Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus B-lymphotrope qui a été identifié comme l’agent étiologique de la leucose bovine enzootique. L’infection par le BLV se caractérise par l’absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle du provirus in vivo; elle favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d’échapper au système immunitaire de l’hôte. Cependant, la transcription du BLV peut être activée de manière rapide et très efficace par la protéine virale TaxBLV. La trans-activation par TaxBLV joue un rôle crucial dans la pathogenèse associée au BLV car elle permet la production de nouvelles particules virales nécessaires à la propagation du virus. Au cours de notre travail de thèse, nous avons étudié différents mécanismes impliqués au cours de ces deux phases clés (latence et trans-activation par TaxBLV) de l’expression du BLV. Le promoteur unique de la transcription du BLV se situe à l’extrémité 5’ du génome proviral, dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) composée des régions U3, R et U5. Les mécanismes impliqués dans la trans-activation du LTR 5’ par TaxBLV sont encore mal connus. La trans-activation du LTR 5’ du BLV par TaxBLV requiert la présence de trois répétitions imparfaites de 21pb (TxREs pour Tax Responsive Elements) agissant en cis et situées dans la région U3. Chacune des TxREs possède dans sa partie centrale un motif imparfait de 8 nucléotides correspondant au site de liaison des protéines de la famille CREB/ATF (sites CREs pour cAMP-Responsive Element). Des expériences de retard de migration sur gel ont montré que les protéines CREB, ATF-1 et ATF-2 lient les CREs viraux in vitro. Comme TaxBLV ne semble pas capable de lier directement l’ADN du LTR, il a été suggéré que les facteurs CREB/ATF serviraient de médiateurs de la trans-activation par TaxBLV. De plus, il a également été suggéré au cours de ces dernières années que les facteurs de transcription CREB/ATF jouent aussi un rôle essentiel en l’absence de TaxBLV lors de l’initiation de la transcription virale. CREB/ATF sont connus pour recruter les co-activateurs CBP/p300 qui possèdent une activité histone-acétyltransférase, suggérant qu’à l’instar d’autres rétrovirus tels que HIV-I ou HTLV-I, l’acétylation protéique pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la transcription du BLV. Au cours de la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence un synergisme transcriptionnel entre TaxBLV et les inhibiteurs de désacétylases TSA et NaBut, indiquant que l’acétylation protéique joue un rôle important dans la trans-activation par TaxBLV. Nous avons ensuite montré que ni TaxBLV, ni son médiateur CREB ne sont acétylés in vivo au niveau d’un résidu lysine interne, mais que la TSA synergise avec TaxBLV via un mécanisme indirect, sensible à l’inhibition de la synthèse protéique. Fonctionnellement, CREB/ATF semblent jouer un rôle crucial dans le synergisme TaxBLV/TSA car la mutation des CREs viraux ou la sur-expression d’un dominant négatif CREB inhibent ce synergisme. Des expériences de gel retard et de ChIP ont démontré, in vitro et in vivo, que les inhibiteurs de désacétylases augmentent la liaison des facteurs CREB/ATF aux TxREs. Nos résultats suggèrent donc que le synergisme TaxBLV/TSA serait dû à une augmentation de la trans-activation par TaxBLV observée suite à l’augmentation, induite par la TSA, du recrutement de CREB/ATF au niveau des TxREs. CREB/ATF appartiennent à la famille des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF agissant au niveau des promoteurs contenant des éléments CREs. Cependant, la liaison de CREM aux CREs imparfaits du LTR du BLV n’a jamais été étudiée. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré que des isoformes du gène CREM sont exprimées dans des PBMCs isolés à partir d’un mouton infecté par le BLV et que ces protéines CREM sont capables de lier in vitro et in vivo le promoteur du BLV, via les motifs CREs présents au centre de chacune des TxREs. Des analyses fonctionnelles ont ensuite montré qu’en l’absence de TaxBLV, la surexpression de l’isoforme activatrice CREMt induit la transcription dirigée par le LTR 5’ du BLV. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que CREMt serait capable d’activer la transcription du BLV en réponse à l’activation des cellules B infectées, via la phosphorylation de la sérine 117 de CREMt et via le recrutement par CREMt des co-activateurs CBP/p300. CREMt serait donc impliqué dans les stades précoces de l’initiation de la transcription du BLV. Cependant, nous avons montré que CREMt n’est pas impliqué dans les stades tardifs de l’expression virale puisqu’il ne semble pas capable d’induire la trans-activation par TaxBLV. Au contraire, nous avons montré par des expériences de compétition que CREMt diminue la trans-activation par TaxBLV lorsque celle-ci est induite par CREB, probablement en entrant en compétition avec CREB pour la liaison au niveau des TxREs. L’expression du gène CREM est régulée transcriptionnellement et post-transcriptionnellement et mène à la production de différentes isoformes capables d’agir comme des activateurs ou des répresseurs de la transcription. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence la présence d’isoformes répressives ICER dans les cellules YR2 infectées par le BLV. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons montré qu’ICER est capable de réprimer la trans-activation par TaxBLV, suggérant qu’ICER retarderait la trans-activation par TaxBLV afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte infecté jusqu’à ce qu’un niveau suffisant du trans-activateur TaxBLV soit produit.

Les extrémités des chromosomes eucaryotes linéaires ont une structure nucléoprotéique particulière, et sont appelées télomères. Étant donnés leur structure et le mécanisme semi-conservatif de la réplication de l’ADN, la longueur des séquences télomériques est instable. Au fil des divisions cellulaires, les réplications successives de l’ADN entraînent une réduction progressive des séquences télomériques. Des télomères courts ne sont plus fonctionnels, ce qui entraîne l’arrêt du cycle cellulaire et de l’instabilité génomique. Il est donc essentiel de prévenir ce raccourcissement. Une enzyme spécialisée rallonge les télomères : la télomérase. La télomérase est une ribonucléoprotéine (RNP) qui maintient les télomères par un mécanisme d’ajout de répétitions de la séquence télomérique. Afin de former un complexe actif, les sous-unités protéiques de l’enzyme doivent s’assembler autour d’un ARN non-codant, nommé Tlc1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cependant, le fait que la RNP nécessite plusieurs sous-unités pour son activité implique un assemblage précis et coordonné. Peu de données existent au sujet de l’assemblage de la RNP en un complexe actif, mais il semble qu’un trafic nucléo-cytoplasmique soit requis dans le cycle fonctionnel de l’enzyme. Caractériser le mécanisme d’assemblage de la télomérase permettra de mieux comprendre les phénomènes de régulation de l’activité de l’enzyme, et donc du maintien des télomères chez S. cerevisiae. À cette fin, j’ai d’abord vérifié l’état stoechiométrique de l’enzyme in vivo par des méthodes de FISH sur des molécules individuelles. J’ai ainsi pu montrer que la télomérase ne comportait qu’un seul ARN Tlc1. Ces données in vivo corrèlent avec des données publiées précédemment grâce à des techniques de biochimie, et suggèrent que l’enzyme n’est composée que de complexes individuels contenant une seule copie de chaque sous-unité protéique. Dans le but d’étudier les mécanismes d’assemblage de la télomérase, j’ai aussi développé un système de contrôle de la transcription d’une forme taguée de Tlc1. Cet outil génétique, basé sur les systèmes Cre-Lox et MS2-GFP, permet l’insertion d’un tag MS2 dans le gène TLC1. Ce tag donne la possibilité de suivre des ARN Tlc1 in vivo et en temps réel par microscopie confocale à spinning-disk. Ce système, baptisé CrEMGaT, a permis de montrer que l’insertion du tag dans le gène entraîne l’apparition de Tlc1-MS2, et que ces ARN forment des agrégats nucléaires ayant des caractéristiques similaires aux T-Recs précédemment caractérisés lors d’une collaboration avec le Pr Chartrand. De plus, des résultats préliminaires obtenus avec le CrEMGaT suggèrent que les ARN Tlc1-MS2 finissent leur cycle fonctionnel au cytoplasme. Dans l’ensemble, les données produites et l’outil développé au cours de cette thèse donnent une meilleure idée de l’état d’assemblage de la télomérase. / Abstract : In the eukaryotic kingdom, the extremities of the linear chromosomes have a particular nucleoproteic structure, and are called telomeres. Because of this structure and the semi-conservative nature of DNA replication, telomere length is unstable. DNA replications during consecutive cell divisions leads to a progressive shortening of telomeric sequences. Below a certain threshold, telomeres are not functional, triggering cell-cycle arrest and genomic instability. It is therefore essential to prevent this shortening. A specialized enzyme elongates telomeres: Telomerase. Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP) that adds repeats of the telomeric sequence to the end of telomeres. The enzyme formation requires protein subunits to assemble onto a scaffolding ncRNA, Tlc1 in Saccharomyces cerevisiae. The fact that several subunits are needed for RNP activity implies a precise and coordinated assembly occurs. However, data are lacking about telomerase assembly into an active complex, but different observations point towards a nucleo-cytoplasmic trafficking requirement during the enzyme life-cycle. Characteristics about telomerase assembly mechanism would provide useful information in the quest for understanding the phenomena regulating the enzyme activity, and therefore telomere maintenance in S. cerevisiae. Engaged in this quest, I first verified telomerase stoichiometry in vivo. By quantitative single-molecule FISH, the results showed that the enzyme only contains one Tlc1 RNA per RNP in the cell. These in vivo data correlate with previous publications which, based on biochemical experiments, suggested single copies of the different subunits are present in the complex. Taken together, these findings are dismantling a previous dogma that stipulated telomerase is composed of two complexes, and suggest telomerase quaternary arrangement stays simple. Aiming to study telomerase assembly mechanisms, I also developed an inducible genetic system governing the transcription of a tagged version of Tlc1 (i.e. Tlc1-MS2). This system, based on the Cre-Lox and MS2-GFP systems, allows to control the insertion of a MS2 tag into the TLC1 gene. In this system, dubbed CrEMGaT, the genetic insertion is controllable and indeed leads to Tlc1-MS2 appearance. It is then possible to track these tagged RNAs in vivo and in real time with a spinning disk confocal microscope. Furthermore, these RNAs form nuclear aggregates with characteristics of the T-Recs previously described in a collaboration between our lab and Pr Chartrand’s. Finally, preliminary data obtained with the CrEMGaT suggest cytoplasm is the last cellular compartment visited by Tlc1-MS2 RNA. Overall, these data and the system developed during my thesis will give insights into telomerase assembly in vivo.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Die zellulären Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorgänge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrität. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenitätsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie gehörenden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden über ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox“ führte. Damit können heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zunächst die Gene für die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminosäurereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kulturüberstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivität der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles“ (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes“ (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der Stämme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-Stämme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen lässt, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP für RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse bestätigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abhängig Membranporen-bedingte Zellschädigungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernfärbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembranschädigung / Zytotoxizität nachgewiesen werden, nicht aber mit den Stämmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verstärkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrität über Adhäsionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-Stämmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Schädigung der Zellschichtintegrität führt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unverändert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu können und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden Mäuse mit deletierten Genen für RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt. / Phagocytosis, migration and regulation of epithelial integrity are central cellular aspects that are controlled by the cellular Rho GTPases. In this regard, Rac1, RhoA and Cdc42 have important regulatory roles mediating various cytoskeletal rearrangements in many cell types including epithelial cells as well as professional phagocytes. Because of the central role of the Rho GTPases in cellular integrity and function, bacterial cytotoxins and modulins targeting these cellular switches are very efficient pathogenicity factors. Recently, the T3SS effectors, IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (pathotype EHEC/EPEC) were assembled in one protein family sharing the common motif W-xxx-E. Members of this protein family are described to act as GEF mimics for the cellular Rho GTPases. In this study the effector functions of IpgB1, IpgB2 and Map were analyzed with the Yersinia (Ysc)-T3SS which led to the development of the “Yersinia-Toolbox”. Yersinia enterocolitica is very suitable to be used as “T3SS-Toolbox” because (1) a plasmid solely carrying the DNA fragment encoding the Ysc-T3SS without T3SS-effectors is available, (2) in difference to Salmonella and E. coli (EPEC/EHECH) the Ysc-T3SS-effector genes of Yersinia are not localized on the chromosome and (3) heterologous proteins fused to the Ysc-T3SS-effector YopE are secreted and translocated into cells. This allows the analysis of single heterologous effectors without simultanous injection of other (unknown/redundant) T3SS-effectors in a physiological context during the interaction of Yersinia with cells. To develop the Yersinia-Toolbox, the genes of the GTPase modulating effectors IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (EHEC) were fused to different long sections of the N-Terminus of the Yersinia-Ysc-T3SS-effector YopE (hybrid proteins: YopEi-X: i = 18, 53 or 138 amino acid residues, X = IpgB1, IpgB2 or Map). This study demonstrates the secretion to the culture supernatent and the injection into target cells of the hybrid proteins YopE53-X and YopE138-X (X = IpgB1, IpgB2 and Map). Furthermore, cell biologic activity was detected for the YopE-X hybrid proteins by fluorescence microscopy as membrane ruffles (Rac1 activation), stress fibres (RhoA activation) and micro spikes (Cdc42 activation) occurred after injection of YopE138-IpgB1,.YopE138-IpgB2 and YopE138-Map, in respective. Invasion studies showed that YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) induced invasion of Yersinia, whereas YopEi-IpgB2 reduced invasion of the strains WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i = 53, 138) compared to the strain WA (pT3SS). Combination of different Yersinia-Toolbox strains in the co-infection model with HeLa cells showed that (1) YopE138-IpgB2 reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2, (2) YopT also reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion (inhibitory function on Rac1) and (3) that YopE as GAP for RhoG/Rac1 (predominantly RhoG) did not inhibit the YopE138-IpgB1 induced invasion. Because of the construction of two different compatible plasmids carrying the genes for either YopE138-IpgB1 or YopE138-IpgB2, simultanous translocation of the hybrid proteins of one single strain was possible. These studies confirmed the results of the co-infection studies. It has been reported that the Ysc translocation pore YopB/YopD induces Rho dependent membrane pores in cells which leads to cellular damage (LDH release, PI-staining of the nucleus). In this study cellular damage / cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strain WA (pT3SS). In contrast to that no cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strains WA (pT3SS, pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 and Map. Additionally, co-infections with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB1) resulted in an increased LDH release whereas a co-infection with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB2) led to the decrease of LDH release compared to single infections with WA (pT3SS), again suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2. These results are contrary to published data, which suggest a correlation between RhoA activation dependent actin polymerisation and pore formation. The cellular Rho GTPases are involved in the maintenance of epithelial integrity of polarized cells. Infections of polarized MDCK cell layers with different Yersinia-Toolbox strains resulted in a decrease of the transepithelial electric resistance (TER) indicating a damage of the epithelial integrity after injection of YopE138-IpgB1 or YopE138-Map. The TER value was not altered after injection of YopE138-IpgB2 indicating an intact epithelial integrity. To study bacterial Rho GTPase modulating proteins in more detail and to get a deeper insight to the role of Rho GTPases in the murine infection model with Yersinia enterocolitica and Salmonella, mice with gene deletions for RhoA, Rac1 or Cdc42 in macrophages were constructed.

Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose. / Background: Interstitial fibrosis is of major importance for the deterioration of renal function, leading to uremia. Interaction of filtered proteins with proximal tubular cells is crucial for the onset and development of tubulointerstitial damage. In the present study we investigated the effects of albuminuria on collagen homeostasis and signaling pathways of the proximal tubular cells. Methods: Therefore we exposed cultured cells derived from the proximal tubule (OK-, LLC-PK1-cells) with high endocytic activity by expressing the endocytic machinery typical for the proximal tubule (megalin, cubilin, NHE3) to albumin concentrations in a range expected during enhanced protein filtration. For comparative studies we used renal epithelial cells (MDCK-, IHKE1-, NHE3-deficient-OK-cells) with low endocytic activity. Collagen homeostasis was assessed by collagenase-sensitive proline incorporation assay, collagen ELISA and collagen Western blot; matrix metalloproteinase activity was assessed by zymography and gelatinase assay. Signaling pathways were monitored by SEAP reporter gene asssay. Results: Albumin exposure led to an increase of secreted collagen type I, III and IV in cells with high endocytic activity. In cells with low endocytic activity albumin exposure inhibited collagen secretion. Collagen Western blot analysis showed an albumin-induced increase of cellular collagen. MMP activity was significantly decreased by albumin exposure shown by zymography and gelatinase assay. Furthermore, albumin exposure led to activation of the NF-kappaB-, AP1- and CRE-pathways detected by SEAP reporter gene assay. Inhibition of NF-kappaB, PKC and PKA partially reversed the effects of albumin-induced collagen secretion. Inhibition of receptor-mediated albumin endocytosis by NHE3-inhibitor EIPA reduced collagen secretion and activation of the above investigated pathways. Discussion: The data show that protein exposure, in a concentration range expected during enhanced protein filtration, disturbs collagen homeostasis of proximal tubular cells due to increased collagen synthesis and decreased collagen degradation. Especially collagen type I and III may contribute to tubulointerstitial fibrosis. The signaling pathways activated by albumin exposure include PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 and CRE; stimulation of PKC, PKA and NF-kappaB directly contribute to collagen secretion. There has to be efficient receptor-mediated protein endocytosis in order to stimulate collagen secretion and signaling pathways; the mere presence of protein in the proximale tubule is not sufficient. The disturbed matrix homeostasis probably supports the progression of interstitial fibrosis, which is of importance for the development of renal insufficiency. Therefore albuminuria is not only a marker, but also a motor or renal fibrosis.

Certains cancers, comme celui du sein et de la prostate forment préférentiellement des métastases au niveau des os et sont dits ostéotropiques. Les SIBLINGs sont des protéines non-collagéniques de la matrice osseuse notamment impliquées dans la régulation de la minéralisation de cette matrice. Nos travaux antérieurs et présents montrent que certaines protéines de la famille des SIBLINGs sont exprimées de manière ectopique au niveau des cellules de cancers considérés comme ostéotropiques. Notre travail a tout dabord permis de mettre en évidence pour la première fois lexpression des SIBLINGs : (a) BSP dans les lésions (pré)néoplasiques du col de lutérus ; (b) DMP1 dans les cancers pulmonaires humains et (c) DSPP dans les cancers prostatiques et sa corrélation avec lagressivité des tumeurs. Dautre part, nous avons contribué significativement à la compréhension des mécanismes responsables de lactivation et de la régulation de la transcription du gène de la BSP dans les cellules cancéreuses et ostéoblastiques. Dans une première étude, nous avons réalisé des constructions comprenant différentes délétions de la région promotrice humaine du gène de la BSP que nous avons ensuite transfectées de manière transitoire dans les cellules cancéreuses mammaires (MDA-MB-231 et MCF-7) et dostéosarcome humain (Saos-2). La comparaison des profils de transfection obtenus pour ces trois lignées nous a permis de déterminer une région du promoteur importante pour la régulation transcriptionnelle de la BSP et suffisante pour expliquer lactivité du promoteur dans les cellules cancéreuses mammaires. Suite à la recherche des sites cis potentiellement actifs, nous avons identifié un élément CRE (cAMP Responsive Element) comme étant principalement responsable de lexpression de la BSP dans les cellules cancéreuses mammaire tandis quun élément FRE (Fibroblast growth factor Response Element) est par contre un acteur incontournable de cette même expression dans les cellules de la lignée osseuse. Des expériences de retard sur gel nous ont ensuite permis didentifier les facteurs CREB-1, Jun-D et Fra-2 comme étant associés à lélément CRE aussi bien dans les lignées cancéreuses mammaires que dans les Saos-2. Nous avons montré que dans nos modèles cellulaires : (a) CREB-1 agit de manière constitutive et positive sur la régulation du gène de la BSP et que (b) Jun D et Fra-2, sont des facteurs de transcription importants pour la régulation transcriptionnelle du gène de la BSP dans les cellules cancéreuses mammaires. Dans une seconde étude basée sur lobservation que lexpression endogène de BSP est fortement augmentée, tant au niveau protéique que de lARNm, dans les cellules Saos-2 confluentes par rapport aux cellules préconfluentes, nous avons voulu déterminer le rôle potentiel du facteur de transcription Runx2 dans la régulation transcriptionnelle du gène de la BSP au niveau de ce modèle de différenciation ostéoblastique. Le facteur de transcription Runx2 est en effet connu comme étant essentiel au développement ostéoblastique, à la différenciation et à la formation osseuse. Ce facteur régule positivement ou négativement lexpression des gènes ostéoblastiques en interagissant avec divers co-facteurs transcriptionnels. Nous avons démontré quun site de liaison pour le facteur Runx2 présent au niveau du promoteur de la BSP lie ce facteur dans les cellules préconfluentes et à un degré significativement moindre dans les cellules post-confluentes suggérant que ce facteur jouerait un rôle répresseur de lexpression du gène de la BSP. Etant donné quil a été démontré que la déacétylase dhistones HDAC3 est capable dinteragir avec Runx2 pour réprimer le promoteur dautre gène osseux, nous avons vérifié lhypothèse selon laquelle HDAC3 et Runx2 seraient présents au niveau du promoteur de la BSP pour réprimer lexpression de la BSP dans les cellules préconfluentes. Des expériences dimmunoprécipitation de la chromatine nous ont permis de mettre en évidence la présence concomitante de Runx2 et de HDAC3 au niveau du promoteur de la BSP dans les cellules Saos-2 préconfluentes et non dans les cellules post-confluentes. Finalement, la suppression de Runx2, dHDAC3 et des deux simultanément par interférence à lARN dans les cellules Saos-2 préconfluentes induit une augmentation de lexpression de la BSP dans ces cellules. Ces travaux ont donc permis de démontrer pour la première fois que la levée de la répression exercée par laction conjointe de Runx2 et de HDAC3 au promoteur de la BSP est nécessaire pour permettre lexpression de cette protéine au cours de la différenciation ostéoblastique. Lensemble de nos résultats nous a permis de dresser de nouveaux modèles de lactivation et de la régulation du gène de la BSP dans les cellules ostéoblastiques au cours de leur différenciation mais aussi dans les cellules cancéreuses.

This study examines whether different corporate real estate (CRE) strategies affect the stock outperformance and systemic risk of various companies. The sample of 443 listed companies of 17 industries in Taiwan during 2000 to 2010 was divided into four groups for the different corporate real estate strategies. The pairwise abnormal return and systemic risk of composite and business (without the affect from real estate market) series were empirically examined and compared using a partial adjustment model. This study also conducts the two-stage least squares procedure to determine whether four CRE strategies were considered diversifiable factors when evaluating the firm¡¦s value The results do not indicate an increasingly abnormal return performance associated with the company implementing a certain CRE strategy, but companies with a stable profession and consistent adjustment strategies are considered a good diversifier by stock investors. Aggressive adjustment strategies do not diversify the systematic risk to overall industry, otherwise the scale of total assets would be considered a diversification in companies with aggressive strategies. The companies using an aggressive profession strategy to increase leverage are regarded as risky phenomen for stock investors, and companies with stable profession strategies face higher systemic risk if their book value is greater than their market value. Therefore, this study determines that CRE strategies affect companies¡¦ systematical risk.

Engineered cellular systems are a promising avenue for production of a wide range of useful products including renewable fuels, commodity and specialty chemicals, industrial enzymes, and pharmaceuticals. Achieving this breadth of biological products is facilitated by the diversity of organisms found in nature. Using biological and engineering principles, this diversity can be harnessed to make efficient and renewable bio-based products. Such advancements rely upon our ability to modify host genetics and metabolism. This work focuses on the development of new biotechnological tools which enable cellular engineering, and the implementation of these tools in eukaryotic systems. Mammalian cell engineering has important implications in protein therapeutics and gene therapy. One major limitation, however, is the ability to predictably control gene expression. We address this challenge by examining critical aspects of gene expression in human cells. First, we evaluate the impact of selection markers, a common mammalian expression element, on cell line development. In doing so, we determine that Zeocin is the best selection agent for human cells. Next, we identify loci across the genome that support high level expression of recombinant DNA and demonstrate their advantage for stable integration. Finally, we optimize a Cre recombinase based methodology that enables efficient retargeting of genomic loci. Collectively, this work augments the current genetic toolbox for human cell lines. Beyond basic gene expression, there is interest in understanding global interactions within the cell and how they relate to phenomena including gene regulation, expression and disease states. Although our tools are not yet sufficient to study these phenomena in many hosts, methods can be developed in lower eukaryotes and then adapted for more complex hosts later. We demonstrated two methods in S. cerevisiae that utilize a systems-level approach to understand complex phenotypes. First, we developed condition-specific codon optimization that utilizes systems biology information to optimize gene sequence in a condition-specific manner. Additionally, we developed a Graded Dominant Mutant Approach which can be used to dissect multifunctional proteins, understand epigenetic factors, and quantitatively determine protein-DNA interactions. Both can be implemented in many cellular hosts and expand our ability to engineer complex phenotypes in eukaryotic cell systems.

Vascular endothelial growth factor-A (VEGF) is required for endothelial cell differentiation and survival. To investigate the renoprotective properties of VEGF in diabetes an inducible Cre-loxP gene targeting system was used to excise VEGF from podocytes of adult mice (VEGFKO). Diabetes was induced by streptozotocin (STZ) at 2.5 weeks of age and VEGFKO was induced by doxycycline (dox) at 3-4 weeks of age. Blood and urine were collected weekly to monitor for hyperglycaemia and proteinuria, respectively. Mice were dissected 8 weeks after diabetes induction or earlier if morbidly ill; twenty percent of the mice in the DM+VEGFKO group died before the surrogate endpoint. Glomerular VEGF mRNA expression was decreased in VEGFKO mice compared to controls. However, DM+VEGFKO mice had significantly greater proteinuria, degrees of glomerular sclerosis, and glomerular cell apoptosis. These results confirm that VEGF is normally upregulated in diabetes but reducing VEGF expression in diabetes causes severe kidney injury.

Vascular endothelial growth factor-A (VEGF) is required for endothelial cell differentiation and survival. To investigate the renoprotective properties of VEGF in diabetes an inducible Cre-loxP gene targeting system was used to excise VEGF from podocytes of adult mice (VEGFKO). Diabetes was induced by streptozotocin (STZ) at 2.5 weeks of age and VEGFKO was induced by doxycycline (dox) at 3-4 weeks of age. Blood and urine were collected weekly to monitor for hyperglycaemia and proteinuria, respectively. Mice were dissected 8 weeks after diabetes induction or earlier if morbidly ill; twenty percent of the mice in the DM+VEGFKO group died before the surrogate endpoint. Glomerular VEGF mRNA expression was decreased in VEGFKO mice compared to controls. However, DM+VEGFKO mice had significantly greater proteinuria, degrees of glomerular sclerosis, and glomerular cell apoptosis. These results confirm that VEGF is normally upregulated in diabetes but reducing VEGF expression in diabetes causes severe kidney injury.