No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

Introdução: A meningite criptocócica causa elevada mortalidade, sobretudo em pacientes acometidos de alguma condição imunossupressora. O objetivo deste estudo foi identificar fenômenos de baixa suscetibilidade a antifúngicos e outros preditores clínicos que possam explicar falha terapêutica e recidiva da neurocriptococose Metodologia: Foram avaliados 96 casos com coleta de dados clínicos epidemiológicos e laboratoriais. Os isolados foram identificados quanto a genótipo molecular, suscetibilidade de anfotericina B (AMB) e fluconazol (FCZ) pela determinação da concentração inibitória mínima (Minimal Inhibitory Concentration, MIC), nível de heteroresistência ao FCZ (NHF) e determinação do tempo de morte frente AMB (Time-Kill, TK). Foram selecionados isolados heterorresistentes para análise quantitativa de DNA por PCR em tempo Real, expressão de bombas de efluxo por citometria de fluxo e isolados tolerantes a AMB para estudo de resistência ao estresse oxidativo. Foi realizada análise univariável e múltipla usando regressão logística para identificar preditores de óbito hospitalar e de um desfecho composto definido pelo óbito, encaminhamento para unidade de terapia intensiva ou recidiva 6 meses após alta hospitalar. Resultados: A maioria dos pacientes eram imunodeprimidos, com CD4 de 2 a 722 cel./mm3 e 96,7% eram portadores do HIV. Foram identificados 93 isolados de C. neoformans, sendo 76 do genótipo VNI e 17 VNII e 3 C. gattii, todos VGII. MIC de AMB variou de 0,012 a 0,94 mg/L e MIC de FCZ estiverem entre 0,12 e 64 mg/L. Resistência a FCZ (MIC>16mg/L) foi maior em VNI do que em VNII (p=0,03). Dentre os isolados VNI, 64,5% sofreu atividade fungicida até as 24h (TK24) de exposição à AMB e 6 cepas VNI não sofreram ação fungicida (TK>72). A maioria dos isolados VNII (64,7%) apresentou TK24. Os 3 isolados VGII sofreram atividade fungicida a partir de TK24. A maioria dos isolados VNI, VNII e todos os isolados VGII apresentaram alto NHF (>32mg/L). Diferença no NHF de acordo com os genótipos foi observada (p=0,005). No modelo múltiplo, as variáveis associadas significativamente ao óbito foram: idade em anos (OR=1,08;IC95%=1,02-1,15), contagem de leveduras no líquido cefalorraquidiano em logaritmo (LCR) (OR=1,66;IC95%=1,21-2,28) e uma variável composta por hipertensão arterial sistêmica ou diagnóstico de edema cerebral ou dilatação ventricular por tomografia (OR=35,68;IC95%=4,97-256,31). Para o desfecho composto, as variáveis associadas foram: contagem de leveduras do 1D em logaritmo (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), cultura de sangue positiva para Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) e descrição de neurotoxoplasmose (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). As associações foram consistentes em modelos de sobrevida. Conclusão: Foi possível descrever genótipos mais frequentes e identificar fatores genéticos, como aumento da expressão de genes e bombas de efluxo, relacionados à resistência aos fármacos. Nenhum dos testes de suscetibilidade esteve associado com os desfechos. Variáveis obtidas nos primeiros dias de internação mostraram utilidade para predizer o prognóstico em pacientes com meningite criptocóccica. Estes preditores podem ajudar a identificar os casos com maior potencial de óbito e que necessitam da otimização dos recursos terapêuticos. / Background: Cryptococcal meningitis causes high mortality in immunocompromised patients. The objective of this study was to identify the phenomena of low susceptibility to antifungal and other clinical predictors that may explain therapeutic failure and relapse of neurocryptococcosis Methodology: It was analyzed 96 cases with clinical and epidemiological data. The respective isolates were identified for genotype, susceptibility profile by Minimal Inhibitory Concentration (MIC), FCZ heteroresistance level (NHF), and time to death determination against 1 mg / L BMA (Time-Kill, TK). We isolated heteroresistant DNA expression analysis by real-time PCR, expression of efflux pumps by flow cytometry and, some isolates tolerant to AMB were selected to study resistance to oxidative stress. Univariable and multiple analyses using logistic regression were performed to identify predictors of in-hospital mortality and a composed outcome defined by death, referral to the intensive care unit and relapse 6 months after hospital discharge. Results: Most of the patients were immunocompromised, with CD4 range from 2 to 722 cells/mm3 and 96.7% patients HIV-positive. It was analyzed 93 strains of Cryptococcus neoformans of which 76 were genotype VNI and 17 were VNII and 3 were C. gattii, all were VGII. AMB MIC ranged from 0.012 to 0.94 mg/L and FCZ MIC were between 0.12 and 64 mg/L. Resistance to FCZ (MIC>16mg/L) was higher to VNI than VNII (p=0.03). Among the VNI strains, 64.5% had fungicidal activity up to 24h (TK24) of exposure to AMB and 6 VNI did not present this activity until 72h (TK> 72). Most VNII strains (64.7%) had TK24. The 3 VGII strains presented fungicidal activity from TK24. According to the MIC, all strains were susceptible to AMB. The majority of VNI strains (93.4%) and VNII (76.5%) and 3 VGII strains showed high NHF (>32mg/L) and it was observed statistical difference according to the genotypes VNI and VNII (p=0.005). At the multiple analysis, the variables significantly associated with the death were the age in years (OR=1.08,95%CI=1.02-1.15), the cerebrospinal fluid (CSF) yeasts count-log (OR=1.66,95%CI=1.21-2.28), and a variable composed of systemic arterial hypertension or diagnosis of cerebral edema or ventricular dilatation by tomography (OR=35.68,95%CI=4.97-256.31). At the composed outcome, the variables associated were: CSF yeasts count-log (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), positive blood culture for Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) and neurotoxoplasmosis (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). The associations were consistent at survival models. Conclusion: It was possible to describe more frequent genotypes and to identify genetic factors, such as increased gene expression and efflux pumps, related to drug resistance. The antifungal susceptibilities were not associated with the outcomes. were not associated with outcomes. Variables available in the first days of hospitalization showed utility to predict the prognosis in patients with cryptococcal meningitis. These predictors can help to identify the cases with higher potential of death and that require the optimization of the therapeutic resources.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cryptococcus neoformans is one yeast opportunist that it unchains meningitis in imunocompetentes patients in such a way as in patients This work had as objective to study the varieties (neoformans and gattii) of isolated C.neoformans in the State of Sergipe from the liquor liquid of patients with infectious miningitis. Also had as objective to determine the sensitivity of C. neoformans variety neoformans and variety gattii, isolated of the líquor of patients with infectious meningite in the State of Sergipe, through the microdilution method (NCCLS) and to determine the sexual type - mating type of isolated physicians of Cryptococcus neoformans through the Reaction in Chain of DNA Polimerase (PCR) in Sergipe. Samples of the LCR had been used that had given entered in the IPH/LACEN/SE in the period of 2001 the 2004. Direct microscopy through the coloration with Nanquim Ink was carried through. An aliquot one of the líquor (0,1mL) was transferred to pipes contends Agar Sabouraud with clorafenicol and incubado in ambient temperature 25ºC and 37ºC. Tests for presumptive, fenotípica identification had been carried through in half Níger and of the varieties in half CGB. In the analyzed period, only one sample presented fenotípicas characteristics in half Níger differentiated of the others. Of the total of 15 samples analyzed in half CGB, 02 samples (13,33%) if had presented positive, or either, had been identified as variety gattii, being one of them isolated one of soronegativo patient for HIV (patient not aidético). The others 13 samples (86,67%) had presented negative CGB, or either, they had been identified as variety neoformans. The majority of the isolated samples of Cryptococcus neoformans of the líquor of patients with infectious meningite is of the variety neoformans in Sergipe. For the accomplishment of the sensitivity test variety had been used two samples of C. neoformans var. gattii and 11 of C. neoformans listed variety neoformans above. For control of the tests standard ATCC 32608 was used. After that suspension of fúngicas cells. The following antifungal had been used: Anphotericin B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina and Terbinafrina. The fungal suspension was adjusted in a final concentration of 0,5x10³ for 2,5x10³ UFC in the half RPMI. The experiment was carried through in microtitulação plates. After the inoculation, the microdilution plates had been incubadas 37ºC and deal in 24, 48 and 72 hours. The end point of the CIM was determined in the readings of 48 and 72 hours. The isolated physicians of C. neoformans had presented high values of CIM for the antifungal agents tested, what he mainly symbolizes one high tax of resistance Anfotericina B and to the Fluconazol, given that he can be correlated with the clinical data. For analysis of mating type sexual of C. neoformans from the líquor of patients with infectious meningite in Sergipe during the period of 2001 and 2004 had been used 13 samples. The related laboratoriais procedures to molecular biology (extration of DNA and accomplishment of the PCR) had followed as Chatuverdi reference et al. (2000). All the samples of C.neoformans tested, as much that pertaining to the variety neoformans as gattii are matting type, considered of bigger virulence. / Cryptococcus neoformans é um fungo oportunista que desencadeia meningite tanto em pacientes imunocompetentes como em pacientes hígidos Este trabalho teve como objetivo estudar as variedades (neoformans e gattii) de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe a partir do LCR de pacientes com meningite infecciosa. Também teve como objetivo determinar a sensibilidade de C. neoformans variedade neoformans e variedade gattii, isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa no Estado de Sergipe, através do método de microdiluição (NCCLS) e determinar o mating type de isolados clínicos de Cryptococcus neoformans através da Reação em Cadeia da DNA Polimerase em Sergipe. Foram utilizadas amostras do LCR que deram entrada no IPH/LACEN/SE no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta através da coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor foi transferida para tubos contendo Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC.Foram realizadas provas para identificação presuntiva, fenotípica em meio Níger e das variedades em meio CGB. No período analisado, apenas uma amostra apresentou características fenotípicas em meio Níger diferenciada das outras. Do total de 15 amostras analisadas em meio CGB, 02 amostras (13,33%) se apresentaram positiva, ou seja, foram identificadas como variedade gattii, sendo uma delas isolada de paciente soronegativo para HIV (paciente não aidético). As outras 13 amostras (86,67%) apresentaram CGB negativo, ou seja, foram identificadas como variedade neoformans. A maioria das amostras de Cryptococcus neoformans isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa são da variedade neoformans em Sergipe. Para a realização do teste de sensibilidade foram utilizadas duas amostras de C. neoformans variedade gattii e 11 de C. neoformans variedade neoformans listadas acima. Para controle dos testes foi utilizada a cepa padrão ATCC 32608. Em seguida foi realizada a preparação do inóculo. Foram utilizados os seguintes antifúngicos: Anfotericina B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina e Terbinafrina. A suspensão fúngica foi ajustada numa concentração final de 0,5x10³ para 2,5x10³ UFC no meio RPMI. O experimento foi realizado em placas de microtitulação. Após a inoculação, as placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC e lida em 24, 48 e 72 horas. O ponto final da CIM foi determinado nas leituras de 48 e 72 horas. Os isolados clínicos de C. neoformans apresentaram valores altos de CIM para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza uma alta taxa de resistência principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol, dado que pode ser correlacionado com os dados clínicos. Para análise do mating type sexual foram utilizadas 13 amostras de C. neoformans a partir do líquor de pacientes com meningite infecciosa em Sergipe durante o período de 2001 e 2004. Os procedimentos laboratoriais relacionados à biologia molecular seguiram como referência Chatuverdi et al. (2000). Todas as amostras de C. neoformans tanto aquelas pertencentes à variedade neoformans como gattii são matting type a, considerado de maior virulência.

As infecções fúngicas invasivas são um problema global em saúde pública que acometem milhões de vidas anualmente. Entre os principais gêneros causadores dessas doenças, a espécie Cryptococcus gattii destaca-se por acometer indivíduos imunocompetentes e imunossuprimidos. Esse patógeno atua no bloqueio da diferenciação das células T helper (Th) 1 (Th1) e 17 (Th17) através da atenuação da resposta pró-inflamatória no tecido pulmonar. Em vista da capacidade imunomoduladora de ArtinM em induzir uma resposta imunológica Th1 e Th17 através da indução da produção de IL-12 por células apresentadoras de antígenos (APCs), e pelo efeito da lectina em células T CD4+, esse efeito imunomodulador de ArtinM promoveu o controle da infecção por P. brasiliensis e C. albicans. Dessa forma, investigamos os efeitos da administração profilática ou terapêutica de ArtinM no controle da infecção experimental por C. gattii. Constatamos que a infecção por C. gattii rapidamente progride no tecido pulmonar, assim como há uma disseminação completa para o coração, fígado, rim, baço, cérebro e sangue após 21 dias de infeção. Na análise do pulmão, o perfil citocínico apresentou baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias, e observamos um aumento na expressão relativa dos marcadores de polarização para o perfil M2 (Arginase-1 e YM-1), em todo período analisado. Visto a capacidade reguladora do C. gattii sobre o sistema imunitário do hospedeiro, avaliamos o efeito da administração profilática de ArtinM sobre o curso dessa infecção. Ao longo de 42 dias de infecção, o grupo tratado com ArtinM apresentou uma redução da carga fúngica pulmonar nos dias 28 e 35 pós-infecção, e os níveis de IFN-?, IL-17 e TNF-? aumentaram significativamente no grupo ArtinM. Esse efeito imunomodulador da administração profilática de ArtinM sobre o modelo de infecção experimental por C. gattii levou-nos a avaliar o efeito da administração terapêutica de ArtinM no curso dessa infecção. Essa nova proposta de aplicação de ArtinM resultou na redução da carga fúngica pulmonar de C. gattii após 21 dias de infecção, comparado com o grupo controle. A administração terapêutica de ArtinM foi capaz de elevar o número absoluto de neutrófilos e linfócitos no sangue periférico dos animais infectados, porém os níveis de citocinas não diferiram entre os grupos ArtinM e controle. Além disso, o grupo tratado com ArtinM apresentou menor frequência de células T CD4+ no baço. Diante do efeito imunomodulador a administração profilática ou terapêutica de ArtinM que promoveu um controle parcial da infecção por C. gattii, partimos para a associação desse agente imunomodulador com o antifúngicoR e s u m o | viii Fluconazol. Verificamos que os animais tratados com ArtinM em associação com fluconazol também apresentaram uma redução da carga fúngica pulmonar em comparação ao grupo controle, indicando que ArtinM é passível de ser associada com a terapia convencional antifúngica. Portanto, nossos dados evidenciaram que a atividade imunomodulatória de ArtinM, através da administração profilática ou terapêutica, foi evidenciada no curso da infecção por C. gattii e favoreceu a imunidade do hospedeiro promovendo uma redução parcial da carga fúngica pulmonar / Invasive fungal diseases are a global public health problem, that affects millions of individuals each year. Among the species that cause these diseases, Cryptococcus gattii is a major because affects immunosuppressed and immunocompetent individuals. C. gattii regulates the differentiation of helper (Th) T cells 1 (Th1) and 17 (Th17) by attenuating the proinflammatory response in the lungs. We know that the immunomodulatory capacity of ArtinM to induce the Th1 and Th17 immune response through IL-12 production by antigen presenting cells (APCs) and the CD4+ T cells activation by direct effect of ArtinM, these activities of ArtinM promoted the control of P. brasiliensis and C. albicans infection. Thus, we investigated the effects of prophylactic or therapeutic administration of ArtinM in the control of C. gattii infection. We found that C. gattii infection rapidly increase in the lungs and disseminate to the heart, liver, kidney, spleen, brain and blood after 21 days of infection. In the lung analysis, the cytokine profile showed low levels of proinflammatory cytokines and we observed an increase in the relative expression of the polarization markers for the M2 macrophages (Arginase-1 and YM-1) for all period. Given the regulatory ability of C. gattii on the host immune response, we evaluated the effect of prophylactic administration of ArtinM on the course of C. gattii infection. During 42 days of infection, the ArtinM-treated group had a reduction in the pulmonary fungal burden on days 28 and 35 post-infection, and levels of IFN-?, IL-17 and TNF-? were significantly increased in the ArtinM group. This immunomodulatory effect of prophylactic administration of ArtinM on the C. gattii infection led us to evaluate the effect of the therapeutic administration of ArtinM on the course of this infection. This new strategy for the ArtinM administration promoted a reduction in the lung fungal burden of C. gattii after 21 days of infection compared to control group. Therapeutic administration of ArtinM was able to increase the absolute number of neutrophils and lymphocytes in the peripheral blood of infected mice, but the cytokine levels did not differ between the ArtinM and control groups. In addition, the ArtinM-treated group showed decrease of the CD4+ T cell frequency in the spleen. Considering the immunomodulatory effect, the prophylactic or therapeutic administration of ArtinM promoted a partial control of C. gattii infection, and instigate us to investigate the association of ArtinM and Fluconazole. We found that the treatment with ArtinM in combination with fluconazole also promoted a reduction in the pulmonary fungal burden, which suggested that ArtinM works well inA b s t r a c t | xi association with antifungal drugs. Therefore, our data showed that the immunomodulatory activity of ArtinM, via prophylactic or therapeutic administration, was evidenced in the course of C. gattii infection and contributed the host immune response to reduce the lung fungal burden

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C. neoformans acomete principalmente indivíduos imunocomprometidos, especialmente aqueles infectados pelo HIV, enquanto C. gattii infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, atingindo todas as faixas etárias. Os fatores principais que determinam a patogênese da criptococose são relacionados com a situação de defesa do hospedeiro, o tamanho do inóculo e a virulência da cepa, sendo este último determinado por quatro características principais: a cápsula polissacarídica, a produção de melanina, a diferença de tipos sexuados (MAT e MATa) e a termotolerância. O fungo possui ciclo de vida transitório entre formas leveduriformes haplóides e formas filamentosas dicarióticas. A reprodução sexuada envolve mistura de material genético de parentais que formam progênies contendo características genéticas de ambos. A forma sexuada pode ocorrer através de um processo conhecido como frutificação haplóide. As espécies são heterotálicas, com dois tipos sexuados MAT e MATa. Estudos de caracterização fenotípica, incluindo a identificação da espécie, sorotipo e tipo sexuado tem grande relevância para a condução de estudos mais aprofundados devido ao estreito relacionamento entre seus aspectos ecológicos variáveis e seu ciclo de desenvolvimento e multiplicação, especialmente para o Norte e Nordeste do Brasil, onde o sorotipo B destaca-se como principal agente de meningite fúngica em hospedeiros normais. Este trabalho utilizou a técnica do CGB para a análise metabólica (identificação da espécie), onde 28 cepas apresentaram resultado positivo, caracterizando C. gattii e duas apresentaram resultado negativo, caracterizando C. neoformans . Os resultados de sorotipagem, realizados através de teste de aglutinação revelaram 28 cepas do sorotipo B e duas do sorotipo A. A determinação do tipo sexuado foi realizada através de técnica de PCR e todas as amostras eram MAT. / Cryptococcus neoformans was described as human pathogen in 1894. Since then, studies about fungal aspects as biology, taxonomy, ecology and epidemiology have been developed with great importance to medicine and the environment. The fungus was recently classified in two separated species, C. neoformans (serotypes A, D and AD) and C. gattii (serotypes B and C) each one with well defined genetic and morphological features as well as ecology and epidemiology aspects. C. neoformans occurs mainly in immunocompromised hosts, especially those infected by HIV. In the other hand, C. gattii infects mainly immunocompetents individuals to all lifetimes. The main factors determining the cryptococcosys pathogenesis have relations with the host defenses state, the size of particle and strain virulence, this last for four main features: the polyssacharide capsule, the melanin production, the mating types (MAT and MATa) and thermotolerance. The fungus has a transitory life cycle between haploid yeast form and dykariotic filamentous forms. The sexual cycles includes a mixture of genetic parental genes that form progenies containing the genetic characteristics of both. The asexual cycle occurs through a process know as haploid fruiting. The species are heterothallic with two mating types MAT and MATa. Phenotypic characterization studies, including the species identification, serotype and mating type have a great importance for conductions of profound studies because of the close relation between the ecological variants features and its development cycle and multiplication, especially in Brazilian regions North and Northeast where serotype B is the most prevalent cause of meningitis in ordinary hosts. This work used the CGB techniques for methabolic analysis (species identification), where 28 strains were positive, characterizing C. gattii and two were negative, characterizing C. neoformans. The serotyping results, make among agglutination test reveals 28 strains of serotype B and two of serotype A. The mating type was realized by PCR technique and all strains were MAT.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bernardina_morales_ipec_dout_2013.pdf: 4097768 bytes, checksum: a3e4244f0c2be9b0d8d257c5f8921c52 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of Cryptococus neoformans and Cryptococus gattii , these species can cause cryptococcosis opportunistic and primary respectively. C. neoformans is composed of molecular types VNI - VNIV and C. gattii VGI - VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a comparative study of the molecular types VNI C. neoformans and VGI, VGII C. gattii analyzing different aspects such as : 1 – The susceptibility profile in vitro of fluconazole ( FLZ ), itraconazole ( ITZ ), 5 - fluorocytosine ( 5FC ) and amphotericin B ( A MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ ) 2 – The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of FLZ , ITZ and AMB with CLSI; 3 - The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a lone and in combination; 4 - The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC, 5 – The induced resistance in vitro to FLZ and standardize the fluorochromes: acetoximetil - calceína (calceina - AM), acetoximetil - 2’, 7’ - bis - (2 - carboxietil) - 5 - (e - 6) - carboxifluoresceína (BCECF - AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’ – dipentiloxacarbocianina (DiOC5) in FCM to verify expression of efflux pumps; 6 - The compare the expression of efflux pumps. These results permitted the identification of dif ferent susceptibility phenotypes which were analyzed and compared between the two species and molecular types, allowing the production of four articles . T hus, we concluded that: 1 - The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility against VGI and VNI, whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of glucose for future tests which can be related to cli nical cases; 2 - the FCM method proved to be an alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine Orange and FUN - 1, 3 - The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of mela nin when exposed to the combination of AMB and 5FC. 4 - Was also verified that expression of melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect in vitro . 5 - The strains induced to resistance to fluconazole made it p ossible to obtain statistically significant results in the verification of acriviry of efflux pumps in vitro using FCM with fluorochrome Dioc5 and protonophores blocker CCCP, 6 - It was found that 65% isolates no inducted to resistance and 90% isolates ind ucted to resistance of the molecular ty pe VGII expels the FLZ with a certain advantage in relation to the molecular types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the understanding of the behavior in vitro of C. neoformans and C. gattii agai nst antifungal drugs and can be applied in clinical correlation studies in vitro and in vivo to better understand the antifungal therapy of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-11Bitstream added on 2014-06-13T18:31:22Z : No. of bitstreams: 1 barboza_ls_me_sjrp_parcial.pdf: 54066 bytes, checksum: 3901016bbfd3977caa34c67746541ca7 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-28T16:08:50Z: barboza_ls_me_sjrp_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-28T16:09:56Z : No. of bitstreams: 1 000642588.pdf: 349486 bytes, checksum: eea3a5247c5cd27a996061bb9441acaa (MD5) / A criptococose é uma micose sistêmica que afeta principalmente o sistema nervoso central, causando meningite. Causada pela inalação de propágulos de fungos do gênero Cryptococcus sp, C neoformans acomete hospedeiros com imunodepressão celular, cujo maior contingente é representado por indivíduos com AIDS. A fonte principal de aquisição desta levedura são fezes de aves, principalmente pombos (Columba livia). C. gattii infecta indivíduos aparentemente imunocompetentes, sendo isolado principalmente em espécies de eucaliptos. C. albidus e C. laurentii aparece em casos de meningites, fungemias, pneumonias, abscessos pulmonares e infecções cutâneas. C.uniguttulatus é encontrado no trato gastrointestinal, fezes de pássaros e contaminante de leitos de animais e habitats de roedores. Termo-tolerância, parede celular, cápsula, adesão, e produção de enzimas são fatores importantes de virulência do gênero. São José do Rio Preto é a 5ª cidade entre os 100 municípios do estado de São Paulo em de casos de AIDS. Analisou-se morfologicamente e bioquimicamente 48 amostras clínicas e 155 ambientais. Amostras de líquor resultaram em 30 isolados da espécie C. neoformans, 17 de C. gattii e um de C. luteolus. Foram identificados 26 isolados de C.albidus, 22 de C. laurentii, 9 de C. neoformans, 5 de C. gattii e um de C.uniguttulatus nas amostras ambientais. A concentração inibitória mínima para antifúngicos foi determinada para todos os isolados por meio do teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS. Os resultados obtidos mostraram resistência à anfotericina B e itraconazol nas cepas clínicas de C. neoformans e C. gattii, e as cepas de C.albidus e C. laurentii apresentaram resistência a 5-fluorcitosina, itraconazol e anfotericina B / Cryptococcosis is a systemic mycosis that mainly affects the central nervous system, causing meningitis. Caused by inhalation of seedlings of fungi of the genus Cryptococcus sp, C. neoformans affects hosts with immunosuppression cellular, whose largest contingent is represented by individuals with AIDS. The main source of acquiring this yeast is feces of birds, especially pigeons (Columba livia). C. gattii infects individuals apparently immunocompetent, being isolated mainly in species of eucalyptus. C. albidus and C. laurentii appear in cases of meningitis, nosocomial fungemia, pneumonia, lung abscesses and skin infections. C. uniguttulatus is found in the gastrointestinal tract and feces of birds and contaminant of beds of animals and habitats of rodents. Thermo-tolerance, cell wall, capsule, accession, and production of enzymes are important factors in the virulence of the genus. São José do Rio Preto is the 5th city among the 100 cities in the state of São Paulo in cases of AIDS. We analyzed morphologically and biochemically 48 clinical samples and 155 environmental. Liquor samples resulted in 30 isolates of the species C. neoformans, 17 of C. gattii and one of C. luteolus. We identified 26 isolates of C. albidus, 22 of C. laurentii, 9 of C. neoformans, 5 of C. gattii and one of C. uniguttulatus in environmental samples. The minimal inhibitory concentration for antifungal agents was determined for all isolates by means of the test of broth microdilution standardized by the NCCLS. The results obtained showed resistance to amphotericin B and itraconazole in clinical strains of C. neoformans and C. gattii, C. albidus and C. laurentii exhibited resistance to 5-fluorocytosine, itraconazole and amphotericin B