Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patricia Barbosa.pdf: 1571215 bytes, checksum: daac7b661ca93cbfd05ca0e7cda85213 (MD5) Previous issue date: 2013-02-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The most part of the eukaryote genomes is constituted for repetitive DNA or multiple copies DNA, which has already been considered as “junk”, may be associated to the heterochromatin. In this study three Astyanax scabripinnis populations from Pindamonhangaba and Guaratinguetá (SP, Brazil) rivers and stream and one population from Maringá (PR, Brazil) were analyzed about the nucleolar organizing region (NORs), As51 satellite DNA, 18S and 5S rDNA location. Moreover, repetitive sequences were isolated and mapped through Cot-1 technique, which showed homology with UnaL2, a LINE type retrotransposon. The fluorescent in situ hybridization (FISH), with the isolated built retrotransposon probe, evidenced disperse labeled and stronger in centromeric and telomeric chromosomes regions, co-located and interspersed with the 18S DNAr and As51, proven by the fiber-FISH technique. The B chromosome of those populations showed very conspicuous labeled with the LINE probe, also co-located with the As51 sequences. The NORs were actives in a single site of a homologue pair in all three populations, with no evidence that the transposable elements and repetitive DNA have influence in its regulation at the performed analyzes level. / A maior parte do genoma dos eucariotos é constituída por DNA repetitivo ou DNA de múltiplas cópias, o qual já foi considerado “lixo”, podendo estar associado à heterocromatina. Neste estudo foram analisadas três populações de Astyanax scabripinnis provenientes de rios e córregos de Pindamonhangaba e Guaratinguetá (SP, Brasil) e uma população da cidade de Maringá (PR, Brasil) quanto a localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), DNA satélite As51, DNA ribossomal (DNAr) 18S e DNAr 5S. Ainda, foram isoladas e mapeadas sequências repetitivas por meio da técnica de Cot-1, que mostrou homologia com UnaL2, retrotransposon do tipo LINE. A hibridação in situ fluorescente (FISH), com sonda construída para o retrotransposon isolado, evidenciou marcações dispersas e mais concentradas em regiões centroméricas e teloméricas dos cromossomos, co-localizadas e interespaçadas com DNAr 18S e As51, comprovada pela técnica de fiber-FISH. O cromossomo B das populações mostrou marcações bastante conspícuas com a sonda LINE, também co-localizada com sequências As51. As RONs apresentaram-se ativas em sítios únicos de um par homólogo nas três populações, não havendo indícios de que elementos transponíveis e DNA repetitivo tenham influência na sua regulação ao nível das análises realizadas.

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: Characidium é um grupo de peixes amplamente distribuídos pela região Neotropical, embora seja considerado o mais especioso dentro de Crenuchidae, do ponto de vista citogenético o número de espécies investigadas ainda é baixo, o que dificulta a caracterização quanto a organização cromossômica do gênero. Em relação ao número diploide, as espécies de Characidium conservaram um cariótipo com 2n = 50 cromossomos, do tipo metacêntricos e submetacêntricos (com exceções), o que resulta em uma macroestrutura homogênea para o grupo. Porém, investigações utilizando sequências repetitivas têm contribuído para ilustrar que a organização microestrutural cromossômica pode diferir entre as espécies, refletindo o hábito destes peixes constituírem populações pequenas e isoladas em cabeceiras de riachos. Adicionalmente, algumas espécies de Characidium também foram descritas portando cromossomos B em seus cariótipos, e a utilização de ferramentas citomoleculares têm contribuído para explorar quanto a origem e evolução destes componentes cariotípicos. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi agregar técnicas citomoleculares com resultados de sequenciamento massivo, para tentar compreender a ocorrência de cromossomos B no genoma de Characidium sp. aff. C. vidali. Os resultados obtidos mostraram que i) o mapeamento físico de diferentes sondas de DNA repetitivo contribuíram não apenas para caracterizar o cariótipo da espécie em estudo, como também adicionaram mais informações quanto a organi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Characidium is a group of fish widely distributed in the Neotropical region, although it is considered the most specious within Crenuchidae, from the cytogenetic point of view the number of species investigated is still low, which makes it difficult to characterize the chromosomal organization of the genus. In relation to the diploid number, Characidium species retained a karyotype with 2n = 50 chromosomes, metacentric and submetacentric (with exceptions), resulting in a homogeneous macrostructure for the group. However, investigations using repetitive sequences have contributed to illustrate that the chromosomal microstructural organization may differ between species, reflecting the habit of these fish constituting small and isolated populations in headwaters of streams. In addition, some species of Characidium have also been described carrying B chromosomes in their karyotypes, and the use of cyto-molecular tools has contributed to explore the origin and evolution of these karyotype components. In this sense, the objective of the present study was to aggregate cyto-molecular techniques with massive sequencing results to try to understand the occurrence of B chromosomes in the genome of Characidium sp. aff. C. vidali. The results showed that i) the physical mapping of different repetitive DNA probes contributed not only to characterize the karyotype of the species under study, but also added more information about the organization and evolution of the chromosomal microstruct... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Marcadores genéticos presentes no cromossomo Y, como os microssatélites (Y-STRs) e polimorfismos de único nucleotídeo (Y-SNPs) são utilizados na caracterização de linhagens masculinas, visto que são transmitidos às gerações seguintes sem alterações, a menos que ocorram mutações (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Por isso, esses marcadores são amplamente empregados em diversas situações, destacando-se o uso constante dos Y-STRs na genética forense por apresentarem alta capacidade de discriminar linhagens. Recentemente, foram descritos 13 marcadores com taxas de mutação substancialmente superiores àquelas verificadas para loci STR do cromossomo Y, denominados Rapidly Mutating (RM) Y-STRs (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). Devido às taxas de mutação elevadas, os RM-YSTRs apresentam maior eficiência na discriminação entre indivíduos proximamente relacionados, pertencentes à mesma linhagem patrilínea. O presente trabalho buscou aprofundar o conhecimento acerca das características populacionais e mutacionais dos loci RM-YSTRs em amostra do Rio de Janeiro, contribuindo com estudos desta natureza na população brasileira. Realizou-se a análise de 13 loci do cromossomo Y em 258 indivíduos do sexo masculino, compondo 129 pares de pais e filhos, nascidos no estado do Rio de Janeiro. O DNA das amostras foi extraído, conforme os protocolos vigentes na rotina do LDD-UERJ. As sequências genéticas de interesse foram amplificadas pela técnica de reação em cadeira da polimerase (PCR) através da realização de três PCR multiplex, cujos produtos de amplificação foram separados por eletroforese em sequenciador automático ABI-3500 (Applied Biosystems). Para os pares pai/filho que apresentaram haplótipos mutados, empregou-se a técnica de sequenciamento para confirmação das mutações. Os loci RM-YSTR geraram um poder de discriminação de 1,0 na amostra analisada, o que significa que todos os 129 indivíduos da amostra populacional apresentaram haplótipos diferentes para tais marcadores, com frequências de 0,0077 e diversidade haplotípica igual a 1. Além disso, foram obtidos valores elevados de diversidade gênica para os 13 marcadores. A análise de distância genética e os resultados de AMOVA baseados nos valores de Fst demonstraram que os RM-YSTR não indicam subdivisão populacional e traços ancestrais comuns. Tais valores estão associados às elevadas taxas de mutação encontradas, cuja média foi de 2,11 x 10-2. Foi possível observar que os loci RM-YSTR são muito discriminativos na amostra miscigenada analisada, além de terem maior capacidade de diferenciar indivíduos do que outros conjuntos de marcadores normalmente usados em estudos populacionais e análises forenses. Sendo assim, é possível concluir que os marcadores RM-YSTR são promissores para discriminar indivíduos da mesma linhagem patrilínea, visto que devido às suas elevadas taxas mutacionais e poder de discriminação, são capazes de diferenciar indivíduos de maneira mais eficiente do que os outros conjuntos de STR. Porém, é necessário maior número de estudos para melhor caracterização destes loci em diferentes populações. / Genetic markers on Y chromosome, as microsatellites (Y-STRs) and single nucleotide polymorphisms (Y-SNPs) are used for the characterization of male lineages, since they are fully transmitted to next generations unless mutations occurs (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Therefore, these markers are widely applied in several situations, highlighting the constant use of Y-STRs in the field of forensic genetics because of their high capacity of discriminate lineages. Recently, 13 rapidly mutating markers were described due to their highly mutation rates in comparison to other common Y-chromosome STRs, being called as Rapidly Mutating Y-STR (RM-YSTR) (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). As a result of their high mutation rates, RM-YSTRs display high efficiency in discriminating paternally related males. The present work aimed to deepen the knowledge about population and mutational RM-YSTR loci characteristics in Rio de Janeiro sample, and then, contribute to other studies with this purpose in Brazilian population. Y chromosome 13 STRs analysis was realized in 258 males born in Rio de Janeiro state, grouped in 129 fathers/sons pairs. The extraction of DNA from biological samples was performed according to routine protocols from LDD-UERJ. Target sequences were amplified by three polimerase chain reactions (PCR) and the amplicons were separated through electrophoresis on automated sequencer ABI-3500 (Applied Biosystems). When mutations were detected, they were confirmed by sequencing. Among the investigated sample, RM-YSTR loci showed a discrimination capacity of 1,0 which means that all 129 analyzed individuals have different haplotypes for these markers, displaying frequencies of 0,0077 and haplotype diversity of 1,0. Moreover, high values of genetic diversities were obtained for the 13 markers. Distance genetic analysis and AMOVA values based on Fst results did not show population substructure and common ancestral traits. These results are associated with high mutation rates found, with an average rate about 2,11 x 10-2. RM-YSTR showed to be very discriminative at this mixed sample, besides proving to be more discriminative than other markers commonly used in population studies and forensic analysis. Thus, it is possible to conclude that RM-YSTR markers are promising to discriminate individuals of the same male strain and due to their high mutation rates and discrimination capacity, they are able to differentiate individuals better than other common markers. Nevertheless, for a better characterization of these loci in different populations more studies are needed.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-11-10T16:06:34Z No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-10T16:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / The determination of fetal sex using maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test (NIPDT), offered to pregnant women, especially those with an increased risk of having children with conditions X-linked inheritance. Because it is a non-invasive technique, it presents a greater advantage over other methods of invasive prenatal diagnosis such as amniocentesis, cordocentesis and biopsy of chorionic villi. The use of cell free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma has become a promising alternative for the diagnosis of noninvasive and early sex determination. The porpuse this study is to conduct a qualitative test in pregnant women with gestational age ranging from 6 to 20 weeks using the noninvasive prenatal test for the early sex determination of fetal by the real time PCR technique. Twenty-one healthy pregnant women, over 18 years of age, single gestation and attended at the Gynecology and Obstetrics Clinic of the Unigen Laboratory belonging to the Private Health Care Network of the City of Goiânia-GO were selected. After venous blood collection, plasma was separated and frozen (-20 ° C). The material to be analyzed followed the laboratory of the company Qiagen® located in São Paulo, SP, where DNA extraction and purification were performed using fully automated equipment (QIAcube®, with the QIAamp® DNA Micro kit, using the protocol "Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples", according to the manufacturer's specifications), and then the quantitative PCR technique (Rotor-Gene® Qiagen) was run for specific Y-sequence amplification. Of the 21 pregnant women selected, two participants aborted and were excluded from the study. The results showed that, in the 19 cases analyzed, comparing the results of qPCR with fetal sex determined by ultrasonography (USG), 7/19 (36.8%) pregnancies with positive results for the Y chromosome (determining the male sex) and 11/19 (57.9%) pregnancies with a negative result for the Y chromosome (determining the female sex) and only one gestation (5.3%) presented false-negative results for males. The analysis of the concordance index, between the results of the qPCR and the USG, found a concordance of 0.89. These results confirmed a good sensitivity and specificity of the method for the gestation period studied (mean of 12 weeks), indicating that this procedure should be used in the medical routine as an auxiliary tool in cases where fetal sexing becomes necessary for health fetal and/or decreased parents anxiety. / A determinação do sexo fetal utilizando o plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN), oferecido as gestantes, principalmente para aquelas com risco aumentado de terem crianças com doenças ligadas ao sexo. Por se tratar de uma técnica não invasiva, apresenta-se com maior vantagem sobre outros métodos de diagnóstico pré-natal invasivos como a amniocentese, cordocentese e a biópsia de vilosidades coriônicas. O diagnóstico pré-natal (DPN) tem sido importante no acompanhamento de gestações com anormalidades fetais, além de permitir um planejamento mais adequado para o parto e de cuidados neonatais específicos. Dessa forma, o DPN tem sido estabelecido na prática obstétrica moderna e integra um conjunto de procedimentos para identificar uma anormalidade no feto durante a gravidez. Diversas pesquisas têm buscado a utilização de novas tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo (DPNI). O uso de DNA fetal livre (cffDNA) no plasma materno passou a ser uma alternativa promissora para diagnóstico do sexo não invasivo e precoce. O objetivo do presente trabalho é realizar um estudo qualitativo em pacientes gestantes, com idade gestacional variando de 6 a 20 semanas utilizando o teste pré-natal não invasivo para a determinação precoce do sexo fetal pela técnica de qPCR. Foram selecionadas 21 gestantes saudáveis, maiores de 18 anos e gestação única e atendidas em clínica de ginecologia e obstetrícia do Centro de Diagnóstico Clínico UNIGEN pertencente à Rede Privada de Atendimento à Saúde da Cidade de Goiânia-GO. Após a coleta de sangue venoso, houve a separação e o congelamento do plasma (-20°C). O material a ser analisado seguiu para o laboratório da empresa Qiagen® localizado em São Paulo-SP, onde foram realizadas a extração e purificação do DNA utilizando equipamento automatizado (QIAcube®, com o kit QIAamp® DNA Micro, empregando-se o protocolo “Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples”, conforme especificações do fabricante), e em seguida foi ralizada a técnica de PCR quantitativa (Rotor-Gene® Qiagen) para amplificação de sequência Y específica. Das 21 gestantes selecionadas, duas participantes abortaram, sendo dessa forma excluídas do estudo. Os resultados revelaram que dos 19 casos analisados, ao comparar os resultados da qPCR com o sexo fetal determinado pela ultrassonografia (USG), 7/19 (36,8%) gestações com resultados positivos para o cromossomo Y (determinando o sexo Masculino) e 11/19 (57,9%) gestações com resultado negativo para o cromossomo Y (determinando o sexo Feminino) e apenas uma gestação (5,3%) apresentou resultado falso-negativo para o sexo masculino. A análise do índice de concordância, entre os resultados da qPCR com a USG foi de 0,89. Esses resultados confirmaram uma boa sensibilidade e especificidade do método para o período de gestação estudado (média de 12 semanas), indicando que este procedimento deve ser utilizado na rotina médica como ferramenta auxiliar nos casos onde a sexagem fetal torna-se necessária para tratamento fetal e/ou diminuição da ansiedade dos pais.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-30T12:00:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_IntegracaoEstudosCromossomicos.pdf: 1817366 bytes, checksum: 3c1634ef74508886d0d4b52b6d5a125d (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-31T12:39:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_IntegracaoEstudosCromossomicos.pdf: 1817366 bytes, checksum: 3c1634ef74508886d0d4b52b6d5a125d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T12:39:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_IntegracaoEstudosCromossomicos.pdf: 1817366 bytes, checksum: 3c1634ef74508886d0d4b52b6d5a125d (MD5) Previous issue date: 2016-05-16 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / A Ordem Gymnotiformes é composta por 219 espécies válidas, que estão distribuídas em cinco famílias. Os gêneros mais investigados são Eigenmannia e Gymnotus. Nosso trabalho concentrou-se na família Rhamphichthyidae, gênero Rhamphichthys que, assim como os demais Gymnotiformes, apresentam maior abundância e diversidade na região Amazônica. Foram realizadas coletas nos municípios de Abaetetuba, Barcarena e Belém (Pará) e em Tefé, Reserva Ecológica de Mamirauá (Amazonas), com objetivo de melhor definir as espécies, através da integração de dados citogenéticos clássicos, citogenômicos (através das sondas de sequências repetitivas de DNA) e do DNA Barcoding e assim compreender a evolução deste gênero de peixes na Amazônia. Foram identificados um novo citótipo para o gênero R. rostratus com a presença de cromossomos B e fórmula cariotípica FC=48m/sm+2st/a+(5-10)B, um novo citótipo da região do Amazonas, Rhamphichthys sp. FC = 44m/sm +6st/a, e também de R. marmoratus, FC = 46+4st/a no estado do Pará. A análise das sequências repetitivas nos novos citótipos demonstrou que as sondas de 18S são coincidentes com as regiões de constrição secundárias que são marcadas com nitrato de prata na técnica de coloração clássica da NOR. As sondas de DNA 5S marcam sítios múltiplos, deixando evidente que a evolução da família de genes ribossomais ocorre de maneira independente, pelo menos no gênero Rhamphichthys. Os retroelementos REX1 e REX3 marcaram de forma dispersa pelo genoma, como já foi descrito na literatura para outros peixes. O elemento REX1 marca ainda a região de constrição secundária em R. rostratus, o que também já foi descrito em outras espécies de peixes que habitam ambientes poluídos, expostos a estresses ambientais e também em indivíduos híbridos. A análise de DNA barcoding permitiu a construção de uma árvore bayesiana, que está de acordo com os dados de citogenética. Assim, as populações de R. rostratus com e sem cromossomos B constituem taxa distintos. Por sua vez, a amostra de Mamirauá, aqui denominada Rhamphichthys sp. por não haver sido descrita formalmente, é mais similar tanto nos dados cariotípicos como na análise de barcoding a R. hanni do Sudeste brasileiro. Nossos dados apontam para um número subestimado de espécies em Rhamphichthys, o que reforça a necessidade de uma revisão taxonômica para o gênero. / The Order Gymnotiformes is composed by 219 valid species, which are distributed in five families. The most investigated genera are Eigenmannia and Gymnotus. Our work focused on family Rhamphichthyidae, genus Rhamphichthys that, like other Gymnotiformes, present greater abundance and diversity in the Amazon region. Sampling was carried out in the municipalities of Abaetetuba, Barcarena and Belém (Pará) and Tefé, Ecological Reserve Mamirauá (Amazonas), in order to better define the species, through the integration of classical cytogenetic data, cytogenomic analysis (probes for repetitive DNA sequences) and DNA Barcoding and thus understand the evolution of this fish in the Amazon. A new karyotype was identified for R. rostratus with the presence of B chromosomes and karyotype formula FC = 48m / sm + 2st / a + (5-10) B, as well as a new cytotype from the Amazon region, in Rhamphichthys sp. FC = 44m / sm + 6st / a, and also in R. marmoratus, FC = 46 + 4st / a in the state of Pará. The analysis of repetitive sequences in the new cytotypes demonstrated that probes 18S coincided with the regions of constriction secondary that are marked with silver nitrate in the classical NOR staining technique. The DNA probes 5S mark multiple sites, letting clear that the evolution of the ribosomal gene family is independent, at least in the genus Rhamphichthys. Retroelements REX1 and REX3 marked in a dispersed fashion throughout the genome, as already described in literature for other fishes. The REX1 element also marks the secondary constriction in R. rostratus, which has also been described in other species of fishes that inhabit polluted environments, exposed to environmental stresses and also in hybrid individuals. The barcoding DNA analysis allowed the construction of a Bayesian tree, which is in agreement with the cytogenetic data. Thus, populations of R. rostratus with and without B chromosomes are separate taxa. In turn, the sample from Mamirauá, herein called Rhamphichthys sp., since it was not been formally described, it is more similar in both karyotypic data as the barcoding analysis with R. hanni from southeastern Brazil. Our data let clear that the number of species in Rhamphichthys is underestimated, which reinforces the need for a taxonomic revision of the genus.

Neste trabalho utilizamos diferentes abordagens para o estudo de genes associados com desenvolvimento e funcionamento do SNC assim como com doenças neurológicas: 1) uma das abordagens consistiu na identificação do alelo associado a uma forma de retardo mental sindrômico com herança recessiva ligada ao cromossomo X, síndrome de Snyder-Robinson, em uma família Brasileira. Utilizando as estratégias de estudo de ligação genética e análise de genes candidatos, identificamos a segunda mutação patogênica no gene SMS (que codifica a enzima espermina sintase) associada à síndrome de Snyder-Robinson. A identificação dessa mutação contribuiu para: delinear e expandir o espectro clínico da síndrome, evidenciar domínios importantes para o funcionamento da proteína espermina sintase, comprovar a importância dessa proteína nos processos cognitivos, e também possibilitar um aconselhamento genético preciso para membros da família; 2) outra abordagem consistiu em analisar (triar mutação) o gene codificador da proteína colibistina (ARHGEF9), a qual está envolvida em sinaptogênese inibitória, em pacientes Brasileiros portadores de hiperecplexia (6 pacientes) e em pacientes portadores de retardo mental associado com epilepsia (22 pacientes). Não identificamos nenhuma alteração patogênica no gene ARHGEF nos 28 pacientes estudados; contudo, o número de pacientes analisados foi muito pequeno. Julgamos que a análise de um número maior de pacientes com essas doenças neurológicas pode vir a revelar novas mutações deletérias em ARHGEF9; 3) a última abordagem consistiu no estudo funcional da proteína colibistina. Com o objetivo de identificar outras proteínas que interagem com a colibistina humana utilizamos o sistema de duplo-híbrido em leveduras e experimentos de co-imunoprecipitação in vitro e in vivo. Identificamos a proteína eIF3-p40 interagindo com a proteína colibistina e também com a proteína gefirina (a qual, por sua vez, também interage com colibistina e está envolvida com funcionamento de sinapses inibitórias). A proteína eIF3-p40 é uma das subunidades do complexo do fator 3 de iniciação de tradução protéica em eucariotos (eIF3). Essas interações ligam as proteínas colibistina e a gefirina à maquinaria de tradução protéica, revelando uma provável nova função dessas proteínas no controle da tradução em sítios pós-sinápticos inibitórios. / In this work we have used different approaches to the study of genes associated with CNS development and function as well as with neurological diseases: 1) one study involved the identification of the allele associated with an X-linked recessive sindromic form of mental retardation, Snyder-Robinson syndrome, in a Brazilian family. Using genetic linkage analysis and candidate gene strategy, we identified the second pathogenic mutation in the SMS gene (that encodes the spermine synthase enzyme) associated with the Snyder-Robinson syndrome. The identification of this mutation contributed to: the delineation and expansion of the clinical spectrum of the syndrome, highlight important domains for spermine synthase protein functioning, demonstrate the importance of this protein in cognitive processes, and also a precise genetic counseling for family members; 2) a second study involved the mutation screening of ARHGEF9, gene encoding the collybistin protein, which is involved in inhibitory synaptogenesis, in Brazilian patients with hyperekplexia (6 patients) and in patients with mental retardation associated with epilepsy (22 patients). We did not identify any pathogenic alteration in the ARHGEF9, gene in the 28 studied patients, but the number of patients analysed was very small. However, the possibility remains that additional mutations in ARHGEF9, may contribute to other cases of hyperekplexia and mental retardation associated with epilepsy; 3) the last study involved the functional analysis of collybistin protein. In order to identify other proteins that interact with human collybistin, we used the yeast two-hybrid system and in vitro e in vivo co-immunoprecipitation experiments. We identified the eIF3-p40 protein as collybistin and gephyrin (another protein involved in the function of inhibitory synapses that also interacts with collybistin) binding partner. The eIF3-p40 protein is one of the subunits of the eukaryotic initiation factor 3 complex (eIF3). These interactions link the collybistin and gephyrin proteins to the protein translation machinery, revealing a putative new role of these proteins in the translation control at inhibitory postsynaptic sites.

A infertilidade é um problema de saúde pública com um significativo impacto social, econômico e psicológico. Em todo o mundo, a incidência da infertilidade entre a população geral é estimada em 10-15%. Cerca de 50% da infertilidade dos casais são de origem masculina. Em mais da metade dos homens inférteis, a causa da infertilidade é desconhecida (idiopática). Etiologicamente, a infertilidade masculina apresenta causas genéticas e não genéticas. Dentre as causas genéticas mais conhecidas temos mutação do receptor de andrógenos, mutação do gene regulador da condutibilidade transmembrana da fibrose cística (CFTR), anomalias cromossômicas clássicas, anomalias meióticas, microdeleções do cromossomo Y, etc. As anomalias cromossômicas são encontradas com muito mais frequência em homens inférteis, com uma incidência de 4-16% em relação à incidência de 0,4% na população fértil. Estudos mostram que as CNVs também podem estar relacionadas com a infertilidade masculina, especificamente com a falha na espermatogênese. CNVs encontradas tanto no cromossomo Y quanto nos cromossomos autossômicos também foram associadas a possíveis falhas na espermatogênese. Um outro fator que também pode estar envolvido com a infertilidade masculina é a expressão desregulada dos miRNAs. O presente trabalho teve como objetivo promover a análise em larga escala da distribuição de CNVs e do perfil transcricional dos miRNAs em amostras de biopsias testiculares de paciente com azoospermia. Para o estudo das CNVs nós utilizamos a metodologia do CytoScan HDTM da Affymetrix. O perfil transcricional de miRNAs nos indivíduos estudados foi avaliado por meio da tecnologia de microarranjos também da plataforma Affymetrix. Para estas analises montamos dois grupos de estudo (Parada de Maturação (MA) de Células Germinativas e Síndrome de Células Sertoli Only (SCOS)) e um grupo controle (azoospermia obstrutiva e espermatogênese normal). Através das análises das CNVs nós encontramos 94 CNVs nos cromossomos autossômicos e sexuais, 35 (37%) CNVs foram classificadas como benignas, 24 (23%) como potencialmente benignas, sete CNVs (7,4%) como patogênicas e sete foram classificadas como potencialmente patogênica. Todas as CNVs classificadas como patogênica estão presentes no cromossomo Y, cinco CNVs são do tipo duplicação e duas do tipo deleção. A CNV do tipo duplicação foi encontrada no paciente MA e a CNV do tipo deleção foi encontrada no paciente SCOS. As CNVs se sobrepõem e quando analisadas em conjunto (formando uma única CNV de cada condição) elas apresentam um tamanho parecido. Estas CNVs apresentam genes envolvidos na espermatogênese. As CNVs classificadas como potencialmente patogênicas estavam presentes nos cromossomos autossômicos e cromossomo X. Nestas CNVs estavam presentes genes que foram associados com a falha na espermatogênese. A análise da expressão dos miRNAs revelou um perfil transicional muito mais alterado nos pacientes com SCOS. As duas condições apresentaram miRNAs exclusivos, mas também compartilharam: 30 miRNAs. Nós identificamos duas famílias de miRNAs (miR449 e miR34) diferencialmente expressos nas duas condições e que apresentam expressão preferencial no testículo. Nossos resultados mostram que alterações no número de copias (CNVs) no cromossomo Y levam a infertilidade masculina e CNVs nos cromossomos autossômicos e X podem levar a infertilidade masculina. As alterações do tipo deleção podem levar a uma falha na espermatogênese maior que as alterações do tipo duplicação. A expressão diferencial dos miRNAs em tecido testicular de pacientes com diferenças histopatológicas (SCOS e MA) apresentam um padrão de expressão de miRNAs diferentes devido ao tipo de células germinativas que eles apresentam no tecido epitelial do testículo. / Infertility is a public health problem with significant social, economic and psychological impact. Worldwide, the incidence of infertility in the general population is estimated at 10- 15%. Approximately 50% of infertility of couples is of male origin. In more than half of infertile men, the cause of infertility is unknown (idiopathic). Etiologically, male infertility has genetic and non-genetic causes. Among the best known genetic causes we found the mutation of the androgen receptor, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), classic chromosomal abnormalities, meiotic abnormalities and microdeletions of the Y chromosome. Chromosomal abnormalities are found much more frequently in infertile men, with an incidence of 4-16% in the incidence of 0.4% in the fertile population. Studies show that CNVs can also be related to male infertility, specifically in the failure of spermatogenesis. CNVs found in both the Y and autosomes chromosomes were also associated with possible failures in spermatogenesis. Another factor that may also be involved in male infertility is the deregulated expression of miRNAs. This work aimed to promote the analysis of large-scale distribution of CNVs and the transcriptional profile of miRNAs in testicular biopsy samples from patients with azoospermia. For the study of CNV we used the CytoScan HDTM Affymetrix methodology and the transcriptional profile of miRNAs in the samples was assessed by means of microarray technology from Affymetrix platform. For these analyzes we set up two study groups (Stop Maturation (MA) of Germ Cells and Sertoli Cell Only Syndrome (SCOS)) and compared them to a control group (obstructive azoospermia, normal spermatogenesis). Through analysis of CNVs, we found 94 CNVs in sexual and autosomes chromosomes, 35 (37%) were classified as benign CNVs, 24 (23%) as a potentially benign seven CNVs (7.4%) as pathogenic and 7 were classified as potentially pathogenic. All CNVs classified as pathogenic are present on the Y chromosome, five CNVs are of duplication type and two are deletion type. The duplication type CNV was found in MA patients and deletion type CNV was found in SCOS patient. We identified that CNVs overlap and when analyzed jointed - as a single CNV of each condition - they have a similar size. These CNVs have genes involved in spermatogenesis. CNVs classified as potentially pathogenic were present in autosomes and in the X chromosome. In these CNVs were present genes that were associated with failure in spermatogenesis. The analysis of the expression of miRNAs revealed a transitional profile much more altered in patients with SCOS. The two conditions presented exclusive miRNAs, but shared 30 miRNAs differentially expressed when compared to the control group. We identify two families of miRNAs (miR449 and miR34) which exhibit preferential expression in testis as differentially expressed in both conditions. Our results show that changes in the number of copies (CNVs) on the Y chromosome lead to male infertility and CNVs in autosomes and X chromosomes may lead to male infertility. The deletion type changes can lead to a failure of spermatogenesis greater than the duplication type changes. The differential expression of miRNAs in patients with testicular tissue histopathologic differences (SCOS and MA) has a different pattern of miRNA expression due to the type of germ cells they present in epithelial tissue of the testis.

Animais de companhia têm sido apontados como reservatórios de bactérias gram-negativas resistentes a antibióticos utilizados em medicina humana e veterinária. O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência da resistência mediada por plasmídeos em bactérias Gram-negativas isoladas de animais de companhia no Brasil e na França, elucidando o papel potencial desses animais como portadores assintomáticos. Amostras de DNA extraídas de quatro coleções de bactérias Gram-negativas produtoras de ESBL foram analisadas por tipagem e sub-tipagem baseados em PCR, análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), dimensionamento baseado em PFGE de nuclease S1 e hibridação Southern blot. Adicionalmente, isolados de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter cloacae foram caracterizados por PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis) e Multilocus Sequence Typing, agrupamento filogenético e tipagem de O25b. A presença de plasmídeos IncH12 (~600-kb) e IncFIB (~210-290-kp) carregando genes blaCTX-M-15 e blaCTX-M-9, foi confirmada entre cepas de E. coli isoladas de animais brasileiros, enquanto uma predominância de plasmídeos IncI1 (~200 kb) pertencentes ao complexo clonal (CC) CC12 contendo o gene blaCMY-2 foi observado entre linhagens de E. coli, em filogrupos de baixa virulência A e B1. A presença de plasmídeos do tipo IncHI2 (~ 600kb) carregando o gene blaCTX-M-15 foi confirmada em cepas de E. cloacae ST927 isoladas de fezes e saliva de cães assintomáticos no Brasil. Entre os animais franceses com infecções, os isolados de E. coli pertencentes ao filogrupo A, B1 e B2 apresentaram tamanho de plasmídeo IncF de ~210-290 kb, carregando principalmente genes blaCTX-M-15, além da presença de plasmídeo IncI1 carregando em sua maioria genes blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 e blaCMY-2. Em animais franceses saudáveis, além das associações blaCTX-M-15/IncI1, blaCTX-M-1/IncFIB, blaCTX-M-14/IncF e da presença de blaCMY-2 e blaTEM-52b (não tipáveis), foi identificada uma cepa de E. coli carregando um plasmídeo IncL (~60kb) contendo o gene blaOXA-48, sendo esta a primeira descrição desse gene em animais na França. Além disso, os genes blaCTX-M-15, blaCTX-M-2 e blaCTX-M-9 foram localizados no cromossomo em cepas brasileiras e francesas, como observado por Southern blot e Sequenciamento de Nova Geração (NGS). Em resumo, em ambos os países, a prevalência de cepas positivas para a resistência tipo ESBL é grande. Os animais de companhia podem ter um papel importante na disseminação dos genes AmpC e ESBL mediados por plasmídeos. / Companion animals can be reservoirs of Gram-negative bacteria resistant to antibiotics used in human and veterinary medicine. The aim of this study was to investigate the genetic context of plasmid-mediated resistance in Gram-negative bacteria isolated from companion animals in Brazil and France, elucidating the potential role of these animals as asymptomatic carriers. DNA samples, extracted from a collection of ESBL-producing Gram-negative bacteria, were analyzed by PCR-based typing and sub-typing schemes, restriction fragment length polymorphism analysis, S1 nuclease PFGE-based sizing and Southern blot hybridization. Additionally, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Enterobacter cloacae isolates were characterized by PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis), Multilocus Sequence Typing, phylogenetic grouping and O25b typing. Presence of IncH12 (~600-kb) and IncFIB (~210-290-kp) plasmids carrying blaCTX-M-15 and blaCTX-M-9, respectively, was confirmed among E. coli strains isolated from Brazilian pets, whereas predominance of IncI1 plasmids (~200 kb) belonging to the clonal complex (CC) CC12 and carrying blaCMY-2 gene was observed among E. coli strains of low-virulence phylogrups A and B1. The presence of IncHI2-type (~ 600-kb) plasmids carrying blaCTX-M-15 gene was confirmed in E. cloacae strains ST927 isolated from feces and saliva from asymptomatic dogs in Brazil. Among French diseased companion animals, E. coli isolates belonging to phylogroup A, B1 and B2 were found carrying IncF-type plasmid with size of ~210-290-kb, which harbored mainly blaCTX-M-15 genes. In addition, presence of IncI1 plasmids carrying blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 and blaCMY-2 genes was identified. In healthy French animals, besides associations blaCTX-M-15/IncI1, blaCTX-M-1/IncFIB, blaCTX-M-14/IncF, and the presence of blaCMY-2 and blaTEM-52b (non-typable), it was observed an E. coli strain carrying an IncL plasmid (~ 60kbp) containing the blaOXA-48 gene, representing the first description of this gene in a French dog. In addition, blaCTX-M-15, blaCTX-M-2 and blaCTX-M-9 genes were located on the chromosome in Brazilian and French strains, as observed by Southern Blot and New Generation Sequencing (NGS) analysis. In summary, in both countries, the prevalence of positive strains for ESBL-type resistance in cats and dogs is high. Companion animals may play an important role in the dissemination of the plasmid mediated AmpC and ESBL genes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição definida como um funcionamento intelectual significativamente prejudicado, expresso juntamente com limitações em pelo menos duas áreas do comportamento adaptativo que se manifestam antes dos 18 anos de idade. A prevalência estimada da DI na população em geral é de 2-3% e um número expressivo de casos permanece sem um diagnóstico definitivo. Há um consenso geral de que a DI é mais comum em indivíduos do sexo masculino em relação aos do sexo feminino. Entre as explicações para este excesso está a concentração de genes específicos para a habilidade cognitiva no cromossomo X. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificador que modulam a expressão gênica pós-transcricional de RNAs mensageiros alvo. Recentemente, estudos têm demonstrado a importância essencial dos miRNAs para o desenvolvimento e funcionamento cerebrais e sabe-se que o cromossomo X tem uma alta densidade de genes de miRNAs. Neste contexto, os miRNAs são candidatos potenciais como fatores genéticos envolvidos na Deficiência Intelectual Ligada ao X (DILX). Neste estudo, foram analisadas as regiões genômicas de 17 genes de miRNAs expressos no cérebro localizados no cromossomo X, com o objetivo de investigar o possível envolvimento de variantes na sequência destes miRNAs na DILX. Para este fim, selecionamos amostras de DNA genômico (sangue periférico) de 135 indivíduos do sexo masculino portadores de DI sugestiva de DILX de um grupo de mais de 1.100 pacientes com DI encaminhados ao Serviço de Genética Humana da UERJ. O critério de inclusão para este estudo era de que os probandos apresentassem um ou mais parentes do sexo masculino afetados pela DI que fossem interligados por via materna. As amostras de DNA dos pacientes foram amplificadas utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase, seguida por purificação e sequenciamento direto pelo método de Sanger dos fragmentos amplificados. Para avaliar a conservação dos 17 miRNAs foi realizada uma análise filogenética in silico incluindo sequências dos miRNAs selecionados de humanos e de outras 8 espécies de primatas estreitamente relacionadas. Não foram encontradas alterações nas sequências nos genes de 17 miRNAs analisados, mesmo diante do padrão genético altamente heterogêneo da população brasileira. Adicionalmente, a análise filogenética destes miRNAs revelou uma alta conservação entre as espécies comparadas. Considerando o papel dos miRNAs como reguladores da expressão gênica, a ausência de alterações e a alta conservação entre primatas sugerem uma forte pressão seletiva sobre estas moléculas, reforçando a sua importância funcional para o organismo em geral. Apesar de não termos encontrado variantes de sequência nos miRNAs estudados, o envolvimento de miRNAs na DI não pode ser completamente descartado. Alterações fora da molécula de miRNA precursor, nos fatores de processamento, nos sítios alvo e variações no número de cópias de genes de miRNAs podem implicar em alteração na expressão dos miRNAs e, consequentemente, na funcionalidade do miRNA maduro. Sendo assim, uma análise sistemática da expressão de miRNAs em pacientes com DILX é urgentemente necessária, a fim de desvendar novos genes/mecanismos moleculares relacionados a esta condição. / Intellectual Disability (ID) is defined as a significantly impaired intellectual functioning, along with limitations in at least two areas of adaptive behavior appearing before 18 years of age. The estimated prevalence of ID in the general population is 2-3% and a significant number of cases remain without a definite diagnosis. There is a general consensus that ID is more common in males compared to females. Among the explanations for this excess it is the concentration of specific genes for cognitive ability on the chromosome X. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate post-transcriptional gene expression of target messenger RNAs. Recently, studies have demonstrated the essential importance of miRNAs for brain development and function and chromosome X has a high density of miRNA genes. In this context, miRNAs are potential candidates as genetic factors involved in X-Linked Intellectual Disability (XLID). In this study, the genomic regions of 17 brain-expressed miRNA genes located on the chromosome X were analyzed, aiming to investigate the possible involvement of sequence variants in these miRNAs in XLID. For this purpose, genomic DNA samples (peripheral blood) were obtained from 135 male patients with ID suggestive of XLID that were selected from a group of over 1,100 patients with ID referred to to the Human Genetics Laboratory of the State University of Rio de Janeiro. Inclusion criteria were at least two affected males in different generations related through maternal lineage. DNA samples from patients were amplified using the polymerase chain reaction technique, followed by purification and direct sequencing by Sanger method. To assess the conservation of the 17 miRNAs, in silico phylogenetic analysis was performed, including sequences of the chosen miRNAs from human and from other 8 closely related primate species. No sequence changes were found for the 17 miRNA genes analyzed, even in light of the highly heterogeneous genetic nature of the Brazilian population. Furthermore, phylogenetic analysis of the selected miRNAs revealed a high conservation among the compared species. Considering the role of miRNAs as regulators of gene expression, the absence of variations and the high conservation among primates suggest a strong selective pressure on these molecules, emphasizing their functional importance for the body in general. Although we have found no sequence variants in the miRNAs studied, the involvement of miRNAs in ID cannot be completely rejected. Alterations outside the precursor miRNA molecules, in the processing factors, in the target sites and changes in copy number of miRNA genes can result in abnormal expression of miRNAs and, consequently, in the functionality of the mature miRNA. Thus, a systematic analysis of miRNAs expression in patients with XLID is urgently needed in order to uncover new genes/molecular mechanisms related to this condition.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição definida como um funcionamento intelectual significativamente prejudicado, expresso juntamente com limitações em pelo menos duas áreas do comportamento adaptativo que se manifestam antes dos 18 anos de idade. A prevalência estimada da DI na população em geral é de 2-3% e um número expressivo de casos permanece sem um diagnóstico definitivo. Há um consenso geral de que a DI é mais comum em indivíduos do sexo masculino em relação aos do sexo feminino. Entre as explicações para este excesso está a concentração de genes específicos para a habilidade cognitiva no cromossomo X. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificador que modulam a expressão gênica pós-transcricional de RNAs mensageiros alvo. Recentemente, estudos têm demonstrado a importância essencial dos miRNAs para o desenvolvimento e funcionamento cerebrais e sabe-se que o cromossomo X tem uma alta densidade de genes de miRNAs. Neste contexto, os miRNAs são candidatos potenciais como fatores genéticos envolvidos na Deficiência Intelectual Ligada ao X (DILX). Neste estudo, foram analisadas as regiões genômicas de 17 genes de miRNAs expressos no cérebro localizados no cromossomo X, com o objetivo de investigar o possível envolvimento de variantes na sequência destes miRNAs na DILX. Para este fim, selecionamos amostras de DNA genômico (sangue periférico) de 135 indivíduos do sexo masculino portadores de DI sugestiva de DILX de um grupo de mais de 1.100 pacientes com DI encaminhados ao Serviço de Genética Humana da UERJ. O critério de inclusão para este estudo era de que os probandos apresentassem um ou mais parentes do sexo masculino afetados pela DI que fossem interligados por via materna. As amostras de DNA dos pacientes foram amplificadas utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase, seguida por purificação e sequenciamento direto pelo método de Sanger dos fragmentos amplificados. Para avaliar a conservação dos 17 miRNAs foi realizada uma análise filogenética in silico incluindo sequências dos miRNAs selecionados de humanos e de outras 8 espécies de primatas estreitamente relacionadas. Não foram encontradas alterações nas sequências nos genes de 17 miRNAs analisados, mesmo diante do padrão genético altamente heterogêneo da população brasileira. Adicionalmente, a análise filogenética destes miRNAs revelou uma alta conservação entre as espécies comparadas. Considerando o papel dos miRNAs como reguladores da expressão gênica, a ausência de alterações e a alta conservação entre primatas sugerem uma forte pressão seletiva sobre estas moléculas, reforçando a sua importância funcional para o organismo em geral. Apesar de não termos encontrado variantes de sequência nos miRNAs estudados, o envolvimento de miRNAs na DI não pode ser completamente descartado. Alterações fora da molécula de miRNA precursor, nos fatores de processamento, nos sítios alvo e variações no número de cópias de genes de miRNAs podem implicar em alteração na expressão dos miRNAs e, consequentemente, na funcionalidade do miRNA maduro. Sendo assim, uma análise sistemática da expressão de miRNAs em pacientes com DILX é urgentemente necessária, a fim de desvendar novos genes/mecanismos moleculares relacionados a esta condição. / Intellectual Disability (ID) is defined as a significantly impaired intellectual functioning, along with limitations in at least two areas of adaptive behavior appearing before 18 years of age. The estimated prevalence of ID in the general population is 2-3% and a significant number of cases remain without a definite diagnosis. There is a general consensus that ID is more common in males compared to females. Among the explanations for this excess it is the concentration of specific genes for cognitive ability on the chromosome X. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate post-transcriptional gene expression of target messenger RNAs. Recently, studies have demonstrated the essential importance of miRNAs for brain development and function and chromosome X has a high density of miRNA genes. In this context, miRNAs are potential candidates as genetic factors involved in X-Linked Intellectual Disability (XLID). In this study, the genomic regions of 17 brain-expressed miRNA genes located on the chromosome X were analyzed, aiming to investigate the possible involvement of sequence variants in these miRNAs in XLID. For this purpose, genomic DNA samples (peripheral blood) were obtained from 135 male patients with ID suggestive of XLID that were selected from a group of over 1,100 patients with ID referred to to the Human Genetics Laboratory of the State University of Rio de Janeiro. Inclusion criteria were at least two affected males in different generations related through maternal lineage. DNA samples from patients were amplified using the polymerase chain reaction technique, followed by purification and direct sequencing by Sanger method. To assess the conservation of the 17 miRNAs, in silico phylogenetic analysis was performed, including sequences of the chosen miRNAs from human and from other 8 closely related primate species. No sequence changes were found for the 17 miRNA genes analyzed, even in light of the highly heterogeneous genetic nature of the Brazilian population. Furthermore, phylogenetic analysis of the selected miRNAs revealed a high conservation among the compared species. Considering the role of miRNAs as regulators of gene expression, the absence of variations and the high conservation among primates suggest a strong selective pressure on these molecules, emphasizing their functional importance for the body in general. Although we have found no sequence variants in the miRNAs studied, the involvement of miRNAs in ID cannot be completely rejected. Alterations outside the precursor miRNA molecules, in the processing factors, in the target sites and changes in copy number of miRNA genes can result in abnormal expression of miRNAs and, consequently, in the functionality of the mature miRNA. Thus, a systematic analysis of miRNAs expression in patients with XLID is urgently needed in order to uncover new genes/molecular mechanisms related to this condition.