Mitocôndrias desempenham um papel central na homeostase celular. Estas organelas se diferem das demais não só por suas múltiplas funções, mas por terem seu próprio genoma, distinto do genoma nuclear. Estas organelas também participam de mecanismos de morte celular de forma central nos três mecanismos mais conhecidos: apoptose, necrose e autofagia. O mtDNA está localizado na face interna da membrana mitocondrial, onde são geradas grandes quantidades de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Em consequência, o mtDNA acumula modificações oxidativas, mesmo em condições normais de metabolismo. Entretanto as respostas celulares ao acúmulo de lesões no mtDNA ainda não são claras. Para investigarmos se lesões oxidativas no mtDNA causam morte celular, propomos um modelo no qual oxigênio singlete é gerado especificamente na mitocôndria, pela ação de fotossensibilizadores com diferentes localizações celulares (azul de metileno, AM, e cristal violeta, CV, citosólicos; Ro 19-8022, Ro, citosólico e nuclear). Mostramos, por microscopia confocal, que os corantes tem a localização esperada em células HeLa. Além disso, observamos que o AM gera oxigênio singlete proporcionalmente a concentração do corante e dose de fotoativação. Mostramos que células tratadas com os corantes diminuem a velocidade de duplicação 24 h após o tratamento, que resulta em morte celular. Para AM e Ro, estes efeitos foram proporcionais à concentração de corante e da dose de fotoativação. Por outro lado, CV apresentou uma alta toxicidade mesmo no escuro. Mostramos que as células tratadas com AM não apresentam fragmentação internucleossômica de DNA, típica de apoptose após 24 h e não apresentam quebras de fita e formação de sítios abásicos logo após o tratamento. Finalmente mostramos que células com depleção do número de cópias de mtDNA são menos sensíveis ao tratamento com AM e igualmente sensíveis ao tratamento com Ro que células HeLa normais, indicando que lesões oxidativas ao mtDNA determinam a sensibilidade celular ao AM. / Mitochondria play a central role in cell homeostasis. They differ from other subcellular structures not only due to their many functions but also because they have their own genome. Moreover, mitochondria also play a central role in cell death, in apoptosis, necrosis as well as autophagy. The mitochondrial DNA sits at the inner side of the inner mitochondrial membrane, where most of reactive oxygen species are generated, and in fact, mtDNA accumulates oxidative damage under normal physiological conditions. However, cellular responses to mtDNA damage are not clearly understood. In order to ascertain whether mtDNA damage induces cell death, we established a cellular model in which oxidative stress is induced exclusively in mitochondria, by using two photosensitizers that localize in the cytosol (methylene blue, MB and crystal violet, CV) and comparing to another one with diffuse distribution (Ro 19-8022, Ro). These molecules generate singlet oxygen locally upon photoactivation. Using confocal fluorescence microscopy we confirmed the cellular localization of the dyes, and found that. MB generates singlet oxygen in cells in a dose- and light-dependent fashion. Treatment with the dyes induced dose-dependent cell proliferation inhibition and cell death. The cytotoxic effects of MB and Ro were completely dependent on light-activation whereas CV induced cell death in the dark. We found that under these conditions, MB treatment did not induce internucleosomal DNA fragmentation or non-nucleosomic fragmentation, as we did not observe comet formation. These results indicate absence of nuclear DNA damage. On the other hand, cells depleted of mtDNA showed decreased sensitivity to MB but not to RO, indicating that mtDNA damage plays a key role in inducing cell death under these experimental conditions.

O envelhecimento da população mundial no último século elevou significativamente o número de casos da doença de Alzheimer (DA), bem como os custos para os sistemas de saúde pública. Apesar de avanços significativos no entendimento da fisiopatologia da doença, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que desencadeiam a perda de memória e a morte neuronal. Resultados recentes sugerem que o acúmulo de bases oxidadas no DNA mitocondrial e alterações nas vias que removem essas lesões desempenham um papel importante na morte neuronal observada em DA. A maioria das lesões em DNA induzidas oxidativamente são removidas pela via de reparo por excisão de bases (BER, do inglês Base Excision Repair). Resultados da literatura mostraram que a atividade da via BER está reduzida no lóbulo parietal e no cerebelo de pacientes com DA, quando comparadas com amostras de indivíduos com cognição normal da mesma faixa etária. Entretanto, esse trabalho mediu a atividade de BER apenas em extratos celulares totais. No presente estudo, foram medidas as atividades de BER em extratos mitocondriais de cérebros de indivíduos com DA, uma vez que lesões no DNA mitocondrial acumulam mais significativamente nos pacientes. Para testar a hipótese que alterações em BER mitocondrial estão associadas ao desenvolvimento da doença, foram analisadas atividades de BER em mitocôndrias em duas regiões cerebrais de indivíduos normais, indivíduos com DA e um grupo de indivíduos que apresentam alterações neuropatológicas de DA (agregados proteicos), porém que se mantiveram cognitivamente normais, nomeados DA assintomático. A atividade da enzima AP endonuclease apresentou-se elevada no cerebelo do grupo DA assintomático, enquanto que não apresentou variação no córtex temporal. Esses resultados sugerem que a preservação de APE1 no grupo DA assintomático pode exercer um papel protetor às lesões neuropatológicas, bem como indicar que as regiões cerebrais apresentam suscetibilidade distinta aos danos. Já a atividade de uracil DNA glicosilase está reduzida no cerebelo tanto em indivíduos com DA quanto com DA assintomático, quando comparados ao grupo controle, enquanto que, no córtex temporal, a redução é verificada somente no grupo DA. Além disso, observou-se que a atividade de UDG e o critério Braak apresentam uma correlação negativa. Os resultados referentes à enzima UDG sugerem que a redução da sua atividade compromete a viabilidade neuronal tornando as células mais propensas às lesões da DA. Assim, o comprometimento da via BER em mitocôndriais de cérebros humanos pode contribuir para os eventos moleculares que ocasionam a morte neuronal associada ao desenvolvimento de DA. / The number of Alzheimer\'s disease cases (AD) has increased steadly over the last century, paralleling a sharp rise in mean Iife expectancy. Consequently, AD- associated public health costs have also increased. Despite several important findings in AD physiopathology, a clear understanding of the molecular events leading to memory loss and neuronal death is still lacking. Recent results show that oxidized DNA lesions accumulate in mitochondrial DNA in neurodegenerative diseases, including AD. Moreover, alterations in DNA repair may also play a causative role in neuronal death. Most oxidized lesions are repaired by the Base Excision Repair (BER) pathway. It has been recently shown that BER activities are reduced in whole cell extracts from parietal lobule and cerebellum from AD patients, when compared with age-matched controls. As accumulation of oxidized bases is seen more prominently in mitochondrial DNA, here we investigated whether changes in BER activities in mitochondria are associated with the development of AD. Thus, we measured BER activities in mitochondria from two brain regions from age-matched normal individuais, AD patients and a group of individuais that show AD-like neuropathological alterations but remained cognitively normal, thus called asymptomatic AD. AP endonuclease activity is elevated in asymptomatic AD cerebellum, while not changed in temporal cortex. Theses results suggest that APE1 activity in asymptomatic AD may play a protective role against neuropatological lesions, and indicate that brain regions show different susceptibility to damage. On the other hand, uracil DNA glycosylase activity is reduced in cerebellum in both AD and asymptomatic individuais, when compared to controls. In temporal cortex, this reduction is observed only in AD group. In addition, UDG activity and Braak stage showed a significant negative correlation. These results indicate that decreased UDG activity may compromise neuronal viability, making the cells more prone to AD lesions. Thus, impairtment of BER in human brain mitochondria may contribute to the molecular events that cause neuronal death during the development of this disease.

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

O carcinoma renal de células claras é o tumor renal maligno mais frequentemente diagnosticado nos adultos. Uma série de defeitos genéticos tem sido observada no tecido tumoral renal e tais achados podem estar envolvidos na gênese ou progressão desses tumores. Alterações metabólicas e genéticas da mitocôndria são fatores que contribuem para muitas doenças humanas, incluindo o câncer. Objetivo: Estabelecer método para extração mitocondrial sem contaminação pelo DNA nuclear; verificar se existe contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs) no sequenciamento do genoma mitocondrial no carcinoma renal de células claras. Métodos: Para o estudo foram selecionados quatro pacientes portadores de carcinoma renal de células claras. Após a cirurgia obtivemos de cada paciente um fragmento de tumor e um fragmento de parênquima renal sem comprometimento neoplásico, as amostras de cada paciente foram extraídas de forma que ao final pudéssemos obter quatro amostras de DNA, sendo duas com isolamento da mitocôndria e duas sem o isolamento da mitocôndria. As amostras obtidas foram submetidas às seguintes análises genéticas: Sequenciamento completo do mtDNA; Reação em cadeia da polimerase para avaliação da contaminação do mtDNA obtido com isolamento da organela por DNA nuclear; avaliação do número de cópias do mtDNA (depleção) e patogenicidade das mutações. Resultados: Com os resultados obtidos neste estudo podemos afirmar que é possível a realização da extração do DNA mitocondrial sem a contaminação do genoma nuclear; e que o DNA mitocondrial extraído de maneira clássica do DNA total não apresentou contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs). / Clear cell renal carcinoma is the most frequently diagnosed malignant renal tumor in adults. A number of genetic defects have been observed in renal tumor tissue and such findings may be involved in the genesis or progression of these tumors. Metabolic and genetic changes in mitochondria are contributing factors to many human diseases, including cancer. Objective: To establish a method for mitochondrial extraction without nuclear DNA contamination; check for contamination by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs) in the sequencing of the mitochondrial genome in clear cell renal carcinoma. Methods: Four patients with clear cell renal carcinoma were selected for the study. After surgery, we obtained from each patient a tumor fragment and a renal parenchyma fragment without neoplastic involvement, the samples from each patient were extracted so that in the end we could obtain four DNA samples, two with mitochondrial isolation and two without the mitochondria isolation of mitochondria. The obtained samples were submitted to the following genetic analyzes: Complete sequencing of mtDNA; Polymerase chain reaction to evaluate the contamination of mtDNA obtained with organelle isolation by nuclear DNA; evaluation of mtDNA copy number (depletion) and pathogenicity of mutations. Results: With the results obtained in this study we can affirm that it is possible to perform mitochondrial DNA extraction without contamination of the nuclear genome; and that the mitochondrial DNA extracted from the classical DNA of the total DNA was not contaminated by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs).

As abelhas sem ferrão estão entre os animais mais importantes para o equilíbrio do meio ambiente, isso devido a fatores como sua enorme diversidade e principalmente por serem importantes polinizadores tanto de ecossistemas naturais como de agroecossistemas. A necessidade de identificação dos animais amostrados por especialistas é fundamental para estudos ecológicos. Neste trabalho foram feitas análises interespecíficas e intra-populacionais sobre os indivíduos do gênero Schwarziana a fim de aperfeiçoar a utilização da técnica de morfometria geométrica, que nos permite identificações baseadas apenas nos padrões de venação das asas desses insetos. Não obstante, foram realizadas também análises de sequenciamento de dois genes do DNA mitocondrial, o COI e o 16S. O gênero estudado foi Schwarziana, com duas espécies válidas, S. quadripunctata e S. mourei. Nas análises morfométricas, os testes realizados por indivíduos os testes de validação cruzada identificaram de forma correta 70% das amostras de um total de 10 localidades diferentes. Esta acurácia aumenta ainda mais à medida que novos grupos são formados, alcançando próximo de 85% quando separadas por regiões. Em todos os ensaios realizados com a morfometria geométrica (partial warps e coordenadas alinhadas) atingiu-se uma taxa de 100% de identificação correta entre as duas espécies e nos ensaios feitos com as médias das colônias esta taxa também foi atingida para a identificação de todas as populações amostradas. Os testes feitos com os partial warps mostraram-se mais eficazes em relação às coordenadas alinhadas, já que nestes últimos a tolerância mínima para a separação dos grupos não foi atingida em alguns ensaios. As análises moleculares apontaram 53 sítios polimórficos para o gene COI, com um índice de diversidade nucleotídica de 0,02180 e de diversidade haplotípica de 0,8854, separando as amostras em 9 haplótipos, porém a rede de haplótipos não foi suficientemente conclusiva. A diferenciação genética total medida pelo parâmetro Fst somente para as populações de S. quadripunctata foi de 0.9453 (P<0,05). Já para o gene 16S foram encontrados 14 sítios polimórfico e um índice de diversidade nucleotídica de 0,00649 e de diversidade haplotípica de 0,8419, com 7 haplótipos gerados. O parâmetro Fst para todas amostras foi de 0.9552 (P<0,05) e somente para as de S. quadripunctata foi de 0.8736 (P<0,05). Para ambos os genes os testes Fst par-a-par mostraram uma maior variação entre as populações dos estados, mostrando que estas populações estão estruturadas. Os testes de Mantel correlacionaram positivamente os dados morfométricos, geográficos e moleculares. Das duas metodologias aplicadas em nossa pesquisa, podemos afirmar que a morfometria mostrou-se extremamente eficiente na diferenciação das populações amostradas. As análises moleculares indicaram que estas populações estão estruturadas mesmo analisando poucas amostras. No entanto ao unirmos estas duas metodologias, combinamos a simplicidade e a rapidez da morfometria geométrica com a capacidade sempre inovadora de estudos moleculares, obtendo desta forma ferramentas eficazes para acessar a biodiversidade em Meliponini, inclusive para rastrear geograficamente espécimes a partir de estudos com indivíduos de sua área de distibuição natural. / Stingless bees are among the most important animals to the environmental balance, that due to their diversity and mainly because they are important pollinators of both natural and agro-ecosystems. The need for identification of sampled animals by experts is essential for ecological studies. In this work, intra and interspecific population analysis was performed in order to improve the technique of geometric morphometry, which allows us to access this biodiversity through identifications based on patterns of wing venation of these insects. We also sequenced two mitochondrial genes, the COI and 16S. Schwarziana Lepeletier 1836 was the gender studied with two valid species, S. quadripunctata and S. mourei. In morphometric analysis, cross-validation tests carried out by individuals correctly identified 70% of samples from a total of 10 different locations. This accuracy increases further as new groups are formed, according to geographic proximity, reaching around 85% when separated by regions. In all tests with geometric morphometry (partial warps and aligned coordinates) reached a rate of 100% correct identification between the two species and the tests made with the averages of the colonies that rate achieved the perfect identification of all populations sampled. Partial warps tests were more effective in relation to aligned coordinates ones, as these last a minimum tolerance for the separation of the groups was not achieved in some tests. Molecular analysis showed 53 polymorphic sites for the COI gene, with nucleotide diversity of 0.02180 and haplotype diversity of 0.8854, separating the samples into 9 haplotypes, but their network of haplotypes was not sufficiently conclusive. The total genetic differentiation measured by Fst parameter only for the populations of S. quadripunctata was 0.9453 (P <0.05). As for the gene 16S, we found 14 polymorphic sites and a nucleotide diversity of 0.00649 and haplotype diversity of 0.8419, with seven haplotypes generated. The parameter Fst for all samples was 0.9552 (P <0.05) and only for S.quadripunctata was 0.8736 (P <0.05). For both genes Fst pairwise tests showed greater variation among populations of the states, showing these groups as a genetic structure. Mantel tests were positively correlated for morphometric, geographical and molecular data. Of the two methodologies in our research, we can affirm that the morphometry proved to be extremely efficient in the differentiation of populations. Molecular analysis showed that populations are consistent, even that a low sample size is available. However combining these two methodologies, we have joined the simplicity and speed of geometric morphometric with the always innovative ability of molecular studies, thus achieving effective tools for accessing biodiversity in Meliponini, including a geographically trace for specimens by studying individuals from their natural range.

As doenças cardiovasculares lideram as causas de morte em vários países, inclusive no Brasil, sendo a insuficiência cardíaca (IC) uma das enfermidades mais frequentes. Estudos epidemiológicos e de genética têm demonstrado associações entre a origem étnica dos indivíduos e o desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares. O presente estudo teve como objetivo avaliar a relação entre haplogrupos mitocondriais e ancestralidade genômica no desenvolvimento da IC. Foram avaliados 503 pacientes com IC e 188 controles saudáveis. Os haplogrupos mitocondriais foram obtidos pela análise da região controle do DNA mitocondrial (mtDNA) e o estudo de ancestralidade genômica foi realizado pela análise de 48 marcadores autossômicos informativos de ancestralidade (AIMs) tipo INDEL. As análises estatísticas foram realizadas com o uso de regressão logística, construção de curvas de Kaplan-Meier e utilizando o método estatístico de log-rank (Mantel-Cox). Os resultados dos AIMs evidenciaram contribuições semelhantes de ancestralidade genômica entre os grupos de pacientes e controles, evidenciando a não estratificação populacional da amostra. A comparação dos haplogrupos mitocondriais entre os dois grupos revelou uma associação dos haplogrupos africanos com risco aumentado (p=0,015; OR 1,56) para o desenvolvimento da IC, enquanto que os haplogrupos ameríndios foi associado a um menor risco (p=0,043; OR 0,71). As análises realizadas apenas dentro do grupo de pacientes revelaram que 74,6% dos indivíduos se autodeclararam como brancos. As etiologias encontradas com maior frequência na nossa amostra foram a hipertensiva (28,6%) e a isquêmica (28,4%). A análise de mtDNA evidenciou que pacientes pertencentes aos haplogrupos africano apresentaram risco aumentado para o desenvolvimento da IC nas etiologias chagásica (p=0,012; OR 2,32) e hipertensiva (p=0,003; OR 2,05). Evidenciou também que pacientes dos haplogrupos africanos, principalmente da etiologia isquêmica, desenvolveram IC mais cedo que os demais, e que os pacientes com esses haplogrupos da etiologia valvar apresentaram maior sobrevida no período avaliado. A análise dos AIMs demonstrou que, na etiologia hipertensiva, a maior contribuição da ancestralidade genômica africana conferiu risco aumentado (p=0,002; OR 6,07), enquanto que a maior contribuição de ancestralidade genômica europeia conferiu risco diminuído (p=0,001; OR 0,16) para o desenvolvimento da IC; os pacientes com maior contribuição de ancestralidade genômica ameríndia apresentaram maior sobrevida no período de 4 anos. O uso de marcadores autossômicos e do DNA mitocondrial fornece estimativas mais precisas da ancestralidade de um indivíduo e/ou população, enquanto que a autodeclaração de cor de pele fornece indiretamente informações importantes sobre aspectos socioeconômicos e culturais. Assim, seria interessante a utilização, especialmente em populações miscigenadas, de uma construção tridimensional de análise, que poderia fornecer dados mais informativos e complementares em estudos de associação entre etnia e fenótipos e/ou doenças complexas / Cardiovascular diseases are the leading cause of death in many countries, including Brazil, being the heart failure (HF) one of the most common diseases. Epidemiological and genetic studies have shown associations between the ethnic origin of individuals and the development of various cardiovascular diseases. The aim of this study was to evaluate the relationship between mitochondrial haplogroups and genomic ancestry in the development of HF. We evaluated 503 patients with HF and 188 healthy controls. The mitochondrial haplogroups were obtained by analysing the control region of mitochondrial DNA (mtDNA) and the study of genomic ancestry was conducted by the analysis of 48 autosomal ancestry informative markers (AIMs) INDEL type. Statistical analyzes were performed using logistic regression, construction of the Kaplan-Meier and using the log-rank test (Mantel-Cox). The results of AIMs showed similar contributions of genomic ancestry among the patients and controls groups, indicating no population stratification of the sample. Comparing mitochondrial haplogroups between the groups, we observed that african haplogroups show increased risk (p=0.015, OR 1.56) of development of the HF, while ameridian haplogroup was associated with a reduced risk (p=0.043, OR 0.71). The analysis carried out only within the group of patients showed that 74.6% of individuals self-declared as white. The etiologies found with greater frequency in our sample were hypertension (28.6%) and ischemic (28.4%). Analysis of mtDNA showed that patients belonging to african haplogroup have increased risk of the development of HF in chagasic (p=0.012, OR 2.32) and hypertensive etiologies (p=0.003, OR 2.05). It also showed that patients of african haplogroups, specially of ischemic etiology, developed HF earlier than others, and the patients with this haplogroup of valvular etiology had better survival in the study period. AIMs analysis showed that in hypertensive etiology, the major contribution of african genomic ancestry conferred increased risk (p=0.002, OR 6.07), while the major contribution of european genomic ancestry conferred decreased risk (p=0.001, OR 0 16) to the development of HF; patients with higher contribution of amerindian genomic ancestry had better survival within 4 years. The use of autosomal markers and mtDNA provides more accurate estimates of ancestry of an individual and/or population, while the self-declared ethnicity, indirectly provides important information about socioeconomic and cultural aspects. Thus, it would be interesting to use, especially in admixed populations, the construction of a three-dimensional analysis, which could provide more informative and complementary data in studies of association between ethnicity and phenotypes and/or complex diseases

Mourella caerulea, popularmente conhecida como mirim-de-chão ou bieira, e Plebeia nigriceps, comumente chamada mirim nigriceps, são meliponíneos ocorrentes no sul do Brasil, polinizadores de plantas nativas e cultivadas. M. caerulea está principalmente relacionada ao bioma Pampa e seu hábito de nidificação é subterrâneo. P. nigriceps nidifica em frestas de rochas e muros, sendo encontrada tanto no Pampa como em Mata Atlântica. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade populacional destas duas espécies, através de três metodologias: a morfometria geométrica de asa, perfil de hidrocarbonetos cuticulares e sequenciamento de fragmentos de genes mitocondriais. Foram coletadas operárias de 24 colônias de M. caerulea em cinco localidades de sua distribuição natural e 53 colônias de P. nigriceps em oito localidades no estado do Rio Grande do Sul. Para análise do padrão de venação da asa, foram marcados 13 marcos anatômicos na asa anterior direita de cinco a 20 operárias por colônia. A análise genética foi realizada avaliando um fragmento do gene Citocromo Oxidase I em M. caerulea, e Citocromo B em P. nigriceps. A análise morfométrica demonstrou estruturação dos grupos com separação estatisticamente significativa (<0,0001) entre as localidades de M. caerulea. As distâncias morfométricas estão correlacionadas com a distância geográfica, e coerentes com regiões fisiográficas do bioma Pampa. A análise dos perfis de hidrocarbonetos distinguiu colônias de diferentes localidades, mas suas distâncias não apresentaram correlação com as distâncias geográficas. Foram encontrados seis haplótipos, todos exclusivos, com diversidade nucleotídica de 0,01631e uma diversidade haplotípica (Hd) de 0,74. Para P. nigriceps, as análises morfométricas apresentaram diferenças significativas entre localidades e correlação com as distâncias geográficas e biomas. A análise dos perfis de hidrocarbonetos distinguiu colônias de diferentes localidades, mas suas distâncias não apresentaram correlação com as distâncias geográficas. Foram encontrados 17 haplótipos, todos exclusivos, com diversidade nucleotídica de 0,0147 e diversidade haplotípica (Hd) de 0,94. A presença de diversos haplótipos exclusivos, perfis morfométricos e de hidrocarbonetos cuticulares em populações pertencentes a diferentes biomas indicam a necessidade de uma atenção especial para estas populações no momento da definição de estratégias de conservação das espécies. Uma especial atenção às abelhas da espécie Mourella caerulea, que além de ser uma espécie representante única de um gênero monoespecífico, apresenta grandes distâncias populacionais entre os indivíduos de todas as localidades amostradas. / Mourella caerulea and Plebeia nigriceps are two stingless bees with occurrence in the South region of Brazil. The first is commonly known as mirim-de-chão or bieira and the second is known as mirim nigriceps. Both species are important pollinators of native flora and crops. M. caerulea is related to Pampa biome and place nests on the ground. P. nigriceps occurs in both Pampa biome and Atlantic Rain Forest. This thesis had the objective of to evaluate the population variability of these species through three techniques: geometric morphometrics of wing, cuticular hydrocarbons (CHC) profiles and sequencing of fragments from mitochondrial DNA genes. We collected workers from 24 colonies for M. caerulea from five localities, and 53 colonies of P. nigriceps from eight localities in Rio Grande do Sul State. For the geometric morphometrics analysis, we used 13 landmarks plotted in the right forewing of five to 20 workers per nest. The fragments of mtDNA genes used for the molecular approach were from Cytochrome Oxidase I for M. caerulea and Cytochrome B for P. nigriceps. The morphometric approach discriminated the populations of M. caerulea from different localities (<0,0001). The morphometric distances are correlated to geographic distances and go along with the physiographic regions of Pampa biome. CHC profiles differentiated the colonies of M. caerulea from different localities, but chemical distances are not in agreement with geographic distances. We found six haplotypes (all exclusives) with a nucleotide diversity of 0.01631 and a haplotype diversity (Hd) of 0.74. For P. nigriceps, morphometric analysis was significant separating localities and in accordance with the geographic distances and biomes. CHC distinguished the colonies, but there was no significant correlation between this result and the geographic distances or biomes. mtDNA revealed 17 haplotypes (all exclusives) with a nucleotide diversity of 0.0147 and a haplotype diversity (Hd) of 0.94. The discovery of different exclusives haplotypes, the morphometric and CHC profiles when comparing population belonging to different biomes indicate that we need to give a particular attention for these species at the moment of create conservation strategies for both biomes from Rio Grande do Sul. M. caerulea deserves a special concern once it is the only species of the monospecific genera, and its populations are distant between themselves.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leonardo Mariano Reis.pdf: 8263558 bytes, checksum: d4842ddc6615e7587ee43da1794b8d63 (MD5) Previous issue date: 2013-03-18 / Abstract of the First Chapter Objective: The objective was to make a wide review of the literature about the genetic aspects of glaucoma, with a highlight at the works dealing with mitochondrial DNA. Methods: Bibliographical research was carried out accessing the sites Scopus, Science Direct, PubMed, Scirus, Scielo and Google. Books, theses and dissertations were also used at the research. Results: The works brought to evidence that there is a relation between certain polymorphisms in mitochondrial DNA and a higher loss of retinal ganglion cells, which leads to the development of Glaucoma, especially Primary Open Angle Glaucoma. Conclusion: Higher incidence of Primary Open Angle Glaucoma (POAG) in afro-descendants is justified by the mitochondrial haplotypes, since it was observed a higher susceptibility of POAG in individuals of the L haplogroups, who are exactly the ones of African origin. It could also justify, based on mitochondrial inheritance, the major incidence of POAG in the maternal lineages, more frequent than paternal inheritance. Abstract of the Second Chapter Objective: To quantify the volume of the scientific production about Primary Open Angle Glaucoma and Mitocohndrial DNA and assess which are the main institutions of research; verify the contribution of the authors that most published about the subject; list the main journals with their Impact Factor; compare the countries and other bibliometric results. Methods: Bibliographical research about mitochondrial DNA and Primary Open Angle Glaucoma was carried out accessing the site Scopus. Then, search with the keywords mitochondrial DNA and glaucoma in all fields for publications until august of 2012 was performed. Finally, data was tabulated and the descriptive statistics was done, with the principal data, as: authors that published about mitochondrial DNA and Primary Open Angle Glaucoma; journals that had works about the subject; Research Centers and Universities that most published; countries where the researchs were performed. Results: The works brought to evidence the influences of certain polymorphisms in mitochondrial DNA at the development of Primary Open Angle Glaucoma. Statistics showed that theese articles have increased in the last few years, though yet confined, mostly, to some centers of research and concentrated in selected researchers in ophthalmology of developed countries. In Brazil, we do not have any article published about the issue, yet. Conclusion: 98 works were listed, until august of 2012, carried out in 30 countries, with higher concentration in the United States and England, but also with contributions of the Arabic world: Qatar and Saudi Arabia. There were more publications in the following journals: Molecular Vision, Investigative Ophthalmology and Visual Science, Archives of Ophthalmology, British Journal of Ophthalmology, Experimental Eye Research, Journal of Glaucoma and Progress in Retinal and Eye Research. More studies about the subject must be encouraged, for they are extremely important to the elucidation of the genetic causes of glaucoma and for the development of new therapies aiming not only the reduction of intraocular pressure. / RESUMO DO CAPÍTULO I Objetivo: O objetivo foi fazer uma ampla revisão de toda a literatura sobre os aspectos genéticos do glaucoma, com enfoque nos trabalhos que envolvem pesquisa com DNA mitocondrial. Métodos: A pesquisa bibliográfica foi realizada por meio das bases de dados: Scopus, Science Direct, PubMed, Scirus, Scielo e pelo sítio de busca Google. Foi feito também levantamento através de livros, dissertações e teses. Resultados: Os trabalhos evidenciaram que há alguma correlação de determinadas linhagens de DNA mitocondrial com maior perda de células ganglionares da retina, o que acaba levando ao desenvolvimento do glaucoma propriamente dito, sobretudo do glaucoma primário de ângulo aberto. Conclusão: Explica-se a maior incidência de glaucoma primário de ângulo aberto em indivíduos afrodescendentes a partir de haplótipos mitocondriais, uma vez que houve maior susceptibilidade ao glaucoma primário de ângulo aberto em haplótipos pertencentes aos grupos L, que são justamente os de origem africana. Também poder-se-ia justificar, a partir da herança mitocondrial, a maior incidência de glaucoma primário de ângulo aberto quando a linhagem materna apresenta a doença, bem mais frequente do que a herança paterna. RESUMO DO CAPÍTULO II Objetivo: Quantificar o volume da produção científica que relaciona o DNA mitocondrial com o Glaucoma Primário de Ângulo Aberto e avaliar quais são as principais instituições; verificar a contribuição dos autores que mais produziram publicações sobre o assunto; listar os principais veículos com os respectivos Fatores de Impacto; comparar os países que mais fizeram trabalhos sobre o tema e outros resultados bibliométricos. Métodos: A pesquisa bibliográfica de trabalhos envolvendo DNA mitocondrial e Glaucoma Primário de Ângulo Aberto foi realizada por meio da base de dados do sítio Scopus. Foi feito o levantamento a partir das palavras-chaves Mitochondrial DNA e Glaucoma em todos os campos para publicações até agosto de 2012. Finalmente, realizada a tabulação dos dados obtidos e a estatística descritiva, com o principais dados como: autores que publicaram sobre o assunto DNA mitocondrial e glaucoma; revistas e outras publicações que tiveram trabalhos relacionados com o tema; Centros de Pesquisa e Universidades que mais publicaram e países onde foram realizados os estudos sobre DNA mitocondrial e glaucoma. Resultados: Os trabalhos evidenciaram a influência de determinados polimorfismos de DNA mitocondrial no desenvolvimento do Glaucoma Primário de Ângulo Aberto. A estatística mostrou que esses estudos têm aumentado sobremaneira ao longo dos últimos anos, mas ainda se encontram confinados, na maior parte, a alguns centros de pesquisa e concentrados em seletos grupos de autores na área da oftalmologia em países desenvolvidos. No Brasil, ainda não temos pesquisas publicadas sobre o assunto até o momento. Conclusão: Foram listados 98 trabalhos até agosto de 2012, realizados em 30 países, com maior concentração nos Estados Unidos e Inglaterra; mas também com contribuições do mundo árabe: Arábia Saudita e Catar. Esses estudos foram mais publicados nas revistas: Molecular Vision, Investigative Ophthalmology and Visual Science, Archives of Ophthalmology, British Journal of Ophthalmology, Experimental Eye Research, Journal of Glaucoma e Progress in Retinal and Eye Research. Mais estudos sobre o assunto devem ser encorajados pois são de fundamental importância para a elucidação das causas genéticas do glaucoma e para o desenvolvimento de novas terapias que não visem tão somente a diminuição da pressão intraocular.

INTRODUÇÃO: A forma clássica de encefalomiopatia mitocondrial associada à mutação do DNA mitocondrial m.3243A>G é a Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (síndrome de MELAS). Entretanto, o espectro de manifestações clínicas dos indivíduos que apresentam essa mutação é bastante amplo. OBJETIVO: Descrever o espectro clínico, laboratorial e de imagem de pacientes com doença mitocondrial decorrente da mutação m.3243A>G. MÉTODOS: Estudo descritivo retrospectivo de uma série de casos de pacientes com a mutação m.3243A>G em seguimento no ANEM/HCFMRP-USP. Os dados clínicos e informações sobre exames complementares foram coletados através de revisão sistemática dos prontuários médicos dos pacientes selecionados. Os exames de neuroimagem foram revisados juntamente com neurorradiologista experiente para descrição das lesões encontradas. RESULTADOS: No período compreendido entre maio de 2000 e maio de 2015, a mutação m.3243A>G foi pesquisada em um total de 817 pacientes, em DNA extraído de células do sangue periférico (n= 441), de fragmentos de biópsia de músculo esquelético (n= 293), de ambos (n= 82) e mais raramente de células do sedimento urinário (n=1). Dentre esses, 16 indivíduos de 12 famílias apresentaram a referida mutação, resultando em uma taxa de detecção da mutação de 1,96% nessa população. Foram incluídos no estudo 12 indivíduos de 9 famílias que estavam em seguimento no nosso serviço. Os achados mais comuns nesta série foram em ordem de frequência: sinais de miopatia, transtornos neurocomportamentais, epilepsia, endocrinopatias, ataxia cerebelar, migrânea, episódios semelhantes a AVC, vômitos recorrentes, distúrbios de condução cardíaca, neuropatia periférica e sinais de disautonomia, mioclonias, surdez neurossensorial, cegueira cortical, comprometimento ocular, e proteinúria. Em nossa série, identificamos que cinco pacientes foram classificados com a forma clássica de MELAS, dois apresentaram CPEO associada a outros sintomas como transtornos psiquiátricos e diabetes mellitus. Os demais pacientes apresentavam características clínicas que não configuravam uma síndrome clinica definida. Além das lesões semelhantes a AVC, as lesões reveladas por neuroimagem mais frequentes nessa população foram alteração de sinal dos núcleos da base, atrofia encefálica e alteração de sinal da substância branca, sendo igualmente prevalentes entre os pacientes com a síndrome clássica de MELAS e os pacientes que não apresentaram lesões semelhantes a AVC. Dos pacientes com MELAS, 100% apresentaram pico anômalo de lactado e 60% redução do NAA à espectroscopia de prótons; enquanto que entre os pacientes sem lesões semelhantes a AVC essas alterações foram encontradas em dois e em um paciente Caracterização clínica, laboratorial e de neuroimagem de pacientes com doença mitocondrial associada à mutação m.3243A>G 8 respectivamente. Nós identificamos o achado inédito de azoospermia associada à mutação m.3243A>G. Essa é a maior série de casos de pacientes brasileiros com a mutação m.3243A>G até o momento. CONCLUSÃO: O amplo espectro de apresentação clínica e de neuroimagem é uma característica notável entre os pacientes com a mutação m.3243A>G do DNAmt. Essa desordem deve ser considerada em pacientes com evidência de sinais e sintomas que sugiram acometimento multissistêmico. / INTRODUCTION: The classic form of mitochondrial encephalomyopathy associated with m.3243A>G mutation is the Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (MELAS syndrome). However, the spectrum of clinical manifestations of patients with this mutation is quite wide. OBJECTIVE: To describe the clinical, laboratory and imaging spectrum of patients with mitochondrial disease due to m.3243A>G mutation METHODS: A retrospective descriptive study of a series of cases of patients with the m.3243A>G mutation in follow-up in ANEM/HCFMRP-USP. Clinical data and information about additional tests were collected through systematic review of medical records of selected patients. Neuroimaging studies were reviewed with supervision of experienced neuroradiologist and the lesions were described. RESULTS: Between May 2000 and May 2015, the mutation m.3243A>G was evaluated in a total of 817 patients, on DNA extracted from peripheral blood (n = 441), skeletal muscle biopsy samples (n = 293), both (n = 82) and more rarely urinary sediment cells (n = 1). We founded 16 individuals 12 families with the mutation, resulting in a mutation detection rate of 1.96 % that population. 12 individuals from nine families, who were following at our service, were included in this study. The most common findings in this series were in order of frequency: myopathy signs, neurobehavioral disorders, epilepsy, endocrine disorders, cerebellar ataxia, migraine, stroke-like episodes, recurrent vomiting, cardiac conduction disorders, peripheral neuropathy and signs of dysautonomia, myoclonus, sensorineural deafness, cortical blindness, uveitis, and proteinuria. In our series, we found that five of the patients were classified with the classical MELAS syndrome, two patients had CPEO associated with other symptoms such as psychiatric disorders and diabetes mellitus. The remaining patients had other features of mitochondrial disease not consistent with another recognised syndrome. In addition to stroke-like lesions, the more frequent lesions revealed in neuroimaging studies were deep gray matter changes, brain atrophy and white matter changes. These changes had similar prevalences between the patients with the classic syndrome of MELAS and patients who did not have stroke-like lesions. All patients with classical MELAS have lactate peak and 60% of them have reduction of NAA at spectroscpopy; while these changes were found in two and one patient respectively, in the group of patients without stroke-like lesions. We identified azoospermia in one paciente with classic MELAS, a finding not previously associated with m.3243A>G. At moment, this is the largest Brazilian case series of patients with the m.3243A>G mutation. Clinical, laboratory and neuroimaging features of patients with mitochondrial disease associated with mutation m.3243A > G 10 CONCLUSION: The wide spectrum of clinical presentation and neuroimaging is a notable feature among patients with the mutation m.3243A> G mtDNA. This disorder should be considered in patients with evidence of signs and symptoms suggestive of multisystem involvement.

Hipertensão arterial (HA) ou pressão alta é uma doença com elevação crônica da pressão arterial (PA) e uma das maiores causas de óbitos no mundo. Há diferença sexual na HA. Receptores Toll-Like (TLRs) ativados induzem inflamação, situação presente na HA. Avaliamos o papel do DNA mitocondrial (DNAmit), que ativa TLR9 e é liberado por necrose celular, na reatividade de aortas de ratos hipertensos (SHR) machos e fêmeas. Estudamos a incubação do DNAmit na reatividade à acetilcolina, nitroprussiato de sódio (NPS), noradrenalina e fenilefrina (Fe), na expressão de TLR9, MyD88, ERK e eNOS e na concentração de IL-6, TNF-&#945;, IL-10 e EROs. O conteúdo de DNAmit no soro e a PA foram maiores em machos SHR versus outros grupos. Em aortas de machos SHR o DNAmit alterou a reatividade ao NPS e Fe, &#8593;ERK e o DNAmit+Fe potencializou a ERK e &#8593;IL-6, TNF-&#945; e IL-10. Nas fêmeas SHR o DNAmit &#8595;ERK, TNF-&#945; e o aumento de EROs induzido por Fe. Portanto, há diferença sexual na modulação da resposta vascular de SHR pelo DNAmit. Tratamento similar da HA para homens e mulheres deve ser reavaliado. / Arterial hypertension (AH) or high blood pressure is a disease with chronic blood pressure (BP) elevation and one of the major causes of death in world. There is sexual difference in AH. Activated Toll-Like receptors (TLRs) induce inflammation, a condition present in AH. We evaluated the role of mitochondrial DNA (mtDNA), which activates TLR9 and is release by cellular necrosis, in aorta reactivity of male and female hypertensive rats (SHR). We studied mtDNA incubation in acetylcholine, sodium nitroprusside (SNP), noradrenaline and phenylephrine (Phe) reactivity, in TLR9, MyD88, ERK and eNOS expression and in IL-6, TNF-&#945;, IL-10 and ROS concentration. Serum mtDNA content and BP were higher in males SHR versus other groups. In male SHR aorta the mtDNA modified the reactivity to SNP and Phe, &#8593;ERK and mtDNA+Phe potentiated ERK and &#8593;IL-6, TNF-&#945; and IL-10. In females SHR the mtDNA &#8595;ERK, TNF-&#945; and the increase in ROS induced by Phe. Thus, there is sexual difference in mtDNA modulation of SHR vascular response. Similar AH treatment for men and women might be reevaluated.