O diabetes mellitus (DM) está associado a diversas complicações micro e macrovasculares diretamente relacionadas a doenças cardiovasculares. A prolongada exposição à hiperglicemia e a resistência a insulina são considerados os principais fatores envolvidos nestas complicações, as quais são exacerbadas pela disfunção endotelial. Mediadores inflamatórios contribuem potencialmente para o desenvolvimento de disfunção endotelial pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, por sua vez, estimulam a transcrição de fatores pró- inflamatórios. Receptores específicos, como os NLRs (NOD-like receptors, receptores do tipo NOD) contribuem para instalação de processo inflamatório pela ativação do complexo inflamassoma. Este regula a ativação da caspase-1 e o processamento proteolítico dos precursores pró-IL-1? e pró-IL-18 nas citocinas maduras. Diversos mediadores podem ativar o inflamassoma NLRP3 como, por exemplo, EROs e DNA mitocondrial. Pouco é conhecido sobre o envolvimento de receptores NLRP3 e DNA mitocondrial na disfunção endotelial associada ao diabetes. Testamos a hipótese que a deficiência genética do receptor NLRP3 confere resistência à ativação de processo inflamatório na vasculatura de animais com diabetes tipo 1 (DM1) e, ainda, que DNA mitocondrial contribui para a ativação vascular do inflamassoma NLRP3 e para disfunção endotelial. Foram utilizados camundongos C57Bl/6 e deficientes para NLRP3, os quais foram tratados com veículo ou submetidos a protocolo para indução de DM1 com estreptozotocina. Parâmetros vasculares funcionais foram determinados em artérias mesentéricas de resistência. Células de músculo liso vascular (CMLV) e endoteliais foram utilizadas para avaliação da ativação do inflamassoma NLRP3 por DNA mitocondrial. A geração de EROs foi avaliada pela fluorescência para o dihidroetídio e pela quimiluminescência para lucigenina. A ativação de caspase-1 e IL-1? foi avaliada por western blot e o influxo de cálcio, por fluorescência. DNA mitocondrial foi avaliado pela expressão gênica de componentes da mitocôndria. O diabetes reduziu a vasodilatação dependente de endotélio, o que não ocorreu em artérias de animais deficientes de NLRP3. Animais diabéticos apresentaram aumento da expressão vascular do receptor NLRP3, da ativação de caspase-1 eIL-1? e da geração de EROs e peróxido de hidrogênio no leito mesentérico, eventos que ocorreram em menor intensidade em camundongos deficientes de NLRP3. Houve redução na expressão proteica vascular de Nox4 (NADPH oxidase 4), bem como na expressão gênica da molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1) em animais deficientes de NLRP3. Houve aumento da liberação de DNA mitocondrial citosólico no pâncreas de animais diabéticos. A incubação com o DNA mitocondrial extraído do pâncreas de animais diabéticos promoveu ativação do inflamassoma em CMLV provenientes de animais C57Bl/6, mas não em CMLV provenientes de animais deficientes de NLRP3. Esta ativação foi associada ao aumento de EROs e influxo de cálcio. Essa mesma ativação também foi observada em células endoteliais. DNA mitocondrial de camundongos diabéticos também reduziu a dilatação dependente do endotélio em artérias mesentéricas, o que foi associado à geração de EROs e ativação do inflamassoma NLRP3. Pacientes diabéticos apresentaram aumento do DNA mitocondrial circulante e ativação de caspase-1 e IL-1? no soro. Os resultados demonstram que o DNA mitocondrial pancreático de animais diabéticos promove ativação, em CMLV e células endoteliais, do inflamassoma NLRP3 através do aumento no influxo de cálcio e da geração de EROs, contribuindo para o processo de disfunção endotelial. A deficiência de NLRP3 protege os animais diabéticos contra os danos vasculares inflamatórios e disfunção endotelial. / Diabetes mellitus (DM) is associated with several micro and macrovascular complications directly related to cardiovascular diseases. Prolonged exposure to hyperglycemia and insulin resistance are considered the main factors involved in these complications, which are exacerbated by endothelial dysfunction. Inflammatory mediators potentially contribute to the development of endothelial dysfunction by the generation of reactive oxygen species (ROS), which, in turn, stimulate the transcription of pro-inflammatory factors. Specific receptors such as NLRs (NOD-like receptors) contribute to the onset of inflammatory processes by the activation of a multiprotein complex called inflammasome. The NLRP3 inflammasome regulates the activation of caspase-1 and the proteolytic processing of pro-IL-1? and pro-IL-18 precursors into mature cytokines. Several mediators, such as ROS and mitochondrial DNA activate the NLRP3 inflammasome. Considering that it is not clear whether NLRP3 and mitochondrial DNA contribute to diabetes-associated endothelial dysfunction, we hypothesized that the genetic deficiency of the NLRP3 confers resistance to vascular inflammatory processes in animals with type 1 diabetes (T1D) and that mitochondrial DNA contributes to vascular activation of NLRP3 inflammasome and endothelial dysfunction. C57B1/6 and NLRP3 knockout mice were treated with vehicle or streptozotocin to induce T1D. Functional vascular parameters were determined in resistance mesenteric arteries. Cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) and endothelial cells were used to determine NLRP3 inflammasome activation by mitochondrial DNA. ROS generation was evaluated by dihydroethidium fluorescence and by chemiluminescence for lucigenin. Caspase-1 and IL-1? activation was evaluated by western blot. Calcium influx was determined by fluorescence and mitochondrial DNA by mRNA expression of mitochondrial components. Diabetes reduced endothelium-dependent vasodilation in C57B1/6, but not in NLRP3 knockout mice. Diabetic mice presented increased vascular NLRP3 receptor expression, increased caspase-1 and IL-1? activation, as well as ROS and hydrogen peroxide generation, events that were mildly observed in NLRP3 knockout mice. There was a reduction in the vascular protein expression of Nox4 (NADPH oxidase 4) as wellas in the gene expression of VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) and ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) in NLRP3 knockout animals. There was an increase in cytosolic mitochondrial DNA release in pancreas from diabetic animals. Mitochondrial DNA from the pancreas of diabetic mice induced NLRP3 inflammasome activation in VSMC from C57B1/6 mice, but not in VSMC from NLRP3 knockout mice. This activation was associated with increased levels of ROS and calcium influx and was also detected in endothelial cells. Mitochondrial DNA from diabetic mice also decreased endothelium-dependent dilation in mesenteric arteries, which was associated with ROS generation and NLRP3 inflammasome activation. Diabetic patients exhibited increased serum mitochondrial DNA and caspase-1 and IL-1? activation. The results demonstrate that pancreatic mitochondrial DNA from diabetic mice activates the NLRP3 inflammasome in VSMC and endothelial cells by increasing calcium influx and ROS generation, contributing to endothelial dysfunction. NLRP3 deficiency prevents diabetes-related vascular inflammatory damage and endothelial dysfunction.

O grupo neuwiedi é composto por oito espécies amplamente distribuídas na diagonal das formações abertas da América do Sul: Bothrops diporus, B. erythromelas, B. lutzi, B. mattogrossensis, B. marmoratus, B. neuwiedi, B. pauloensis e B. pubescens. Foi utilizada uma amostra de 140 espécimes, com intuito de fornecer um teste independente, do limite das espécies e uma hipótese filogenética para os membros do grupo. As inferências filogenéticas realizadas a partir da máxima parcimônia, máxima verossimilhança e análise bayesiana, utilizando sequências de 1018 pb dos genes mitocondriais citocromo b e ND4 combinados, recuperaram topologias similares, nas quais as espécies do grupo neuwiedi formam um grupo monofilético com elevados valores de suporte. Foi recuperado o monofiletismo recíproco para as espécies B. erythromelas, B. lutzi e B. pubescens. Entretanto, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi, B. marmoratus e B. pauloensis apresentaram-se parafiléticas ou polifiléticas, como atualmente definidas. Haplótipos de Bothrops diporus e B. mattogrossensis foram recuperados em dois clados distintos, B. neuwiedi e B. marmoratus em três clados, e B. pauloensis em quatro clados. Os padrões parafiléticos e polifiléticos recuperados para os haplótipos podem ser decorrentes de um arranjo taxonômico inadequado, retenção de morfologia ancestral, convergência morfológica, plasticidade fenotípica, eventos de introgressão genética recente e antiga na história evolutiva do grupo, homoplasia molecular e retenção de polimorfismo ancestral, fenômenos que não são mutuamente exclusivos. O compartilhamento de haplótipos de DNA mitocondrial, simpatria e indivíduos de morfologia intermediária entre B. marmoratus e B. pauloensis são evidências que sugerem a ocorrência de introgressão recente e a existência de uma zona de hibridação na região central do Brasil. As inferências filogenéticas para o grupo neuwiedi sugerem a possível existência de espécies crípticas, demonstrando a necessidade premente de uma reavaliação da taxonomia corrente, a partir da análise conjunta dos dados morfológicos e DNA mitocondrial aqui apresentados. Também serão necessários estudos complementares a partir de marcadores nucleares. Esta pesquisa, quando comparada aos estudos filogenéticos prévios, representa um marcante aumento na quantidade e qualidade da amostragem para o grupo neuwiedi, incluindo todas as espécies atualmente reconhecidas e amostra de 140 indivíduos para 92 localidades de 13 Estados do Brasil, fornecendo importantes informações para o entendimento e conservação da biodiversidade das serpentes Neotropicais. / The neuwiedi group of species of the genus Bothrops is widespread in open areas of South America, and it is composed by eight current species: Bothrops diporus, B. erythromelas, B. lutzi, B. mattogrossensis, B. marmoratus, B. neuwiedi, B. pauloensis, and B. pubescens. A total of 140 samples were used to provide an independent test of the species boundaries and a hypothesis of phylogenetic relationships among the members of this group. Our combined data (1018 bp of cyt b and ND4 from mtDNA) recovered the neuwiedi group as a highly supported monophyletic group in Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Analyses. Reciprocal monophyly for each B. erythromelas, B. lutzi and B. pubescens was recovered. However, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi, B. marmoratus and B. pauloensis showed to be paraphyletic and polyphyletic as currently defined. Haplotypes from each B. diporus and B. mattogrossensis were recovered in two different clades, B. neuwiedi and B. marmoratus were recovered in three clades, and B. pauloensis in four clades. The lack of monophyletic species could be explained by imperfect taxonomic analysis method, retention of ancestral morphology, convergent morphology, plasticity phenotipic, recent and ancient introgression, molecular homoplasy and incomplete lineage sorting, and these phenomena are not mutually exclusive. Sympatry, phenotipycally intermediate specimens and mtDNA haplotypes shared between B. marmoratus and B. pauloensis, provide evidences for recent introgression and the possibility of occurrence of a hybrid zone in Central Brazil. These phylogenetic inferences within neuwiedi group suggest the possible occurrence of cryptic species which were no detected morphologically, and the necessity of a current taxonomy review based on combining data presented here to morphological data. Compared to previous phylogenetic studies, the investigation presented here represents a remarkable increasing in quantity and quality concerning the group sampling, since it includes all the currently recognized species and samples of 140 individuals from 92 localities of 13 states of Brazil. It has never been done before, and supplies important information for understanding and to the conservation of Neotropical snake biodiversity.

Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Psyllidae) é um inseto exótico no Brasil, registrado desde a década de 40. Apesar dos danos diretos que pode causar, só recebeu atenção como praga em 2004, quando foi confirmada a doença Huanglonbing (HLB) em citros, a qual foi posteriormente relacionada a D. citri como inseto-vetor. Atualmente, não há cura para plantas doentes. Portanto, o manejo do HLB é baseado na retirada de árvores infectadas e no controle dos psilídeos, o qual se fundamenta no controle biológico clássico, ação natural de predadores e no controle químico. Porém, o uso contínuo e intenso de agrotóxicos é sempre problemático devido ao desequilíbrio que pode causar nos agroecossistemas. Portanto, investigar as populações de D. citri no Brasil e discutir possíveis medidas alternativas para o controle ou manejo do vetor/doença são desejáveis. Assim, este trabalho apresenta como objetivos i) avaliar a diversidade genética intra e interpopulacional de D. citri e verificar a existência de estruturação populacional no Brasil, especialmente entre as populações que se distribuem na principal região citrícola do país; ii) determinar a ocorrência e frequência de infecção por Wolbachia em diferentes populações desse psilídeo, além de caracterizar a diversidade desse simbionte e definir a relação entre os haplótipos do hospedeiro e as linhagens de Wolbachia,visando fornecer subsídios para o controle alternativo deste inseto-vetor. A análise de diversidade genética utilizou o gene da citocromo oxidase I (COI) como marcador molecular. Os cálculos dos índices de fixação F indicaram a presença de estrutura genética e os cálculos dos índices de diversidade molecular mostraram um quadro de expansão populacional recente. Já a caracterização de Wolbachia via tipagem pela análise de sequências de multilocos (multilocus sequencing typing - MLST) indicou a ocorrência de cinco STs (173, 174, 175, 225 e 236), enquanto que análises das sequências do wsp indicaram quatro tipos de Wolbachia. O ST-173 foi predominante, estando presente em todas as populações, enquanto que os demais foram populações-específicos. Análises da relação hospedeiro-simbionte não revelou a existência de relações específicas entre os haplótipos do hospedeiro e os STs de Wolbachia, nem a diminuição da diversidade nucleotídica de D. citri frente à infecção por mais de um ST do simbionte. A relação entre os STs de Wolbachia e as consequências desta diversidade na bioecologia do hospedeiro ainda permanecem desconhecidas, mas a constatação de que Wolbachia ocorre em todas as populações e de que há um ST com distribuição abrangente abre caminhos para a utilização desse simbionte no desenvolvimento de estratégias alternativas de controle de D. citri. / Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Psyllidae) is an exotic insect in Brazil, first recorded in the 40s. Although it causes direct damage, D. citri only received attention as a pest in 2004, when the \"Huanglonbing\" (HLB) disease was confirmed infecting citrus in Brazil, and subsequently related to D. citri as vector. Currently, there is no cure for diseased plants, and the management of HLB is based on the removal of infected trees and psyllid control, which is based on classical biological control, natural predation and chemical control. However, the continuous use of pesticides is always problematic due to the imbalance it can cause in agrosystems. Therefore, investigations on the populations structure of D. citri in Brazil and possible alternative measures for vector/disease control or management are highly desired. Thus, this study was aimed to i) evaluate the intra and interpopulation genetic diversity of D. citri and verify the existence of population structuring in Brazil, especially in the main citrus producing region of the country, ii) determine the natural rate of infection and characterize the Wolbachia strains associated with different populations of D. citri and iii) investigate the relationship among host haplotypes and the strains of Wolbachia, in order to provide data for the alternative control of this vector. The analysis of genetic diversity was done using the cytochrome oxidase I (COI) gene as a molecular marker. The fixation rates F calculated indicated the presence of genetic structure, while the molecular diversity indices pointed to a recent population expansion of D. citri in Brazil. The multilocus sequence typing analysis (\"multilocus sequencing typing - MLST\") for Wolbachia demonstrated the presence of five new sequence-types (STs = 173, 174, 175, 225 and 236), while only four were identified when using the wsp sequences as markers. The ST-173 was the predominant ST associated with D. citri, being present in all populations, while others were specific to certain populations. Analysis of the hostsymbiont relationship did not reveal the existence of specific interactions between host haplotypes and the STs of Wolbachia, or the decrease of nucleotide diversity of D. citri in populations infected by more than one ST. The effects of Wolbachia diversity on the host bioecology are still unknown, but the fact that Wolbachia is fixed in all populations and that there is a ST broadly distributed throughout the D. citri populations highlights the use of Wolbachia for the development of alternative strategies to control D. citri.

Urophycis Gill, 1863 é um gênero de peixes marinhos demersais de médio porte, popularmente conhecidos como abróteas, distribuídos ao longo da costa do Atlântico Ocidental, do Canadá à Argentina. Atualmente são reconhecidas sete espécies válidas dentro deste gênero. Apesar de sua importância comercial, até então poucos estudos taxonômicos e biogeográficos haviam sido realizados com estas espécies. Três espécies foram descritas do Atlântico Sul ocidental: U. brasiliensis (Kaup, 1858), descrita de Motevideo, Uruguai, U. latus Miranda Ribeiro, 1903 e Urophycis mystacea Miranda Ribeiro, 1903, ambas descritas do Rio de Janeiro, Brasil. Urophycis mystacea é morfologicamente semelhante à U. cirrata (Goode & Bean, 1896), descrita do Golfo do México nos Estados Unidos, sendo frequentemente confundidas. Os objetivos desta contribuição foram (1) redescrever U. brasiliensis, e alocar U. latus como um sinônimo júnior ; (2) redescrever U. cirrata e alocar U. mystacea como um sinônimo júnior; (3) estabelecer diagnoses e mapas de distribuição atualizados para ambas espécies. Tecidos e exemplares foram obtidos com pescadores e em coleções científicas. Foram utilizados métodos tradicionais de morfologia para comparação dos exemplares, além de técnicas de identificação molecular utilizando o gene mitocondrial citocromo oxidase I (COI). Testes para a amplificação da região controle do DNA mitocondrial de U. brasiliensis foram realizados e discutidos. / Urophycis Gill, 1863 is a genus of marine, demersal, mid-sized fish, popularly known as codlings or hakes, and distributed along the the Western Atlantic coast, from Canada to Argentina. Seven species are currently recognized as valid within this genus. Despite its economical importance, a few taxomomic an biogeographic studies had been carried out with those species. Three species were described from western South Atlantic: U. brasiliensis (Kaup, 1858), described from Montevideo, Uruguay, U. latus Miranda Ribeiro, 1903 and Urophycis mystacea Miranda Ribeiro, 1903, both described from Rio de Janeiro, Brazil. Urophycis mystacea is morfologically similar to U. cirrata (Goode & Bean, 1896), described from Gulf of Mexico, USA, and these species are repeteadly confused. The objectives of this contributions were (1) redescribe U. brasilienis, placing U. latus as a junior synonym; (2) redescribe U. cirrata, placing U. mystacea as a junior synonym; (3) provide updated diagnosis and maps of distributions for both species. Tissues and specimens were obtained from fisherman and scientific collections. Traditional morphological methods were used to compare the specimens, besides molecular identification techniques using the mithocondrial gene citochrome c oxidadse I (COI). Testst for amplification of the DNA mitochondrial control region in U. brasiliensis were performed and discussed.

Desde o início do processo de africanização das abelhas Apis mellifera nas Américas em 1957, as abelhas africanizadas têm sido alvo de muitos estudos, sendo a variabilidade populacional um destes focos. Neste trabalho, populações Neotropicais de Apis mellifera do Brasil e do Panamá foram avaliadas quanto a sua variabilidade morfológica por morfometria tradicional, morfometria geométrica e pelo software de identificação automática de abelhas ABIS (Automatic Bee Identification System). Foram ainda avaliadas quanto à origem do DNA mitocondrial encontrado atualmente nas populações, bem como mudanças temporais nos perfis morfométricos e de DNA mitocondrial nas populações de Ribeirão Preto e do Panamá. Os resultados mostram que as populações brasileiras amostradas apresentam um gradiente de variação de tamanho, sendo que as abelhas do sul são significantemente maiores que as do norte do país, assim como as abelhas do princípio do processo de africanização em Ribeirão Preto e no Panamá são maiores que as populações atuais. Essas diferenças de tamanho podem refletir diferentes graus de mistura das populações ancestrais e também fatores ecológicos e ambientais. Entretanto, nenhuma correlação significante foi encontrada entre as medidas de tamanho de asa e altitude da localidade amostrada, fato este que nos indica que em nossas amostras, a variável altitude não interferiu no tamanho das asas das abelhas. No que diz respeito à variabilidade do formato das nervuras das asas das abelhas africanizadas, esta se mostra pequena e, apesar de distinto do formato de Apis mellifera scutellata, o formato das nervuras das abelhas africanizadas é mais parecido com o destas abelhas do que das demais subespécies formadoras do híbrido. O DNA mitocondrial das populações brasileiras de abelhas africanizadas apresentou-se quase que totalmente como sendo de origem africana à exceção de três colônias que apresentaram DNA mitocondrial como sendo de origem de subespécies do leste europeu. Quando a morfometria geométrica e o ABIS foram testado no quesito identificação populacional, ambos mostraram um desempenho muito fraco em identificar as populações de abelhas africanizadas, provavelmente devido ao alto fluxo gênico entre os grupos. Entretanto, quando tratamos de grupos mais distantes, como subespécies e populações isoladas, como é o caso da população de abelhas italianas (A. m. ligustica) de Fernando de Noronha, os dois métodos morfométricos se mostraram muito eficientes, com as taxas de acerto girando entre 85% e 100% na identificação de colônias de diferentes subespécies e da população de Fernando de Noronha. A população de Fernando de Noronha apresentou ainda um perfil morfométrico completamente diferenciado de Apis mellifera ligustica, subespécie que foi introduzida na ilha em 1984, podendo estas diferenças serem resultado de inbreeding, adaptação ambiental ou mesmo efeito gargalo das matrizes introduzidas. Desta maneira, as novas metodologias morfométricas utilizadas neste trabalho, embora não sejam precisas ou as mais apropriadas para identificar o grau de africanização das populações de abelhas africanizadas, se mostram muito promissoras no estudo da identificação das subespécies de Apis mellifera e mesmo de outras espécies de abelhas. / Since the release of the African bee Apis mellifera scutellata in Brazil in 1957, Africanized honey bees have been widely studied, though there are still unresolved questions about population variability. We examined the temporal and spatial variability of Apis mellifera populations from Brazil and Panama, using mitochondrial DNA, traditional morphometrics, geometric morphometrics and an Automatic Bee Identification System (ABIS). The populations from Ribeirão Preto, Brazil and Panamá were examined for temporal changes in their morphometric profiles and in mitochondrial DNA patterns. Bees from south Brazil were found to be significantly larger than those from the north and northeast. Bees collected at the beginning of the Africanization process were also found to be bigger than those collected recently. These differences in size may reflect different degrees of admixture of the founder subspecies and also environmental and ecological factors. No significant correlation was observed between the size of the wings and the altitude where the bees were sampled. When the patterns of wing venation were compared among the Africanized populations, we found little variation; though Africanized bees were found to be distinct from (African) A. m. scutellata, this group was most similar to the African pattern. The mtDNA of the Africanized populations was found to be almost completely of African origin, except for three of 394 colonies, which had the east European pattern. This nearly complete displacement may have been caused by nest usurpation by Africanized bees or due to a competitive disadvantage of hybrids with European maternity. We did not get good discrimination or identifications of the populations with ABIS and geometric morphometrics, probably due to the high rates of gene flow among the groups. However, when tested in more distinct groups, for example, subspecies and isolated populations, such as the Italian bees on Fernando de Noronha island, these two methods were very efficient, with identification rates of around 85% and 100%, respectively. The population of Italian bees (A.m. ligustica) on Fernando de Noronha presented a morphometric profile very different from that of A. m. ligustica, the subspecies introduced to the island in 1984. These differences could be a result of inbreeding, environmental adaptations or bottleneck effects. The two new morphometric methodologies, though they did not provide good discrimination of the Africanized populations, are very promising for studies of Apis mellifera subspecies and for identification of other bee species.

Mitocôndrias desempenham um papel central na homeostase celular. Estas organelas se diferem das demais não só por suas múltiplas funções, mas por terem seu próprio genoma, distinto do genoma nuclear. Estas organelas também participam de mecanismos de morte celular de forma central nos três mecanismos mais conhecidos: apoptose, necrose e autofagia. O mtDNA está localizado na face interna da membrana mitocondrial, onde são geradas grandes quantidades de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Em consequência, o mtDNA acumula modificações oxidativas, mesmo em condições normais de metabolismo. Entretanto as respostas celulares ao acúmulo de lesões no mtDNA ainda não são claras. Para investigarmos se lesões oxidativas no mtDNA causam morte celular, propomos um modelo no qual oxigênio singlete é gerado especificamente na mitocôndria, pela ação de fotossensibilizadores com diferentes localizações celulares (azul de metileno, AM, e cristal violeta, CV, citosólicos; Ro 19-8022, Ro, citosólico e nuclear). Mostramos, por microscopia confocal, que os corantes tem a localização esperada em células HeLa. Além disso, observamos que o AM gera oxigênio singlete proporcionalmente a concentração do corante e dose de fotoativação. Mostramos que células tratadas com os corantes diminuem a velocidade de duplicação 24 h após o tratamento, que resulta em morte celular. Para AM e Ro, estes efeitos foram proporcionais à concentração de corante e da dose de fotoativação. Por outro lado, CV apresentou uma alta toxicidade mesmo no escuro. Mostramos que as células tratadas com AM não apresentam fragmentação internucleossômica de DNA, típica de apoptose após 24 h e não apresentam quebras de fita e formação de sítios abásicos logo após o tratamento. Finalmente mostramos que células com depleção do número de cópias de mtDNA são menos sensíveis ao tratamento com AM e igualmente sensíveis ao tratamento com Ro que células HeLa normais, indicando que lesões oxidativas ao mtDNA determinam a sensibilidade celular ao AM. / Mitochondria play a central role in cell homeostasis. They differ from other subcellular structures not only due to their many functions but also because they have their own genome. Moreover, mitochondria also play a central role in cell death, in apoptosis, necrosis as well as autophagy. The mitochondrial DNA sits at the inner side of the inner mitochondrial membrane, where most of reactive oxygen species are generated, and in fact, mtDNA accumulates oxidative damage under normal physiological conditions. However, cellular responses to mtDNA damage are not clearly understood. In order to ascertain whether mtDNA damage induces cell death, we established a cellular model in which oxidative stress is induced exclusively in mitochondria, by using two photosensitizers that localize in the cytosol (methylene blue, MB and crystal violet, CV) and comparing to another one with diffuse distribution (Ro 19-8022, Ro). These molecules generate singlet oxygen locally upon photoactivation. Using confocal fluorescence microscopy we confirmed the cellular localization of the dyes, and found that. MB generates singlet oxygen in cells in a dose- and light-dependent fashion. Treatment with the dyes induced dose-dependent cell proliferation inhibition and cell death. The cytotoxic effects of MB and Ro were completely dependent on light-activation whereas CV induced cell death in the dark. We found that under these conditions, MB treatment did not induce internucleosomal DNA fragmentation or non-nucleosomic fragmentation, as we did not observe comet formation. These results indicate absence of nuclear DNA damage. On the other hand, cells depleted of mtDNA showed decreased sensitivity to MB but not to RO, indicating that mtDNA damage plays a key role in inducing cell death under these experimental conditions.

O objetivo do presente estudo foi caracterizar a estrutura genética populacional de duas espécies de araras: Ara chloropterus e Ara macao. Foram analisadas amostras de sangue e penas de diferentes regiões no Brasil, de uma localidade na Bolívia e outra no Peru. Foram realizadas análises com DNA mitocondrial (região controladora e citocromo oxidase I) e nuclear (microssatélites) das duas espécies. Para A. chloropterus foram obtidos 2166 pares de base do DNA mitocondrial de 89 amostras e dados de seis locos de microssatélites de 95 amostras. A rede de haplótipos e a árvore de neighbor-joining construídas com dados mitocondriais e os índices de FST obtidos com os dois marcadores revelaram fraca estruturação genética. Isso pode ser devido a alto fluxo gênico apresentado ou retenção de polimorfismo ancestral. Portanto, a espécie parece se organizar em metapopulações (baixa estruturação genética e alto fluxo gênico). Nesse caso, seria interessante conservar indivíduos de diversas localidades e seus corredores. Para Muscular Dystrophy foram obtidos 2094 pares de base do DNA mitocondrial de 68 amostras e dados de sete locos de microssatélites de 64 amostras. A rede de haplótipos e a árvore de neighbor-joining construídas com dados mitocondriais e os índices de FST obtidos com os dois marcadores indicam ausência de diferenciação genética entre as localidades estudadas. A análise demográfica dessa espécie indica expansão populacional há pouco mais de 50.000 anos atrás e declínio populacional desde o último período máximo de glaciação. Estes resultados sugerem que essa espécie é constituída de uma única grande população que poderia ser considerada como uma única unidade de manejo caso outras diferenças (ex.: adaptações ecológicas locais) não sejam encontradas. Ambas as espécies estudadas apresentam alta diversidade genética, possivelmente devido a um intenso fluxo gênico dentro de cada uma. / The present study aimed to characterize the population genetic structure of two macaw species: Ara chloropterus and Ara macao. Samples from various localities in Brazil, one in Bolivia and another in Peru were analyzed. Mitochondrial (control region and cytochrome oxidase I) and nuclear (microsatellites) DNA were analyzed. For A. chloropterus 89 individuals had 2166 bp of mitochondrial DNA sequenced and 95 individuals were genotyped for six polymorphic microsatellite loci. Network and the neighbor-joining tree constructed based on mitochondrial data and FST values obtained with both molecular markers revealed weak genetic structure. This can be due to high gene flow or retained ancestral polymorphism. Thus, A. chloropterus seems to be organized in metapopulations (low genetic structure and high gene flow). Under this scenario, it would be desirable to preserve individuals from various locations and there corridors. For Muscular Dystrophy we obtained 2094 bp of mitochondrial DNA for 68 individuals and data on seven microsatellites for 64 individuals. The haplotype network and the neighbor-joining tree constructed based on mitochondrial data and FST values obtained with both molecular markers revealed no genetic differentiation among localities. The demographic analysis of this species indicated a population expansion 50,000 years ago and a population decline since the last glaciation maximum. These results suggest that this species is organized as a large population that could be considered as a single management unit for conservation purposes if other differences are not found (eg. local ecological adaptations). Both species have high genetic diversity, possibly due to extensive gene flow within each one.

O diabetes mellitus (DM) está associado a diversas complicações micro e macrovasculares diretamente relacionadas a doenças cardiovasculares. A prolongada exposição à hiperglicemia e a resistência a insulina são considerados os principais fatores envolvidos nestas complicações, as quais são exacerbadas pela disfunção endotelial. Mediadores inflamatórios contribuem potencialmente para o desenvolvimento de disfunção endotelial pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, por sua vez, estimulam a transcrição de fatores pró- inflamatórios. Receptores específicos, como os NLRs (NOD-like receptors, receptores do tipo NOD) contribuem para instalação de processo inflamatório pela ativação do complexo inflamassoma. Este regula a ativação da caspase-1 e o processamento proteolítico dos precursores pró-IL-1? e pró-IL-18 nas citocinas maduras. Diversos mediadores podem ativar o inflamassoma NLRP3 como, por exemplo, EROs e DNA mitocondrial. Pouco é conhecido sobre o envolvimento de receptores NLRP3 e DNA mitocondrial na disfunção endotelial associada ao diabetes. Testamos a hipótese que a deficiência genética do receptor NLRP3 confere resistência à ativação de processo inflamatório na vasculatura de animais com diabetes tipo 1 (DM1) e, ainda, que DNA mitocondrial contribui para a ativação vascular do inflamassoma NLRP3 e para disfunção endotelial. Foram utilizados camundongos C57Bl/6 e deficientes para NLRP3, os quais foram tratados com veículo ou submetidos a protocolo para indução de DM1 com estreptozotocina. Parâmetros vasculares funcionais foram determinados em artérias mesentéricas de resistência. Células de músculo liso vascular (CMLV) e endoteliais foram utilizadas para avaliação da ativação do inflamassoma NLRP3 por DNA mitocondrial. A geração de EROs foi avaliada pela fluorescência para o dihidroetídio e pela quimiluminescência para lucigenina. A ativação de caspase-1 e IL-1? foi avaliada por western blot e o influxo de cálcio, por fluorescência. DNA mitocondrial foi avaliado pela expressão gênica de componentes da mitocôndria. O diabetes reduziu a vasodilatação dependente de endotélio, o que não ocorreu em artérias de animais deficientes de NLRP3. Animais diabéticos apresentaram aumento da expressão vascular do receptor NLRP3, da ativação de caspase-1 eIL-1? e da geração de EROs e peróxido de hidrogênio no leito mesentérico, eventos que ocorreram em menor intensidade em camundongos deficientes de NLRP3. Houve redução na expressão proteica vascular de Nox4 (NADPH oxidase 4), bem como na expressão gênica da molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1) em animais deficientes de NLRP3. Houve aumento da liberação de DNA mitocondrial citosólico no pâncreas de animais diabéticos. A incubação com o DNA mitocondrial extraído do pâncreas de animais diabéticos promoveu ativação do inflamassoma em CMLV provenientes de animais C57Bl/6, mas não em CMLV provenientes de animais deficientes de NLRP3. Esta ativação foi associada ao aumento de EROs e influxo de cálcio. Essa mesma ativação também foi observada em células endoteliais. DNA mitocondrial de camundongos diabéticos também reduziu a dilatação dependente do endotélio em artérias mesentéricas, o que foi associado à geração de EROs e ativação do inflamassoma NLRP3. Pacientes diabéticos apresentaram aumento do DNA mitocondrial circulante e ativação de caspase-1 e IL-1? no soro. Os resultados demonstram que o DNA mitocondrial pancreático de animais diabéticos promove ativação, em CMLV e células endoteliais, do inflamassoma NLRP3 através do aumento no influxo de cálcio e da geração de EROs, contribuindo para o processo de disfunção endotelial. A deficiência de NLRP3 protege os animais diabéticos contra os danos vasculares inflamatórios e disfunção endotelial. / Diabetes mellitus (DM) is associated with several micro and macrovascular complications directly related to cardiovascular diseases. Prolonged exposure to hyperglycemia and insulin resistance are considered the main factors involved in these complications, which are exacerbated by endothelial dysfunction. Inflammatory mediators potentially contribute to the development of endothelial dysfunction by the generation of reactive oxygen species (ROS), which, in turn, stimulate the transcription of pro-inflammatory factors. Specific receptors such as NLRs (NOD-like receptors) contribute to the onset of inflammatory processes by the activation of a multiprotein complex called inflammasome. The NLRP3 inflammasome regulates the activation of caspase-1 and the proteolytic processing of pro-IL-1? and pro-IL-18 precursors into mature cytokines. Several mediators, such as ROS and mitochondrial DNA activate the NLRP3 inflammasome. Considering that it is not clear whether NLRP3 and mitochondrial DNA contribute to diabetes-associated endothelial dysfunction, we hypothesized that the genetic deficiency of the NLRP3 confers resistance to vascular inflammatory processes in animals with type 1 diabetes (T1D) and that mitochondrial DNA contributes to vascular activation of NLRP3 inflammasome and endothelial dysfunction. C57B1/6 and NLRP3 knockout mice were treated with vehicle or streptozotocin to induce T1D. Functional vascular parameters were determined in resistance mesenteric arteries. Cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) and endothelial cells were used to determine NLRP3 inflammasome activation by mitochondrial DNA. ROS generation was evaluated by dihydroethidium fluorescence and by chemiluminescence for lucigenin. Caspase-1 and IL-1? activation was evaluated by western blot. Calcium influx was determined by fluorescence and mitochondrial DNA by mRNA expression of mitochondrial components. Diabetes reduced endothelium-dependent vasodilation in C57B1/6, but not in NLRP3 knockout mice. Diabetic mice presented increased vascular NLRP3 receptor expression, increased caspase-1 and IL-1? activation, as well as ROS and hydrogen peroxide generation, events that were mildly observed in NLRP3 knockout mice. There was a reduction in the vascular protein expression of Nox4 (NADPH oxidase 4) as wellas in the gene expression of VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) and ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) in NLRP3 knockout animals. There was an increase in cytosolic mitochondrial DNA release in pancreas from diabetic animals. Mitochondrial DNA from the pancreas of diabetic mice induced NLRP3 inflammasome activation in VSMC from C57B1/6 mice, but not in VSMC from NLRP3 knockout mice. This activation was associated with increased levels of ROS and calcium influx and was also detected in endothelial cells. Mitochondrial DNA from diabetic mice also decreased endothelium-dependent dilation in mesenteric arteries, which was associated with ROS generation and NLRP3 inflammasome activation. Diabetic patients exhibited increased serum mitochondrial DNA and caspase-1 and IL-1? activation. The results demonstrate that pancreatic mitochondrial DNA from diabetic mice activates the NLRP3 inflammasome in VSMC and endothelial cells by increasing calcium influx and ROS generation, contributing to endothelial dysfunction. NLRP3 deficiency prevents diabetes-related vascular inflammatory damage and endothelial dysfunction.

Introdução: A endometriose afeta 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva e há evidências crescentes de que o estresse oxidativo está envolvido na sua patogênese. Os polimorfismos na região controladora do DNA mitocondrial podem levar à replicação e à transcrição alterada dos genes mitocondriais, o que pode afetar a função mitocondrial e, consequentemente, a geração intracelular de espécies reativas de oxigênio. Descobertas recentes indicam que os polimorfismos do DNA mitocondrial (mtDNA) estão relacionados à endometriose em populações coreana e indiana. Objetivo: Avaliar a associação entre polimorfismos e haplogrupos do DNA mitocondrial e a presença de endometriose em mulheres brasileiras. Métodos: Pacientes com idade entre 18 e 50 anos foram divididas nos grupos endometriose (n = 90) e controle (n = 92). O primeiro grupo incluiu mulheres com diagnóstico histológico de endometriose e estadiamento cirúrgico, enquanto o segundo grupo incluiu pacientes submetidas à cirurgia para laqueadura tubária, leiomioma ou cistos ovarianos benignos, sem evidência de endometriose. O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue periférico seguido do sequenciamento de Sanger e eletroforese capilar. Os polimorfismos foram determinados comparando as sequências obtidas com a Sequência padrão de Cambridge Revisada. Resultados: As frequências dos polimorfismos T16217C (14,4% vs. 5,4%; p = 0,049), G499A (13,3% vs. 4,3%; p = 0,038), T236C (5,6% vs. 0%; p = 0,028) e G185A (6,7% vs. 0%; p = 0.013) foram maior no grupo endometriose em comparação ao grupo controle, respectivamente, enquanto as frequências dos polimorfismos T146C (18,9% vs 32,6%; p = 0,042) e 573.2C (5,6% vs. 29,3%; p < 0.001) foram menores. A distribuição dos haplogrupos foi semelhante entre os grupos endometriose e controle. Nenhuma diferença foi observada nos haplogrupos de acordo com o estádio ou localização da doença. Conclusão: Os polimorfismos T16217C, G499A, T236C e G185A do DNA mitocondrial foram relacionados à presença de endometriose, enquanto T146C e 573.2C foram relacionados à ausência de doença, em amostra de mulheres brasileiras. Não foram observadas diferenças significativas entre os haplogrupos mitocondriais / Background: There is increasing evidence that oxidative stress is a major factor in the pathogenesis of endometriosis, a prevalent disease that affects 5-15% of reproductive-aged women worldwide. Polymorphisms in the control region of mitochondrial DNA (mtDNA) can lead to the altered replication and transcription of mitochondrial genes, thereby affecting both overall mitochondrial function, and the intracellular generation of reactive oxygen species. Objective: The present study investigated whether the incidence of mtDNA polymorphisms and/or haplogroups is associated with endometriosis in a Brazilian population. Methods: Female patients (aged 18-50 years) were enrolled in the present study, and assigned to either endometriosis (n = 90) or control (n = 92) group. The former group comprised patients who had received a histological diagnosis of endometriosis and had been assigned a surgical stage, while the latter comprised patients who had undergone gynecological surgery for tubal ligation, leiomyoma, or ovarian cysts, and showed no evidence of endometriosis. DNA was extracted from peripheral blood samples, and then subjected to Sanger sequencing and capillary electrophoresis. Polymorphisms were identified by comparing the isolated mtDNA sequences with the revised Cambridge Reference Sequence. Results: The frequency of some identified polymorphisms was found to be higher in the endometriosis group than in the control group, including polymorphisms T16217C (found in 14.4% and 5.4% of endometriosis- and control-group members, respectively; p=0.049), G499A (13.3% vs. 4.3%; p=0.038), T236C (5.6% vs. 0%; p=0.028), and G185A (6.7% vs. 0%; p=0.013). In contrast, polymorphisms T146C (18.9% vs. 32.6%; p=0.042) and 573.2C (5.6% vs. 29.3%; p < 0.001) were found to occur at a lower frequency in the endometriosis compared to the control group. Observed haplogroup frequencies were similar between the endometriosis and control groups, and did not appear to be affected by either disease location and/or staging. Conclusion: mtDNA polymorphisms T16217C, G499A, T236C, and G185A were found to be associated with endometriosis, while conversely, T146C and 573.2C were shown to be associated with an absence of disease in the analyzed Brazilian population. No significant differences were observed between the mitochondrial haplogroups of patients with, versus without endometriosis

O objetivo desse estudo foi avaliar se a baixa fertilidade de vacas Holandesas repetidoras de serviço [RS; comparativamente a novilhas (NOV) e vacas próximas ao pico de lactação (PL)] está associada com comprometimento da qualidade oocitária e se esta condição é agravada pelo estresse térmico. Fêmeas das três categorias foram tratadas com o mesmo protocolo de sincronização da emergência de onda folicular. Cinco dias após o início do protocolo, a ovum pick-up (OPU) foi realizada e foram avaliados (Capítulo; Cap. 1) o número de folículos ovarianos, de oócitos totais e viáveis, temperatura retal (TR), temperatura de superfície cutânea (TC) e frequência respiratória (FR). Os oócitos viáveis foram utilizados para a produção in vitro de embriões (Cap. 2) e avaliações biomoleculares (Cap. 3). No Cap. 2, foram avaliados o desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, de blastocisto e de eclosão) e a qualidade dos embriões produzidos (número de células e frequência de núcleos fragmentados). No Cap. 3, realizou-se a extração de RNA e DNA de parte dos oócitos coletados para a quantificação relativa e absoluta de DNA mitocondrial (mtDNA) e a avaliação da expressão de genes relacionados à replicação/transcrição do mtDNA (PPARGC1A, NRF1, POLG, POLG2, TFAM e MT-CO1), à apoptose (BAX, BCL2 e ITM2B) e ao estresse térmico (HSP90AA1 e HSPA1AB). No Cap. 4, a taxa de concepção após IATF foi avaliada em ambas as estações do ano e nas três categorias quando o mesmo protocolo de sincronização para IATF e a mesma partida de sêmen foram utilizados. No Cap. 1, vacas RS e PL aumentaram sua FR e TR no verão em relação ao inverno (P<0,0001), enquanto as NOV mantiveram essas variáveis constantes em ambas as estações. Nas três categorias houve aumento (P<0,0001) da TC no verão, mas esta sempre foi superior (P<0,001) em vacas RS e PL do que nas NOV, independente da estação. O número de folículos e de oócitos totais e viáveis declinou nas RS e PL durante o verão, mantendo-se semelhante em NOV em ambas as estações. No Cap. 2, a taxa de clivagem foi semelhante entre categorias e estações. Já a taxa de blastocisto foi reduzida no verão nas três categorias, sendo essa queda mais acentuada nas RS. A taxa de eclosão e o número de células dos blastocistos foram menores no verão (independente de categoria). Menor número de células foi observado em embriões de RS e PL (independente da estação). Além disso, a porcentagem de núcleos fragmentados foi maior nos blastocistos das RS no verão. No Cap. 3, a expressão de ITM2B e BAX foi maior em RS durante o verão. Ainda, detectaram-se indícios da ativação de mecanismos pró-apoptóticos nos oócitos de RS (maior relação BAX/BCL-2) comparadas a PL e de mecanismos compensatórios da deficiência da função mitocondrial (menor conteúdo de mtDNA e maior expressão de PPARGCC1, NRF1, TFAM, POLG e POLG2) nas RS durante o verão em relação as demais categorias. No Cap. 4, menor taxa de concepção foi observada em RS e durante o verão. Os resultados geram evidências de que o baixo desempenho reprodutivo de vacas RS durante o verão deva estar relacionado ao comprometimento da qualidade de seus oócitos, demonstrado pelo seu reduzido conteúdo de mtDNA e elevada expressão de genes relacionados a replicação/transcrição do mtDNA, apoptose e síntese de chaperonas, culminado em baixa taxa de blastocisto e alta fragmentação nuclear destes. / The aims of the present study were to evaluate whether lower fertility of repeat-breeder (RB) Holstein cows [compared to peak lactation cows (PL) and heifers (H)] is associated with oocyte quality and whether this condition is aggravated by summer heat stress. Females of the three categories were treated with same protocol for synchronization of follicular wave emergence during summer and winter. Five days after the protocol onset, the ovum pick-up (OPU) was performed. The following variables were evaluated in Chapter 1: number of ovarian follicles before OPU, number of total and viable oocytes, rectal temperature (RT), cutaneous temperature (CT) and respiration rate (RR). Viable oocytes were sent forThe aims of the present study were to evaluate whether lower fertility of repeat-breeder (RB) Holstein cows [compared to peak lactation cows (PL) and heifers (H)] is associated with oocyte quality and whether this condition is aggravated by summer heat stress. Females of the three categories were treated with same protocol for synchronization of follicular wave emergence during summer and winter. Five days after the protocol onset, the ovum pick-up (OPU) was performed. The following variables were evaluated in Chapter 1: number of ovarian follicles before OPU, number of total and viable oocytes, rectal temperature (RT), cutaneous temperature (CT) and respiration rate (RR). Viable oocytes were sent for in vitro embryo production (Chapter 2) and bimolecular evaluation (Chapter 3). In Chapter 2, embryo development (rates of cleavage, blastocyst and hatching) and quality (total number of nuclei and frequency of nuclear fragmentation) were assessed. In Chapter 3, part of the oocytes were subjected to DNA and RNA extraction to allow relative and absolute quantification of mitochondrial DNA (mtDNA), and the evaluation of the expression of genes related to mtDNA replication/transcription (PPARGC1A, NRF1, POLG, POLG2, TFAM and MT-CO1), apoptosis (BAX, BCL2 and ITM2B) and heat stress (HSP90AA1 e HSPA1AB). In Chapter 4, RB, PL and H were subjected to same protocol for fixed-time AI using the same batch of semen of a single sire in order to evaluate their P/AI during summer and winter. In Chapter 1, RB and PL had increased (P<0.0001) RR and RT during summer compared to winter; while H maintained similar RR and RT in both seasons. CT was greater (P<0.0001) during summer than winter in all categories, but it was always higher (P<0.001) in RB and PL than H, regardless of season. The numbers of follicles and total and viable oocytes were lower in RB and PL during summer than winter, and maintained stable in H in both seasons. In Chapter 2, cleavage rate was similar among categories and between seasons. However, blastocyst rate was invariably reduced during summer, but more pronouced in RB. Hatching rate and the total number of nuclei were decreased during summer, regardless of category. Lower number of nuclei was observed in RB and PL embryos compared to H, regardless of the season. Furthermore, the percentage of fragmented nuclei was greater in RB blastocysts during the summer. In Chapter 3, expressions of ITM2B and BAX were greater in RB oocytes collected during summer. Also, the activation of pro-apoptotic mechanisms (greater BAX/BCL2 ratio) was suggested in RB heat stressed-oocytes compared with PL. Activation of compensatory mechanisms of deficient mitochondrial function (low number of copies of mtDNA and increased expression of PPARGCC1, NRF1, TFAM, POLG and POLG2) were also observed in RB heat stressed-oocytes compared with PL and H. In Charpter 4, lower P/AI was observed in RB and under summer heat stress. These data provide evidences that the lower reproduction performance observed in RB during heat stress may be due to impaired oocyte quality, as shown by their reduced mtDNA content and upregulation of several genes related to mtDNA replication/transcription, apoptosis and chaperones synthesis, resulting in lower blastocyst rate and higher nuclear fragmentation of embryos.