Die hoch abundante sRNA 6S RNA reguliert in Prokaryoten durch Bildung eines stabilen Riboproteinkomplexes mit der RNA Polymerase maßgeblich die globale Genexpression zur Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde die regulative Funktion von 6S RNA in Cyanobakterien am Beispiel des Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 beleuchtet. Die Analysen zeigten, dass die 6S RNA-Transkriptmenge sowohl unter phototrophen als auch unter photoheterotrophen Bedingungen in der stationären Wachstumsphase abnahm. Zudem wurden physiologische Untersuchungen einer 6S RNA-Deletionsmutante (delta_ssaA) und einer Überexpressionsmutante unter diversen Stressbedingungen durchgeführt. Während für delta_ssaA eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress gemessen wurde, war die Thermotoleranz in den Mutanten nicht beeinträchtigt. Ferner wurde für delta_ssaA eine verlangsamte Regeneration nach Stickstoffmangel ermittelt, die sich phänotypisch durch eine verzögerte Reassemblierung der Phycobilisomen und des Glykogenabbaus sowie durch eine verminderte photosynthetische Aktivität äußerte. Vergleichende Microarray-Analysen zeigten, dass sich die Genexpression in delta_ssaA unter Stickstoffmangel kaum vom Wildtyp unterschied. Hingegen waren während der Regeneration Gene kodierend für die ATP-Synthase, ribosomale Proteine, Photosynthese-Komplexe und Phycobilisomen in delta_ssaA signifikant negativ exprimiert. Zudem wurde eine charakteristische Expressionskinetik für die sRNA SyR11 ermittelt. In vivo-pulldown-Analysen der RNA Polymerase zeigten, dass 6S RNA während der Regeneration die Rekrutierung des Hauptsigmafaktors SigA begünstigt und die Dissoziation von Sigmafaktoren der Gruppe 2 beschleunigt. Derweil blieb das 6S RNA-Transkriptlevel unter Stickstoffstress nahezu konstant. Ein Nachweis von in vivo-synthetisierten pRNA-Transkripten blieb negativ. Die Ergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der funktionellen Bedeutung von 6S RNA für die Adaptation an Stressbedingungen in Cyanobakterien diskutiert. / The highly abundant sRNA 6S RNA extensively regulates the global gene expression for adaptation to changing environmental conditions in many prokaryotes by forming stable complexes with the RNA polymerase. In this work, Synechocystis sp. PCC 6803 was used as a model organism to study the regulative function of 6S RNA in cyanobacteria. A decline in 6S RNA transcript levels during stationary phase was measured under phototrophic and photoheterotrophic conditions. Physiological studies were carried out under various stress conditions using a 6S RNA deletion mutant (delta_ssaA) and an overexpression mutant. Delta_ssaA exhibited increased sensitivity toward oxidative stress, whereas the thermo-tolerance of the cells was not affected in the mutant strains. The recovery from nitrogen depletion was considerably delayed in delta_ssaA compared to the wild type. This phenotype was physiologically characterized by a decelerated phycobilisome reassembly and glycogen degradation as well as reduced photosynthetic activity in delta_ssaA. Comparative transcriptome analysis verified these observations. While under nitrogen depletion similar gene expression patterns were measured in delta_ssaA and wild type, genes encoding ATP synthase, ribosomal proteins, photosystem components and phycobilisomes were significantly negatively affected in the mutant strain during recovery. Furthermore, a distinctive accumulation kinetics was found for the sRNA SyR11. In vivo pulldown analyses of the RNA polymerase revealed a promoting effect of 6S RNA on the recruitment of the housekeeping sigma factor SigA as well as on the complex dissociation of group 2 sigma factors. Meanwhile, the 6S RNA transcript level remained nearly constant during nitrogen deficiency and the detection of in vivo synthesized pRNA transcripts was negative. The results are discussed regarding the functional role of 6S RNA for the adaptation to stress conditions in cyanobacteria.

We evaluated the effect of cyanobacterial crude extracts containing microcystin (CCEMC+) from a natural bloom on seed germination and initial development of three economically important legume species: green mung bean Vigna radiata, cowpea Vigna cylindrical and red mung bean Vigna angularis and compared it to crude extracts of cyanobacteria without the toxin (CCEMC–). Results showed that CCEMC+ and CCEMC– caused different effects on seed germination and initial development of the three species. There was a clear inhibition on germination and root growth of the green mung bean exposed to the CCEMC+ (20, 200 and 500 μg/L), indicating that the green mung bean being more sensitive to CCEMC+ when compared to the cowpea and red mung bean. CCEMC+ induced a greater occurrence of abnormal seedlings in the green mung bean, duce to inhibition the germination as well as reduction of fresh weight and root length. The CCEMC– extract caused no harmful effects to germination and seedlings growth of the green mung bean and red mung bean. However, it reduced shoot and root length in cowpea bean, suggesting that the cowpea being more sensitive to both extracts. Our results indicated that the sensitivity in germination and root growth of the green mung bean V. radiata could be used as an indicator to evaluate the toxic effect and monitor the toxin concentration of water contaminated with microcystins. / Nghiên cứu này khảo sát và so sánh các tác động bất lợi của ly trích vi khuẩn lam có chứa và không chứa độc tố lên sự nẩy mầm và sự phát triển ở giai đoạn đầu của ba loại cây họ đậu gồm đậu xanh Vigna radiata, đậu đỏ Vigna angularis và đậu đen Vigna cylindrical. Kết quả cho thấy hai loại ly trích gây ra các tác động khác nhau lên ba loại cây đậu thí nghiệm. Ly trích vi khuẩn lam có chứa độc tố ở nồng độ 20, 200 và 500 μg/L ngăn chặn đáng kể sự nẩy mầm và sự phát triển rể ở đậu xanh. Cả hai loại ly trích có chứa và không chứa độc tố đều ngăn chặn sự nẩy mầm và sự phát triển rể ở đậu đen. Ngược lại ly trích vi khuẩn lam có chứa độc tố ở nồng độ 500 μg/L lại kích thích chiều dài rể, thân mầm và trọng lượng tươi ở đậu đỏ. Kết quả cho thấy đậu đen khá nhạy cảm với cả hai loại ly trích có chứa và không chứa độc tố, trong khi đó đậu xanh nhạy cảm hơn với ly trích có chứa độc tố. Tính nhạy cảm của các loại cây họ đậu khi phơi nhiễm với ly trích vi khuẩn lam có thể được sử dụng để chỉ thị cho sự ô nhiễm và quan trắc độc tố vi khuẩn lam trong môi trường.

Das phylogenetisch weit verbreitete RNA-bindende Protein Hfq ist an einer Vielzahl von Prozessen innerhalb des bakteriellen RNA-Metabolismus, insbesondere im Rahmen der post-transkriptionellen Genregulation durch kleine RNAs (sRNAs) beteiligt. Hfq-Proteine zählen zu der Familie der Sm- und Lsm-Proteine und zeichnen sich strukturell durch die funktionelle Ausbildung ringförmiger Homohexamere aus. Cyanobakterielle Orthologe zeigen gegenüber den gut untersuchten Hfq-Proteinen aus E. coli und anderen Proteobakterien eine schwache Sequenzkonservierung und bieten auch daher einen interessanten Ansatzpunkt für die Untersuchung riboregulatorischer Prozesse in diesen Organismen. In der vorliegenden Arbeit werden einleitende Untersuchungen zu Funktion und Struktur des orthologen Hfq-Proteins aus dem einzelligen Modell-Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 vorgestellt. Die Inaktivierung des hfq-Gens (ssr3341) führte in diesem Organismus zum Verlust der phototaktischen Motilität. Mithilfe elektronenmikroskopischer Analysen konnte dieser Phänotyp auf das Fehlen von Typ IV Pili zurückgeführt werden. Microarray-Analysen wiesen in der deltahfq-Mutante für 31 Gene eine veränderte, in den meisten Fällen reduzierte Transkriptakkumulation nach. Am stärksten betroffenen waren Gene bzw. Operone, welche dem Regulon des cAMP-Rezeptorproteins Sycrp1 zugeordnet werden und zum Teil nachweislich an der Motilität von Synechocystis-Zellen beteiligt sind. Weitere vergleichende Expressionsanalysen identifizierten mithilfe eines speziellen Tiling-arrays ferner zwei „intergenisch“ kodierte potenzielle sRNAs, Hpr1 und Hpr3, deren Transkriptmengen signifikant von der hfq-Inaktivierung beeinflusst werden. Kristallstrukturdaten deuten zusammen mit den Ergebnissen aus in vitro-Bindungsstudien und genetischen Komplementierungsexperimenten - trotz starker Konservierung zentraler struktureller Charakteristika - neuartige biochemische und funktionelle Eigenschaften des Hfq-Proteins aus Synechocystis sp. PCC 6803 an. Funktionelle Implikationen werden im strukturellen und phylogenetischen Kontext diskutiert. / The phylogenetically conserved RNA binding protein Hfq is a key player in bacterial RNA metabolism, particularly with regard to sRNA-mediated post-transcriptional gene regulation. Hfq proteins belong to the well-conserved family of Sm- and Lsm proteins and are characterized by the formation of homo-hexameric ring-shaped structures. In comparison with well-studied Hfq proteins from E.coli and other proteobacteria the cyanobacterial orthologues show rather poor sequence conservation. Therefore, they provide a quite interesting background for analyzing riboregulatory processes in these organisms. In this work, the orthologous Hfq protein from the unicellular model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 has been initially characterized on the functional and structural level. Insertional inactivation of the hfq gene (ssr3341) led to a non-phototactic phenotype that was due to the loss of type IV pili on the cell surface, as demonstrated by electron microscopy. Microarray analyses revealed a set of 31 genes with altered transcript levels in the knock-out mutant. Among the most strongly affected genes, there were members of two operons that had previously been shown to be involved in motility, controlled by the cAMP receptor protein Sycrp1. Further comparative transcriptional analyses using custom tiling arrays revealed two putative sRNAs (Hpr1 and Hpr3) from intergenic regions, whose transcript levels appeared to be significantly affected by hfq-inactivation. Structural analyses, genetic complementation as well as RNA-binding studies in vitro indicate that the Hfq orthologue from Synechocystis sp. PCC 6803 exhibits novel biochemical and functional properties, though retaining general structural features of its proteobacterial counterparts. Functional implications are discussed with regard to structural und phylogenetic considerations.

Bis zum heutigen Zeitpunkt ist wenig über die physiologischen Effekte von Ethanol auf Cyanobakterien bekannt. Dies ist nicht überraschend, da es unwahrscheinlich ist, dass Cyanobakterien in ihrer natürlichen Umwelt auf Wachstums inhibierende Konzentrationen stoßen, und deswegen war die Stressantwort auf Ethanol nur von geringerem Interesse für die Forschungsgemeinschaft. Nichts desto weniger sind durch neue Entwicklungen im Biofuel- Sektor, insbesondere im Kontext der Produktion von Ethanol mit Hilfe von genetisch manipulierten Cyanobakterien, Kenntnisse über die zelluläre Toleranz und Zellantwort gegenüber dem gewünschten Produkt von grundlegender Bedeutung. Microarray-Experimente, die einen Einblick in die zelluläre Antwort durch Änderung der Genexpression auf Ethanolproduktion bringen sollten, zeigten, dass Gene des Phycocyanin-Operons als die am signifikantesten und stärksten betroffenen funktionalen genetischen Elemente. Weitere Microarray-Experimente mit verschiedenen Konzentrationen von extern zugefügtem Ethanol zeigten eine zeitverzögerte (24h) Hochregulation von PS II-Genen und dem Transkript cpcG2. Diese Arbeit beschreibt weiterhin die Ergebnisse eines Experiments zur "Evolution im Labor", das die intrinsische Kapazität von Synechocystis sp. PCC 6803 zur Erweiterung der Toleranz gegenüber Ethanol aufzeigen sollte. Die erhöhte Ethanoltoleranz führte zu einer Optimierung der endogenen Ethanolproduktion. Derartige Versuche zur Stammoptimierung durch "Evolution im Labor" sollten daher geeignete Mittel sein, um bestimmte Eigenschaften von Organismen für biotechnologische Ziele zu verbessern. In der Gesamtheit geben die Ergebnisse dieser Arbeit Einblicke in die Antwort der Synechocystis-Zellen auf Ethanol auf den Ebenen des Stoffwechsels und der Genexpression und stellen eine wertvolle Datensammlung für zukünftige Versuche mit dem Ziel dar, die Ethanolproduktionsrate in Cyanobakterien durch genetic engineering zu erhöhen. / Until recently, little has been known about the effects of ethanol on the physiology of cyanobacteria. This is not surprising as it is unlikely that cyanobacteria encounter growth inhibiting concentrations of ethanol in their natural environment, and thus the ethanol stress response used to be of limited interest to the scientific community. Nevertheless, for recent biotechnological approaches in the field of biofuel production, and in particular for the attempts to produce ethanol with the help of genetically modified microalgae and cyanobacteria, knowledge of cellular tolerance and response to the desired product is pivotal. Microarray analysis demonstrating that a specific part of the phycocyanin operon is the most significantly and strongly affected functional genetic subsystem under ethanol producing conditions. Additional microarray experiments with different concentrations of external ethanol showed a time-delayed (24h) characterized by a prominent up-regulation of PS II genes with phycocyanin linker proteins playing a major role in the transcriptional response. Another aspect of this work was an artificial evolution experiment, which was performed to delineate the intrinsic capacity of Synechocystis sp. PCC6803 to tolerate ethanol. In addition, the evolved strain proved to be a superior background for endogenous ethanol production showing that artificial evolution experiments are a suitable method to improve certain features of organisms for biotechnological purposes. Overall, the results of this work give new insight into physiological and gene regulatory responses of Synechocystis sp. PCC6803 exposed to ethanol and will be a very valuable dataset for future attempts to improve cyanobacterial ethanol production by the means of genetic engineering.

Die meisten Cyanobakterien und Chloroplasten von Rotalgen verfügen über Phycobilisomen, große lichtsammelnde Multiproteinkomplexe, die an der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran gebunden vorliegen. Unter stickstofflimitierten Bedingungen werden die Phycobilisomen proteolytisch abgebaut. Dieser Prozess schützt vor Fotoschäden unter den gegebenen Stressbedingungen und liefert gleichzeitig einen großen Vorrat an Stickstoff enthaltenden Substanzen. Das Gen nblA, welches in allen Phycobilisomen enthaltenden Organismen vorkommt, kodiert für ein Polypeptid von ungefähr 7 kDa, das eine Schlüsselrolle im Abbau der Phycobilisomen einnimmt. Die Wirkungsweise von NblA dabei wird jedoch bisher kaum verstanden. Ein Selenomethioninderivat von NblA des filamentösen Cyanobakteriums Anabaena sp. PCC 7120 wurde in Escherichia coli rekombinant hergestellt, gereinigt und kristallisiert. Die Röntgenkristallstruktur von NblA wurde mithilfe der single-wavelength anomalous dispersion-Methode bis zu einer Auflösung von 1,8 Angstrom bestimmt. Das finale Modell verfügt über einen kristallographischen R-Wert von 18,2% und einen freien R-Wert von 21,7%. Das kleine NblA-Protein von 65 Aminosäuren besteht aus zwei alpha-Helices, die in einem ca. 37°-Winkel in einer antiparallelen, V-förmigen Anordnung zueinander stehen. Zwei dieser Monomere bilden die grundlegende strukturelle Einheit von NblA, ein vier-Helix-Bündel, bei dem sich die Spitzen der "Vs" auf der gleichen Seite des Dimers überlagern und über eine nicht-kristallographische zweizählige Achse miteinander verknüpft sind. Auf der Grundlage von Bindungsstudien und der Kenntnis der NblA-Struktur konnte ein Modell für die Bindung von NblA an die Phycobilisomenstruktur postuliert werden. / Cyanobacterial light harvesting complexes, the phycobilisomes, are proteolytically degraded when the organisms are starved for combined nitrogen, a process referred to as chlorosis or bleaching. Gene nblA, present in all phycobilisome-containing organisms, encodes a protein of about 7 kDa that plays a key role in phycobilisome degradation. To gain deeper insights into the mode of action of NblA in this degradation process the crystal structure of NblA was determined and a model of its binding to phycobilisomes was proposed. For this purpose, NblA from Anabaena sp. PCC 7120 was produced as selenomethionine NblA derivative in Escherichia coli B834 (DE3), purified and crystalized. NblA crystals grew as long, but thin rods and belong to the monoclinic space group P2(1) with cell parameters of a = 43.2 A, b = 95.9 A, c = 104.8 A and Beta = 97.0°. They contain twelve NblA monomers in the asymmetric unit. The crystal structure with a resolution of 1.8 A was determined using the single-wavelength anomalous dispersion (SAD) technique and refined to final values for Rwork and Rfree of 0.182 and 0.217, respectively. The small NblA polypeptide of 65 amino acids consists of two alpha-helices which are assembled at a ~37° angle in an antiparallel, V-shaped arrangement. Two NblA monomers form the basic structural unit of NblA, a four-helix bundle with the tips of the V superimposing on the same side of a dimer. The dimer is formed by two molecules related by a non-crystallographic dyad axis. Based on the crystal structure presented here, pull-down experiments, and peptide scan data a model of binding of NblA to phycobilisomes was proposed. Considering the entire phycobilisome structure, NblA is predicted to bind via its amino acids Leu51 and Lys53 to the trimer-trimer interface of the phycobiliprotein hexamers.

Geruchsstoffe in Trinkwassergewinnungsanlagen stellen ein weltweit auftretendes Problem dar und führen in der Regel zu einer Kostenintensivierung bei der Aufbereitung des Rohwassers. Die den erdig-muffigen Geschmack des Wassers verursachenden, hauptsächlichsten Substanzen Geosmin und 2-Methylisoborneol (2-MIB) sind schon in einem Konzentrationsbereich von 1-10 ng/L wahrnehmbar. Da das Trinkwasser Geruchs- und Geschmacksneutral sein soll, müssen im Zuge der Rohwasseraufbereitung die Geruchsstoffe entfernt werden. Geruchsstoffe können durch verschiedene Mikroorganismen wie Cyanobakterien, Aktinomyceten, Streptomyceten oder auch Algen gebildet werden. Das Ziel dieser Arbeit stellte daher die Identifikation von cyanobakteriellen Geruchsstoffbildnern in den drei sächsischen Trinkwassertalsperren Klingenberg, Cranzahl und Saidenbach dar. Das Hauptaugenmerk lag auf der Charakterisierung der vorkommenden benthischen Cyanobakterien. Neben deren Abhängigkeit von der Trophie des Gewässers sollte das Artenspektrum der benthischen Cyanobakterien untersucht werden sowie eine Identifikation erfolgen, welche Geruchsstoffe sie synthetisieren bzw. freisetzen. Dazu erfolgte die Gewinnung von Isolaten benthischer Cyanobakterien anhand von Proben, die aus den Talsperren entnommen wurden. Die anschließende Charakterisierung der Isolate wurde sowohl auf morphologischer als auch auf molekularbiologischer Ebene durch die partielle Sequenzierung der rbcL- und geoA-Gene durchgeführt. Ein weiteres Ziel bestand darin, die Fähigkeit zur Bildung von Geosmin und 2-MIB nachzuweisen. Dazu sollten ausgewählte Isolate, zur Abschätzung des Geruchsstoff-Bildungspotentials der Cyanobakterien in der Talsperre, unter verschiedenen Laborbedingungen kultiviert und auf die Bildung und Freisetzung von Geruchsstoffen hin untersucht sowie der Einfluss der Beleuchtung durch verschiedene Lichtfarben bzw. Spektren und des Mediums bestimmt werden. Zusätzliche Fragestellungen stellten die Identifikation spezifischer Gene sowie die Entwicklung eines geeigneten Primersystems und gegebenenfalls der Nachweis einer Korrelation zur Geruchsstoffbildung dar. Anhand der Klima- und der physikalischen Daten sollten mögliche Einflussgrößen auf die Geruchsstoffproduktion durch benthische Cyanobakterien aufgezeigt werden. Durch regelmäßige Probenahmen wie auch Kamerabefahrungen in Zusammenarbeit mit der Landestalsperrenverwaltung Sachsen wurde die Entwicklung des von Cyanobakterien dominierten Phytobenthos in drei Talsperren verfolgt und dokumentiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass dieses durch Vertreter der Gattungen Oscillatoria und Phormidium dominiert wurde. Im Verlauf der Untersuchungen konnten mehrere Massenentwicklungen von Cyanobakterien verfolgt werden. Die Abnahme des Staupegels ist in Verbindung mit der Sonneneinstrahlung die möglicherweise wichtigste Stellgröße für eine Massenentwicklung benthischer Cyanobakterien und einem damit verbundenen Anstieg des Geruchsstoff-Gehalts im Roh- bzw. Oberflächenwasser. Die Analyse der Entwicklung der Cyanobakterien unter natürlichen Bedingungen stellt aufgrund der großen Varianz der Einfluss nehmenden Parameter eine sehr komplexe Aufgabe dar. Daher wurden zur umfangreicheren Analyse der Herkunft der Geruchsstoffe Cyanobakterien isoliert. Dadurch wurde es möglich, das Geruchsstoff-Bildungspotential näher zu charakterisieren. Die erhaltenen Isolate wurden durch morphologische Merkmale bestimmt und molekularbiologisch durch partielle Sequenzierung des rbcL-Gens klassifiziert. Weiterhin erfolgte der analytische Nachweis von Geruchsstoffen in der Biomasse der Cyanobakterien sowie im Kultivierungsmedium. Der Nachweis von Geosmin in der Biomasse konnte hoch signifikant mit dem PCR-Nachweis von geoA korreliert werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Besitz von geoA zu einer deutlich stärkeren Bildung und Freisetzung des Geruchsstoffs führt. Für das unter natürlichen Bedingungen ebenfalls auftretende 2-MIB konnten dagegen keine gesicherten cyanobakteriellen Produzenten identifiziert werden. 2003 wurde die Funktionalität des Gens cyc2 in Streptomyceten durch Gust et al. beschrieben. Auf dieser Grundlage konnte ein degeneriertes Primersystem zum Nachweis eines Stoffwechselgens (geoA) bei Cyanobakterien entwickelt werden. Die Biomasse des Isolats Phormidium sp. P2r aus der Talsperre Saidenbach enthielt einerseits in besonders großen Mengen intrazelluläres Geosmin. Andererseits konnten aber auch im Kultivierungsmedium hohe Geosminkonzentrationen ermittelt werden. Durch die Anwendung des etablierten Primersystems konnte mit der isolierten, genomischen DNA dieses Cyanobakteriums ein Amplifikat erhalten und sequenziert werden. Durch die Anwendung weiterer Protokolle, wie beispielsweise degenerierte Primersysteme oder des Vectorette-Ansatzes konnte der bekannte Sequenzbereich deutlich vergrößert werden. Dabei stellte es sich heraus, dass Phormidium sp. P2r zwei sehr ähnliche Gene (geoA1 und geoA2) besitzt, die vermutlich koreguliert werden. Die mRNA-Expressionsuntersuchungen bestätigten die Expression beider Gene bei Licht und einer Temperatur im Bereich von 10 - 20 °C. Nach einer 24stündigen Dunkelphase konnte die Bildung der geoA-mRNA hingegen nicht mehr nachgewiesen werden, was die Vermutung bestätigt, dass die Aktivität der Gene reguliert und nicht konstitutiv ist. Eine Verbindung der Synthese von Geosmin zur Photosysnthese ist aber dennoch fraglich. Die molekularbiologische Bestimmung der Diversität von geoA in Proben des Phytobenthos aus der Talsperre Klingenberg offenbarte eine große Vielfalt unterschiedlicher Sequenzen. Dies könnte auf vielfältigste Geosmin produzierende Mikroorganismen hinweisen. Das Geruchsstoff-Bildungspotential der isolierten und charakterisierten Cyanobakterien wurde unter verschiedenen Testbedingungen ermittelt. Dabei wurde vor allem der Einfluss unterschiedlicher Nährstoffkonzentrationen sowie Lichtfarben einschließlich UV-Strahlung untersucht. Es hat sich gezeigt, dass alle getesteten Stämme zur Geosmin-Freisetzung befähigt waren und sich das Freisetzungsniveau massiv in Abhängigkeit des Besitzes von geoA unterschied. Bei grünem Licht, welches auch in den untersuchten Talsperren den dominierenden Spektralanteil im Wasserkörper darstellt, wurde neben dem Tageslicht das beste Wachstum benthischer Cyanobakterien ermittelt. Letztendlich konnte durch die Laborexperimente eine variable Geosminbildung sowie ein unterschiedlicher Einfluss der Testbedingungen festgestellt werden. In der Talsperre Klingenberg konnte im Juni 2007 ein Gehalt von bis zu mehr als 70 ng Geosmin/L Oberflächenwasser bei einer Geruchsschwellenkonzentration von 1 ng/L (Young et al., 1996) ermittelt werden. Die Herkunft dieses Geruchsstoffs kann mit den Ergebnissen dieser Arbeit eindeutig den benthischen Cyanobakterien zugeordnet werden. Von besonderer Bedeutung war die Feststellung, dass der Besitz von geoA unter den benthischen Cyanobakterien der drei untersuchten Talsperren mit etwa 33 % der unterschiedlichen rbcL-Genotypen nicht weit verbreitet war. Die Rolle der anderen Cyanobakterien darf jedoch nicht unterschätzt werden, da z. B. hohe Geruchsstoff-Konzentrationen in der Talsperre Klingenberg bei einer deutlichen Dominanz von Oscillatoria sp. zustande kamen, aber alle als Oscillatoria klassifizierten Isolate geoA negativ waren. Eine Vorhersage der Entwicklung benthischer Cyanobakterien in den Talsperren kann auch mit den Ergebnissen dieser Arbeit nicht getroffen werden. Dazu ist die Reaktion der Cyanobakterien auf unterschiedliche Umweltfaktoren wie diese bei der Geruchsstoff-Bildung getestet wurden zu mannigfaltig. Wenn Cyanobakterien im Phytobenthos der Talsperren nachweisbar sind, könnte eine Prognose zur weiteren Entwicklung unter Berücksichtigung der zu erwartenden Veränderungen der Rahmenbedingungen, wie vor allem des Staupegels gegeben werden. Zur Ausbildung stabiler Cyanobakterien-Matten wie diese in der Talsperre Cranzahl 2007 vorhanden waren, ist sicherlich eine längerfristige Stabilität verschiedener und bislang noch unbekannter Rahmenbedingungen nötig. Obwohl die Dominanz der Cyanobakterien bei der Bildung von Geruchsstoffen im Phytobenthos in ähnlichen Habitaten auf Grund dieser Untersuchungen nicht mehr in Frage gestellt werden wird, ist dennoch die Möglichkeit gegeben, dass möglicherweise unter anderen Voraussetzungen und Bedingungen auch andere, nicht näher untersuchte Mikroorganismengruppen wie Aktinomyceten intensiv Geruchsstoffe in Talsperren bilden könnten.

Cyanobakterien sind die einzig bekannten Prokaryoten, die in der Lage sind oxygene Photosynthese zu betreiben. Sie besitzen ein großes Potenzial als nachhaltige Ressourcen für die Herstellung zahlreicher industriell und medizinisch relevanter Wirkstoffe. Trotz ihrer essentiellen Bedeutung ist jedoch das Wachstum von Cyanobakterien bis jetzt nur unzureichend verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich daher ein mathematisches Modell entwickelt, das das Wachstum von Cyanobakterien auf der Grundlage von intrazellulärer Proteinverteilung beschreibt. Dabei wurde das Proteom in wenige relevante Protein-Klassen unterteilt, die an fundamentalen zellulären Prozessen beteiligt sind, darunter Kohlenstoffaufnahme, -fixierung und -stoffwechsel, sowie Photosynthese und Proteintranslation. Besonders interessant sind die aus dem Modell resultierenden sogenannten mikrobiellen Wachstumsgesetze, sprich die Korrelationen zwischen der Wachstumsrate und der Proteinverteilung, die im stationären Zustand des Wachstums beobachtet werden. Das Modell prognostiziert eine charakteristische Krümmung für die Wachstumsgesetze jener Proteine, welche mit Lichtabsorption und Proteintranslation assoziiert werden. Verursacht wird diese Krümmung durch hohe Lichtintensitäten, die eine Abnahme der Wachstumsrate zur Folge haben. Die prognostizierten Wachstumsgesetze werden durch Proteindaten, die mittels Massenspektrometrie erhoben wurden, vom Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 gestützt. Des Weiteren bietet das Modell einen geeigneten Ausgangspunkt für die Erweiterung von der Charakterisierung von Einzelzellen zu einer Population von Zellen in einem lichtlimitierten Chemostat. Das erweiterte Modell stellt einen Zusammenhang her zwischen intrazellulärer Proteinverteilung, Wachstum der Population und Kultivierungseigenschaften, und bietet somit einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung und Verbesserung der Kultivierung von phototrophen Organismen und die Optimierung der photosynthetischen Produktivität. / Cyanobacteria are the only known prokaryotes that perform oxygenic photosynthesis, and therefore, hold significant potential as sustainable resources for the production of numerous industrially and medically relevant compounds. Despite their importance, however, the (molecular) limits and cellular economy of photoautotrophic growth are still insufficiently understood. In this thesis, I present a mathematical model based on a coarse-grained description of cellular protein allocation to describe cyanobacterial growth. The model describes cellular trade-offs considering only proteins that are involved in key cellular processes (carbon uptake, fixation, and metabolism, as well as photosynthesis and protein translation). Of particular interest are the resulting microbial growth laws, i.e., correlations between the growth rate and the protein distribution observed during balanced growth. The model predicts a characteristic kink for the growth laws of the light harvesting components and the translational machinery induced by photoinhibition, a decrease in growth rate due to high light intensities. The resulting growth laws are supported by quantitative mass spectrometry-based proteomics data of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The proteomics data shows that the mathematical model has intrinsic predictive power, and thus, provides a suitable starting point for extending it from describing single cells to describe a growing population in a light-limited chemostat. The extended modeling framework goes beyond current models using phenomenological growth equations and establishes a mechanistic link between intracellular protein allocation, population growth and cultivation properties. The extended model provides a novel approach to study and guide phototrophic cultivation improvements that maximize photosynthetic productivity.

Cyanobakterien sind meist photoautotroph lebende Prokaryoten, welche nahezu alle Biotope der Welt besiedeln. Sie gehören zu den wichtigsten Produzenten der weltweiten Nahrungskette. Um sich auf den täglichen Wechsel von Tag und Nacht einzustellen, besitzen Cyanobakterien eine innere Uhr, bestehend aus den Proteinen KaiA, KaiB und KaiC, deren biochemische Interaktionen zu einem 24-stündigen Rhythmus von Phosphorylierung und Dephosphorylierung führen. Die circadiane Genexpression im Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 habe ich mittels drei verschiedener Zeitserienexperimente untersucht, wobei ich einen genauen Zeitplan der Genaktivierung in einer Tag-Nacht-Umgebung, aber keine selbsterhaltenden Rhythmen entdecken konnte. Allerdings beobachtete ich einen überaus starken Anstieg der ribosomalen RNA in der Dunkelheit. Aufgrund ihrer hohen Wachstumsraten und der geringen Anforderungen an die Umwelt bilden Cyanobakterien eine gute Grundlage für die nachhaltige Erzeugung von Biokraftstoffen, für einen industriellen Einsatz sind aber weitere Optimierung und ein verbessertes Verständnis des Metabolismus von Nöten. Hierfür habe ich die Orthologie von verschiedenen Cyanobakterien sowie die Konservierung von Genen und Stoffwechselwegen untersucht. Mit einer neu entwickelten Methode konnte ich gemeinsam vorkommende Gene identifizieren und zeigen, dass diese Gene häufig an einem gemeinsamen biologischen Prozess beteiligt sind, und damit bisher unbekannte Beziehungen aufdecken. Zusätzlich zu den diskutierten Modulen habe ich den SimilarityViewer entwickelt, ein grafisches Computerprogramm für die Identifizierung von gemeinsam vorkommenden Partnern für jedes beliebige Gen. Des Weiteren habe ich für alle Organismen automatische Rekonstruktionen des Stoffwechsels erstellt und konnte zeigen, dass diese die Synthese von gewünschten Stoffen gut vorhersagen, was hilfreich für zukünftige Forschung am Metabolismus von Cyanobakterien sein wird. / Cyanobacteria are photoautotrophic prokaryotes populating virtually all habitats on the surface of the earth. They are one of the prime producers for the global food chain. To cope with the daily alternation of light and darkness, cyanobacteria harbor a circadian clock consisting of the three proteins KaiA, KaiB, and KaiC, whose biochemical interactions result in a phosphorylation cycle with a period of approximately 24 hours. I conducted three time-series experiments in the model organism Synechocystis sp. PCC 6803, which revealed a tight diurnal schedule of gene activation. However, I could not identify any self-sustained oscillations. On the contrary, I observed strong diurnal accumulation of ribosomal RNAs during dark periods, which challenges common assumptions on the amount of ribosomal RNAs. Due to their high growth rates and low demand on their environment, cyanobacteria emerged as a viable option for sustainable production of biofuels. For an industrialized production, however, optimization of growth and comprehensive knowledge of the cyanobacterial metabolism is inevitable. To address this issue, I analyzed the orthology of multiple cyanobacteria and studied the conservation of genes and metabolic pathways. Systematic analysis of genes shared by similar subsets of organisms indicates high rates of functional relationship in such co-occurring genes. I designed a novel approach to identify modules of co-occurring genes, which exhibit a high degree of functional coherence and reveal unknown functional relationships between genes. Complementing the precomputed modules, I developed the SimilarityViewer, a graphical toolbox that facilitates further analysis of co-occurrence with respect to specific cyanobacterial genes of interest. Simulations of automatically generated metabolic reconstructions revealed the biosynthetic capacities of individual cyanobacterial strains, which will assist future research addressing metabolic engineering of cyanobacteria.

Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Temperaturtoleranz des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 mittels ungerichteter Mutagenese und adaptiver Evolution. Trotz des erneuten Interesses an Cyanobakterien und Mikroalgen in den letzten Jahren, gibt es nur relativ wenige aktuelle Studien zum Einsatz dieser Methoden an Cyanobakterien. Zur Analyse eines mittels Mutagenese erzeugten Gemischs an Stämmen, ist es von großem Vorteil Hochdurchsatz-Methoden zur Kultivierung und zum Screening einsetzen zu können. Auf Basis eines Pipettierroboters wurde solch eine Plattform für phototrophe Mikroorganismen neu entwickelt und folgend stetig verbessert. Die Kultivierung erfolgt in 2,2ml Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kultivierungskammer. Schüttelbedingungen, Beleuchtung, Temperatur und CO2-Atmosphäre sind hierbei vollständig einstellbar.Die Plattform erlaubt semi-kontinuierliche Kultivierungen mit automatisierten Verdünnungen von hunderten Kulturen gleichzeitig. Automatisierte Messungen des Wachstums, des Absorptionsspektrums, der Chlorophyllkonzentration, MALDI-TOF-MS sowie eines neu entwickelten Vitalitätsassays wurden etabliert. Für die Mutagenese wurden die Letalität- und die nicht-letale Punktmutationsrate von ultravioletter Strahlung und Methylmethansulfonat für Synechocystis charakterisiert. Synechocystis wurde mit den so ermittelten optimalen Dosen mehrfach behandelt und anschließend einer in vivo Selektion unterzogen. Somit wurde dessen Temperaturtoleranz um bis zu 3°C erhöht. Über die Screeningplattform wurden die thermotolerantesten monoklonalen Stämme identifiziert. Nach einer Validierung wurde das vollständige Genom der Stämme sequenziert. Hierdurch wurden erstmals Mutationen in verschiedenen Genen mit der Langzeittemperaturtoleranz von Synechocystis in Verbindung gebracht. Bei einigen dieser Gene ist es sehr unwahrscheinlich, dass sie mittels anderer Verfahren hätten identifiziert werden können. / The goal of this work was the increase of the thermal tolerance of the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 via random mutagenesis and adaptive evolution. Even with the renewed interest in cyanobacteria in the recent years, there is relatively limited current research available on the application of these methods on cyanobacteria. To analyse a mixture of various strains typically obtained through random mutagenesis, a method allowing high-throughput miniaturized cultivation and screening is of great advantage. Based on a pipetting robot a novel high-throughput screening system suitable for phototrophic microorganisms was developed and then constantly improved. The cultivation was performed in 2,2 ml deepwell microtiter plates within a cultivation chamber outfitted with programmable shaking conditions, variable illumination, variable temperature, and an adjustable CO2 atmosphere. The platform allows semi-continuous cultivation of hundreds of cultures in parallel. Automated measurements of growth, full absorption spectrum, chlorophyll concentration, MALDI-TOF-MS, as well as a novel vitality measurement protocol, have been established. Prior to the mutagenesis, the lethality and rate of non-lethal point mutations of ultraviolet radiation and methyl-methanesulphonate were characterized for Synechocystis. The thus determined optimal dosages were applied to Synechocystis followed by in vivo selection in four rounds of mutagenesis, thereby raising its temperature tolerance by 3°C. The screening platform was used to identify the most thermotolerant monoclonal strains. After validation, their whole genomes were sequenced. Thus mutations in various genes were identified which promote the strains'' thermal tolerance. For some of the genes it is very unlikely that their link to high thermal tolerance could have been identified by other approaches.

Die lösliche, NAD+-reduzierende Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha H16 ist eine Pyridinnukleotid-abhängige Hydrogenase. Das heißt, der Umsatz von H2 im Hydrogenasemodul des Enzyms ist an die Reduktion von NAD(P)+ im NAD(P)H:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul gekoppelt. Die SH ist Vertreter des Subtyps, der auch in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv ist. Dies wird ermöglicht durch eine reduktive Entfernung von O2, die nach dem aktuellen Modell abhängig ist vom rückläufigen e--Transport vom NADH:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul zum aktiven [NiFe]-Zentrum in der großen Hydrogenaseuntereinheit. Der Einfluss des FeS-Clusters in der kleinen Hydrogenaseuntereinheit HoxY auf diesen Prozess wurde hier untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die vier hochkonservierten Cysteine C41, C44, C113 und C179 in HoxY an der Koordination des FeS-Zentrums beteiligt sind. Außerdem wurde das nahegelegene Cystein C39 als relevant für die Sauerstofftoleranz identifiziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das Tryptophan W42 aus HoxY essentiell für die Hydrogenaseaktivität der SH ist. Damit bestätigt sich, dass die Kinetik des rückläufigen e--Transports durch die Aminosäureumgebung des FeS-Clusters in HoxY beeinflusst ist. Ferner wurden in dieser Arbeit Ansätze zum Einsatz der SH aus R. eutropha in einer H2-produzierenden cyanobakteriellen Designzelle weiterverfolgt. Dazu wurden Hybridsysteme aus SH und cyanobakteriellem Photosystem I in vitro hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur lichtgetriebenen H2-Produktion untersucht. Außerdem wurde an einem heterologen Expressionssystem der SH für Cyanobakterien gearbeitet. Weiterhin wurde die SH aus Rhodococcus opacus MR11 als komplementäres Modellsystem für O2-tolerante Pyridinnukleotid-abhängige Hydrogenasen etabliert. Dieser zur SH aus R. eutropha homologe Komplex hatte in früheren Arbeiten Vorteile für spektroskopische Studien offenbart und wurde hier erstmals im direkten Vergleich zur SH aus R. eutropha biochemisch und spektroskopisch charakterisiert. / The soluble, NAD+-reducing hydrogenase (SH) from Ralstonia eutropha H16 is a pyridine nucleotide-dependent hydrogenase. In these types of enzymes the conversion of H2 in the hydrogenase module of the complex is coupled to the reduction of NAD(P)+ in the NAD(P)H:acceptor oxidoreductase module. The SH belongs to a subtype that is catalytically active also in the presence of O2. This O2 tolerance is enabled by a reductive removal of O2, which according to the current model depends on a reverse e- flow from the NADH:acceptor oxidoreductase module to the active [NiFe] site in the large hydrogenase subunit. The impact of the FeS cluster in the small hydrogenase subunit HoxY on this process was analyzed in this study. Thereby it was shown that the four highly conserved cysteines C41, C44, C113 and C179 in HoxY are involved in the coordination of the FeS center. Further the nearby cysteine C39 was identified to be relevant for the O2 tolerance of the SH. Additionally we found the tryptophan W42 to be essential for the hydrogenase activity of the SH. Thus it was confirmed that the kinetic of the reverse e- transport is affected by the amino acid environment of the FeS cluster in HoxY. In addition, approaches for using the SH from R. eutropha in H2 producing cyanobacterial design cells were pursued. On one hand hybrid systems consisting of the SH and cyanobacterial photosystem I were analyzed in vitro for their capacity to produce H2 in a light dependent manner. On the other hand work on a heterologous expression system of the SH for Cyanobacteria was continued. Furthermore the SH from Rhodococcus opacus MR11 was established as complementary model system for O2-tolerant pyridine nucleotide-dependent hydrogenases. This complex, which is homologous to the SH from R. eutropha, has revealed advantages for spectroscopic analysis in earlier studies. Here it was characterized biochemically and spectroscopically for the first time in direct comparison with the SH from R. eutropha.