significante para ausência ou leve capilarite peritubular (P = 0,012) e com contagem superior a 0,56 céls/mm2, foram associadas à presença de glomerulite (P = 0,002). Foi observado maior número de células positivas para o marcador CD16 no compartimento glomerular em biópsias positivas para dosagem sérica de DSA com diagnóstico de rejeição aguda mediada por anticorpos (P = 0,03) e em biópsias com presença de glomerulite (P = 0,009). Presença de maior número de células CD16+ no compartimento intersticial associou-se com capilarite peritubular (P = 0,0001). CONCLUSÕES: Maior expressão de células CD56 positivas no compartimento intersticial das biópsias foi significantemente associada com escores relacionados à lesão na microcirculação, especialmente glomerulite, com rejeição aguda mediada por células T e pior sobrevida do enxerto renal. Células CD16 positivas, no compartimento glomerular foram associadas com rejeição aguda mediada por anticorpos e glomerulite. As variações na expressão dos marcadores de células NK nos diferentes compartimentos da biópsia renal podem sugerir presença de envolvimento das células NK em diferentes vias do sistema imune nas rejeições agudas de aloenxertos renais / INTRODUCTION: The aim of this study was to investigate the immunohistochemical profile of markers related to NK cells from renal allograft biopsies with morphological diagnosis of acute rejection (T-cells or antibodies mediated rejection) and to study associations of those markers with types of rejection, microcirculation injury morphological parameters and graft survival. METHODOLOGY: Historical retrospective study that reviewed 74 biopsies performed between January 2009 and December 2012 in patients with acute T-cell-mediated rejection (n=36) and acute antibody-mediated rejection with (n=19) or without evident C4d deposition (n=19). The study was performed with relevant clinical and laboratory data. Immunohistochemical reactions were performed for CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 and CD4 markers with highlights for CD56 and CD16. Counting of positive cells throughout cortical biopsy was performed in glomerular, interstitial and vascular compartments. Statistical tests were applied according to assumptions set out the goal of the study.RESULTS: DSA-negative biopsies-from patients with acute T-cell mediated rejection (aTCMR) had an increased expression of CD56+ and CD57+ cells (P = 0.004 and P < 0.001) in the interstitial compartment in comparison with donor-specific antibodies ( DSA)-positive biopsies from patients acute antibody-mediated rejection with and without C4d deposition. Interstitial CD56+ cells had an increased expression for presence of glomerulitis (g >= 1) (P = 0.02) and peritubular capillaritis (ptc >= 2) (P = 0.003). Interstitial CD56 + cells with mean superior to 0.56cells/mm2 had worse allograft survival (P = 0.028). CD56+ cells in the interstitial compartment with mean inferior or equal to 0.56cells/mm2 associated with absence or mild peritubular capillaritis (P = 0.012) and mean superior to 0.56cells/mm2 was associated with presence of glomerulitis (P = 0.002). CD16+ cells was increased in the glomerular compartment in DSA-positive biopsies (P = 0.03) and in the presence of glomerulitis (P = 0.009). Interstitial CD16+ cells associated with peritubular capillaritis (P = 0.0001).CONCLUSION: CD56+ cell infiltrates in the interstitial compartment were significantly associated with microcirculation injury scores, especially glomerulitis, acute T-cell mediated rejection and clinical outcomes. CD16+ cell infiltrates in glomerular compartment was associated with acute antibody-mediated rejection and glomerulitis. Our findings showed variations in expression of NK cells markers in renal biopsy different compartments which might suggest the involvement of NK cells in different immune system pathways in acute renal allograft rejection

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-08-30Bitstream added on 2014-06-13T18:42:17Z : No. of bitstreams: 1 silva_pt_dr_arafo.pdf: 428042 bytes, checksum: fe2b6b39c1693d5ed4af444bc6e9be75 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Analisou-se a citotoxicidade dos seguintes cimentos: Endofill, Sealapex e Polifil, quanto à liberação de óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em culturas de macrófagos peritoneais de camundongos e também utilizamos um método de análise colorimétrica usando M.T.T. Concluiu-se que as considerações presentes após os resultados, discussão e constatação os cimentos que apresentaram o menor nível de citotoxicidade foi o Endofill, seguido da equivalência de liberação de Polifil e Sealapex, embora todos foram menos citotóxicos que o Grupo Controle Zimosan-A para H2O2 e o LPS para o NO. / It was analyzed the citotoxicity of the following cements Endofill, Sealapex, and Poliol regarding the nitric oxide (NO) release and the hydrogen peroxide (H2O2) in the peritoneais macrophages medium of mice in different concentrations and we have also analyzed a colorimetric method using the M.T.T. It was concluded from the considerations which were present in the results, discussion, and verification that the cement which presented the lowest citotoxicity level was the Sealapex followed by the Polifil and the Endofill, although all of them were less citotoxic than the Zimosan-A control group for H2O2 and the LPS for the NO.

INTRODUÇÃO: O objetivo do estudo foi avaliar o perfil de marcadores imuno-histoquímicos relacionados às células NK em biópsias de aloenxertos renais com diagnóstico anatomopatológico de rejeição aguda (mediadas por células T ou anticorpos) e estabelecer relações desses marcadores com parâmetros morfológicos de lesão à microcirculação e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Estudo retrospectivo histórico que revisou 74 biópsias realizadas entre janeiro de 2009 e dezembro de 2012, de pacientes com rejeição aguda mediada por células T (n=36), rejeição aguda mediada por anticorpos com expressão positiva (n=19) ou negativa (n=19) para o marcador C4d, juntamente com levantamento de dados clínicos e laboratoriais pertinentes ao estudo. Foram realizadas reações imuno-histoquímicas, para os marcadores CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 e CD4 com ênfase para os marcadores CD56 e CD16. Foi feita análise das células positivas em toda a cortical da biópsia nos compartimento intersticial, glomerular e vascular. Testes estatísticos foram aplicados conforme os pressupostos definidos no objetivo da pesquisa. RESULTADOS: No compartimento intersticial, células CD56+ (P = 0,004) e CD57+ (P < 0,001) foram expressas em maior quantidade em biópsias negativas para dosagem sérica de anticorpos específicos anti-doador (DSA) com diagnóstico de rejeição aguda mediada por células T. CD56 intersticial foi associado estatisticamente com presença de glomerulite (g >= 1) (P = 0,02) e ausência / leve capilarite peritubular (ptc <= 1) (P = 0,003). Células intersticiais positivas para o marcador CD56 com média superior a 0,56 céls/mm2 tiveram uma pior sobrevida do enxerto renal (P = 0,028). Biópsias com contagem inferior ou igual a 0,56 cél/mm2 tiveram associação estatisticamente significante para ausência ou leve capilarite peritubular (P = 0,012) e com contagem superior a 0,56 céls/mm2, foram associadas à presença de glomerulite (P = 0,002). Foi observado maior número de células positivas para o marcador CD16 no compartimento glomerular em biópsias positivas para dosagem sérica de DSA com diagnóstico de rejeição aguda mediada por anticorpos (P = 0,03) e em biópsias com presença de glomerulite (P = 0,009). Presença de maior número de células CD16+ no compartimento intersticial associou-se com capilarite peritubular (P = 0,0001). CONCLUSÕES: Maior expressão de células CD56 positivas no compartimento intersticial das biópsias foi significantemente associada com escores relacionados à lesão na microcirculação, especialmente glomerulite, com rejeição aguda mediada por células T e pior sobrevida do enxerto renal. Células CD16 positivas, no compartimento glomerular foram associadas com rejeição aguda mediada por anticorpos e glomerulite. As variações na expressão dos marcadores de células NK nos diferentes compartimentos da biópsia renal podem sugerir presença de envolvimento das células NK em diferentes vias do sistema imune nas rejeições agudas de aloenxertos renais / INTRODUCTION: The aim of this study was to investigate the immunohistochemical profile of markers related to NK cells from renal allograft biopsies with morphological diagnosis of acute rejection (T-cells or antibodies mediated rejection) and to study associations of those markers with types of rejection, microcirculation injury morphological parameters and graft survival. METHODOLOGY: Historical retrospective study that reviewed 74 biopsies performed between January 2009 and December 2012 in patients with acute T-cell-mediated rejection (n=36) and acute antibody-mediated rejection with (n=19) or without evident C4d deposition (n=19). The study was performed with relevant clinical and laboratory data. Immunohistochemical reactions were performed for CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 and CD4 markers with highlights for CD56 and CD16. Counting of positive cells throughout cortical biopsy was performed in glomerular, interstitial and vascular compartments. Statistical tests were applied according to assumptions set out the goal of the study.RESULTS: DSA-negative biopsies-from patients with acute T-cell mediated rejection (aTCMR) had an increased expression of CD56+ and CD57+ cells (P = 0.004 and P < 0.001) in the interstitial compartment in comparison with donor-specific antibodies ( DSA)-positive biopsies from patients acute antibody-mediated rejection with and without C4d deposition. Interstitial CD56+ cells had an increased expression for presence of glomerulitis (g >= 1) (P = 0.02) and peritubular capillaritis (ptc >= 2) (P = 0.003). Interstitial CD56 + cells with mean superior to 0.56cells/mm2 had worse allograft survival (P = 0.028). CD56+ cells in the interstitial compartment with mean inferior or equal to 0.56cells/mm2 associated with absence or mild peritubular capillaritis (P = 0.012) and mean superior to 0.56cells/mm2 was associated with presence of glomerulitis (P = 0.002). CD16+ cells was increased in the glomerular compartment in DSA-positive biopsies (P = 0.03) and in the presence of glomerulitis (P = 0.009). Interstitial CD16+ cells associated with peritubular capillaritis (P = 0.0001).CONCLUSION: CD56+ cell infiltrates in the interstitial compartment were significantly associated with microcirculation injury scores, especially glomerulitis, acute T-cell mediated rejection and clinical outcomes. CD16+ cell infiltrates in glomerular compartment was associated with acute antibody-mediated rejection and glomerulitis. Our findings showed variations in expression of NK cells markers in renal biopsy different compartments which might suggest the involvement of NK cells in different immune system pathways in acute renal allograft rejection

A exocitose de grânulos secretórios é o principal mecanismo efetor de células TCD8+. No entanto, pouco se sabe sobre a composição dos grânulos líticos dessas células. Resultados prévios do nosso grupo identificaram algumas dezenas de novas proteínas desses grânulos. Dentre elas foi identificada Gal-1. A literatura relata que Gal-1 age por via exógena através de sua secreção por via não convencional. Dados iniciais do nosso grupo apontam um novo cenário para esta proteína no qual ela está presente em grânulos citotóxicos. Através das técnicas de microscopia eletrônica e confocal e de ensaios de citotoxicidade, nossos resultados sugerem que Gal-1 participa do papel citotóxico das CTLs modulando a via dos receptores de morte FAS-FASL. Nós também mostramos que Gal-1 interfere com o tempo de contato entre APCs e linfócitos TCD8+, com a ativação dessas células e com o controle da proliferação dos linfócitos. Nossos resultados apontam um novo cenário para Gal-1, no qual ela está presente em grânulos líticos das CTLs e está relacionada a resposta efetora dessas células. / Exocytosis of secretory granules is the main effector mechanism of CD8+ T cells. In particular, little is known about CTLs lytic granules composition. Previous results from our group identified a few dozens of new proteins associated with these granules. Among them, we identified galectin-1. Literature reports the extracellular action of Gal-1. Initial data from our group suggested a new scenario for this protein, since Gal-1 was found inside cytotoxic granules. Here, we show by transmission electron and confocal laser scanning microscopy and cytotoxicity assays that Gal-1 has a role on CTL killing probably mediating the FAS-FASL pathway. We also show that Gal-1 is regulates the time of contact between APCs and TCD8+ lymphocytes, the activation of APCs and the proliferation of CD8 T cells. Taken together, our findings suggest a new scenario, in which Gal-1 is present in CTL granules and participates in cytotoxic effector response.

GONÇALVES, Nidyedja Goyanna Gomes. Ação da lectina de Dioclea altissima sobre células tumorais: Citotoxidade e Perfil Proteômico da Linhagem PC3M. 2012. 106 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-27T12:21:35Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_ngggoncalves.pdf: 5791111 bytes, checksum: 5bb7d007364d7c5364b8faa3b419bf9c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:07:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_ngggoncalves.pdf: 5791111 bytes, checksum: 5bb7d007364d7c5364b8faa3b419bf9c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:07:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_ngggoncalves.pdf: 5791111 bytes, checksum: 5bb7d007364d7c5364b8faa3b419bf9c (MD5) Previous issue date: 2012 / Recently, plant lectins have attracted great interest due to their several biological activities of which stands out the antitumoral action in vivo and in vitro that in general result in inhibition of cell growth and induction of cell death by apoptosis. In the present study, it was investigated the effect of the Dioclea altissima (DAL) lectin, a legume alfa-D-mannose ligand lectin on A549 (lung cancer), OVCAR-8 (ovarian cancer) and PC3M (prostate cancer) and normal line PBMC (cell blood tissue). DAL was isolated and purified by affinity chromatography on a Sephadex G-50 column and its cytotoxicity was evaluated by MTT assay. DAL was selectively cytotoxic to cancer cells A549, PC3M after 48 and 72 hours of incubation, and OVCAR-8 after 72 hours of treatment with DAL (CI50 values between 23.0 e 55.7 μg/mL). Moreover, it was observed cell agglutination from 24 hours of incubation. Comet assay revealed DAL does not cause direct DNA damage. The line PC3M was selected for proteomic analysis by mass spectrometry (nanoUPLC® nanoESI-MSE) to present the best evidence of sensitivity to DAL. PC3M line was treated with various concentrations of DAL during 24, 48 e 72 hours, it was identified a total of 837 proteins, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). The study of differential protein expression of the DAL-treated PC3M cells compared to control demonstrated apoptotic effect generated, mainly, via ER stressed-dependent. / Nas últimas décadas, as lectinas vegetais têm atraído grande interesse devido às suas diversas atividades biológicas das quais se destaca a ação antitumoral in vivo e in vitro que, em geral, causa a inibição do crescimento celular e a indução da morte celular por apoptose. No presente estudo, foi investigado o efeito da lectina de Dioclea altissima (DAL), uma lectina de leguminosa, alfa-D-manose ligante, sobre as linhagens tumorais A549 (carcinoma pulmonar), OVCAR-8 (carcinoma de ovário) e PC3M (carcinoma de próstata) e linhagem normal CMSP (células do tecido sanguíneo). DAL foi isolada e purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50 e sua citotoxicidade foi avaliada através do ensaio do MTT. DAL foi seletivamente citotóxica para as células cancerígenas A549, PC3M, após 48 e 72 horas de incubação, e para OVCAR-8, após 72 horas de tratamento apresentando valores de CI50 entre 23,0 e 55,7 μg/mL, promovendo aglutinação celular a partir de 24 horas de incubação. DAL não se mostrou citotóxica para células normais. O teste do cometa revelou que DAL não causa dano direto ao DNA. A linhagem PC3M foi selecionada para análise proteômica por espectrometria de massas (nanoUPLC® nanoESI-MSE) por apresentar maior sensibilidade à DAL. Após tratamento das células com diversas concentrações de DAL, por 24, 48 e 72 horas, foi identificado um total de 837 proteínas válidas, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). O estudo das proteínas diferencialmente expressas das células tratadas com a lectina em relação ao controle definiu o efeito citotóxico de DAL em PC3M como apoptótico gerado, principalmente, via estresse do retículo endoplasmático.

A exocitose de grânulos secretórios é o principal mecanismo efetor de células TCD8+. No entanto, pouco se sabe sobre a composição dos grânulos líticos dessas células. Resultados prévios do nosso grupo identificaram algumas dezenas de novas proteínas desses grânulos. Dentre elas foi identificada Gal-1. A literatura relata que Gal-1 age por via exógena através de sua secreção por via não convencional. Dados iniciais do nosso grupo apontam um novo cenário para esta proteína no qual ela está presente em grânulos citotóxicos. Através das técnicas de microscopia eletrônica e confocal e de ensaios de citotoxicidade, nossos resultados sugerem que Gal-1 participa do papel citotóxico das CTLs modulando a via dos receptores de morte FAS-FASL. Nós também mostramos que Gal-1 interfere com o tempo de contato entre APCs e linfócitos TCD8+, com a ativação dessas células e com o controle da proliferação dos linfócitos. Nossos resultados apontam um novo cenário para Gal-1, no qual ela está presente em grânulos líticos das CTLs e está relacionada a resposta efetora dessas células. / Exocytosis of secretory granules is the main effector mechanism of CD8+ T cells. In particular, little is known about CTLs lytic granules composition. Previous results from our group identified a few dozens of new proteins associated with these granules. Among them, we identified galectin-1. Literature reports the extracellular action of Gal-1. Initial data from our group suggested a new scenario for this protein, since Gal-1 was found inside cytotoxic granules. Here, we show by transmission electron and confocal laser scanning microscopy and cytotoxicity assays that Gal-1 has a role on CTL killing probably mediating the FAS-FASL pathway. We also show that Gal-1 is regulates the time of contact between APCs and TCD8+ lymphocytes, the activation of APCs and the proliferation of CD8 T cells. Taken together, our findings suggest a new scenario, in which Gal-1 is present in CTL granules and participates in cytotoxic effector response.