A doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa progressiva e a forma de demência mais prevalente no mundo. As alterações fisiopatológicas da DA têm sido associadas a dois marcadores neuropatológicos clássicos: a deposição de placas de β- amilóide e a formação de emaranhados neurofibrilares da proteína tau hiperfosforilada. Porém, devido a complexidade da DA, outros mecanismos têm sido propostos como coadjuvantes no processo neurodegenerativo, entre eles eventos neuroinflamatórios, a quebra da homeostasia de sistemas de neurotransmissão e disfunção sináptica. Esta pletora de eventos patológicos parece preceder a fase de demência por um longo período onde a doença age de forma silenciosa, ou seja, onde não existem evidências sintomatológicas. Na presente tese, avançamos no entendimento de vias de sinalização associadas com a hipersforforilação da proteína tau envolvendo a disfunção da proteína fosfatase 2A e neurotoxicidade do sistema glutamatérgico. Além disso, avaliamos os radiofármacos de tomografia de emissão de pósitrons (PET) disponíveis para visualização in vivo e não invasiva da fisiopatologia da DA. Finalmente, avaliamos um novo biomarcador de PET, o [11C]ABP688, para visualizar flutuações no sistema glutamatérgico e avançamos no entendimento do impacto das células gliais no sinal do PET [18F]FDG, o radiofármaco mais utilizado na clínica atualmente para visualizar metabolismo de glicose cerebral. O [11C]ABP688 pode ser diretamente incluído em estudos clínicos e a reconceptualização do [18F]FDG proposta nesta tese pode alterar a maneira atual como vemos o metabolismo de glicose na DA e em outras doenças neurodegenerativas. Finalmente, nesta tese, avançamos em termos de mecanismos, e no contexto da busca por um diagnóstico precoce e acurado da DA. / Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most prevalent cause of dementia worldwide. The AD pathophysiological features have been associated to two main classic neuropathological markers: depositon of β-amyloid plaques and formation of neurofibrillary tangles of hyperphosphorylated tau. Due to AD complexity, however, additional mechanisms have been proposed as contributors to the neurodegenerative process, such as neuroinflammatory changes, altered neurotransmission, and synaptic dysfunction. These pathological events seem to precede the dementia phase by many years, resulting in a long silent period, i.e., a preclinical phase. In this thesis, we advanced in the understanding of signaling pathways associated with tau hyperphosphorylation, which includes dysfunction of protein phosphatase 2A (PP2A) and glutamatergic neurotoxicity. Furthermore, we underscored radiopharmaceuticals currently available for imaging AD pathophysiology in vivo and non-invasively with positron emission tomography (PET). Finally, we evaluated a new PET biomarker, [11C]ABP688, for visualizing glutamatergic fluctuations and advanced in the understating of how glial cells contribute to the [18F]FDG signal, the widely used radiopharmaceutical in clinical settings for visualizing cerebral glucose metabolism. Our findings have high translational value and direct impact in clinical settings, which can potentially alter the way we interpret glucose metabolism in AD and other neurodegenerative disorders. In summary, in this thesis, we have advanced in terms of molecular mechanisms, and in the use of PET biomarkers toward an early and accurate diagnosis of AD.

Septinas constituem uma família de proteínas de ligação a GTP que foram inicialmente identificadas em levedura Saccharomyces cerevisiae, mas também estão presentes em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de leveduras, Drosophila e cérebros de mamíferos na forma de filamentos, porém o mecanismo através do qual acorre a formação destes filamentos ainda não é muito bem compreendido. Septinas são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. O gene SEPT4 foi identificado por M. Tanaka e colaboradores a partir do cDNA de cérebro humano e apresentou duas distintas transcrições: Bradeiona ? e ?. Interessantemente, além de cérebro e coração, as proteínas Bradeiona Α e Β. são detectadas somente em câncer do cólon, reto, próstata e melanoma maligno. Neste trabalho, o gene da proteína Bradeiona Β foi subclonado em um vetor de expressão bacteriano, produzido em E. coli e purificado com sucesso. O espectro de dicroísmo circular (CD) mostrou o perfil característico de proteínas com hélices a na estrutura secundária. Resultados de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS) indicam que a septina Bradeina foi produzida na forma de um estável oligômero com características monodispersivas, que foi subseqüentemente cristalizado em PEG6000. A atividade GTPase da Bradeiona Β foi comprovada através da técnica de eletroforese capilar (CE), mostrando-se absolutamente dependente de íons Mg2+. Inibição da atividade GTPase foi verificada em altas concentrações de Mg2+ (maiores que 5 mM). Com a finalidade de caracterizar os domínios preditos da Bradeiona Β (Fragmento Conservado e domínio GTPase), essas regiões foram previamente definidas, expressas em E. cozi e purificadas com sucesso. Resultados de CD, SEC, espectroscopia de fluorescência e NMR-600MHz indicam que o FC foi produzido na forma de um estável monômero com pouca estrutura secundária regular. Resultados de DLS e CD indicam que a fusão 6xHis-DGTPase foi produzida na forma de um oligômero com a presença de hélices a na estrutura secundária. A fusão 6xHis-DGTPase mostrou-se instável a altas concentrações na ausência de imidazol. A atividade GTPase da fusão GST+DGTPase foi comprovada, similarmente a Bradeiona , através da técnica de CE. Novamente, verificou-se dependência de íons Mg2+ (para a atividade catalítica) e inibição em altas concentrações de Mg2+. A fusão GST+DGTPase também foi capaz de hidrolisar ATP. Espera-se que as informações relatadas neste estudo proporcionem um alicerce para estudos estruturais/funcionais futuros das proteínas Bradeiona Α e Βoutras septinas. / Septins form a class of eukaryoyic guanine nucleotide-binding proteins that were first identified in budding yeast. Septins purified from yeast, Drosophila and mammalian brain form filaments, however the mechanism by which the filaments assemble is unclear. Septins have a highly conserved structure, which includes a central GTP-binding domain, a variable N-terminal region, and most septins also contain a coiled coil domain at the Cterminus. Bradeion p is one of the splice variants of the human septin gene, SEPT4, recently isolated by expression screening of an adult human brain cDNA library. The Bradeion gene resides at 17q23, and has been shown to present specific expression in both human colorectal cancer, urologic cancers and malignant melanoma. In order to characterize the GTPase activity of Bradeion Β , the protein was successfully expressed in E. coli and purified. The recombinant protein was characterized by circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and a novel non-radioactive enzyme assay, which utilizes capillary electrophoresis (EC) to monitor GTP hydrolysis. The CD spectrum exhibited the typical shape characteristic of the presence of helical elements of secondary structure and the DLS pattern was indicative of a monodisperse solution, which was readily crystallized in the presence of PEG6000. GTP hydrolysis was shown to be Mg2+ dependent within the low millimolar range but at 5 mM was inhibitory. In order to characterize the predicted domains of Bradeion Β, these defined regions were successfully expressed in E. cozi and purified. The CD spectrum of CF exhibited the shape typically found for non-regular structure. The results of fluorescence spectroscopy, gel filtration (SEC) and NMR-600MHz also corroborate with the CD results indicating an irregular structure. The fusion protein 6xHis-DGTPase exhibited a CD spectrum with the typical shape characteristic of the presence of helical elements but was show to be instable at high concentrations in the absence of imidazole. To characterize the GTPase activity of the fusion protein GST+DGTPase, the CE technique was used to monitor GTP hydrolysis. Analysis by CE showed that GST+DGTPase was functional, since both GTP and ATP hydrolysis was observed in a Mg2+ dependent manner. This work provides novel approaches, which should aid in the fbture study of the structure and fùnction of Bradeion Α e Β, others septins and related GTPases.

A estreptozotocina (STZ) é utilizada como modelo de indução do Diabetes, e mais recentemente, sua injeção intracerebroventricular (icv) tem sido utilizada como modelo animal de DA. Nosso objetivo neste trabalho é o de avaliar os efeitos causados por doses subtóxicas de STZ em uma linhagem de neuroblastoma sobre a cascata intracelular associada à sinalização de insulina. Os resultados confirmam a doação espontânea de NO pela STZ e sugerem que a droga é capaz de modular a cascata intracelular associada ao receptor de insulina devido à doação do radical livre. O perfil de produção de EROs induzido por STZ pode ser a causa da sua neurotoxicidade. Por fim, foi visto que o tratamento com STZ, bem como a indução de resistência à insulina, é capaz de impedir a formação de neuritos pelo tratamento com NGF. Dessa forma, este trabalho contribui para a elucidação dos mecanismos pelos quais a injeção icv de STZ pode causar algumas características de toxicidade neuronal semelhantes à DA. / Streptozotocin (STZ) has been used as an animal model for Diabetes and, more recently, its intracerebroventricular (icv) injection as an AD animal model. Our objective involves the assessment of the effects caused by subtoxic doses of STZ in a neuroblastoma cell line upon insulin signaling associated intracellular cascade. Results confirm STZ spontaneous NO donation and suggest that the drug is capable of modulating the intracellular cascade associated to insulin receptor due to the spontaneous donation of the free radical. Therefore, EROs production may play an important role in the mechanism linked to STZ induced neurotoxicity. Ultimately, it has been shown that STZ treatment, as well as insulin resistance alone, is capable of impair neurite outgrowth by NGF treatment. This work contributes for the elucidation of the mechanisms by which STZ icv injection may cause features similar to DA.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-02T14:17:31Z No. of bitstreams: 2 Tese - Wesley Gomes da Silva - 2016.pdf: 5910954 bytes, checksum: 7d938f9383af006973baacbf56b71a52 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-02T14:19:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Wesley Gomes da Silva - 2016.pdf: 5910954 bytes, checksum: 7d938f9383af006973baacbf56b71a52 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:19:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Wesley Gomes da Silva - 2016.pdf: 5910954 bytes, checksum: 7d938f9383af006973baacbf56b71a52 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-01-29 / The diagnosis of dementia is made through autopsy. The histopathological and immunohistochemical technique makes it possible to differentiate the subtypes of dementia by pre-established macroscopic and microscopic criteria. Banks brain, although recent, provide biological material quality for multidisciplinary research in normal subjects and with dementia. Objectives: To correlate clinical findings with neuropathological cases with dementia from the Brains Bank of Central of Brazil (BBCB); establish morphological patterns in macroscopic focal dementias; determine the prevalence of diagnosis of other types of dementia. Materials and Methods: Brain Study from autopsies of patients with neurodegenerative diseases of dementia clinic of the HC-UFG (Ethics Committee of the Protocol on research 0692007). The brains were processed following dissection and measurement protocol. Appropriate external and macroscopic morphological descriptions and coronal and sagittal sections were performed. Results: 15 brains, 9 female patients were studied, aged 10 to 89 years. The types of dementias found in BCBC were 5 cases of frontotemporal dementia (FTD), 3 Alzheimer's disease (AD), 3 patients had primary progressive aphasia (PPA) and corticobasal degeneration (CBD), 1 Huntington's disease, 1 disease Creutzfeldt-Jakob 1, Rasmussen's encephalitis and 1 depressive pseudodementia (Cotard’s syndrome). Described frontal gyrus supernumerary in 3 cases of CBD and 2 cases of FTD. Discussion: Most cases presented morphological pattern of the respective type of dementia according to the literature, except PPA with CBD. In BCBC material only 20% of AD cases were 27% and frontotemporal lobar degeneration (FTLD). Conclusion: The higher prevalence of dementia in BCBC was the type FTLD. The frontotemporal focal atrophy was the most observed type of change. The cases with FTD showed classic morphological patterns, while the PPA CBD was different standard literature. The BCBC will enable studies in various research areas. / O diagnóstico definitivo das demências é feito através de necropsia. Os exames anatomopatológico e imunoistoquímico possibilitam diferenciar os subtipos de demência por critérios macroscópicos e microscópicos pré-estabelecidos. Os bancos de cérebros, apesar de recentes, fornecem material biológico de qualidade para pesquisas multidisciplinares de indivíduos normais e com demência. Objetivos: Correlacionar aspectos clínicos com alterações neuropatológicas de casos com demências provenientes do Banco de Cérebros do Brasil Central (BCBC); estabelecer padrões morfológicos macroscópicos nas demências focais; verificar a prevalência do diagnóstico de outros tipos de demências. Materiais e Métodos: Estudo de cérebros provenientes de necropsias de pacientes com doenças neurodegenerativas do ambulatório de demências do HC-UFG (protocolo do Comitê de ética em pesquisa 0692007). Os cérebros foram processados seguindo protocolo de dissecção e mensuração. Foram realizadas as devidas descrições morfológicas e macroscópicas externas e dos cortes coronais e sagitais. Resultados: Foram estudados 15 cérebros, 9 de pacientes do sexo feminino, com idade entre 10 a 89 anos. Os tipos de demências encontrados no BCBC foram: 5 casos de demência frontotemporal (DFT), 3 de doença de Alzheimer (DA), 3 casos com afasia progressiva primaria (APP) e degeneração corticobasal (DCB), 1 de doença de Huntington, 1 de doença de Creutzfeldt-Jakob, 1 de encefalite de Rasmussen e 1 de pseudodemência depressiva (síndrome de Cotard). Foi observado giro frontal supranumerário nos 3 casos de DCB e em 2 casos de DFT. Discussão: A maioria dos casos apresentou padrão morfológico do respectivo tipo de demência de acordo com a literatura, exceto APP com DCB. No material do BCBC apenas 20% dos casos foram de DA e 27% degeneração lobar frontotemporal (DLFT). Conclusão: A maior prevalência de demências no BCBC foi do tipo DLFT. A atrofia focal frontotemporal foi o tipo de alteração mais observada. Os casos com DFT apresentaram padrões morfológicos clássicos, enquanto que os de APP com DCB apresentaram padrão diferente da literatura. O BCBC possibilitará a realização de estudos em várias linhas de pesquisa.

As doenças neurodegenerativas (DN) estão entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos países ocidentais. Não há ainda um tratamento definitivo para estas neuropatias, mas estudos têm indicado mecanismos comuns de toxicidade que incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, apoptose e neuroinflamação. Adicionalmente, o efeito benéfico da neuroplasticidade induzida por fatores neurotróficos no retardamento ou inibição do processo neurodegenerativo também tem sido sugerido por muitos estudos. O beta-cariofileno é um sesquiterpeno bi-cíclico encontrado no óleo essencial de algumas plantas, e que possui efeito anti-inflamatório e antioxidante. Assim, este composto possui características e é capaz de induzir efeitos que o tornam um potencial candidato ao tratamento/prevenção dos processos envolvidos na neurodegeneração. Apesar disso, pouco se sabe sobre os efeitos e os mecanismos de ação do beta-cariofileno no processo de degeneração neuronal. Então, neste estudo, avaliou-se o efeito do beta-cariofileno em modelos celulares (PC 12) de neurotoxicidade que mimetizam in vitro os mecanismos moleculares envolvidos nas doenças de Parkinson, Huntington e Alzheimer, os quais, para efeitos práticos, denominaremos de \"modelos celulares de Parkinson, Huntington e Alzheimer\". Estes modelos são induzidos experimentalmente pela neurotoxina dopaminérgica iodeto de 1-metil 4-fenil piridina (MPP+), pela neurotoxina mitocondrial ácido 3-nitropropiônico (3NP) e pelo peptídeo neurotóxico B-amiloide (AB42), respectivamente. O beta-cariofileno apresentou efeitos benéficos nestes três modelos de neurotoxicidade, e adicionalmente induziu neuritogênese e a expressão de proteínas neurotípicas no modelo neuronal. Este é o primeiro estudo a demonstrar tais efeitos do beta-cariofileno. / Neurodegenerative diseases (ND) are among the leading causes of mortality and morbidity in Western countries. There is not a definitive treatment for these neuropathies, but studies have indicated common mechanisms of toxicity that include mitochondrial dysfunction, oxidative stress, neuroinflammation and apoptosis. Additionally, the beneficial effect of the neuroplasticity induced by neurotrophic factors on the retardation or inhibition of neurodegeneration has also been suggested by several studies. Beta-caryophyllene is a bicyclic sesquiterpene found in essential oils of some plants, and possesses anti-inflammatory and antioxidant effects. Thus, this compound has characteristics and is capable of inducing effects that make it a potential candidate for treatment / prevention of the processes involved in neurodegeneration. Despite this, little is known about the effects and mechanisms of action of beta-caryophyllene in the neuronal degeneration process. Then, this study evaluated the effect of beta-caryophyllene in cellular models of neurotoxicity (PC 12) that mimic in vitro the molecular mechanisms involved in Parkinson\'s, Huntington\'s and Alzheimer\'s diseases, which, for practical purposes, we will denominate \"Cellular models of Parkinson\'s, Huntington\'s and Alzheimer\'s diseases.\" These models are experimentally induced by the dopaminergic neurotoxin 1-methyl iodide, 4-phenyl pyridine (MPP+), by the mitochondrial neurotoxin 3-nitropropionic acid (3NP) and the neurotoxic peptide B-amyloid (AB42), respectively. Beta-caryophyllene showed beneficial effects on these three models of neurotoxicity, and additionally induced neuritogenesis and the expression of neurotypic proteins in the neuronal model. This is the first study to demonstrate such effects of beta-caryophyllene.

A neurodegeneração é um processo onde ocorre morte celular progressiva. O tráfego neuronal anterógrado e retrógado, e entre os compartimentos é essencial para a viabilidade celular. As proteínas Rabs pertencem à família de pequenas GTPases, com funções de tráfego de vesículas e organelas, para realizarem sua função as proteínas Rab podem recrutar proteínas motoras como as KIF 1B e KIF 5, responsáveis pelo transporte anterógrado mitocondrial. A associação do distúrbio do tráfego intracelular com doenças neurodegenerativas tem sido tema de estudos recentes. Com isso o objetivo do presente trabalho é analisar a expressão das proteínas Rab, bem como estudar as proteínas motoras que podem contribuir para o esclarecimento sobre os distúrbios no tráfego intracelular que antecedem a formação de agregados proteicos envolvidos em neurodegeneração. Para tanto, utilizou-se o modelo de tratamento com rotenona para indução de agregados em Ratos Lewis idosos que foram expostos a rotenona durante 4 semanas, em seguida foram avaliados os níveis de expressão das proteínas Rab no hipocampo, substância negra e locus coeruleus, por western blotting. Foram analisados também os níveis de expressão das proteínas motoras KIF1B e KIF5 antes e durante a formação de agregados proteicos, em culturas de células, de ratos Lewis neonatos, do hipocampo, substância negra e locus coeruleus tratadas com rotenona por 24 horas ou 48 horas nas concentrações de 0,1nM, 0, 3nM e 0,5nM. Foi observado diminuição dos níveis de expressão das proteínas Rab 1 nas regiões do hipocampo e locus coeruleus. Houve aumento de expressão das Rab 4,5 e 6 no hipocampo, porém na substância negra a expressão da Rab 1 aumentou e da Rab 6 diminuiu. Já no locus coeruleus in vivo a Rab 6 aumentou, mas as Rab 1, 5 e 11 diminuíram sua expressão. Já a expressão da KIF 5 aumentou com o tratamento de 0,1nM de rotenona e diminuiu após 0,5nM do xenobiótico por 48 horas in vitro, na mesma região. Na substância negra aumentaram as KIFs 1B e 5 após o tratamento com 0,5nM por 48 horas in vitro, mas diminuíram as KIF 1B e 5 após o tratamento com 0,3nM por 24 horas e KIF 5 após o tratamento com 0,1nM por 48 horas. Esses resultados permitem concluir que a expressão de proteínas importantes para o tráfego mitocondrial e de vesículas encontram-se alteradas e fazem parte dos eventos intracelulares que antecedem a neurodegeneração / Neurodegeneration is a process that leads to progressive cell death. The anterograde and retrograde neuronal traffic as well as the traffic between compartments are essential for cell viability. The Rab proteins belong to the small GTPases family with function of vesicles and organelle trafficking. Rab proteins can recruit motor proteins such as KIF 1B and KIF 5 that are responsible for anterograde mitochondrial transport. The association of intracellular traffic disturb with neurodegenerative diseases have been theme of recent studies. Thereat the objective of this study is analyze the expression of Rab and motor proteins that can contribute for the understanding about the disturb of the intracellular traffic that precedes protein aggregation involved in neurodegeneration. For this purpose it was employed the model of rotenone treatment for induction of aggregation in aged Lewis rats that were exposed to rotenone during 4 weeks in order to evaluate Rabs expression. The levels of motor proteins KIF 1B and KIF 5 expression were evaluated before and during the formation of protein aggregates in hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus cell cultures of neonates Lewis rats, exposed to rotenone for 24 hours or 48 hours in the concentrations of 0.1nM, 0.3nM or 0.5nM. It was observed decreased levels of Rab 1 expression in hippocampus and locus coeruleus. Rabs 4,5 and 6 were increased in the hippocampus, but in the substantia nigra the expression of Rab 1 increased and Rab 6 decreased. In the locus coeruleus the Rab 6 increased, but Rabs 1, 5 and 11 decreased. The expression of KIF 5 increased after 0.1nM of rotenone and decreased after the exposure to 0.5nM of for 48 hours in cultured cell from the locus coeruleus. In the substantia nigra the KIF1B and KIF 5 increased after treatment with 0.5nM for 48 hours in vitro, but these protein decreased after treatment with 0.3nM for 24 hours in vitro, and KIF 5 after treatment with 0.1nM for 48 hours. These results allow us conclude that the expression of important proteins for the mitochondrial and vesicles traffic are altered and participate of intracellular events that precede the neurodegeneration

Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas expressaram CD90, 105, 44 e 13 mas foram negativas para CD34 e 45. Isto significa que não são de origem hematopoiética; 98,74 ± 0,43% das células incorporaram BrdU em 24 horas. Após o isolamento, foi possível diferenciá-las em condrócitos ou osteócitos. Em situação controle, não foram evidenciadas células positivas para NF200. Por outro lado, ocorreu positividade em 10,75% ± 1,35 (p<0,0001) das células sob IBMX e, em 15,18% ± 1,12, sob a combinação cAMP e IBMX (p<0,0001). Foram registradas correntes de Na+ e K+ dependentes de voltagem, mas não potenciais de ação. A diferenciação foi inibida com PKAi (5,73% ± 0,42, p<0,0001), nifedipina (5,79% ± 0,98, p<0,0001), Ni2+ (7,06% ± 1,68, p<0,0001) e Cd2+ (0 ± 0, p<0,0001). Discussão. Isolou-se uma população de células-tronco estromais da medula-óssea de seres humanos que se mostrou multipotencial e auto-renovável. O aumento da concentração de AMPc no meio elevou a concentração de neurônios para 15%. A diferenciação parece depender da via PKA mas também envolve a concentração intracelular de Ca2+. Conclusão. O correto entendimento de como as células-tronco mesenquimais diferenciam-se pode contribuir para aumentar a eficácia do método e, talvez um dia, tornar possível o uso dessa ferramenta no campo clínico. / Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into chondrocytes and osteocytes. In a control situation, no NF200 positive cell was seen. On the other hand, 10.75% ± 1.35 (p<.0001) of positivity was seen under IBMX and 15.18% ± 1.12 in the combination of cAMP with IBMX (p<.0001). Na+ and K+-voltage gated currents were recorded. Differentiation was impaired with PKAi (5.73% ± 0.42, p<.0001), nifedipin (5.79% ± 0.98, p<.0001), Ni2+ (7.06% ± 1.68, p<.0001), and Cd2+ (0 ± 0, p<.0001). Discussion. We were able to isolate a population of stromal stem cells from the bone marrow of human subjects, since they were multipotential and self-renewable. Increasing the concentration of cAMP raised the percentage of neurons up to 15%. The differentiation seems to be dependent on the PKA pathway, but also involved the intracellular concentration of Ca2+. Conclusions. The complete understanding of how MSC differentiate can contribute to increase the efficiency of the method and thus make possible to use this powerful tool in the clinical practice.

Mutações na enzima Cu,Zn-superóxido dismutase (SOD1) estão associadas a casos familiares de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), uma doença neurodegenerativa motora fatal. Entretanto, a toxicidade das SOD1s mutantes não está totalmente compreendida. Sabe-se que o desenvolvimento da doença está associado ao acúmulo de lesões oxidativas em biomoléculas, mas o papel da SOD1 neste processo não está claro. Estudos com sistemas modelo são, ainda, necessários para desvendar os mecanismos envolvidos. Para contribuir na compreensão dos mecanismos de danos em DNA promovidos pela SOD1, foram realizados estudos in vitro com SOD1/H2O2/HCO3-, e estudos com neuroblastomas em cultura transfectados com SOD1 mutante G93A, característica de ELA. Através da quantificação de quebras em DNA plasmidial e dos níveis de 8-oxo-7,8-dihidro-2´-desoxiguanosina (8-oxodGuo) e 1,N2-eteno-2\'-desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo) em DNA de timo de bezerro, concluiu-se que o cobre liberado da SOD1 tem um papel central na formação de lesões no DNA promovidas pela SOD1 na presença de H2O2, e que o bicarbonato pode modular a reatividade do cobre liberado. Níveis aumentados de quebras no DNA, 8-oxodGuo e 1,N2-&#949;dGuo foram encontrados nos neuroblastomas transfectados com SOD1 G93A. Maior atividade de p53 foi também observada nestas células, indicando que o acúmulo de lesões no DNA pode desencadear o processo de apoptose neste modelo celular de ELA. Observou-se que a SOD1 pode estar associada à cromatina, e que a SOD1 G93A possui maior afinidade pelo DNA e maior atividade peroxidásica no núcleo. Estes resultados indicam que as lesões no DNA observadas no modelo celular de ELA podem ser diretamente promovidas pela SOD1 mutante. / Mutations in the gene encoding Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) have been linked to familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), a fatal motor neuron disease. However, the toxicity of mutant SOD1s was not completely understood. It is known that the development of the disease is associated with oxidative damage to biomolecules, but the role of SOD1 in this process is not clear. Model studies are still necessary to reveal the mechanisms involved. To understand the mechanism of DNA damage promoted by SOD1, in vitro studies with SOD1/H2O2/HCO3-, and studies with neuroblastoma cells transfected with the G93A ALS-mutant SOD1, were performed. Through the quantification of strand breaks in plasmid DNA and the quantification of 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxodGuo) and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) levels in calf thymus DNA, it was concluded that copper liberated from SOD1 has a central role in DNA damage promoted by SOD1 in the presence of H2O2, and that bicarbonate can modulate the reactivity of released copper. Increased levels of DNA strand breaks, 8-oxodGuo and 1,N2-&#949;dGuo were found in neuroblastoma cells transfected with G93A SOD1. Increased p53 activity was also observed in these cells, indicating that accumulation of DNA damage can lead to apoptosis in this ALS cellular model. Western blot analysis showed that G93A SOD1 is present in the nucleus, being associated to the DNA. Nuclear G93A SOD1 has identical superoxide dismutase-activity but displays increased peroxidase activity, when compared to wild-type. These results indicate that DNA damage observed in this ALS cellular model may be directly promoted by mutant SOD1.

As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-&beta;, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.

Introducão: o comprometimento cognitivo leve (CCL) é reconhecido como um estágio transicional sintomático entre o envelhecimento normal e a demência, particularmente a doença de Alzheimer (DA). Apresenta como subtipos principais o amnéstico (CCLa), com comprometimento de memória, e o não amnéstico (CCLna), que apresenta perda de outras funções, principalmente executivas, de atenção, de linguagem e visuoespaciais. Aparentemente o CCLna tem menor taxa de conversão para demências ao longo do tempo que o subtipo amnéstico, particularmente para a DA. Dessa forma, o CCLna poderia apresentar um perfil de biomarcadores diferente do CCLa no momento do diagnóstico. Estudos na literatura investigando o padrão de biomarcadores no CCLna como grupo independente são raros, alguns destes indicando perfil menos relacionado à DA no CCLna que o visto no CCLa. Segundo nosso conhecimento, não há estudos investigando concomitantemente volume e metabolismo cerebrais, além de biomarcadores no LCR de uma mesma amostra de CCLna, em comparação com CCLa e um grupo de idosos cognitivamente normais. Objetivo: investigar as alterações de volume e metabolismo cerebral em grupos de indivíduos com os subtipos amnéstico e não amnésico de CCL, comparativamente a voluntários idosos sem comprometimento cognitivo, com o intuito de avaliar se há concordância entre estas alterações. Avaliou-se ainda possíveis associações entre os perfis dos estudos de imagem com padrões classicamente descritos na para CCL em risco de evolução para DA, investigando ainda a existência de correlações entre destes achados com o dos diferentes biomarcadores no LCR e com dados clínicos. Métodos: cento e quatorze voluntários foram incluídos em três diferentes grupos: gCCLna (N = 38), gCCLa (N = 46) e GC (N = 30). Após entrevista clínica, exame neurológico e classificação por uma bateria de testes neuropsicológicos, estes foram submetidos a exames de RM cerebral (para excluir outras causas de comprometimento cognitivo e para análise de morfometria baseada em voxels - VBM) e de PET-18FDG cerebral. Analisou-se ainda os valores de biomarcadores no LCR (A?, tau e p-tau) de uma subamostra de pacientes (CCLna = 33, CCLa = 38). Resultados: os três grupos não apresentaram diferenças em relação às variáveis idade, escolaridade, sexo, fatores de risco cardiovascular (exceto por maior prevalência de dislipidemia no gCCLa) e hiperintensidades de substância branca na RM. Menores valores de mini-exame do estado mental foram observado nos grupos CCLa e CCLna em relação ao GC. O subgrupo amnéstico apresentou redução de volume em porções mediais e polares de ambos os lobos temporais em comparação com GC e gCCLna, além de áreas de redução do metabolismo no giro do cíngulo posterior e pré-cúneo direitos e giro temporal médio esquerdo em relação ao GC. Esse padrão de redução volumétrica e metabólica não foi visto no gCCLna, que demonstrou discreta redução volumétrica nos giros temporal inferior esquerdo e frontal médio direito em comparação com o GC. Nenhuma alteração metabólica persistiu no subgrupo não amnéstico após correção para efeito de volume parcial em comparação com o GC, havendo redução metabólica bilateral no giro frontal médio em comparação com o gCCLa. Não houve diferenças significativas nos biomarcadores de LCR entre os grupos CCLa e CCLna. Houve, porém, tendência de menores valores de peptídeo A? no gCCLa. Observou-se correlação positiva entre metabolismo no giro temporal médio esquerdo e rendimento em testes de memória; correlação negativa também foi observada entre os valores de A? e os de tau e p-tau no LCR. Conclusão: os grupos CCLa e CCLna apresentaram alterações de volume e metabolismo diferentes em comparação com o grupo controle, e estas alterações não apresentaram concordância entre si. Também não foram encontradas correlações entre os diferentes biomarcadores de imagem e no LCR, notando-se apenas correlação positiva entre metabolismo temporal e desempenho em testes de memória. O gCCLa apresentou padrões de metabolismo e volume cerebrais classicamente relacionados a risco de evolução para DA. Por outro lado, o grupo CCLna apresentou um padrão diferente de alterações metabólicas e volumétricas, com áreas menores de redução de volume e padrão mais heterogêneo de alterações metabólicas em relação ao grupo controle. O conjunto de achados de biomarcadores no gCCLna não é indicativo de nenhum perfil específico de evolução para demências / Introduction: Mild cognitive impairment (MCI) is presumably a transitional stage between normal aging and dementia, particularly Alzheimer\'s disease (AD). Non-amnestic subtypes (naMCI) present with executive, attention, visuospatial and language dysfunctions. They have a lower conversion rate to dementia compared to amnestic subtypes (aMCI). Investigations regarding biomarker profiles of naMCI as an independent group are scarce. To our knowledge there is no study investigating the brain volumetric and metabolic features, as well as the profile of cerebrospinal fluid (CSF) biomarkers of naMCI patients as a single group in comparison to aMCI and cognitively normal elderly patients (control group - CG). Objective: to investigate the brain volumetric and metabolic changes in individuals presenting amnestic and non-amnestic MCI subtypes in comparison to elderly volunteers without cognitive impairment, aiming to verify if there are agreements between these changes. Possible associations between the imaging profile of these groups and classical patterns of high risk for developing AD were also evaluated, as well as possible correlations between imaging biomarkers, CSF biomarkers and clinical data. Methods: a hundred and fourteen (114) patients were included in three different groups: naMCIg (N = 38), aMCIg (N = 46) and CG (N = 30). Patients underwent brain MRI (in order to exclude other causes of the cognitive impairment but also for VBM analysis) and [18F]FDG-PET. A subsample (naMCIg = 33, aMCIg = 38) also underwent a lumbar puncture in order to assess the profile of amyloid-ß peptide, tau and phosphorylated tau protein levels in the CSF. Results: There was no difference in CSF biomarkers, education years, age, gender and cardiovascular risk factors between the naMCI and aMCI groups, except for a higher prevalence of dyslipidemia in aMCI. The amnestic MCI group had lower rBGM in relation to control group in the precuneus, posterior cingulate and left medium temporal gyrus. Compared to aMCIg, naMCIg presented with bilateral prefrontal cortex hypometabolism, but without metabolic changes in relation to CG after correction for partial volume effect. Amnestic MCI group had bilateral temporal lobe volume reduction in comparison to naMCI and CG, particularly in the polar and mesial parts of the temporal lobe. Non-amnestic MCI presented with discrete volumetric reductions in comparison to CG, Conclusion: Volumetric and metabolic alterations were different and essentially discordant between aMCI and naMCI groups in comparison to CG. Amnestic MCI showed metabolic and volumetric profiles classically related to MCI due to AD, while naMCI group presented with less-significant areas of volumetric and metabolic reductions in relation to control group. Our non-amnestic MCI group probably represents a heterogeneous group with a different pattern of neurodegeneration than the classical MCI due to AD