Submitted by ANALORENA CIFUENTES RINCÓN null (lorenacifuentesmvz@gmail.com) on 2016-12-05T19:02:32Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Lorena (Versão final)2.pdf: 4872200 bytes, checksum: 6e585a9162115d6ddb21dc9ffd88b0ee (MD5) Dissertação Lorena (Versão final)2.pdf: 4872200 bytes, checksum: 6e585a9162115d6ddb21dc9ffd88b0ee (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-12-06T15:42:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cifuentesrincon_a_me_jabo.pdf: 4872200 bytes, checksum: 6e585a9162115d6ddb21dc9ffd88b0ee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-06T15:42:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cifuentesrincon_a_me_jabo.pdf: 4872200 bytes, checksum: 6e585a9162115d6ddb21dc9ffd88b0ee (MD5) Previous issue date: 2016-08-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A espécie Mazama americana (veado-mateiro) é conhecida como a maior espécie pertencente ao gênero Mazama, e também um dos cervídeos mais abundantes e amplamente distribuídos na floresta Neotropical. A espécie já passou por diferentes classificações taxonômicas ao longo do tempo devido a potencial existência de diversas espécies dentro do que hoje é conhecido como M. americana. É considerada um complexo de espécies crípticas, pois apresenta alta taxa de paralelismo morfológico entre indivíduos com uma variação cromossômica coerente em termos geográficos, sugerindo a existência de unidades evolutivamente distintas. Assim, o objetivo do trabalho foi propor um neótipo para M. americana a partir da caracterização morfológica, citogenética e molecular de um topótipo, no sentido de fazer uma descrição emendada da espécie a partir de uma visão integrativa, permitindo assim a comparação com outros padrões já descritos na literatura considerados M. americana. Para tanto, um indivíduo foi coletado na localidade tipo da espécie (Guiana Francesa), e caracterizado por técnicas de morfologia tradicional (medidas cranianas, coloração da pele, biometria corporal) e morfometria geométrica, assim como por análises citogenéticas (banda C, banda G, coloração Ag-NOR, coloração convencional de Giemsa) e moleculares (análises filogenéticas de genes mitocondriais e nucleares). Os resultados corroboram evidências da existência de um complexo de espécies dentro do que hoje se considera M. americana, já que, segundo os seus padrões citogenéticos, o topótipo não se enquadra em nenhuma variante da espécie até agora conhecida. Molecularmente, as análises indicam a existência de pelo menos duas espécies diferentes dentro deste táxon. A similaridade morfológica é clara dentro de todas as variantes, comprovando mais uma vez que as unidades taxonômicas do veado-mateiro são muito difíceis de se diferenciar só pelos caracteres morfológicos. Deste modo, no presente trabalho, é proposto um neótipo o qual é o ponto de partida para a descrição de novas espécies e possível mudança completa na nomenclatura do gênero Mazama. / The red brocket deer species, Mazama americana, is known as the largest species of the genus Mazama, and also one of the most abundant deer and widely distributed in Neotropical forests. This species has undergone different taxonomic classifications over time due to the potential existence of several species within what is currently known as M. americana, which is considered as a complex of cryptic species. Individuals included in this species show a high morphological convergence between them with a consistent chromosomal variation in geographical terms, suggesting the existence of different evolutionary units. The objective of this study, therefore, was to obtain the morphological, cytogenetic and molecular profile of a M. americana topotype to gain an exact description of the species and be able to compare them with other standards already described in the literature for M. americana. For this purpose, an individual was collected at the type locality of this species (French Guiana) and characterized by traditional morphological techniques (cranial measurements, skin color, body biometrics), geometric morphometry, cytogenetic analysis (Band C, Band G Ag-NOR staining, conventional Giemsa staining) as well as molecular analysis (phylogenetic analyzes of mitochondrial and nuclear genes). Among highlights of the results, cytogenetic analysis showed a pattern that does not fit into any of the Mazama americana variants until now known. Similarly, the molecular analysis revealed the existence of, at least, two different species within this taxon, being clear the morphological similarity in all variants, proving once again that the red brocket variants are impossible to differentiate only by morphological characters. All these results, therefore, corroborate the existence of several species within M. americana species, contributing largely to the taxonomy of this species, as well as to the description of new species within the genus Mazama and the generation of a new holotype.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PriscilaAM.pdf: 370438 bytes, checksum: 93995dd721c298f0b6f78207c20d0453 (MD5) Previous issue date: 2009-07-24 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Extensive studies using molecular markers on butterflies have shown how a highly fragmented landscape may result in the reduction of gene flow among patches of habitat and, consequently, increase genetic differentiation among populations. However, little is known about Heliconius geographical structure and the effects of fragmentation on the connectivity of populations. Furthermore, findings on the effects of the population structure on the dynamics of mimicry evolution in Heliconius butterflies need to be tested in H. erato and H. melpomene specimens found in other locations other than Central and northern South Americas. For the present study, we had two motivations: (1) compare the population structure of H. erato and H. melpomene given the highly fragmented Brazil s Atlantic Forest habitat; and (2) studying population structure of co-mimics could give us insights into the dynamics of mimicry evolution. For this, we analysed the spatial structure and connectivity of eight populations of Heliconius butterflies, in a total of 137 H. erato specimens and 145 H. melpomene specimens, using nine microsatellites loci, 1144 AFLPs markers and 282 mitochondrial DNA sequences. In general, both species exhibited evidence of population subdivision but no isolation by distance indicating some extent of genetic differentiation among populations. Contrary to Kronforst & Gilbert s (2008) Costa Rican Heliconius, H. melpomene exhibited more genetic differentiation than H. erato based on nuclear markers. However, for mitochondrial DNA, H. erato populations showed more genetic differentiation than H. melpomene. Our results corroborate to other studies on Heliconius butterflies concerning the pronounced population subdivision and local genetic drift found in this genus. Nevertheless, the pattern of this differentiation varies significantly from the pattern found in studies conducted in Central America, where H. erato is generally more differentiated and structured than H. melpomene, based on nuclear markers. This different pattern may reflect different evolutionary histories of Heliconius species in Northeastern Brazil s Atlantic Forest / Estudos utilizando marcadores moleculares em borboletas t?m mostrado como uma paisagem altamente fragmentada pode resultar na redu??o do fluxo g?nico entre as manchas de habitat e, conseq?entemente, aumentar a diferencia??o gen?tica entre as popula??es. No entanto, pouco se sabe sobre a estrutura geogr?fica e os efeitos da fragmenta??o sobre a conectividade das popula??es do g?nero Heliconius. Al?m disso, as conclus?es sobre os efeitos da estrutura populacional sobre a din?mica da evolu??o do mimetismo de borboletas do g?nero Heliconius precisam ser testados em esp?cimes de H. erato e H. melpomene encontrados em outros locais, al?m dos da Am?rica Central norte da Am?rica do Sul. Neste estudo, tivemos duas motiva??es: (1) comparar a estrutura populacional de H. erato e H. melpomene dada a elevada fragmenta??o do Mata Atl?ntica Brasileira, e (2) estudar a estrutura populacional de esp?cies co-m?micas poderia nos fornecer insights a respeito da din?mica da evolu??o do mimetismo. Para isso, analisamos a estrutura espacial e conectividade de oito popula??es de Heliconius, em um total de 137 esp?cimes de H. erato e 145 de H. melpomene, utilizando nove loci de microssat?lites, 1144 marcadores AFLPs e 282 sequ?ncias de DNA mitocondrial. Em geral, ambas as esp?cies apresentaram evid?ncias de subdivis?o populacional, mas nenhum isolamento por dist?ncia indicando alguma diferencia??o gen?tica entre as popula??es. Contrariamente ao Heliconius da Costa Rica (Kronforst & Gilbert 2008), H. melpomene exibiu maior diferencia??o gen?tica que H. erato, baseado em marcadores nucleares. No entanto, para DNA mitocondrial, as popula??es de H. erato apresentaram maior diferencia??o gen?tica que H. melpomene. Nossos resultados corroboram com outros estudos sobre Heliconius no tocante ? subdivis?o populacional e deriva g?nica local encontrada neste g?nero. No entanto, o padr?o dessa diferencia??o varia significativamente do padr?o encontrado em estudos realizados na Am?rica Central, onde H. erato ? geralmente mais diferenciado e estruturado. Esse padr?o pode refletir diferentes hist?rias evolutivas de esp?cies de Heliconius na Mata Atl?ntica do Nordeste do Brasil

Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Psyllidae) é um inseto exótico no Brasil, registrado desde a década de 40. Apesar dos danos diretos que pode causar, só recebeu atenção como praga em 2004, quando foi confirmada a doença Huanglonbing (HLB) em citros, a qual foi posteriormente relacionada a D. citri como inseto-vetor. Atualmente, não há cura para plantas doentes. Portanto, o manejo do HLB é baseado na retirada de árvores infectadas e no controle dos psilídeos, o qual se fundamenta no controle biológico clássico, ação natural de predadores e no controle químico. Porém, o uso contínuo e intenso de agrotóxicos é sempre problemático devido ao desequilíbrio que pode causar nos agroecossistemas. Portanto, investigar as populações de D. citri no Brasil e discutir possíveis medidas alternativas para o controle ou manejo do vetor/doença são desejáveis. Assim, este trabalho apresenta como objetivos i) avaliar a diversidade genética intra e interpopulacional de D. citri e verificar a existência de estruturação populacional no Brasil, especialmente entre as populações que se distribuem na principal região citrícola do país; ii) determinar a ocorrência e frequência de infecção por Wolbachia em diferentes populações desse psilídeo, além de caracterizar a diversidade desse simbionte e definir a relação entre os haplótipos do hospedeiro e as linhagens de Wolbachia,visando fornecer subsídios para o controle alternativo deste inseto-vetor. A análise de diversidade genética utilizou o gene da citocromo oxidase I (COI) como marcador molecular. Os cálculos dos índices de fixação F indicaram a presença de estrutura genética e os cálculos dos índices de diversidade molecular mostraram um quadro de expansão populacional recente. Já a caracterização de Wolbachia via tipagem pela análise de sequências de multilocos (multilocus sequencing typing - MLST) indicou a ocorrência de cinco STs (173, 174, 175, 225 e 236), enquanto que análises das sequências do wsp indicaram quatro tipos de Wolbachia. O ST-173 foi predominante, estando presente em todas as populações, enquanto que os demais foram populações-específicos. Análises da relação hospedeiro-simbionte não revelou a existência de relações específicas entre os haplótipos do hospedeiro e os STs de Wolbachia, nem a diminuição da diversidade nucleotídica de D. citri frente à infecção por mais de um ST do simbionte. A relação entre os STs de Wolbachia e as consequências desta diversidade na bioecologia do hospedeiro ainda permanecem desconhecidas, mas a constatação de que Wolbachia ocorre em todas as populações e de que há um ST com distribuição abrangente abre caminhos para a utilização desse simbionte no desenvolvimento de estratégias alternativas de controle de D. citri. / Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Psyllidae) is an exotic insect in Brazil, first recorded in the 40s. Although it causes direct damage, D. citri only received attention as a pest in 2004, when the \"Huanglonbing\" (HLB) disease was confirmed infecting citrus in Brazil, and subsequently related to D. citri as vector. Currently, there is no cure for diseased plants, and the management of HLB is based on the removal of infected trees and psyllid control, which is based on classical biological control, natural predation and chemical control. However, the continuous use of pesticides is always problematic due to the imbalance it can cause in agrosystems. Therefore, investigations on the populations structure of D. citri in Brazil and possible alternative measures for vector/disease control or management are highly desired. Thus, this study was aimed to i) evaluate the intra and interpopulation genetic diversity of D. citri and verify the existence of population structuring in Brazil, especially in the main citrus producing region of the country, ii) determine the natural rate of infection and characterize the Wolbachia strains associated with different populations of D. citri and iii) investigate the relationship among host haplotypes and the strains of Wolbachia, in order to provide data for the alternative control of this vector. The analysis of genetic diversity was done using the cytochrome oxidase I (COI) gene as a molecular marker. The fixation rates F calculated indicated the presence of genetic structure, while the molecular diversity indices pointed to a recent population expansion of D. citri in Brazil. The multilocus sequence typing analysis (\"multilocus sequencing typing - MLST\") for Wolbachia demonstrated the presence of five new sequence-types (STs = 173, 174, 175, 225 and 236), while only four were identified when using the wsp sequences as markers. The ST-173 was the predominant ST associated with D. citri, being present in all populations, while others were specific to certain populations. Analysis of the hostsymbiont relationship did not reveal the existence of specific interactions between host haplotypes and the STs of Wolbachia, or the decrease of nucleotide diversity of D. citri in populations infected by more than one ST. The effects of Wolbachia diversity on the host bioecology are still unknown, but the fact that Wolbachia is fixed in all populations and that there is a ST broadly distributed throughout the D. citri populations highlights the use of Wolbachia for the development of alternative strategies to control D. citri.

O grupo neuwiedi é composto por oito espécies amplamente distribuídas na diagonal das formações abertas da América do Sul: Bothrops diporus, B. erythromelas, B. lutzi, B. mattogrossensis, B. marmoratus, B. neuwiedi, B. pauloensis e B. pubescens. Foi utilizada uma amostra de 140 espécimes, com intuito de fornecer um teste independente, do limite das espécies e uma hipótese filogenética para os membros do grupo. As inferências filogenéticas realizadas a partir da máxima parcimônia, máxima verossimilhança e análise bayesiana, utilizando sequências de 1018 pb dos genes mitocondriais citocromo b e ND4 combinados, recuperaram topologias similares, nas quais as espécies do grupo neuwiedi formam um grupo monofilético com elevados valores de suporte. Foi recuperado o monofiletismo recíproco para as espécies B. erythromelas, B. lutzi e B. pubescens. Entretanto, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi, B. marmoratus e B. pauloensis apresentaram-se parafiléticas ou polifiléticas, como atualmente definidas. Haplótipos de Bothrops diporus e B. mattogrossensis foram recuperados em dois clados distintos, B. neuwiedi e B. marmoratus em três clados, e B. pauloensis em quatro clados. Os padrões parafiléticos e polifiléticos recuperados para os haplótipos podem ser decorrentes de um arranjo taxonômico inadequado, retenção de morfologia ancestral, convergência morfológica, plasticidade fenotípica, eventos de introgressão genética recente e antiga na história evolutiva do grupo, homoplasia molecular e retenção de polimorfismo ancestral, fenômenos que não são mutuamente exclusivos. O compartilhamento de haplótipos de DNA mitocondrial, simpatria e indivíduos de morfologia intermediária entre B. marmoratus e B. pauloensis são evidências que sugerem a ocorrência de introgressão recente e a existência de uma zona de hibridação na região central do Brasil. As inferências filogenéticas para o grupo neuwiedi sugerem a possível existência de espécies crípticas, demonstrando a necessidade premente de uma reavaliação da taxonomia corrente, a partir da análise conjunta dos dados morfológicos e DNA mitocondrial aqui apresentados. Também serão necessários estudos complementares a partir de marcadores nucleares. Esta pesquisa, quando comparada aos estudos filogenéticos prévios, representa um marcante aumento na quantidade e qualidade da amostragem para o grupo neuwiedi, incluindo todas as espécies atualmente reconhecidas e amostra de 140 indivíduos para 92 localidades de 13 Estados do Brasil, fornecendo importantes informações para o entendimento e conservação da biodiversidade das serpentes Neotropicais. / The neuwiedi group of species of the genus Bothrops is widespread in open areas of South America, and it is composed by eight current species: Bothrops diporus, B. erythromelas, B. lutzi, B. mattogrossensis, B. marmoratus, B. neuwiedi, B. pauloensis, and B. pubescens. A total of 140 samples were used to provide an independent test of the species boundaries and a hypothesis of phylogenetic relationships among the members of this group. Our combined data (1018 bp of cyt b and ND4 from mtDNA) recovered the neuwiedi group as a highly supported monophyletic group in Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Analyses. Reciprocal monophyly for each B. erythromelas, B. lutzi and B. pubescens was recovered. However, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi, B. marmoratus and B. pauloensis showed to be paraphyletic and polyphyletic as currently defined. Haplotypes from each B. diporus and B. mattogrossensis were recovered in two different clades, B. neuwiedi and B. marmoratus were recovered in three clades, and B. pauloensis in four clades. The lack of monophyletic species could be explained by imperfect taxonomic analysis method, retention of ancestral morphology, convergent morphology, plasticity phenotipic, recent and ancient introgression, molecular homoplasy and incomplete lineage sorting, and these phenomena are not mutually exclusive. Sympatry, phenotipycally intermediate specimens and mtDNA haplotypes shared between B. marmoratus and B. pauloensis, provide evidences for recent introgression and the possibility of occurrence of a hybrid zone in Central Brazil. These phylogenetic inferences within neuwiedi group suggest the possible occurrence of cryptic species which were no detected morphologically, and the necessity of a current taxonomy review based on combining data presented here to morphological data. Compared to previous phylogenetic studies, the investigation presented here represents a remarkable increasing in quantity and quality concerning the group sampling, since it includes all the currently recognized species and samples of 140 individuals from 92 localities of 13 states of Brazil. It has never been done before, and supplies important information for understanding and to the conservation of Neotropical snake biodiversity.

Introdução. Danos no DNA mitocondrial (DNAmt) têm sido descritos em pacientes com doença renal crônica (DRC). Estes danos podem ser avaliados através da deleção 4977pb do DNAmt em diversos tecidos. Métodos. Identificamos a prevalência da deleção 4977pb do DNAmt através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) no sangue de pacientes com DRC em tratamento conservador (creatinina >2mg/dl) ou submetidos a hemodiálise. Resultados. A freqüência da ocorrência da deleção do DNAmt foi de 73.1% (38/52) nos pacientes com DRC submetidos a hemodiálise, 57.1% (27/42) nos pacientes com DRC em tratamento conservador e 27.8% (15/54) nos controles (P< 0.001). Não encontramos aumento da freqüência desta deleção em relação a idade dos pacientes com DRC (P= 0.54) ou ao tempo de diálise (P= 0.70). Conclusão. Danos no DNAmt podem ser induzidos pela DRC em especial nos pacientes submetidos a hemodiálise. Desta forma, a deleção 4977pb do DNAmt pode servir como um marcador de danos moleculares em pacientes com DRC. / Background. Damage to mitochondrial DNA (mtDNA) has been described in patients with chronic renal disease (CRD). The presence of mtDNA 4977bp deletion in many different tissues can serve as a marker of this damage. Methods. Polymerase chain reaction techniques (PCR) were used to identify the prevalence of 4977bp deletion in mtDNA from the blood of hemodialysis patients or patients with CRD receiving conservative treatment. Results. The frequency of 4977bp deletion in mtDNA was 73.1% (38/52) in patients undergoing hemodialysis, 57.1% (27/42) in patients with CRD receiving conservative treatment and 27.8% (15/54) in control samples (P< 0.001). Higher frequencies of this mutation were not associated with patient age (P= 0.54) or time on dialysis (P= 0.70). Conclusion. Damage to mtDNA can be induced in CRD, especially in patients undergoing dialysis. Thus, mtDNA with 4977bp deletion can serve as a marker of molecular damage in patients with CRD.

Orientadores: Shirlei Maria Recco-Pimentel, Carmen Sílvia Busin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T01:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruschi_DanielPacheco_M.pdf: 3876863 bytes, checksum: 337679c24ea52e966f84be587a0058cb (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A taxonomia e as relações de parentesco em Phyllomedusa são temas de constantes discussões. Hipóteses sobre os relacionamentos intra- e interespecíficos desse gênero decorrem basicamente de análises morfológicas e comportamentais, o que não têm sido suficiente para responder alguns dos questionamentos. O grupo de P. hypochondrialis, o maior dentro do gênero, apresenta dificuldades na sua delimitação e, até o momento, não foi observada nenhuma sinapomorfia que possa reunir as espécies atualmente alocadas no grupo, de maneira que outras ferramentas podem ser elucidativas para resolução dessa problemática. O presente trabalho teve como objetivo utilizar dados citogenéticos e de sequências de DNA mitocondrial para o estudo de algumas das espécies do grupo de P. hypochondrialis. Todos os espécimes apresentaram o número diplóide 2n=26 e morfologia dos cromossomos bastante conservada, o que permitiu a inferência de homeologias cromossômicas. Exceto nas populações de Phyllomedusa sp. (aff. azurea) que apresentam o par 7 submetacêntrico, os cariótipos das demais populações analisadas foram constituídos por seis pares metacêntricos (1, 4, 8, 11-13), seis submetacêntricos (2, 3, 5, 6, 9, 10) e um subtelocêntrico (par 7). A diferença detectada no par 7 pode ser atribuída à presença de uma NOR nos braços curtos dos cromossomos 7 submetacêntricos. Pequenas variações na morfologia de alguns pares cromossômicos, incluindo a localização da NOR, foram observadas em P. rohdei de Ilhéus/BA em relação à descrita por outros autores, corroborando a hipótese da provável existência de espécies crípticas sob esse nome. O cariótipo de P. nordestina se diferenciou dos demais principalmente pela grande quantidade de heterocromatina e pela posição da NOR em 9p. A análise de morfologia externa relativa aos dois caracteres indicados para diagnose e separação de P. hypochondrialis e P. azurea, aplicados a todos os espécimes de diferentes localidades brasileiras, mostrou variações intrapopulacionais não acompanhadas de variações citogenéticas e moleculares. Esses dados apontam a necessidade de uma re-avaliação desses caracteres de diagnose e separação para essas espécies. A análise conjunta de dados citogenéticos e moleculares das populações permitiu identificar a população de Belterra/PA como P. hypochondrialis, portadora de NOR intersticial em 8p. Dados moleculares sugerem que as populações de Uberlândia (Minas Gerais), de São Luís, Bacabeira e Urbano Santos (Maranhão) e de Porto Nacional (Tocantins) possivelmente correspondam a um mesmo táxon, P. azurea. Nesse caso, a NOR em 7p nas populações ao Norte (Maranhão e Tocantins) e em 4p ao sudeste (Minas Gerais) corresponderia a variação interpopulacional. Na análise filogenética molecular, os haplótipos de Chapada dos Guimarães + Santa Terezinha (Mato Grosso) formaram um clado e as populações de Laranjal do Jari (Amapá) e de Prainha (Pará) formaram cada uma um ramo independente. Os dados dessas quatro populações (portadoras de NOR pericentromérica em 8q) sugerem que uma revisão minuciosa deva ser realizada para auxiliar no esclarecimento de seus status taxonômicos. / Abstract: Taxonomy and phylogenetic relationships of Phyllomedusa have been subject of continuous discussions. Hypotheses about the intra- and interspecific relationships within this genus have basically arised from morphological and behavioral characteristics, which have not been enough to elucidate the problems as the assigning of species to the P. hypochondrialis group. So, other tools may help to solve this problem. This work aimed to contribute with cytogenetic analysis and mitochondrial DNA sequencing data to the understanding of intra- and interspecific relationships involving the species P. rohdei, P. nordestina, P. hypochondrialis and P. azurea of the P. hypochondrialis group. These species showed the same chromosome number, 2n=26, with a very similar morphology. All populations had karyotypes with six metacentric (1, 4, 8, 11-13), six submetacentric (2, 3, 5, 6, 9, 10) pairs and one subtelocentric pair (7). The populations of Phyllomedusa sp. (aff. azurea) from São Luis, Bacabeira, Urbano Santos (Maranhão state) and Porto Nacional (Tocantins state) had the pair 7 submetacentric. This morphological difference in pair 7 can be attributed to the Nucleolus Organizer Region (NOR) that is located only in the submetacentric pair 7. The karyotype of P. nordestina was distinguished from P. rohdei by the large amount of heterochromatin and by the position of the NOR in chromosome 9p, whereas in P. rohdei it is located in 9q. The karyotype of P. rohdei also differed from that described by other author, suggesting the existence of cryptic species. Brazilian populations of P. azurea, P. hypochondrialis and other populations related to those species were analyzed. Intrapopulational variations in characters of external morphology were not associated with cytogenetic and molecular variations, showing that it is necessary a reevaluation of the diagnosis and separation characters for those species. The combined analysis of molecular and cytogenetic data allowed classifying the population of Belterra/PA as P. hypochondrialis, with NOR in pair 8p. Molecular data suggested that populations from Uberlândia (Minas Gerais), São Luiz, Bacabeira e Urbano Santos (Maranhão) and Porto Nacional (Tocantins) probably correspond to the taxon P. azurea. By comparing the karyotype of specimens from North populations (Maranhão and Tocantins) and from Southeast populations (Minas Gerais) different NOR positions were observed and interpreted as an interpopulational variation. The genetic diversity observed among populations with pericentromeric NOR in 8q (Laranjal do Jari, Prainha and Chapada dos Guimarães + Santa Terezinha; three clades in the molecular phylogenetic analysis) suggests that these populations could be in incipient process of speciation. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coronel_PabloFresia_D.pdf: 3741316 bytes, checksum: 4416d19fe30ca45f8d2185db03898903 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A mosca-da-bicheira, Cochliomyia hominivorax, é um ectoparasito obrigatório dos animais de sangue quente endêmico das Américas. As miíases causadas por esta praga geram severos prejuízos econômicos na produção pecuária da América do Sul e da região do Caribe, devido à mortalidade e redução na produtividade dos animais infestados. Nesta tese, abordamos alguns aspectos da distribuição da variação de seqüências do DNA mitocondrial de C. hominivorax em duas escalas geográficas e os eventos históricos que podem explicar os padrões observados. As principais contribuições foram compiladas em três artigos científicos. No primeiro artigo, (artigo 1) investigamos o padrão geral de estruturação geográfica da variabilidade genética em 38 localidades ao longo de toda a distribuição da espécie. As análises das seqüências parciais da região controle (CR) e dos genes COI e COII mitocondriais revelaram que a diversidade genética da espécie está estruturada em quatro grupos regionais principais, denominados Cuba (CG), República Dominicana (DRG), região norte e região sul da Amazônia (NAG e SAG, respectivamente). Foi sugerido que o padrão observado foi principalmente formado por eventos históricos, como a colonização das ilhas do Caribe, vicariância na região Amazônica e expansão das populações desde o último máximo glacial. O segundo artigo (artigo 2) apresenta um teste da hipótese de perturbação-vicariância na região Amazônica, que foi realizado através de simulações de coalescência e modelagem ecológica da espécie. Os resultados indicaram que os ciclos climáticos do Pleistoceno promoveram a expansão, fragmentação e mistura das populações na região Amazônica em diferentes momentos do passado. Detectamos que o primeiro momento de divergência dos grupos de populações analisadas (SAG, NAG e amostras da América Central e do Norte) é mais antigo que o último período glacial e deve ter acontecido no interglacial Yarmouth (~250.000 anos atrás). Porém, a demografia histórica da espécie e as relações filogenéticas das seqüências mitocondriais sugerem um padrão mais complexo, incluindo reticulação, para a evolução e divergência das populações na região Amazônica. No terceiro artigo (artigo 3), apresentamos o primeiro estudo da variabilidade genética de C. hominivorax em escala local, em que se analisaram indivíduos de 25 sítios de coleta distribuídos numa área de 90 km por 60 km próxima às cidades de Quaraí e Artigas, na fronteira entre Brasil e Uruguai. Os resultados sugerem que os indivíduos pertencem a uma única população com alto grau de polimorfismo, indicando que esta é uma população estável capaz de sobreviver às condições adversas do inverno local e que flutua demograficamente de acordo com o clima da região. Porém, há evidências de que estas amostras não estão em equilíbrio e, portanto, a ausência de estruturação baseada nas estimativas tradicionais deve ser interpretada com cuidado. Como esta é uma região importante para a atividade pecuária do Brasil e Uruguai, estes resultados são de interesse para um possível plano de controle na região. No entanto, serão necessárias análises de amostras seriadas ao longo de um ano, assim como de diferentes anos na mesma escala geográfica, para melhor entender o padrão de fluxo gênico na região / Abstract: The New World screwworm fly, Cochliomyia hominivorax, is an obligate ectoparasite of warm blooded vertebrates, endemic of the Americas. Myiasis caused by this pest fly generate great profit looses to the livestock sector in South America and the Caribbean region, due to mortality and productivity reduction of infested animals. In this thesis, we approach some aspects of mitochondrial DNA sequences variation of C. hominivorax in two geographic scales, and the historical events that could explain the observed patterns. The main contributions were compiled in three research articles. In the first (article 1), we investigate the general pattern of genetic variability distribution in 38 localities encompassing the species geographic range. The analysis of partial sequences of the mitochondrial control region (CR), COI and COII genes revealed four main regional groups of genetic diversity, denominated Cuba (CG), Dominican Republic (DRG), north region (NAG) and south region (SAG) of the Amazon basin. Results suggest that current distribution of C. hominivorax genetic diversity was mainly shaped for historical events, i.e. Caribbean islands colonization, vicariance in the Amazon region and population expansion since the last glacial maximum. The second article (article 2) presents a hypotheses test of vicariance-perturbation in the Amazon region, through coalescent simulations and ecological niche modeling of the species. The results indicate that Pleistocene climatic cycles promote expansion, fragmentation and mixture of Amazon region populations during the past. We detected that the divergence among groups of analyzed populations (SAG, NAG and samples from North and Central America) occurred before the last glacial maximum and may have happened during the interglacial Yarmouth (~250.000 years ago). However, the species demographic history and the phylogenetic relationships of the mitochondrial sequences suggest a more complex pattern, including reticulation, for the evolution and divergence of the Amazonian region populations. Finally, in the third article (article 3) we present the first study of the genetic variability of C. hominivorax in a local scale, in which individuals of 25 localities in a 90 km for 60 km area in the proximity of Artigas city and Quaraí city, in the border between Brazil and Uruguay, were analyzed. The results suggest that the individuals are from a unique population, with high level of polymorphism, indicating that this is a stable population which is capable of survive the adverse local winter conditions and demographically fluctuate in accordance to the region climate. However, there are evidences that these samples are not in equilibrium hence the absence of structure interpretation based on traditional estimates must be done carefully. As this is an important region for livestock industry of Brazil and Uruguay, these results are interesting for a possible control program in the region. However, studies of serially collected samples throughout the year and in different years at the same geographic scale will be necessary to better understand the gene flow pattern in the region / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O presente trabalho teve como objetivos estimar os efeitos da inclusão de linha materna e do DNA mitocondrial (mtDNA) nos modelos de avaliação genética, avaliar o efeito do DNA satélite em características de desenvolvimento ponderal, bem como estimar parâmetros genéticos para características de carcaça e idade ao primeiro parto. Análises do mtDNA foram realizadas a partir de sangue coletado de 457 animais da raça Nelore, linhagem Lemgruber. Para as características de desenvolvimento ponderal foram analisados 14.432 registros de produção relacionados com 16.561 animais no pedigree. Para característica reprodutiva e as de carcaça foram analisados 4.621 registros de idade ao primeiro parto e 951 registros de área de olho de lombo e espessura de gordura subcutânea, relacionados com 7.135 registros de pedigree. As estimativas dos efeitos de linha materna e DNA mitocondrial foram analisadas sob 5 modelos diferentes. Os componentes de (co)variância para idade ao primeiro parto e características carcaça foram estimados em análises uni e bicaracterísticas. Não foram encontrados efeitos significativos de linhagem materna ou de DNA mitocondrial sobre as características de produção. Entretanto, foi verificado que animais com mitocôndria de origem Bos taurus, apresentam uma pequena superioridade na média de seus valores genéticos para as características de desenvolvimento ponderal. Animais com padrão de DNA satélite B tiveram suas médias ligeiramente superiores aos outros padrões. Os efeitos da precocidade de acabamento sobre a precocidade sexual devem ser avaliados utilizando-se estruturas de dados mais adequadas. / The aim of this research was to estimate the effect of the maternal lineage and mitochondrial DNA inclusion in the genetic evaluation model for growth traits, to evaluate the satellite DNA effect in these traits and to estimate genetic parameters for carcass traits and age at first calving. Blood samples were collected to mtDNA analysis from 457 Nellore cattle. Growth traits were analyzed from 14,432 production data and 16,561 pedigree data. Reproductive and carcass traits were analyzed from 4,621 age at first calving data and 951 loin-eye area and subcutaneous fat thickness data related to 7,135 pedigree data. Maternal lineage and mitochondrial DNA estimative were analyzed under 5 different models, (co)variance components for age at first calving and carcass traits were estimated in single and multiple-trait. There were no significant effects of maternal lineage or mitochondrial DNA related to production traits, but animals harboring Bos taurus mtDNA showed a low superiority on breeding values average for growth traits and animals harboring satellite DNA B pattern also showed a low superiority related to the other patterns. Further studies are suggested to evaluate the backfat thickness precocity effect related to sexual precocity.

As mitocôndrias desempenham um papel fundamental na sobrevivência e morte celular. Alterações do DNA mitocondrial (DNAmt) - como, por exemplo, amplificação, mutação homoplásmica, deleção e depleção -, bem como suas implicações clínico-patológicas, tem sido analisadas em inúmeras neoplasias humanas. No intuito de se pesquisar alterações mitocondriais associadas à tumorigênese, o presente trabalho teve como objetivos analisar a expressão de genes implicados no metabolismo energético e envolvidos na replicação e transcrição mitocondriais, quantificar o número de organelas mitocondriais e de cópias de DNAmt e analisar a expressão dos genes em astrocitomas de diferentes graus de malignidade (23 OMS grau I, 26 grau II, 18 grau III e 84 grau IV ou GBM) em relação ao tecido cerebral não tumoral (22 amostras). As expressões relativas dos genes selecionados, bem como as quantificações relativa e absoluta do DNA mitocondrial, foram realizadas por PCR em tempo real. O aumento de expressão relativa de genes-chave da via glicolítica, alterações nos níveis de expressão dos genes do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e hipoexpressão de genes da fosforilação oxidativa detectados corroboraram o efeito Warburg. Foi demonstrado que a redução do número de cópias do DNAmt está associada com o grau de malignidade dos astrocitomas difusamente infiltrativos, sendo GBM o mais depletado e independente do número de organelas. As médias observadas para tecido não tumoral, astrocitoma grau I, grau II, grau III e GBM foram, respectivamente, 1,28, 0,26, 0,45, 0,42 e 0,17. Níveis aumentados de expressão relativa dos genes dos fatores de transcrição mitocondriais A (TFAM), B1 (TFB1M), B2 (TFB2M) e da subunidade catalítica da polimerase mitocondrial (POLG) foram detectados em todos os graus de astrocitomas, exceto TFB2M em astrocitoma grau II. Embora exista forte correlação entre os fatores de transcrição mitocondriais, somente os níveis de expressão de POLG se correlacionaram inversamente com o número de cópias de DNAmt. A expressão elevada de TFAM está associada a uma maior sobrevida no grupo de pacientes com GBM, interpretada como compensatório. As hiperexpressões de TFAM e POLG estão relacionadas a um melhor prognóstico em pacientes com GBM. Embora nossos achados da disfunção do metabolismo intermediário e depleção do DNAmt em astrocitomas corroborem a literatura, ainda não está bem esclarecida sua implicação na iniciação e manutenção da transformação maligna. Investigações futuras são necessárias para o esclarecimento destas questões. / Mitochondria has a key role in cell survival and death. Mitochondrial DNA (mtDNA) alterations, for example, amplification, homoplasmic mutation, deletion and depletion, and their clinical and pathological implications have been analyzed in human malignancies. In order to search for mitochondrial alterations associated to tumorigenesis, this study aimed to analyze the expression levels of genes involved in energetic metabolism, and in mitochondrial replication and transcription, to quantify the number of mitochondrial organelle and mtDNA copy number in astrocytomas of different grades of malignancy (23 WHO grade I, 26 grade II, 18 grade III and 84 grade IV or GBM) related to non-neoplastic brain tissue (22 samples). The relative expression level of the selected genes as well as the relative and absolute quantification of mtDNA were performed by real-time PCR. Relative expression increase of glycolytic pathway key genes, change of citric acid cycle genes and hipoexpression of oxidative phosphorylation genes were detected, and confirmed the presence of Warburg effect. The reduced mtDNA copy number was associated to the grade of malignancy of diffusely infiltrating astrocytoma, being GBM the most depleted, and not related to parallel decrease in the number of organelle. The mean mtDNA copy number for non neoplastic tissue, astrocytoma grade I, grade II, grade III and GBM were respectively 1.28, 0.26, 0.45, 0.42 and 0.17. The increased relative gene expression of mitochondrial transcription factor A (TFAM), B1 (TFB1M), B2 (TFB2M) and the catalytic subunit of mitochondrial polymerase (POLG) were observed in all grades of astrocytoma, except TFB2M in grade II astrocytoma. Although a strong correlation was observed among the mitochondrial transcription factors, only the expression level of POLG correlated inversely to the mtDNA copy number. The overexpression of TFAM was associated with long-term survival in the GBM patients and interpreted as compensatory. TFAM and POLG overexpressions were related to better prognosis in GBM patients. Although our findings concerning the impairment of intermediary metabolism and depletion of mtDNA in astrocytomas confirmed previous reports, their role in initiation or maintenance of malignant transformation were not fully understood. Further investigations are needed to clarify these issues.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento que utiliza um fotossensibilizador, luz e oxigênio para gerar espécies reativas de oxigênio capazes de induzir a morte de células indesejadas, como tumores e micro-organismos infecciosos. Nosso foco está na morte induzida por 1,9-dimetil azul de metileno fotoativado (TFD-DMMB). Este fotossensibilizador foi previamente estudado por nosso grupo. Foi mostrado que o DMMB se acumula em lisossomos e mitocôndrias, e danifica essas organelas após fotoativado. O DMMB em concentração nanomolar promove uma morte celular eficiente, que parece ser resultante do bloqueio da conclusão do processo autofágico, enquanto outros fotossensibilizadores geralmente são empregados na faixa de micromolar. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar o mecanismo molecular da TFD-DMMB através do estudo do papel da proteína p53 nas respostas celulares à TFD-DMMB. Sendo uma proteína supressora tumoral, p53 participa de vários processos celulares em resposta a diferentes estresses. Para atingir nosso objetivo, utilizamos linhagens celulares HEK293T que expressam diferentes quantidades de p53, sendo uma linhagem knockdown para p53 (HEK293T-p53KD) e outra com expressão normal de p53 (HEK293T-SC, scramble). Após o tratamento com DMMB fotoativado, avaliamos a fototoxicidade, apoptose, dano no DNA, ciclo celular e autofagia. Nossos resultados mostram que, apesar de não observarmos a estabilização de p53, a TFDDMMB parece induzir a localização citoplasmática de p53, sugerindo que p53 citoplasmática participa da resposta celular à TFD-DMMB. A linhagem HEK293T-p53KD mostrou-se menos sensível à TFD-DMMB. Essa diferença foi explicada pelo acúmulo de células em sub- G1, indicativo de morte por apoptose, apenas na linhagem HEK293T-SC, que foi mais sensível ao tratamento. É possível que a atividade citoplasmática de p53 esteja relacionada com a indução de apoptose no nosso modelo. Em contraste aos efeitos de p53 na morte celular, encontramos respostas à TFD-DMMB independentes de p53 na parada do ciclo celular e autofagia. Observamos acúmulo de células na fase S do ciclo celular associado à fosforilação de CHK1 e H2AX, indicativo da ocorrência de estresse replicativo. A relação com a autofagia foi confirmada pelo acúmulo de vesículas ácidas e aumento dos níveis proteicos de LC3-II. Esses resultados indicam a indução ou o bloqueio da autofagia, entretanto não observamos um aumento simultâneo nos níveis de BECLIN-1, proteína importante para a iniciação da autofagia. Além disso, DMMB fotoativado resultou em dano seletivo no DNA mitocondrial (mtDNA), que não foi reparado em 24 horas. Desse modo, e baseado nos resultados preliminares do nosso grupo, propomos que a morte celular induzida por DMMB fotoativado é decorrente principalmente do bloqueio da resolução da via autofágica, comprometendo a eliminação de mitocôndrias danificadas e levando a alterações na dinâmica do ciclo celular. Nossos resultados sugerem que há respostas celulares à TFDDMMB dependentes e independentes de p53. Resultados similares foram obtidos para a linhagem HEK293, que é a linhagem parental de HEK293T. Do nosso conhecimento, a relocalização de p53 para o citoplasma, a habilidade em induzir dano seletivo no mtDNA e o bloqueio da progressão do ciclo celular na fase S são resultados inéditos decorrentes da TFDDMMB. O dano seletivo ao mtDNA torna o DMMB um modelo útil para estudos de mecanismos de resposta a dano no DNA específicos para a mitocôndria. / Photodynamic Therapy (PDT) is a treatment modality that uses a photosensitizer, light and oxygen to generate reactive oxygen species capable of inducing death of unwanted cells, such as cancer cells and infectious microorganisms. In this work, we are interested in studying death induced by 1,9-dimethylmethylene blue as a photosensitizer by PDT (DMMB-PDT). This photosensitizer has been previously studied by our group. It has been shown that DMMB accumulates within lysosomes and mitochondria, and damages these organelles after photoactivation. In this case, cell death is believed to be a result from the impairment of autophagy. DMMB at nanomolar concentration promotes efficient cell death, while other photosensitizers are usually employed in the micromolar range. The aim of this work is to investigate the molecular mechanism of DMMB-PDT action through the study of p53 protein role over the cell response to DMMB-PDT. Being a tumor suppressor protein, p53 participates in several cellular processes in response to different stresses. To achieve our goal, we used HEK293T cell lines that express different amounts of p53: a p53 knockout cell line (HEK293T-p53KD) and a normal cell line (HEK293T-SC, scramble). After treatment with photoactivated DMMB, we evaluated phototoxicity, apoptosis, DNA damage, cell cycle, and autophagy. Our results showed that, although we did not observe p53 stabilization, DMMBPDT seems to induce the cytoplasmic localization of p53, suggesting that cytoplasmic p53 participates in the cell response to DMMB-PDT. The HEK293T-p53KD cell line was less sensitive to DMMB-PDT. This difference could be explained by the level of sub-G1 accumulation suggestive of apoptosis that was only observed for HEK293T-SC cell line, which was more sensitive to the treatment. It is possible that the cytoplasmic activity of p53 was related to apoptosis induction according our model. In contrast to p53 effects on cell death, we found that there are p53-independent responses to DMMB-PDT on cell cycle arrest and autophagy. We observed a significant increase in the fraction of cells in the S phase of the cell cycle associated with phosphorylation of the CHK1 and H2AX proteins, indicating induction of replicative stress. The relationship of DMMB-PDT and autophagy was confirmed by the accumulation of acidic vesicles and the increased LC3 conversion (LC3-I to LC3-II). These results indicated that DMMB-PDT induces and/or impairs autophagy. However, we did not observe a simultaneous increase in BECLIN-1 levels, which is an important protein to autophagy initiation. Photoactivated DMMB resulted in selective damage in mitochondrial DNA (mtDNA) that was not repaired in 24 hours. According to these results, we propose that cell death induced by photoactivated DMMB is mainly related to blockade of a late stage of the autophagy pathway. It could compromise the elimination of damaged mitochondria and might lead to cell cycle dynamics alterations. Our results suggested that there are p53-dependent and p53-independent cell responses to DMMB-PDT. Similar results were obtained from HEK293 cell line, which is the parental cell line of HEK293T. To the best of our knowledge, the p53 relocalization to the cytoplasm, the ability to induce selective mtDNA damage, and the S arrest represent new insights in the DMMB-PDT field. The selective mtDNA damage makes DMMB a useful model for studies on mechanisms of DNA damage responses in mitochondria.