Transkriptionsfaktoren (TFs) empfangen Signale in Signaltransduktionskaskaden und übersetzen diese in eine zelluläre Antwort. Dadurch ermöglichen sie es Zellen, Organen und Organismen sich an verändernde Umgebungsbedingungen anzupassen. In früheren Studien wurde gezeigt, dass viele TFs nach Aktivierung Oszillationen im Zellkern aufweisen. Ein Beispiel dafür ist p53. Als zentrales Protein im Rahmen der zellulären Stressantwort reguliert es nach DNA Schaden die Expression hunderter Zielgene die das Zellschicksal steuern. Anomalien in der Aktivität von p53 stehen im Zusammenhang mit schwerwiegenden Erkrankungen wie der Krebsentstehung. Die Dynamik der Akkumulation von p53 im Zellkern ist abhängig von der Art des DNA Schadens und korreliert mit der resultierenden zellulären Antwort. Obwohl dieser Zusammenhang mehrfach gezeigt wurde, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen jedoch weitgehend unerforscht. Mit der vorliegenden Arbeit soll ein Beitrag zum Verständnis dazu geleistet werden, wie p53 Oszillationen im Zellkern die Transkription von Zielgenen auf Einzelzellebene modulieren. Dazu wurden sieben Zielgene ausgewählt und mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz in situ Hybridisierung und mathematischer Analyse charakterisiert. Es werden Ergebnisse der quantitativen, zeitaufgelösten mRNA Expression und der bursting Aktivität von Zielgenpromotoren mit Einzelzell- und Einzelmolekülauflösung dargestellt. Diese Analyse weist darauf hin, dass die Aktivierung von p53 nach DNA Doppelstrangbrüchen primär die Frequenz des stochastischen bursting der untersuchten Zielgene reguliert. Diese können anhand ihrer Promotoraktivität in drei Archetypen eingeteilt werden: anhaltend, transient und pulsierend, die jedoch nicht ausschließlich durch veränderte p53 Menge im Zellkern erklärt werden können. Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Veränderungen im Acetylierungszustand der C-terminalen Lysinreste von p53 entscheidend für diese Gen-spezifische Regulation sind. / Transcription factors (TFs) are receiver and compiler of cell signaling, transmitting incoming inputs into cellular responses that enable cells, organs and organisms to respond and adapt to a changing environment. In the past, it has been shown that many TFs exhibit oscillations of nuclear abundance over time when activated. One of these TFs is the tumor suppressor p53, a central hub in the signaling network regulating the cellular stress response, controlling cell fate decisions by changing the expression of hundreds of target genes. Aberrations in p53’s activity are related to severe human malignancies such as cancer. The dynamics of its nuclear accumulation are stimulus dependent and enable the p53 pathway to mediate distinct responses to cellular stress. However, the molecular mechanisms translating such dynamics to altered gene expression remain elusive. In this thesis, I analyzed how oscillations of p53 affect the transcriptional regulation of target genes in single-cells and at individual promoters. I chose a panel of seven targets and employed a combinatorial approach of single-molecule fluorescence in-situ hybridization and mathematical analysis. I present quantitative, time-resolved measurements of target gene mRNA expression and transcriptional bursting activity with single-cell and single-molecule resolution. The resulting data show characteristic principles how p53 nuclear accumulation increases transcriptional bursting upon stimulation and reveal gene-specific modulations. P53 target promoters are regulated by changing the fraction of active promoters, indicating burst frequency regulation. Based on this, genes can be grouped along three archetypes of promoter activity: sustained, transient and pulsatile. These archetypes cannot solely be explained by nuclear p53 levels or promoter binding of total p53. Instead, I provide evidence that the time-varying acetylation state of p53’s C-terminal lysine residues is critical for this gene-specific regulation.

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation. / The genome of every cell is constantly subjected to stresses that could compromise its integrity. DNA double-strand breaks (DSB) are amongst the most damaging events for a cell and can lead to gross chromosomal rearrangements, cell death and cancer if improperly repaired. Homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ) are the main repair pathways responsible for the repair of DSBs. However, the mechanistic basis of both pathways is fundamentally different and the regulation of the choice between both for the repair of DSBs remains largely misunderstood. The Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) complex acts as a DSB first responder and contributes to repair by both homologous recombination and NHEJ. Being at the crossroads of both DSB repair pathways, the MRX complex is therefore in a convenient position to influence the repair choice. This thesis unravels two distinct phosphorylation systems modifying the MRX complex and specifically regulating repair by NHEJ. The first relies on cell cycle progression and inhibits NHEJ, while the second requires the presence of DNA damage and is necessary for efficient NHEJ. Together, our results suggest a model in which the MRX complex would act as an integrator of phospho-stimuli in order to regulate the DSB repair pathway choice.

La sénescence réplicative est le phénomène associé à un arrêt de croissance permanent causé par le raccourcissement progressif des télomères à chaque division. Lorsqu’ils atteignent une longueur critique, les télomères perdent leur structure terminale protectrice en t-loop, ce qui révèle l’extrémité du chromosome et déclenche une Réponse aux dommages à l’ADN (RDA) p53-dépendante. Le nombre de télomères ouverts nécessaire à la mise en place de la sénescence n’est pas connu, mais plusieurs évidences suggèrent que la cellule pourrait en tolérer un certain nombre avant de s’arrêter définitivement. Dans ce projet, nous utilisons un dominant négatif de Tin2 (Tin2DN), un membre du complexe nucléo-protéique nommé le télosome qui stabilise la t-loop, pour démontrer que la dysfonction chromatinienne télomérique seule ne suffit pas à déclencher un arrêt de croissance permanent. Lorsqu’il est exprimé, Tin2DN induit la formation de foyers de dommages de 53BP1, la RDA ainsi qu’un arrêt de croissance transitoire. De façon surprenante, nous observons que les cellules qui ont subi ce premier arrêt de croissance ré-entrent dans le cycle cellulaire et se divisent, et ce malgré la présence de foci télomériques. Cette réentrée cause l’apparition de cassures secondaires ainsi qu’une accumulation d’instabilités génomiques, telles que des ponts chromosomiques ou des micro-noyaux. Cet échappement des points de blocages du cycle cellulaire pourrait être expliqué par notre observation que la dysfonction télomérique induite par Tin2DN n’active que très faiblement p53 et p21, et pratiquement pas la kinase chkChk2. Néanmoins, en inhibant directement l’activité de p53, nous n’observons plus aucun arrêt de croissance mais une accumulation de foci et d’instabilités génomiques, avec une forte occurrence de catastrophes mitotiques. L’ensemble de ces résultats propose un nouveau modèle d’entrée en sénescence réplicative : l’ouverture des télomères induits une faible RDA menant à un premier arrêt de prolifération transitoire p53-dépendant. Les cellules échappent à cet arrêt et se divisent, mais l’ouverture des télomères ayant causé des fusions chromosomiques, la division crée alors de nouvelles cassures doubles brins dans le génome qui déclencheront une forte RDA et un nouvel arrêt de croissance permanent, la sénescence réplicative. / Replicative senescence is the physiological permanent growth arrest caused by telomeres shortening, at each round of replication. Once they have reach a critical length, the telomeres lose their t-loop structure, revealing the chromosome extremity that triggers a p53-dependant DNA damage response (DDR) and leads to proliferation arrest. The number of shortened telomeres that are necessary to onset senescence is not known, but accumulating evidences suggest that the cell is able to tolerate a certain level of telomere uncapping before stopping its divisions. Here, we used an inducible dominant negative form of Tin2 (Tin2DN), a member of the shelterin complex that stabilizes the t-loop, to show that telomeres uncapping alone is not sufficient to induce a stable growth arrest. When expressed, Tin2DN leads to the openingverture of the t-loop, creating a DDR with the formation of 53BP1 DNA damage foci (DDF) and a transient growth arrest. Indeed, we observed that the cells were re-entering the cell cycle and dividing, despite their uncapped DDF harbouring telomeres. As telomere uncapping creates chromosome fusions, such division leads to the apparition of secondary DNA breaks, with an accumulation of genomic instabilities, such as chromosomes bridges or micronuclei. We observed that Tin2 DN-induced telomere uncapping leads to a very weak activation of p53 and p21, with almost no phosphorylation of chkChk2. Nevertheless, when we infected our cells with a shp53, the primary growth arrest did not occur, leading to an amplification of the damages, with strong signs of instability and mitotic catastrophe. Altogether, these results propose a new model for replicative senescence: telomere uncapping induces a weak DDR that leads to a transitory growth arrest. The cells divide with fused chromosomes, creating new randomly distributed double strand breaks that trigger a stronger DDR and a permanent growth arrest. In that model, replicative senescence is not directly induced by telomere uncapping, but by an amplification of DNA damages through mitotic catastrophe.

Recent knowledge suggests that the onset of cancer is modulated by the interplay of internal and external environmental factors along with numerous gene variants. Structural chromsomal aberrations in peripheral blood lymphocytes are considered as biomarkers of effect of genotoxic carcinogens and reflect elevated risk of cancer. Incomplete or deficient repair of double-strand breaks in DNA underlie chromosomal aberrations and the measurement of cytogenetic alterations may reflect interindividual differences in the response towards the mutagen. In this study the expected deficiences in the DNA repair capacity have been determined in incident oncological patients with breast, colorectal and urogenital cancers. The determination of chromosomal aberrations have been supplemented by the measurement of variants in genes involved in double-strand breaks repair (XRCC3, rs861539; RAD54L, rs1048771). Methodologically, we employed conventional cytogenetic analysis, cytogenetic analysis following the induction of chromocomal damage by bleomycin ("Challenge assay"), TaqMan discrimination analysis for the detection of allelic variants and statistical analyses. By using these methods we did not observe statistically signifiant differences either in chromosomal breaks (p=0,354) or in a percentage of cells with...

Le cancer de la prostate est la forme de cancer la plus fréquente et la troisième cause de décès par cancer chez l’homme dans les sociétés occidentales. Alors que la plupart des cancers de la prostate localisés sont éradiqués chirurgicalement, la plupart des tumeurs métastatiques répondant initialement aux thérapies par privation d’androgènes deviennent résistantes au traitement, causant généralement le décès du patient. Les gènes suppresseurs de tumeur PTEN et p53 étant fréquemment mutés dans les cancers de la prostate métastatiques et résistants à la castration, le laboratoire d’accueil a généré des modèles murins dans lesquels Pten et/ou Trp53 sont sélectivement invalidés à l’âge adulte dans les cellules épithéliales prostatiques dans le but de déterminer les évènements clés conduisant à la progression du cancer de la prostate. Notre étude révèle que l’invalidation de PTEN stimule la prolifération des cellules épithéliales prostatiques et conduit à des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux en quelques mois. Cette hyper-prolifération induit un stress réplicatif et une réponse aux dommages de l’ADN qui va conduire à un arrêt progressif de la croissance cellulaire et une entrée en sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent de nombreuses cytokines et de chimiokines, et peuvent accumuler des mutations contribuant ainsi à la progression de la tumeur. Il est notable qu’en l’absence de Trp53, les épithéliums prostatiques dépourvus de Pten développent des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux entrant en sénescence. Cependant, la formation d’adénocarcinomes est accélérée et des tumeurs sarcomatoïdes pouvant générer à long terme des métastases apparaissent. En l’absence de Pten, certaines cellules épithéliales prostatiques perdent leur identité moléculaire en exprimant des marqueurs caractéristiques de cellules souches et différenciation neuroendocrinienne. Nous avons également mis en évidence des cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN et p53 résistantes à la castration exprimant à la fois des marqueurs de cellules basales et luminales. En conclusion, nos travaux ont permis une avancée dans la compréhension des mécanismes conduisant à des formes incurables de cancer de la prostate. Les traitements actuels ayant des effets secondaires importants et pouvant générer des résistances, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’élimination des cellules sénescentes mais aussi des cellules épithéliales prostatiques exprimant des marqueurs de cellules basales et luminales dans les lésions précancéreuses représente des perspectives intéressantes pour traiter le cancer de la prostate. / Prostate cancer (PCa) is a leading cause of male cancer death worldwide. While most locally PCa are curable, metastatic tumors initially respond to androgen deprivation therapy but ultimately relapse to castration-resistant prostate cancer (CRPC), which is a lethal disease. Since the tumor suppressor genes PTEN and p53 are frequently mutated in metastatic and CRPC, the host laboratory generated mouse models in which Pten and/or Trp53 are selectively ablated in adult prostatic epithelial cells (PECs) in order to unravel the key events leading to prostate cancer progression. Our study reveals that Pten ablation stimulates PECs proliferation forming prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) within a few months. This hyper-proliferation induces replicative stress and a DNA damage response (DDR), which in turn leads to a progressive growth arrest with characteristics of cell senescence. As senescent cells secrete a large number of cytokines and chemokines, and can accumulate other mutations, they might contribute to tumor progression. Importantly, in the absence of Trp53, most Pten-null PECs develop PINs that enter senescence. However partial loss of PECs identity is detected as we show enhanced stemness and focal neuroendocrine differentiation of luminal Pten-null PECs. In some cases, adenocarcinoma and sarcomatoid tumors are formed, and more than one-third of the latter develop metastases. Strikingly, we also show formation of a castrate-resistant cell entity of both Pten and Pten/Trp53-null PECs sharing luminal and basal markers. Taken together, as current treaments lead to side effects and resistance, the development of therapeutic strategies to eliminate senescent cells/and or PECs expressing luminal and basal/stem progenitor in pre- cancerous lesions represents promising option for prostate cancer treatment.

Abstract Hereditary mutations in DNA damage response (DDR) genes often lead to genomic instability and ultimately tumor development. However, the molecular mechanism of how these DDR deficiencies promote genomic instability and malignancy is not well understood. Thus, the specific aim of this thesis is to identify the functional and molecular framework behind the elevated breast cancer risk observed in heterozygous PALB2 and ABRAXAS mutation carriers. The heterozygous germline alteration in PALB2 (c.1592delT) causes a haploinsufficiency phenotype in the mutation carrier cells. Due to PALB2 haploinsufficiency, elevated Cdk activity and consequently aberrant DNA replication/damage response was observed in the PALB2 mutation carrier cells. Excessive origin firing that is indicative of replication stress was also seen in the PALB2 mutation carrier cells. In addition to replication stress, PALB2 mutation carrier cells also experience G2/M checkpoint maintenance defects. The increased malignancy risk in females associated with heterozygosity for the Finnish PALB2 founder mutation is likely to be due to aberrant DNA replication, elevated genomic instability and multiple different cell cycle checkpoint defects. The heterozygous germline alteration in ABRAXAS (c.1082G>A) causes a dominant-negative phenotype in the mutation carrier cells. Decreased BRCA1 protein levels as well as reduced nuclear localization and foci formation of BRCA1 and CtIP was observed in the ABRAXAS mutation carrier cells. This causes disturbances in basal BRCA1-A complex localization, which is reflected by a restraint in error-prone DNA double-strand break (DSB) repair pathway usage, attenuated DNA damage response, deregulated G2/M checkpoint control and apoptosis. Most importantly, mutation carrier cells display a change in their transcriptional profile, which we attribute to the reduced nuclear levels of BRCA1. Thus, the Finnish ABRAXAS founder mutation acts in a dominant-negative manner on BRCA1 to promote genome destabilization in the heterozygous carrier cells. / Tiivistelmä Perinnölliset muutokset DNA-vauriovasteen geeneissä johtavat usein genomin epävakauteen ja lopulta syövän kehittymiseen. Molekyylitason mekanismeja, joilla vauriovasteen vajaatoiminta ajaa genomin epävakautta ja syöpää, ei kuitenkaan ymmärretä kunnolla. Tämän väitöskirjan tavoitteena on tunnistaa solutoiminnan ja molekyylitason vaikuttajat heterotsygoottisten PALB2- ja ABRAXAS-geenimuutosten kantajien kohonneen rintasyöpäriskin taustalla. Heterotsygoottinen ituradan suomalainen perustajamuutos PALB2-geenissä (c.1592delT) aiheuttaa haploinsuffisienssin kantajahenkilöiden soluissa. PALB2:n haploinsuffisienssin seurauksena kantajasoluissa havaittiin kohonnutta Cdk-proteiinin aktiivisuutta ja siitä johtuvaa kiihtynyttä DNA:n kahdentumista. PALB2-mutaatiota kantavissa soluissa nähtiin myös liiallista replikaation aloituskohtien käyttöä, mikä viittaa replikaatiostressiin. Replikaatiostressin lisäksi PALB2-mutaation kantajasoluilla havaittiin vaikeuksia ylläpitää solusyklin G2/M-tarkastuspisteen toimintaa. Näiden solutoiminnan poikkeavuuksien takia heterotsygoottisen PALB2 c.1592delT -mutaation kantajilla todettiin genomin epävakautta ja kohonnut syöpäriski. Heterotsygoottinen ituradan mutaatio ABRAXAS-geenissä (c.1082G>A) aiheuttaa dominantti-negatiivisen fenotyypin mutaation kantajasoluissa. ABRAXAS-mutaatiota kantavissa soluissa havaittiin BRCA1-proteiinitasojen laskua sekä BRCA1- ja CtIP-proteiinien vähentynyttä lokalisaatiota tumaan ja DNA-vauriopaikoille. Tämä aiheuttaa häiriöitä BRCA1-A-kompleksin paikallistumisessa, mikä johtaa häiriöihin virhealttiiden DNA-kaksoisjuoste¬katkoksien korjausmekanismien käytössä, DNA-vauriovasteessa, G2/M-tarkastus-pisteen säätelyssä ja ohjelmoidussa solukuolemassa. Tärkeimpänä löydöksenä havaittiin mutaation kantajasoluissa muuttunut transkriptioprofiili, joka johtunee BRCA1-proteiinitasojen laskusta tumassa. Näin ollen suomalainen ABRAXAS-perustajamutaatio toimii dominantti-negatiivisena BRCA1:n suhteen, aiheuttaen genomin epävakautta heterotsygoottisissa kantajasoluissa.

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral. / Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation. / The genome of every cell is constantly subjected to stresses that could compromise its integrity. DNA double-strand breaks (DSB) are amongst the most damaging events for a cell and can lead to gross chromosomal rearrangements, cell death and cancer if improperly repaired. Homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ) are the main repair pathways responsible for the repair of DSBs. However, the mechanistic basis of both pathways is fundamentally different and the regulation of the choice between both for the repair of DSBs remains largely misunderstood. The Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) complex acts as a DSB first responder and contributes to repair by both homologous recombination and NHEJ. Being at the crossroads of both DSB repair pathways, the MRX complex is therefore in a convenient position to influence the repair choice. This thesis unravels two distinct phosphorylation systems modifying the MRX complex and specifically regulating repair by NHEJ. The first relies on cell cycle progression and inhibits NHEJ, while the second requires the presence of DNA damage and is necessary for efficient NHEJ. Together, our results suggest a model in which the MRX complex would act as an integrator of phospho-stimuli in order to regulate the DSB repair pathway choice.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’acétylation de l’histone H3 sur la Lysine 56 (H3K56ac) a lieu sur toutes les histones H3 nouvellement synthétisées qui sont déposées derrière les fourches de réplication. L’acétylation de H3K56 joue un rôle primordial dans l’assemblage de l’ADN lors la réplication et la réparation. L’acétylation de H3K56 joue également un rôle important dans la stabilité génomique et la stabilisation des fourches de réplication bloquée. En effet, les cellules dépourvues de H3K56ac sont sensibles au méthane sulfonate de méthyle (MMS) et à d’autres agents génotoxiques qui causent du stress réplicatif. Notre projet visait à investiguer les liens entre la protéine du réplisome Ctf4 et l’acétyltransférase d’histone Rtt109. Dans un premier lieu, la délétion de CTF4 a partiellement contré la sensibilité des cellules rtt109Δ au MMS. Notre analyse génétique a aussi montré que Ctf4, Rtt109, et le complexe Rtt101-Mms1-Mms22 agissent dans la même voie de réponse face à un stress réplicative. Nos résultats montrent que les cellules ctf4Δ et rtt109Δ présentent des foyers intenses du complexe de liaison à l'ADN simple-brin RPA en réponse au stress réplicatif, suggérant la formation excessive de régions d'ADN simple-brin aux fourches de réplication bloquées, ce qui conduit à une hyper activation des points de contrôle des dommages à l'ADN. Ces mutants présentent des ponts anaphase et des foyers persistants des protéines de recombinaison homologues Rad51 et Rad52 en réponse aux génotoxines, suggérant ainsi que la structure anormale des réplisomes bloqués peut compromettre leur récupération. Nos résultats indiquent également que la délétion des gènes de la RH (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 et MUS81) avec ctf4Δ et rtt109Δ respectivement, engendre une sensibilité synergique au MMS, suggérant que les cellules qui sont déficientes en H3K56 acétylation utilisent la RH pour réparer les dommages causés suite à un stress réplicatif. En conclusion, nos résultats suggèrent que les cellules déficientes en H3K56ac présentent des défauts de RH en réponse aux dommages à l’ADN induits par le MMS durant la phase S. / In Saccharomyces cerevisiae, histone H3 lysine 56 acetylation (H3K56ac) occurs on all newly synthesized histones H3 that are deposited behind DNA replication forks. H3K56ac plays critical role in chromatin assembly during DNA replication and repair. H3K56ac is also required for genome stability and stabilization of stalled replication fork. Cells lacking H3K56ac are sensitive to methyl methane sulfonate and other drugs that cause replicative stress. In this thesis, we investigated the links between the replisome protein Ctf4 and the H3K56 acetyltransferase Rtt109. Deletion of CTF4 partially rescued the sensitivity of rtt109Δ cells to methyl methane sulfonate. Genetic analyses also showed that Ctf4, Rtt109, and the Rtt101-Mms1-Mms22 complex act in the same pathway to response to replicative stress. ctf4Δ and rtt109Δ cells displayed intense foci of the single-stranded DNA binding complex RPA during replicative stress, suggesting formation of excess single-stranded DNA regions at stalled replication forks, leading to hyper activation of DNA damage checkpoints. These mutants accumulated anaphase bridges and persistent foci of the homologous recombination proteins Rad51 and Rad52 in response to genotoxins, suggesting that abnormal DNA structure formed at stalled replisome may compromise their recovery. Deletion of HR genes (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 and MUS81) together with ctf4Δ and rtt109Δ presents synergistic sensitivity to MMS, suggesting that H3K56ac deficient cells use HR to repair the damages caused by replicative stress. Overall our results demonstrate that H3K56ac deficient cells cannot recover MMS- induced damages because HR is compromised in these mutants.

De nombreuses voies de signalisation cellulaire complexes permettent de répondre à la présence de dommages à l’ADN. Cette réponse cellulaire est indispensable afin d’éviter l’accumulation de mutations pouvant éventuellement conduire à la transformation tumorale. Ces différentes voies de réponse aux dommages à l’ADN sont hautement coordonnées et sont regroupées au sein d’un mécanisme global appelé DNA damage response (DDR). Les facteurs du DDR sont régulés à plusieurs niveaux de la cascade de l’expression des gènes. De façon notable, plusieurs protéines de liaison à l’ARN (RBP) participent à la régulation de l’expression des gènes du DDR via la régulation post- transcriptionnelle de leur ARN messager. La RBP STAU2 est connue pour lier plusieurs ARNm codant pour des protéines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire ainsi que dans les voies du DDR. La protéine STAU2 est elle-même régulée au niveau transcriptionnel par le facteur de transcription E2F1. De récentes observations laissent penser que la kinase centrale du DDR, CHK1, pourrait être impliquée dans la régulation de la stabilité de STAU2. Par ailleurs, les conséquences cellulaires de la diminution du niveau d’expression de STAU2 sont à ce jour très peu connues. Ce mémoire a d’abord été entrepris dans le but de mieux comprendre l’implication de la voie de la kinase CHK1 dans la régulation de la protéine de liaison à l’ARN STAU2. CHK1 est une protéine centrale des voies du DDR ainsi que du contrôle de la progression du cycle cellulaire en l’absence de dommages à l’ADN. Nos résultats montrent que la diminution de CHK1 induit une dégradation rapide de STAU2 par les caspases d’une façon indépendante de l’apoptose. Nous avons également renforcé ce lien entre STAU2 et les mécanismes de réparation des dommages à l’ADN en identifiant plusieurs protéines des voies de réparation dans l’environnement immédiat de STAU2. D’autre part nos travaux visent à mettre en évidence les conséquences de la déplétion de STAU2 dans plusieurs types cellulaires. STAU2 étant une RBP, sa dérégulation impacte inévitablement le devenir de plusieurs ARNm. Afin de caractériser ces différentes conséquences, nous avons dans un premier temps réalisé la déplétion totale de STAU2 dans des cellules hTert-RPE par la technique de CRISPR/Cas9. Nos résultats montrent que ces cellules accumulent anormalement des dommages à l’ADN et prolifèrent plus rapidement que des cellules normales. En outre plusieurs gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN se retrouvent diminués dans ces cellules. Dans un second temps, afin de définir si cet effet est dépendant du type cellulaire, nous avons induit la diminution de l’expression de STAU2 dans des cellules IMR90. Nous avons montré que dans ce cas, la diminution de STAU2 induit un arrêt du cycle cellulaire et une entrée des cellules en sénescence. Ainsi, les données présentées dans ce mémoire contribuent à mieux comprendre l’implication de STAU2 dans les processus cellulaires majeurs que sont la régulation du DDR et le contrôle du cycle cellulaire. / Many complex cellular pathways are induced in response to DNA damages. This cellular response is indispensable to prevent the accumulation of mutations and to avoid malignant transformation. These different pathways are highly coordinated and are organized in a global mechanism called DNA damage response (DDR). Proteins involved in the DDR are regulated at different levels of the gene expression process. Notably, several RNA binding proteins are involved in the regulation of DDR gene expression through the post-transcriptional control of their mRNA. The RBP STAU2 is known to bind various mRNAs coding for proteins involved in the DDR or cell cycle control. STAU2 is regulated at the transcriptional levels by the major transcription factor E2F1. Recent observations suggest that CHK1 could be implicated in the control of the steady-state level of STAU2. Otherwise, the cellular consequences of STAU2 downregulation remain elusive. The purpose of this research was first to elucidate the implication of CHK1 pathway in STAU2 regulation. CHK1 is a major protein involved in the DDR regulation as well as in the control of cell cycle progression in the absence of DNA damage. Our data show that the downregulation of CHK1 rapidly leads to a caspase-dependent degradation of STAU2 independently of apoptosis. The link between STAU2 and mechanisms of DNA repair was reinforced by our BioID2 experiment that identified several proteins of the DDR in close proximity with STAU2. On the other hand, the aim of this study was to determine the consequences of STAU2 downregulation in different cell lines. Given that STAU2 is an RBP, its dysregulation will inevitably change the fate of several mRNA. In order to increase our understanding of theses consequences, we generated an hTert-RPE1 STAU2-KO cell line using the CRISPR/Cas9 technique. Our data show that these cells accumulate DNA damage and have an increased proliferation rate. Moreover, several genes involved in the DNA repair pathway are downregulated. We also downregulated STAU2 in IMR90 to determine if the previous observations are cell-type specifics. In the latter case, STAU2 diminution triggers cell cycle arrest and cellular senescence. Altogether, these results contribute to improve our knowledge of STAU2 function, especially in DNA damage response pathway and in cell cycle regulation.