Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Una fecundación exitosa depende, entre otras cosas, de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la reacción acrosómica. Este fenómeno es esencial para una adecuada interacción gamética y posterior fecundación del ovocito. El espermatozoide de perro al ser sometido a criopreservación puede verse afectado alterando negativamente este proceso y por tanto, su capacidad fecundante. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides congelados de perro a través de la actividad enzimática de la acrosina, mediante dos métodos de evaluación: hidrólisis de gelatina en placa y por espectrofotometría, la hidrólisis de esteres de bajo peso molecular (BAEE). La obtención de semen se realizó a partir 5 machos adultos sanos, mediante estimulación manual del pene. Se utilizó la segunda fracción espermática de cada eyaculado, midiendo su volumen en copa recolectora y la motilidad espermática se evaluó en forma subjetiva al microscopio de contraste de fases. La concentración espermática se determinó mediante recuento en la cámara de Neubauer, de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. Se trabajó con semen fresco (control) y semen congelado proveniente de los mismos machos. El pellet obtenido de cada muestra se ajustó a una concentración de 200x106 de esp/ml, incubándolas por períodos de 0, 30, 60 y 90 minutos a temperatura ambiente (21°C) para inducir la capacitación de los espermatozoides. Luego de cada tiempo de capacitación se realizó la medición de la actividad enzimática de acrosina a través de hidrólisis de gelatina en placa y espectrofotometría de esteres de bajo peso molecular (BAEE). 7 Los resultados obtenidos en relación a la actividad enzimática de acrosina durante la capacitación espermática en perros se describieron en términos de promedios, y se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se realizaron 5 replicas experimentales y se usó 1 eyaculado por perro en promedio. En relación al tipo de población espermática, los espermatozoides congelados y frescos (control) presentaron diferencias (P < 0,05) en relación al tamaño de los halos de digestión, observándose un diámetro promedio de halo mayor en espermatozoides frescos en comparación a los congelados de acuerdo a los tiempos de capacitación. Al evaluar la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de BAEE, se observó que durante los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos, la actividad enzimática de acrosina presentó variaciones (P<0,05) con mayor actividad enzimática en los espermatozoides a partir de los 60 min, mientras que en espermatozoides congelados la mayor actividad se observó al tiempo 0 de capacitación (no capacitados) (P <0,05). La actividad enzimática de acrosina en espermatozoides congelados sería menor que en los espermatozoides frescos, tanto en su actividad proteolítica en gelatina, como en espectrofotometría con BAEE. Además, la actividad de proacrosina/acrosina en espermatozoides caninos frescos se vería aumentada a través del tiempo de capacitación a diferencia de los espermatozoides congelados donde no se observó diferencias entre los diferentes tiempos de incubación en medio capacitante, por lo que se sugeriría que los espermatozoides frescos podrían retener mayores cantidades de acrosina que aquellos congelados/descongelados, lo que se traduciría en una acción más gradual en el tiempo observándose la mayor liberación de enzima entre los tiempos 60 y 90 minutos. / Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El estudio de las biotecnologías reproductivas ha conducido a generar nueva y mejor información sobre la reproducción en mamíferos. Sin embargo, en caninos estos estudios se han desarrollado de manera más lenta que en otras especies. Es así como las técnicas de criopreservación de espermatozoides de perro representan aún un tópico que necesita ser más estudiado con el fin de lograr mejores índices de preñez. El objetivo del presente trabajo fue inmunolocalizar la enzima acrosina en espermatozoides caninos refrigerados/entibiados y capacitados in vitro, con el fin de determinar el efecto del tiempo y temperatura de incubación sobre la cinética de liberación de la acrosina durante la Reacción del Acrosoma (RA). Se recolectó un total de 7 eyaculados de 3 perros mediante manipulación digital. En cada muestra se evaluó la concentración y motilidad progresiva (MP). Los espermatozoides de cada eyaculado se refrigeraron con un diluyente en base a TRIS, fructosa, ácido cítrico y yema de huevo (20%). Luego de 24 horas en refrigeración (4º C), cada muestra libre del diluyente y resuspendida en medio de capacitación canino (CCM) fue dividida en 7 alícuotas, las que fueron incubadas separadamente por 0, 1, 2 y 3 horas a 20º y 37º C. Cada muestra en las diferentes condiciones de incubación de tiempo y temperatura fue procesada para inmunofluorescencia indirecta, empleando un anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10 y luego un anticuerpo secundario “antimouse” fluorescente. Mediante un microscopio de epifluorescencia (Nikon Optiphot2), se evaluó la ausencia (no marcados) o presencia (marcados) de marca fluorescente a nivel acrosomal, indicativo de la liberación de acrosina o la permanencia de ésta dentro del acrosoma, respectivamente. Los porcentajes de no marcados (sin marca fluorescente) obtenidos fueron aumentando significativamente a través del tiempo de incubación desde 45,14% a la hora 0 a 81,21% a las 3 h de incubación a 20º C (P < 0,05). Los espermatozoides incubados a 37° C presentaron un aumento significativo del patrón no marcado; desde 45,14% a la hora 0 a 78, 86% a las 3 horas de incubación, presentando la mayor pérdida a la segunda hora de incubación. La MP fue evaluada subjetivamente, mediante microscopIa de contraste de fases, para determinar la viabilidad espermática. Se obtuvo que a medida que transcurrió el tiempo de capacitación la MP fue disminuyendo de 78,57% a la hora 0 a 55% en la tercera hora a 20º C (P < 0,05). La MP a 37º C no experimentó una variación significativa en el tiempo. Con los resultados obtenidos se puede concluir que en espermatozoides caninos refrigerados/entibiados y capacitados in vitro, la liberación de acrosina es dependiente del tiempo, y que esta liberación se produce de manera más acelerada al aumentar la temperatura a 37º C. La motilidad, sin embargo, se vio afectada sólo por el tiempo de capacitación, sin mostrar efecto significativo la temperatura de incubación / Proyectos ENL 05/8 DID; FONDECYT 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En espermatozoides caninos criopreservados, existen pocos antecedentes respecto de la dinámica del proceso de Capacitación Espermática (CE) y de los factores que la influencian. La Reacción Acrosómica (RA), paso final de la CE, permite la liberación de la enzima acrosina, proteasa presente en el acrosoma de los espermatozoides mamíferos, que ha sido involucrada en la unión y penetración de la Zona Pelúcida (ZP). El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del tiempo y la temperatura sobre la cinética de la liberación de la enzima acrosina a través de su localización, mediante inmunofluorescencia indirecta. Los eyaculados fueron obtenidos mediante manipulación digital, siendo evaluados a través de microscopía de contraste de fases, para el análisis subjetivo de Motilidad Progresiva (MP) y el recuento de la concentración espermática, para luego ser congelados con diluyente en base a fructosa, TRIS, ácido cítrico, 20% de yema de huevo y 5% de glicerol y descongelados en agua a 60º C por 8 segundos. Los espermatozoides descongelados fueron capacitados utilizando el Medio de Capacitación Canino (CCM) a diferentes tiempos y temperaturas de incubación. Posteriormente, las muestras fueron procesadas para inmunofluorescencia, mediante la fijación de los espermatozoides y la aplicación de los anticuerpos; como primer anticuerpo se utilizó el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10. La evaluación de los espermatozoides se realizó observando la presencia de la enzima acrosina, de acuerdo a la marca fluorescente a nivel acrosomal mediante Microscopía de Epifluorescencia (Nikon Optihot 2). Los espermatozoides caninos congelados mostraron la presencia de acrosina sólo a nivel acrosomal. Se pudo identificar 2 patrones según la presencia de la marca: a) sin marca fluorescente o patrón nulo y b) con marca fluorescente o patrón marcado. Al patrón nulo, corresponderían los espermatozoides que han experimentado la RA y por lo tanto, han liberado la enzima acrosina desde el acrosoma, mientras que al patrón marcado pertenecerían aquellos espermatozoides que no han cursado la RA y contienen la enzima en el interior del acrosoma. Al incubar los espermatozoides en medio capacitante (CCM), por periodos de 0, 30, 60 y 90 minutos y a temperaturas de 20 y 37º C se observó que el porcentaje de espermatozoides reaccionados o sin marca fluorescente aumentó a través del tiempo desde 29,71% a 65,43% a 20º C y desde 50,29% a 73,43% a 37º C de incubación. La motilidad espermática fue medida subjetivamente, mediante microscopía de contraste de fases en cada protocolo de capacitación (tiempo y temperatura) y se utilizó como medida de la viabilidad espermática. Los resultados de este estudio indicaron que la motilidad disminuyó a medida que aumentó el tiempo y la temperatura de incubación, desde un 67,14% a un 41,43% a 20º C (p < 0,05) y desde un 45% a un 25,71% a 37º C (p < 0,05). En base a los resultados obtenidos, se puede concluir que la ocurrencia de la liberación de la enzima acrosina en espermatozoides caninos congelados es afectada tanto por el tiempo de CE, como por la temperatura de incubación, traduciéndose en mayores porcentajes de liberación o pérdida de la enzima. Asimismo, la motilidad espermática disminuye a través del tiempo y al aumentar la temperatura de incubación. / Proyectos ENL 05/8 DID y FONDECYT 1060602

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L'ús d'esperma criopreservada en la inseminació artificial (IA) d'espècies d'interès productiu permet un major control sanitari i la creació de bancs de germoplasma d'alt valor genètic, entre d'altres avantatges. En el mercat porcí la major part de les inseminacions són encara realitzades amb semen refrigerat degut a l'èxit de l'aplicació de diluents de llarga durada i també a causa de la sensibilitat de l'esperma porcina a la criopreservació. Malgrat que aquesta sensibilitat ve donada per característiques particulars de la fisiologia espermàtica en l'espècie, algunes ejaculacions mantenen els paràmetres de qualitat espermàtica després de la criopreservació (ejaculacions amb bona "congelabilitat", GFEs) enfront d'altres que no sobreviuen al procés (ejaculacions amb mala "congelabilitat", PFEs). El primer objectiu de l'estudi va ser comparar ambdós grups en termes de fertilitat in vivo. El segon objectiu va ser testar l'eficiència de la inseminació postcervical (post-CAI) amb l'esperma criopreservada. El tercer objectiu va ser buscar predictors de la congelabilitat de les ejaculacions, tant en les GFEs com en les PFEs i en tres passos del procés de criopreservació (a 17ºC, a 5ºC i a 240 min postdescongelació). Aquest objectiu es va dur a terme mitjançant l'avaluació de paràmetres convencionals de qualitat espermàtica i a través de l'estudi de la localització i la reactivitat sota el microscopi de tres proteïnes (GLUT3, HSP90AA1 i Cu/ZnSOD) relacionades amb la fisiologia espermàtica i amb possibles rols en la congelabilitat. El quart objectiu va ser quantificar l'expressió de les tres proteïnes per transferència western, tant en espermatozoides d'ejaculacions GFEs com en els d'ejaculacions PFEs i en els tres passos abans esmentats, per tal de determinar el seu potencial com a predictores de la congelabilitat. Pel primer i el segon objectiu, 86 truges van ser inseminades per post-CAI amb 26 ejaculacions de mascles Piétrain dividides en una porció refrigerada a 17ºC (tractament control) i una porció criopreservada, ambdues porcions classificades alhora com a GFEs o PFEs. Els resultats més rellevants van demostrar que les probabilitats d'embaràs eren dues vegades menors en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions PFEs (P < 0.05) que en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs, fet que indica que les ejaculacions amb percentatges elevats d'espermatozoides mòbils progressius i d'integritat de membrana (per sobre del 40% en les GFEs) són més favorables a provocar embarassos que no pas aquelles ejaculacions amb una pobra funció espermàtica in vitro (PFEs). Ni el nombre de truges que van donar a llum, ni la quantitat de garrins, ni el risc de reflux espermàtic van ser significativament diferents entre les inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs i les inseminacions control amb semen refrigerat, la qual cosa demostra la bona aplicabilitat de la inseminació post-CAI amb l'esperma criopreservada. Finalment, pel tercer i quart objectius van ser criopreservades 29 i 11 ejaculacions de mascles Piétrain, respectivament. Dos paràmetres cinètics espermàtics, la linealitat (LIN) i la rectitud (STR), van mostrar una hiperactivació de la mobilitat superior en les ejaculacions PFEs que en les GFEs després de 30 min a 5ºC durant la criopreservació. A més, la combinació d'ambdós paràmetres va donar una fiabilitat propera al 72% en la predicció de la congelabilitat de les ejaculacions porcines. Tot i que no va ser possible predir la congelabilitat mitjançant l'avaluació de les tres proteïnes al microscopi, els resultats de transferència western van revelar diferències en l'expressió de la HSP90AA1 en l'esperma a 17ºC, molt possiblement relacionades amb la millor supervivència a la criopreservació dels espermatozoides d'ejaculacions GFEs. Aquests resultats suggereixen que la promoció de la criopreservació d'esperma porcina per la seva aplicació en IA passa pel desenvolupament de tests per la predicció de la congelabilitat en semen refrigerat. / The use of frozen-thawed (FT) sperm in artificial insemination (AI) of species with productive interest allows higher sanitary control and the creation of high genetic value sperm banks, among other advantages. In the swine market, most inseminations are still performed with refrigerated semen (FS) because of the successful application of long-term extenders and the sensitivity of boar sperm to cryopreservation. Although this sensitivity is provided by particular features of the sperm physiology in boars, some boar ejaculates maintain the sperm quality parameters after freezing (good freezability ejaculates, GFEs) in front of others that do not survive the process (poor freezability ejaculates, PFEs). The first objective of the study was to compare both groups in terms of field fertility. The second objective was to test the efficiency of the post-cervical AI (post-CAI) with FT sperm. The third objective was to search for predictors of the ejaculate freezability by assessing, both in GFEs and in PFEs and in three steps during the cryopreservation procedure (17ºC, 5ºC and 240 min post-thaw), conventional sperm quality parameters and the location and reactivity, under the microscope, of three proteins related to the sperm physiology with potential roles in freezability (GLUT3, HSP90AA1 and Cu/ZnSOD). The fourth objective was to quantify, through western blotting, the expression of the three proteins, both in GFEs and in PFEs and in the three steps mentioned, to determine their potential as freezability predictors. For the first and second objectives, 86 sows were inseminated by post-CAI with 26 ejaculates from Piétrain boars divided into a 17ºC FS portion (control treatment) and a cryopreserved (FT) sperm portion, the two portions in turn classified into GFEs and PFEs. The most relevant outcomes were that the probabilities of pregnancy resulted two times lower after inseminations with FT-PFEs (P < 0.05) compared to FT-GFEs, which indicates that ejaculates with high post-thaw sperm progressive motility and membrane integrity (over 40% in GFEs) are more likely to result in pregnancies than those with poor in vitro sperm function (PFEs). Neither the number of farrowing sows and the litter size nor the risk of sperm backflow was significantly different in FT-GFEs from that achieved in FS control treatments, which showed the good applicability of post-CAI to boar FT sperm. For the third and fourth objectives, 29 and 11 Piétrain boar ejaculates, respectively, were cryopreserved. Two kinematic indices, the sperm linearity (LIN) and the sperm straightness (STR), revealed higher hyperactivated motility in PFEs than in GFEs when assessed after 30 min at 5ºC during cryopreservation, the combination of the two motility parameters showing around 72% confidence in the freezability prediction of ejaculates. Whereas it was not possible to predict the freezability of the boar ejaculates by assessing the three proteins under microscope, results from western blot showed differences in the HSP90AA1 expression in sperm at 17ºC that are most possibly related to the best cryosurvival of GFEs. This finding aims to promote the cryopreservation of boar sperm intended for use in AI through the development of tests for freezability prediction in FS.

Este trabajo se ha centrado en el estudio de diferentes factores que afectan a la capacidad fecundante del semen congelado, como la velocidad de descongelación y el sistema antioxidante del semen porcino. También se ha estudiado la capacidad predictiva de la fertilidad in vivo que tienen las diferentes técnicas de análisis seminal tanto para el semen congelado como en condiciones de campo para el semen refrigerado. Se pudo determinar que la velocidad de descongelación más rápida tiene un efecto positivo sobre la funcionalidad espermática de las muestras evaluada mediante un sistema de FIV. Igualmente se concluyó también que el sistema de FIV parece ser la mejor herramienta disponible para evaluar la calidad del semen congelado-descongelado. Se evidenció que el proceso de crioconservación del semen supuso una pérdida siginificativa en el contenido de GSH intracelular. Finalmente, se demostró que el análisis seminal sólo puede identificar eyaculados con bajo potencial fértil. / Boar frozen-thawed semen is still a valuable tool as a complement to artificial insemination with fresh semen in some conditions. The objectives were firstly, the design of better freezing methods in order to obtain acceptable semen quality (freezing-thawing procedures) and secondly, to address the question of whether differences in farrowing rate and litter size after the use of different ejaculates could be predicted using the standard semen parameters under commercial conditions.We can determine that the IVF fertilization system seems to be a good tool to evaluate the quality of frozen-thawed boar semen previous to its commercial way. In other way, we found that there was a loss in GSH content after cryopreservation of boar semen and the addition of GSH to the thawing extender resulted in a significant increase in sperm fertilizing ability. Finally, semen analysis, under commercial conditions, allows to identify ejaculates with very low fertility potential. Therefore, it is unlikely to detect fertility differences associated with seminal parameters.

Tesis por compendio / [ES] Los tiburones y rayas aparecieron hace 420 millones de años, conformando el antiguo y ecológicamente diverso, grupo de vertebrados acuáticos conocido como elasmobranquios. Este variado grupo posee unas estrategias vitales que los hace muy vulnerables a los cambios rápidos del entorno, como los derivados de la acción antrópica. Pese a ser elementos clave en la regulación de los ecosistemas en los que habitan, en la actualidad, se trata de uno de los grupos vertebrados más amenazados del planeta. Paralelamente a la conservación in situ, los programas de conservación ex situ se pueden utilizar para mejorar la situación de algunas especies sensibles. Entre estos programas, los planes de cría en cautividad aumentarían la sostenibilidad de acuarios públicos y centros de investigación, además de permitir el desarrollo de estrategias de conservación en estado salvaje. Sin embargo, para que sean efectivos, estos planes deberían incluir el uso de técnicas de reproducción asistida. Desafortunadamente, estas técnicas apenas se han desarrollado en el pasado, por lo que su utilidad no se ha demostrado adecuadamente. Esta tesis aborda el uso de técnicas de reproducción en elasmobranquios, con énfasis en la obtención y preservación del esperma. Inicialmente, se centró en dos especies modelo, Scyliorhinus canicula y Raja radula, pero luego se incluyeron otras especies. Esto reveló variabilidad en las estructuras reproductivas, lo que puede afectar la eficacia y calidad de las técnicas. Los capítulos 1 y 2 se enfocaron en catalogar y describir estas estructuras en diversas especies, destacando las mejores prácticas de obtención de gametos e inseminación. La conservación a corto, medio y largo plazo del esperma es esencial para planes ex situ, reduciendo el transporte de machos, conflictos durante el cortejo y endogamia. El Capítulo 3 detalla fórmulas para mantener el esperma fresco y un medio para su supervivencia por más de 30 días. Luego, se describe la criopreservación del esperma de varias especies de rayas y tiburones mediante crioprotectores. El Capítulo 4 aborda desafíos en la manipulación de espermatozoides elasmobranquios debido a su morfología helicoidal y la formación de agregaciones llamadas espermatozeugma. Se resalta la importancia de la viscosidad en las técnicas de reproducción asistida. En la Discusión, se compara la eficacia de los métodos y se exploran nuevas oportunidades al tener acceso a diversas especies. Esto incluye descripciones detalladas con análisis de imagen, evaluación de viscosidad y agregados en la preservación, y la consideración de inseminaciones artificiales. / [CA] Els taurons i les ratjades van aparèixer fa 420 milions d'anys, formant el grup conegut com a elasmobranquis. Aquest grup divers posseeix estratègies vitals que els fan molt vulnerables als canvis ràpids de l'entorn. Malgrat ser elements clau en la regulació dels ecosistemes on habiten, actualment són un dels grups més amençats del planeta. Els programes de conservació ex situ es poden utilitzar per millorar la situació d'algunes espècies. Entre aquests programes, els plans de cria en captivitat augmentarien la sostenibilitat dels aquaris públics i els centres de recerca, a més de permetre el desenvolupament d'estratègies de conservació a l'estat salvatge. No obstant això, aquests plans haurien d'incloure l'ús de tècniques de reproducció assistida. Desafortunadament, aquestes tècniques gairebé no s'han desenvolupat en el passat. Davant d'aquesta situació, aquesta tesi pretén omplir certes mancances en el coneixement sobre l'ús d'aquestes tècniques en diverses espècies d'elasmobranquis. La nostra investigació va començar centrant-se especialment en dues espècies model, el tauró gat Scyliorhinus canicula i la ratjada peluda Raja radula, però al llarg de l'estudi es va aconseguir tenir accés a altres espècies. Aquest accés ens va permetre ser conscients de la gran variabilitat en la disposició de les estructures del sistema reproductor. Malgrat que en la literatura hi ha descripcions generals i, en ocasions, detallades dels sistemes reproductors de certes espècies, aquestes descripcions mai s'han centrat en l'aplicació pràctica de les tècniques de reproducció assistida. Per aquest motiu, els capítols 1 i 2 es van centrar en la catalogació i descripció de les diferents estructures d'espècies que abasten un ampli espectre taxonòmic. La conservació de l'esperma juga un paper clau per poder desenvolupar plans de conservació en condicions ex situ. Disposar d'esperma de qualitat permet limitar el transport de mascles entre institucions, minimitzar problemes derivats de la manca de sincronia entre adults reproductors, reduir conflictes durant èpoques d'aparellament i reduir l'endogàmia. El tercer capítol es centra en com es van desenvolupar i provar diferents fórmules per aconseguir el manteniment en fresc de l'esperma, fins a aconseguir un medi on diluir l'esperma capaç de mantenir-lo amb vida durant més de 30 dies. Posteriorment, mitjançant l'addició de diversos crioprotectors (ou, DMSO i metanol) en diverses concentracions, s'explica com es va aconseguir la criopreservació de l'esperma de diverses espècies de ralles i, per primer cop, la criopreservació de l'esperma de diverses espècies de taurons. Un dels primers obstacles que es van detectar en treballar amb els espermatozoides es va deure a la morfologia d'aquestes cèl·lules en comparació amb les d'altres espècies. El cap dels espermatozoides presenta una forma helicoidal, amb un nombre variable de voltes en funció de l'espècie. A més, en moltes ocasions les cèl·lules no apareixen lliures en el fluid seminal, sinó que formen agregacions estructurades anomenades espermatotzeugma. Al llarg del capítol 4 s'explora com aquestes dues característiques sorgeixen com a resultat de la fecundació interna i les característiques mecàniques del medi en què han de realitzar la seva funció. Per primer cop, es pot observar com les cèl·lules reaccionen davant mitjans amb diferents propietats, posant de relleu la importància de la viscositat en l'aplicació de tècniques de reproducció assistida. Finalment, a la discussió, es compara l'eficàcia dels mètodes emprats i s'explora nous camins d'acció sorgits de tenir accés a més individus de diferents espècies. Això inclou la possibilitat de fer descripcions detallades mitjançant tècniques d'anàlisi d'imatge, avaluar la importància de la viscositat i els agregats en els processos de preservació i la possibilitat de realitzar inseminacions artificials. / [EN] Sharks and rays emerged 420 million years ago, forming the ancient and ecologically diverse group of aquatic vertebrates known as elasmobranchs. This diverse group possesses vital strategies that make them highly vulnerable to rapid environmental changes, such as those resulting from human activities. Despite being key elements in the regulation of the ecosystems they inhabit, they are currently one of the most threatened vertebrate groups on the planet. In parallel with in-situ conservation efforts, ex-situ conservation programs can be used to improve the status of some sensitive species. Among these programs, captive breeding plans would enhance the sustainability of public aquariums and research centers, as well as enable the development of conservation strategies in the wild. However, for these plans to be effective, they should include the use of assisted reproduction techniques. Unfortunately, these techniques have been scarcely developed in the past, and their utility has not been adequately demonstrated. This thesis addresses the use of reproduction techniques in elasmobranchs, with an emphasis on sperm retrieval and preservation. Initially, it focused on two model species, Scyliorhinus canicula and Raja radula, but later, other species were included. This revealed variability in reproductive structures, which can affect the effectiveness and quality of the techniques. Chapters 1 and 2 focused on cataloging and describing these structures in various species, highlighting best practices for gamete retrieval and insemination. The short, medium, and long-term conservation of sperm is essential for ex-situ plans, reducing the need for transporting males, conflicts during courtship, and inbreeding. Chapter 3 details formulas for maintaining sperm freshness and a medium for its survival for over 30 days. Subsequently, sperm cryopreservation in several species of rays and sharks is described using cryoprotectants. Chapter 4 addresses challenges in handling elasmobranch sperm due to its helical morphology and the formation of aggregates called spermatozeugma. The importance of viscosity in assisted reproduction techniques is emphasized. In the Discussion, the effectiveness of the methods is compared, and new opportunities are explored by having access to various species. This includes detailed descriptions with image analysis, viscosity assessment, and aggregate preservation, as well as the consideration of artificial inseminations. / This research was partially funded by the Fundación Biodiversidad ( ). PGS has a PhD contract from the European Union through the Operational Program of the European Social Fund (ESF) of the Comunitat Valenciana 2014–2020 ACIF 2018 (ACIF/2018/147). VG has a postdoc contract from the MICIU, Programa Juan de la Cierva-Incorporación (IJCI- 2017-34200). / García Salinas, P. (2023). Development and Application of Techniques for the Control of Captive Breeding in Elasmobranchs [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201494 / Compendio