No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

Introdução: A meningite criptocócica causa elevada mortalidade, sobretudo em pacientes acometidos de alguma condição imunossupressora. O objetivo deste estudo foi identificar fenômenos de baixa suscetibilidade a antifúngicos e outros preditores clínicos que possam explicar falha terapêutica e recidiva da neurocriptococose Metodologia: Foram avaliados 96 casos com coleta de dados clínicos epidemiológicos e laboratoriais. Os isolados foram identificados quanto a genótipo molecular, suscetibilidade de anfotericina B (AMB) e fluconazol (FCZ) pela determinação da concentração inibitória mínima (Minimal Inhibitory Concentration, MIC), nível de heteroresistência ao FCZ (NHF) e determinação do tempo de morte frente AMB (Time-Kill, TK). Foram selecionados isolados heterorresistentes para análise quantitativa de DNA por PCR em tempo Real, expressão de bombas de efluxo por citometria de fluxo e isolados tolerantes a AMB para estudo de resistência ao estresse oxidativo. Foi realizada análise univariável e múltipla usando regressão logística para identificar preditores de óbito hospitalar e de um desfecho composto definido pelo óbito, encaminhamento para unidade de terapia intensiva ou recidiva 6 meses após alta hospitalar. Resultados: A maioria dos pacientes eram imunodeprimidos, com CD4 de 2 a 722 cel./mm3 e 96,7% eram portadores do HIV. Foram identificados 93 isolados de C. neoformans, sendo 76 do genótipo VNI e 17 VNII e 3 C. gattii, todos VGII. MIC de AMB variou de 0,012 a 0,94 mg/L e MIC de FCZ estiverem entre 0,12 e 64 mg/L. Resistência a FCZ (MIC>16mg/L) foi maior em VNI do que em VNII (p=0,03). Dentre os isolados VNI, 64,5% sofreu atividade fungicida até as 24h (TK24) de exposição à AMB e 6 cepas VNI não sofreram ação fungicida (TK>72). A maioria dos isolados VNII (64,7%) apresentou TK24. Os 3 isolados VGII sofreram atividade fungicida a partir de TK24. A maioria dos isolados VNI, VNII e todos os isolados VGII apresentaram alto NHF (>32mg/L). Diferença no NHF de acordo com os genótipos foi observada (p=0,005). No modelo múltiplo, as variáveis associadas significativamente ao óbito foram: idade em anos (OR=1,08;IC95%=1,02-1,15), contagem de leveduras no líquido cefalorraquidiano em logaritmo (LCR) (OR=1,66;IC95%=1,21-2,28) e uma variável composta por hipertensão arterial sistêmica ou diagnóstico de edema cerebral ou dilatação ventricular por tomografia (OR=35,68;IC95%=4,97-256,31). Para o desfecho composto, as variáveis associadas foram: contagem de leveduras do 1D em logaritmo (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), cultura de sangue positiva para Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) e descrição de neurotoxoplasmose (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). As associações foram consistentes em modelos de sobrevida. Conclusão: Foi possível descrever genótipos mais frequentes e identificar fatores genéticos, como aumento da expressão de genes e bombas de efluxo, relacionados à resistência aos fármacos. Nenhum dos testes de suscetibilidade esteve associado com os desfechos. Variáveis obtidas nos primeiros dias de internação mostraram utilidade para predizer o prognóstico em pacientes com meningite criptocóccica. Estes preditores podem ajudar a identificar os casos com maior potencial de óbito e que necessitam da otimização dos recursos terapêuticos. / Background: Cryptococcal meningitis causes high mortality in immunocompromised patients. The objective of this study was to identify the phenomena of low susceptibility to antifungal and other clinical predictors that may explain therapeutic failure and relapse of neurocryptococcosis Methodology: It was analyzed 96 cases with clinical and epidemiological data. The respective isolates were identified for genotype, susceptibility profile by Minimal Inhibitory Concentration (MIC), FCZ heteroresistance level (NHF), and time to death determination against 1 mg / L BMA (Time-Kill, TK). We isolated heteroresistant DNA expression analysis by real-time PCR, expression of efflux pumps by flow cytometry and, some isolates tolerant to AMB were selected to study resistance to oxidative stress. Univariable and multiple analyses using logistic regression were performed to identify predictors of in-hospital mortality and a composed outcome defined by death, referral to the intensive care unit and relapse 6 months after hospital discharge. Results: Most of the patients were immunocompromised, with CD4 range from 2 to 722 cells/mm3 and 96.7% patients HIV-positive. It was analyzed 93 strains of Cryptococcus neoformans of which 76 were genotype VNI and 17 were VNII and 3 were C. gattii, all were VGII. AMB MIC ranged from 0.012 to 0.94 mg/L and FCZ MIC were between 0.12 and 64 mg/L. Resistance to FCZ (MIC>16mg/L) was higher to VNI than VNII (p=0.03). Among the VNI strains, 64.5% had fungicidal activity up to 24h (TK24) of exposure to AMB and 6 VNI did not present this activity until 72h (TK> 72). Most VNII strains (64.7%) had TK24. The 3 VGII strains presented fungicidal activity from TK24. According to the MIC, all strains were susceptible to AMB. The majority of VNI strains (93.4%) and VNII (76.5%) and 3 VGII strains showed high NHF (>32mg/L) and it was observed statistical difference according to the genotypes VNI and VNII (p=0.005). At the multiple analysis, the variables significantly associated with the death were the age in years (OR=1.08,95%CI=1.02-1.15), the cerebrospinal fluid (CSF) yeasts count-log (OR=1.66,95%CI=1.21-2.28), and a variable composed of systemic arterial hypertension or diagnosis of cerebral edema or ventricular dilatation by tomography (OR=35.68,95%CI=4.97-256.31). At the composed outcome, the variables associated were: CSF yeasts count-log (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), positive blood culture for Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) and neurotoxoplasmosis (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). The associations were consistent at survival models. Conclusion: It was possible to describe more frequent genotypes and to identify genetic factors, such as increased gene expression and efflux pumps, related to drug resistance. The antifungal susceptibilities were not associated with the outcomes. were not associated with outcomes. Variables available in the first days of hospitalization showed utility to predict the prognosis in patients with cryptococcal meningitis. These predictors can help to identify the cases with higher potential of death and that require the optimization of the therapeutic resources.

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

A identificação histopatológica dos agentes fúngicos é um método excelente de diagnóstico, devido ao fato de que as estruturas são facilmente identificadas por meio das técnicas histoquímicas. Até o momento, não dispõem-se de métodos aceitáveis para quantificação da atividade da infecção. Esta investigação protocola um método de estimativa para atividade biológica da criptococose através da determinação dos índice de brotamentos e carminofílico do Cryptococcus. Objetivos: Descrever os aspectos histopatológicos da criptococose através das técnicas histoquímicas básicas e especiais da micologia. Métodos: Foram avaliados 33 pacientes com diagnóstico histopatológico prévio da criptococose. Resultados: Houve predominância do sexo masculino. A idade variou entre 10 a 81 anos, com média de 45,6 anos. A criptococose é doença definidora dos casos de Aids, sendo considerado seu principal fator predisponente, seguido de transplantes. O trato respiratório é o mais envolvido. O microrganismos tem tropismo para o sistema nervoso central e apresenta disseminação para outros órgãos. Resultados falso-negativos é reflexo da deficiência de material capsular. A mortalidade foi de 36%, sendo o maior índice obervado até os 3 primeiros meses após o diagnóstico. A criptococose apresenta-se sob duas formas, reativa e paucireativa. Na infecção reativa, os organismos foram menos abundantes e predominantemente intracelulares aos histiócitos e às células gigantes. Na infecção paucireativa, há um grande número de leveduras, que proliferam-se extracelularmente e estão associadas a destruição do tecido afetado. Ambos infecções, reativas e paucireativas mostraram grande variação no índice de brotamento. O índice carminofílico foi menor nas infecção reativas, quando comparados a infecção paucireativa. Discussão: A coloração de Hematoxilina-Eosina é usada para visualizar as alterações estruturais das lesões, bem como da reação tecidual. A coloração da prata é a mais utilizada para identificação dos organismos fúngicos como o Cryptococcus. A coloração de Mucicarmim de Mayer detecta a cápsula mucopolissacarídica circundante corada na cor magenta. A coloração de FM oferece diagnóstico diferencial nos casos inconclusivos à coloração de Mucicarmim de Mayer. A quantificação de IB e IC é uma escala útil na interpretação da resposta inflamatória do hospedeiro e atividade biológica da criptococose. / The histopathologic identification from the fungal agents that's a method excellent of diagnostic, due the fact of what the structures são easily identified for histochemical techniques. So far, there is no methods you accepted about to measurement of biologic activity. This investigation aponta to an method of estimate of the activity biologic of cryptococcal infection by determination of the Budding Index and Carminophilic Index of the Cryptococcus. Objectives: Describes the histologic features of cryptococcosis by basic and special histochemical techniques of mycology. Methods: Have been evaluated 33 patients with previous cryptococcosis histopathologic diagnostic. Results: There is an predominance of the males. The age of the patients ranged from 10 to 81 years with a median value 45,4 years. The HIV infection was the main risk factor for disease, followg of transplants. The respiratory tract is the most frequently involved among the organ systems organs. The false-negative latex test are due to capsular deficiency. The moratlity rate was 36%, The high rate of 50% was observed between of 1 to 3 months. The cryptococcal infections is divided into two major histologic categories, reactive and paucireactive, based upon the host reaction. In reactive infection, the organisms were lessa abundant and were predominantly intracellular within histiocytes and giant cells. In paucireactive infection, thre is large numbers of yeats in the lesions, cryptococci proliferate extracellarly within the involved tissues, associated histologically with mucoid degeneration of the surrounding tissue. Both reactice and paucireactive infections showed great variation in Budding Index. The Carminophilic Inded was lower in the reactive infections, when compared with the paucireactive infection. In this Carminophilic Index presented higher measurements.. Discussion: The Hematoxilin-Eosin stain is used to look for strucutural changes of the infectd lesion, as well tissues reactions. The Gomori’s methenamine-silver stain is the more commonly used in identificatifying these organisms. The mucicarmine stain detecting the surrounding mucopolisacharides capsule of the magenta color. The Fontana-Masson staining offers differential diagnostic. The determination of IB and IC is an scale that relied, because it provides an interpretation of the host response and biological activity of the cryptoccosis.

A identificação histopatológica dos agentes fúngicos é um método excelente de diagnóstico, devido ao fato de que as estruturas são facilmente identificadas por meio das técnicas histoquímicas. Até o momento, não dispõem-se de métodos aceitáveis para quantificação da atividade da infecção. Esta investigação protocola um método de estimativa para atividade biológica da criptococose através da determinação dos índice de brotamentos e carminofílico do Cryptococcus. Objetivos: Descrever os aspectos histopatológicos da criptococose através das técnicas histoquímicas básicas e especiais da micologia. Métodos: Foram avaliados 33 pacientes com diagnóstico histopatológico prévio da criptococose. Resultados: Houve predominância do sexo masculino. A idade variou entre 10 a 81 anos, com média de 45,6 anos. A criptococose é doença definidora dos casos de Aids, sendo considerado seu principal fator predisponente, seguido de transplantes. O trato respiratório é o mais envolvido. O microrganismos tem tropismo para o sistema nervoso central e apresenta disseminação para outros órgãos. Resultados falso-negativos é reflexo da deficiência de material capsular. A mortalidade foi de 36%, sendo o maior índice obervado até os 3 primeiros meses após o diagnóstico. A criptococose apresenta-se sob duas formas, reativa e paucireativa. Na infecção reativa, os organismos foram menos abundantes e predominantemente intracelulares aos histiócitos e às células gigantes. Na infecção paucireativa, há um grande número de leveduras, que proliferam-se extracelularmente e estão associadas a destruição do tecido afetado. Ambos infecções, reativas e paucireativas mostraram grande variação no índice de brotamento. O índice carminofílico foi menor nas infecção reativas, quando comparados a infecção paucireativa. Discussão: A coloração de Hematoxilina-Eosina é usada para visualizar as alterações estruturais das lesões, bem como da reação tecidual. A coloração da prata é a mais utilizada para identificação dos organismos fúngicos como o Cryptococcus. A coloração de Mucicarmim de Mayer detecta a cápsula mucopolissacarídica circundante corada na cor magenta. A coloração de FM oferece diagnóstico diferencial nos casos inconclusivos à coloração de Mucicarmim de Mayer. A quantificação de IB e IC é uma escala útil na interpretação da resposta inflamatória do hospedeiro e atividade biológica da criptococose. / The histopathologic identification from the fungal agents that's a method excellent of diagnostic, due the fact of what the structures são easily identified for histochemical techniques. So far, there is no methods you accepted about to measurement of biologic activity. This investigation aponta to an method of estimate of the activity biologic of cryptococcal infection by determination of the Budding Index and Carminophilic Index of the Cryptococcus. Objectives: Describes the histologic features of cryptococcosis by basic and special histochemical techniques of mycology. Methods: Have been evaluated 33 patients with previous cryptococcosis histopathologic diagnostic. Results: There is an predominance of the males. The age of the patients ranged from 10 to 81 years with a median value 45,4 years. The HIV infection was the main risk factor for disease, followg of transplants. The respiratory tract is the most frequently involved among the organ systems organs. The false-negative latex test are due to capsular deficiency. The moratlity rate was 36%, The high rate of 50% was observed between of 1 to 3 months. The cryptococcal infections is divided into two major histologic categories, reactive and paucireactive, based upon the host reaction. In reactive infection, the organisms were lessa abundant and were predominantly intracellular within histiocytes and giant cells. In paucireactive infection, thre is large numbers of yeats in the lesions, cryptococci proliferate extracellarly within the involved tissues, associated histologically with mucoid degeneration of the surrounding tissue. Both reactice and paucireactive infections showed great variation in Budding Index. The Carminophilic Inded was lower in the reactive infections, when compared with the paucireactive infection. In this Carminophilic Index presented higher measurements.. Discussion: The Hematoxilin-Eosin stain is used to look for strucutural changes of the infectd lesion, as well tissues reactions. The Gomori’s methenamine-silver stain is the more commonly used in identificatifying these organisms. The mucicarmine stain detecting the surrounding mucopolisacharides capsule of the magenta color. The Fontana-Masson staining offers differential diagnostic. The determination of IB and IC is an scale that relied, because it provides an interpretation of the host response and biological activity of the cryptoccosis.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ludmila de Matos Baltazar _ dissertacao.pdf: 1344528 bytes, checksum: 3adf6afe644493dc3f572d95071acc58 (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cryptococcosis is a systemic mycosis, which the meningoencephalitis is the most severe and most common clinical manifestation. The main species involved in your etiology are Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. The ecology of these species is not well, known, C. neoformans has the excrement of birds, mainly pigeons, as its principal habitat and C. gattii is commonly associate to the trees. The presence of C. gattii was investigated in different regions of Espirito Santo State and it was found in only two (0,7%) of the 209 samples of trees analyzed whereas C. neoformans was isolated in 9 (17%) of the 54 pigeon excrements analyzed. The occurrence of C. neoformans (63 isolates) at both clinical and environmental samples was higher than C. gattii (4 isolates). In the total, 67 isolates, clinical and environmental, of C. neoformans and C. gattii, were analyzed and all of then were sensitive to the voriconazole (VCZ) and amphotericin B (AMB). For the drug itraconazole (ITZ), 82% were sensitive (S), 18% sensitive-dose-dependent (SDD) and for fluconazole (FCZ), 75% S, 24% SDD and 1% resistant (R). Considering the origin of the isolates, the susceptibility profile was similar between the clinical and environmental origin. Among the azoles, the VCZ was the drug that showed higher activity and FCZ which showed less activity in vitro. There was no crossresistance between FCZ and VCZ. Regard the production of the phospholipase enzyme, 84% of the isolates had high production and only 3% showed no production of the enzyme. All the 67 isolates showed activity of phenoloxidase enzyme, being 71% low and none of then with negative activity. Lower production of phospholipase and higher phenoloxidase activity were observed in strains isolated from HIV-pos. All the clinical and environmental strains of C. neoformans belonged to genotype VNI and all C. gattii to VGII genotype. These results showed similarity in the genetic pattern, susceptibility profile of the drugs and production of extracellular enzymes, phospholipase and phenoloxidase between environmental and clinical isolates and confirm that the infection can be from environmental source. / A criptococose é uma micose sistêmica e a meningoencefalite é a sua manifestação clínica mais grave e mais comum. As principais espécies envolvidas na etiologia são Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A ecologia destas espécies não é ainda bem conhecida, C. neformans tem como habitat, fezes de aves, principalmente pombos e C. gattii é comumente associada a árvores. A presença de C. gattii foi investigada em diferentes regiões do Estado do Espírito Santo e foi encontrada em apenas duas (0,7%) das 209 amostras de árvores analisadas enquanto C. neoformans foi isolado em 9 (17%) das 54 amostras de excrementos de aves analisadas. A ocorrência de Cryptococcus neoformans (63 isolados) tanto em amostras ambientais como clínicas foi maior que a de Cryptococcus gattii (4 isolados). No total, 67 isolados, clínicos e ambientais, de C. neoformans e C. gattii, foram analisados e todos foram sensíveis as drogas voriconazol (VCZ) e anfotericina B (AMB). Para a droga itraconazol (ITZ), 82% foram sensíveis (S), 18% sensível-dosedependente (SDD) e para fluconazol (FCZ), 75% S, 24% SDD e 1% resistente (R). Considerando a origem dos isolados, o perfil de suscetibilidade foi semelhante entre os de origem clínica e os ambientais. Entre os azólicos, o voriconazol foi o fármaco que apresentou maior atividade e o fluconazol o que apresentou menor atividade in vitro. Não foi observada resistência cruzada entre voriconazol e fluconazol. Quanto à produção da enzima fosfolipase, 84% dos isolados apresentaram produção alta e apenas 3% não produziram a enzima. Todos os 67 isolados mostraram atividade da enzima fenoloxidase, sendo 71% com atividade baixa e nenhum com atividade negativa. Produção mais baixa da fosfolipase e níveis mais altos de atividade da fenoloxidase foram observados em cepas isoladas de pacientes HIV-positivos. Todas as cepas clínicas e ambientais de C. neoformans pertenceram ao genótipo VNI e todas C. gattii ao genótipo VGII. Esses resultados revelaram semelhança no padrão genético, perfil de suscetibilidade a drogas e produção das enzimas extracelulares, fosfolipase e fenoloxidase, entre isolados ambientais e clínicos e confirmam que a infecção pode ocorrer a partir de fontes ambientais.

A identificação histopatológica dos agentes fúngicos é um método excelente de diagnóstico, devido ao fato de que as estruturas são facilmente identificadas por meio das técnicas histoquímicas. Até o momento, não dispõem-se de métodos aceitáveis para quantificação da atividade da infecção. Esta investigação protocola um método de estimativa para atividade biológica da criptococose através da determinação dos índice de brotamentos e carminofílico do Cryptococcus. Objetivos: Descrever os aspectos histopatológicos da criptococose através das técnicas histoquímicas básicas e especiais da micologia. Métodos: Foram avaliados 33 pacientes com diagnóstico histopatológico prévio da criptococose. Resultados: Houve predominância do sexo masculino. A idade variou entre 10 a 81 anos, com média de 45,6 anos. A criptococose é doença definidora dos casos de Aids, sendo considerado seu principal fator predisponente, seguido de transplantes. O trato respiratório é o mais envolvido. O microrganismos tem tropismo para o sistema nervoso central e apresenta disseminação para outros órgãos. Resultados falso-negativos é reflexo da deficiência de material capsular. A mortalidade foi de 36%, sendo o maior índice obervado até os 3 primeiros meses após o diagnóstico. A criptococose apresenta-se sob duas formas, reativa e paucireativa. Na infecção reativa, os organismos foram menos abundantes e predominantemente intracelulares aos histiócitos e às células gigantes. Na infecção paucireativa, há um grande número de leveduras, que proliferam-se extracelularmente e estão associadas a destruição do tecido afetado. Ambos infecções, reativas e paucireativas mostraram grande variação no índice de brotamento. O índice carminofílico foi menor nas infecção reativas, quando comparados a infecção paucireativa. Discussão: A coloração de Hematoxilina-Eosina é usada para visualizar as alterações estruturais das lesões, bem como da reação tecidual. A coloração da prata é a mais utilizada para identificação dos organismos fúngicos como o Cryptococcus. A coloração de Mucicarmim de Mayer detecta a cápsula mucopolissacarídica circundante corada na cor magenta. A coloração de FM oferece diagnóstico diferencial nos casos inconclusivos à coloração de Mucicarmim de Mayer. A quantificação de IB e IC é uma escala útil na interpretação da resposta inflamatória do hospedeiro e atividade biológica da criptococose. / The histopathologic identification from the fungal agents that's a method excellent of diagnostic, due the fact of what the structures são easily identified for histochemical techniques. So far, there is no methods you accepted about to measurement of biologic activity. This investigation aponta to an method of estimate of the activity biologic of cryptococcal infection by determination of the Budding Index and Carminophilic Index of the Cryptococcus. Objectives: Describes the histologic features of cryptococcosis by basic and special histochemical techniques of mycology. Methods: Have been evaluated 33 patients with previous cryptococcosis histopathologic diagnostic. Results: There is an predominance of the males. The age of the patients ranged from 10 to 81 years with a median value 45,4 years. The HIV infection was the main risk factor for disease, followg of transplants. The respiratory tract is the most frequently involved among the organ systems organs. The false-negative latex test are due to capsular deficiency. The moratlity rate was 36%, The high rate of 50% was observed between of 1 to 3 months. The cryptococcal infections is divided into two major histologic categories, reactive and paucireactive, based upon the host reaction. In reactive infection, the organisms were lessa abundant and were predominantly intracellular within histiocytes and giant cells. In paucireactive infection, thre is large numbers of yeats in the lesions, cryptococci proliferate extracellarly within the involved tissues, associated histologically with mucoid degeneration of the surrounding tissue. Both reactice and paucireactive infections showed great variation in Budding Index. The Carminophilic Inded was lower in the reactive infections, when compared with the paucireactive infection. In this Carminophilic Index presented higher measurements.. Discussion: The Hematoxilin-Eosin stain is used to look for strucutural changes of the infectd lesion, as well tissues reactions. The Gomori’s methenamine-silver stain is the more commonly used in identificatifying these organisms. The mucicarmine stain detecting the surrounding mucopolisacharides capsule of the magenta color. The Fontana-Masson staining offers differential diagnostic. The determination of IB and IC is an scale that relied, because it provides an interpretation of the host response and biological activity of the cryptoccosis.

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

Cryptococcus neoformans (C. neoformans), um fungo que se encontra disseminado em várias partes do mundo, inclusive no Brasil, é o responsável pela criptococose infecção oportunista mais comum em pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). O caráter sistêmico da criptococose pode levar esses pacientes a óbito. A finalidade de se obter um diagnóstico laboratorial rápido e acurado de C. neoformans, principalmente para o seguimento dos pacientes HIV nos levou a investigar \"seqüências iniciadoras\" (Si) A, B e C das regiões 18SrDNA, 5,8SrDNA e ITS do Cryptococcus spp. Pela Nested PCR com estas seqüências, sugerimos a melhor delas para o desenvolvimento de um diagnóstico molecular em relação aos métodos usuais. Para tal, foram avaliadas amostras de soro e líquor de 39 pacientes, que já haviam recebido tratamento clínico. Todos os casos foram selecionados em grupos, como segue:7 com criptococose (GIII), 14 HIV positivos (GIV), 18 HIV positivos associados com a criptococose (GV) em relação a 10 controles - indivíduos sadios (GI) e amostras de culturas referência (GII). Os resultados obtidos pela Nested PCR com as \"Sis\" A, B e C foram comparados àqueles obtidos pelos métodos de diagnóstico convencionais. As análises desse estudo mostraram que as \"Sis\" A, B e C detectam C. neoformans com especificidade variada, tanto no soro (SiA 91,66%, SiB-100%, SiC 75%), como no líquor (SiA 83,33%, SiB 100% e SiC 75%) mas não apresentaram falso positivo, quando esses resultados foram comparados aos obtidos das culturas heterólogas (GVI). A SiB, em líquor, apresentou sensibilidade, acurácia, valores preditivo positivo e negativo, e especificidade de 100% para a detecção de C. neoformans da mesma forma que no soro, porém neste o valor preditivo negativo foi 89%, acurácia 94% e a sensibilidade 88%. Em amostras de soro e líquor, os testes Tinta da China e Látex, mostraram resultados falso positivos para o GIV e falso negativos nos grupos GIII e GV. As análises comparativas entre as técnicas mostraram que a ordem de eficiência da sensibilidade para detecção de C. neoformans no soro foi SiB>SiA=Látex>SiC e no líquor foi SiB> SiA>tinta da China>Látex=SiC. No soro, a especificidade entre as técnicas foi SiB>SiA=Látex>SiC e no líquor foi SiB=tinta da China>Látex>SiA>SiC. De acordo com nossos dados, concluímos que, independente da doença associada (HIV) ou se o paciente for tratado, a SiB foi a melhor seqüência para a detecção de C. neoformans, tanto em amostras diretamente de soro, como de líquor para todos os grupos estudados. Tendo em vista os fatos, acreditamos que, a aplicação da técnica da Nested PCR com a \"SiB\", em amostras de líquor e soro, é um método viável e acurado para realizar o diagnóstico molecular do C. neoformans em pacientes HIV. O uso de amostras de soro, para o segmento dos pacientes com SIDA, durante o tratamento, pode ser a forma menos invasiva em relação ao líquor para a detecção do C. neoformans, com vantagens sobre os métodos utilizados / Cryptococcus neoformans (C. neoformans), a fungus that is widespread in many parts of the world, including Brazil, is responsible for cryptococcosis the most common opportunistic infection in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The systemic character of cryptococcosis may be fatal. In order to obtain a rapid and accurate laboratory diagnosis to follow - up of HIV-cryptococcosis patients led us to investigate the sensibility and especificity of three primers (A, B and C) of 18SrDNA, 5,8SrDNA and ITS regions of Cryptococcus spp. Using Nested PCR with those primers we suggest the best among them to be used as a method of molecular diagnosis in relation to the usual techniques. For this purpose, the serum and cerebrospinal fluid (CSF) of 39 patients, who had received medical treatment, were evaluated. All cases were separated in groups, as follows: 7 with cryptococcosis (group III), 14 HIV positive (group IV), 18 HIV positive associated with cryptococcosis (group V) were compared to, 10 healthy subjects (group I) controls, as well as to reference cultures (group II) samples. The results obtained by nested PCR with primers A and B and C were compared to those obtained by conventional diagnostic methods. The analyses of primers A, B and C detected C. neoformans both in serum (SiA 91,6%, SiB-100%, SiC 75%), and in CSF (SiA 83,3%, SiB 100% e SiC 75%). Besides, they were specific for the identification of C. neoformans and showed that there were no false positives when compared with heterologous cultures (group VI) samples. The primer B in CSF showed 100% sensitivity, 100% accuracy and 100% predictive values (positive and negative), and 100% specificity for the detection of C. neoformans, the same that occurs in serum, but in this case, with 88% in sensitivity, 89% predictive value negative and 94% accuracy. In serum and CSF samples the China Ink and the Latex tests showed false positive results for group IV and false negative for III and V groups. The comparative analysis among the techniques (Nested PCR, China Ink, Latex) indicated that the efficiency order of sensitivity for the detection of C. neoformans were PrB> PrA = Latex> PrC in serum and PrB > PrA > China Ink> Latex = PrC in CSF. For the serum and CSF specificities the same techniques were used with the following results: PrB>PrA=Latex>PrC and PrB=China Ink>Latex>PrA>PrC. According to our data we conclude that, whether the patients had been under treatment or not, the Nested PCR by PrB was the best way to detect C. neoformans both in serum and in CSF for all groups. The following up of AIDS patients, throughout the course of therapy was found to be feasible, accurate and less invasive to detect C. neoformans by using serum samples (directly)