INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

A comunicação entre sistema nervoso e imune contribui para a homeostasia. Em humanos, a convivência com portadores de doenças crônicas (\"caregiving\") é agente causador de alterações inclusive imunológicas. Modelos animais podem contribuir para a compreensão dos mecanismos aí envolvidos. Avaliamos aqui, em fêmeas sadias, as alterações decorrentes do convívio com parceira singenêica (C57/Bl6) portadora do melanoma B16F10. Os resultados mostraram que esta convivência, por 20 dias: 1) alterou o comportamento, sem modificar a concentração sérica de corticosterona; 2) aumentou a expressão de CD80 nas populações MHCII+CD11c+, no baço, mas não nos linfonodos; 3) diminuiu o percentual de células MHCII+CD80+ após cultura de medula óssea, por sete dias em meio com GM-CSF, IL-4 e LPS; 4) inibiu, parcialmente, a indução de uma reação de hipersensibilidade tardia; 5) não modificou o estabelecimento do melanoma. Assim, este modelo pode, com cautela, ser usado para o estudo das alterações imunes observadas em \"caregivers\". / The communication between the nervous and immune systems contributes to the homeostasis. In humans, living with chronic disease bearers (caregiving) is the causing agent of alterations including the immunological ones. Animal models can contribute for understanding the involved mechanisms. Herein, we evaluated, in healthy females, the alterations caused by cohabiting with a syngeneic (C57Bl/6) partner bearing the B16F10 melanoma. The results showed that such cohabitation for 20 days: 1) altered the behavior without modifying the corticosterone seric level; 2) increased the CD80 expression on MHC+CD11c+ cells at the spleen, but not those at the lymph node; 3) decreased the percentage of MHCII+CD80+ bone marrow cells cultured for 7 days in a GM-CSF, IL-4 and LPS medium. 4) partially inhibited the induction of a delayed type hypersensitivity; 5) did not modified the melanoma establishment. So forth, this model may cautiously be taken as a means for the study of immune alteration observed in caregivers.

O papel do complemento na modulação da resposta de células dendríticas não é bem entendido. Neste trabalho observamos que estas células produzirem proteínas do complemento e que o componente C3 regula positivamente a expressão de DC-SIGN, HLA-DR, CD1a, CD80 e CD86 e a produção de IL-6 e IL-12 por células dendríticas humanas. Também observamos, em modelo murino, menor expressão de MHC-II em células dendríticas C5aR-/-, a qual está associada com menor expressão do transativador de MHC-II; menor expressão de moléculas coestimuladoras nas células C3aR-/-, C5aR-/- e C5L2-/- e menor produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-6 em resposta a ligantes de TLR2 pelas células C3aR-/- e C5aR-/-. Conseqüentemente, a ausência de sinal pelos C3aR e C5aR, regula negativamente a habilidade destas células na indução da resposta de linfócitos T CD4+, modificando os níveis de proliferação e citocinas produzidas. De maneira conjunta, observamos participação do complemento na diferenciação e maturação de células dendríticas e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. / The role of complement in the modulation of dendritic cells functions remains elusive. Here we show that these cells are able to produce complement proteins and that complement C3 upregulates the expression of DC-SIGN, HLA-DR, CD1a, CD80 and CD86 and the production of IL-6 e IL-12 by human dendritic cells. We also observed, in a mouse model, lower expression of MHC-II in C5aR-/- dendritic cells, which is correlated to lower expression of MHC-II transactivator; lower expression of costimmulatory molecules in C3aR-/-, C5aR-/- and C5L2-/- cells and lower production of IL-12p40, IL-12p70 and IL-6 by C3aR-/- and C5aR-/- cells in response to TLR2 stimulation. In consequence to the absence of C3aR and/or C5aR signaling we observed that these cells have lower ability to induce CD4+ T cells proliferation and production of Th1 cytokines. Together our data show a participation of complement in dendritic cell differentiation and maturation and in the polarization of adaptative immune responses.

Imunidade protetora depende da geração e manutenção do repertório de linfócitos T de memória. A geração dessas células está correlacionada com a apresentação de antígenos pelas células dendríticas (DCs). O direcionamento de antígenos tem sido estudado como um novo método vacinal que consiste em entregar antígenos diretamente para DCs usando anticorpos monoclonais. O principal objetivo desse trabalho foi direcionar uma proteína de Plasmodium para a subpopulação DEC205+ de DCs. Camundongos foram imunizados e então desafiados dias depois, com esporozoítos de P. yoelii. A proteína direcionada não protegeu camundongos do desafio, mas a proteína não direcionada protegeu, alcançando níveis de proteção estéril em torno de 100% em alguns casos. Observamos correlação entre a quantidade dos anticorpos e a proteção relativa dos animais imunizados com a proteína não direcionada. Além disso, utilizando anticorpos monoclonais demonstramos que a região conhecida como major repeat pode ser utilizada como alvo direto de pesquisas em vacinas contra malária. / In general, protective immunity against many pathogens depends on the generation of memory T cells, and the survival of cells for a long period of time after initial contact with pathogens. We know that the generation of these cells is correlated with the activation of parasite-specific immune cells and the presentation of antigens for dendritic cell (DCs). Targeting antigens to DCs has been studied as a new vaccination method, delivering antigens directly to DCs using monoclonal antibodies. The goal was target circunsporozoite protein (CSP), from Plasmodium, to a DEC205+ (DC) subset. Mice were immunized and challenged days later using P. yoelii sporozoites. Targeting protein did not protect mice from challenge, but non-targeting CS lead to 100% of protection. We found correlation between levels of antibody with protection, and high levels of anti-CS IgG in mice immunized with non-targeting protein. Using monoclonal antibodies we were able to map major repeat as a potential target for new researches in malaria vaccine.

Células dendríticas (DCs) são centrais na indução da resposta imune e o desvio de sua diferenciação para macrófagos, no microambiente tumoral pode ser um mecanismo de escape do tumor frente à resposta imune. Assim, o objetivo deste projeto foi comparar, entre tecido neoplásico e não-neoplásico, a freqüência de DCs, macrófagos e mastócitos e da produção in situ das citocinas IL-4 e TNF-<font face=\"symbol\">a. Nesta análise observou-se maior quantidade de DCs (CD1a+ ou S100+), macrófagos (CD68+), mastócitos (azul de toluidina+) e células produtoras de TNF-<font face=\"symbol\">a no tumor do que no tecido pulmonar. No tecido pulmonar encontrou-se maior freqüência de células positivas para IL-4, assim como, entre células dissociadas de tecido fresco, observou-se maior freqüência de DCs maduras. Identificou-se também a expressão, por células tumorais ou do estroma pulmonar, do marcador CD83, característico de DCs ativadas, em 10 de 11 pacientes. O sobrenadante de cultura destas células CD83+ inibiu a ativação de linfócitos por DCs alogenêicas, mas esta atividade foi suprimida por anticorpos anti-CD83. / Dendritic cells (DCs) play a crucial role in the immune response and the deviation of its differentiation to macrophages in the tumor microenvironment may be a mechanism of escape of tumor from immune response. Thus, the aim of this project was to compare between affected and non-affected lung, the frequency of DCs, macrophages and mast cells and production in situ of IL-4 and TNF-<font face=\"symbol\">a. In this analysis, we observe higher amount of DCs (CD1a+ and S-100+), macrophages (CD68+), mast cells (toluidine blue+) and cells producing TNF-<font face=\"symbol\">a in the tumor than non-affected lung. In lung, we found higher frequency of cells IL-4+ and in lung digests we observed higher amount of mature DCs. We also identified the expression by tumor or stroma cells the CD83, present in activated DCs, in 10 of 11 patients. The supernatant of such cells CD83+ inhibited the activation of lymphocyte by alogeneic DCs, but this effect was decreased by anti-CD83.

A paracoccidioidomicose (PCM) é a micose sistêmica mais frequente no Brasil. Na última década, foi demonstrado que é possível enviar antígenos diretamente para as células dendríticas utilizando o anticorpo &#945;DEC205 e na presença de um estímulo de maturação, o resultado é a indução de uma resposta imunológica. Verificamos que o anticorpo &#945;DEC fusionado ao peptídeo P10 induziu uma resposta por células produtoras de IFN-&#947; após uma única dose em relação à administração de P10, mesmo tendo sido administrado em uma concentração menor. Entretanto, essa resposta não se manteve após segunda dose do anticorpo. Após desafio dos animais com P. brasiliensis, imunizados com duas doses do anticorpo quimérico, detectamos níveis de IFN-&#947; e IL-4 no tecido pulmonar estatisticamente maiores no grupo &#945;DEC/P10 e ISO/P10 em relação à administração de P10, todos em presença de Poly I:C. Em ensaios de terapia, verificamos no pulmão de camundongos tratados com o anticorpo quimérico, principal órgão envolvido em modelo animal de PCM, baixa concentração de IFN-&#947; e IL-10 em relação aos controles. Em adição, ficou evidente que nos animais tratados com o anticorpo &#945;DEC/P10 o tecido pulmonar está compatível com o tecido de animais não infectados, enquanto que na ausência de tratamento adequado encontramos aglomerados de leveduras e um tecido com aumento no infiltrado celular. Esses achados indicam uma boa evolução clínica em animais tratados e indicam que o direcionamento do P10 através do anticorpo quimérico &#945;DEC/P10, na presença de Poly I:C, é uma estratégia promissora para terapia contra P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most common systemic mycosis in Brazil. In the last decade, it was demonstrated that antigens can be directly target to the dendritic cells using the antibody &#945;DEC205 in the presence of a maturation stimulus, resulting in the induction of a strong immune response. We found that &#945;DEC205 antibody fused to peptide P10 induced great response by IFN-&#947; producing cells after a single dose in relation to the administration of P10, although it has been administered in a lower concentration. However, this response was not maintained after second dose of antibody. Animals challenge with P. brasiliensis, after immunization with two doses of the chimeric antibody, produced high levels IFN-&#947; and IL-4 in lung tissue significantly higher in &#945;DEC/P10 group in relation to the administration of P10, all in the presence of Poly I:C. In therapy assays, we found in the lungs of mice treated with the chimeric antibody, the main organ involved in an animal model of PCM, low concentration of IFN-&#947; and IL-10 compared to controls. In addition, it became evident that animals treated with &#945;DEC/P10 antibody have a lung tissue much closer to that of non-infected tissue, while in the absence of suitable treatment we find clusters of yeasts and tissue filled with cellular infiltrates. Altogether, these findings show a clinical improvement in treated animals and indicate that targeting of P10 through the chimeric antibody &#945;DEC/P10 in the presence of Poly I:C, is a promising strategy for therapy against P. brasiliensis.

Células produtoras de IFN-? e IL-17A são envolvidas na proteção contra infecção por Leishmania infantum (L. infantum). Ainda não está claro como o sistema imune coordena, ou o parasito manipula, o balanço entre Th1 e Th17 durante a leishmaniose visceral (LV). Utilizando RNAseq, PCR array e citometria de fluxo, nós demonstramos que, enquanto o padrão Th1 é altamente induzido, o perfil Th17 é inibido durante a infecção por L. infantum, e que as células B compõem uma fonte importante de IL-17A nesse modelo. Usando animais Nod2-/- e Rip2-/- nós caracterizamos essa via como um regulador negativo de células Th17 na LV. Por outro lado, a potente indução de Th1 foi dependente da sinalização via NOD2-RIP2 em células dendríticas CD8??+XCR1+, o que foi crucial para produção de IL-12 através da fosforilação de p38 e JNK. Como consequência, camundongos Nod2-/- e Rip2-/- tiveram defeito na resposta Th1, aumento de Th17, e maiores cargas parasitárias comparado com camundongos WT. Juntos, os dados mostram que a via de NOD2-RIP2 desempenha um papel importante na modulação da resposta imune adaptativa e promove proteção contra LV causada por L. infantum / IFN-? and IL-17A-producing cells are described to be related to protection against Leishmania infantum (L. infantum) infection. How the immune system coordinates, or the parasite manipulates, the balance between Th1 and Th17 during visceral leishmaniasis (VL) is still unknown. We showed here that Th17 is suppressed during L. infantum infection and B cells are an important source of IL-17A in this model. By using Nod2-/- and Rip2-/- mice we characterized this pathway as a negative regulator for Th17 cells in VL. On the other hand, the high level of Th1 induction was dependent on the NOD2-RIP2 signaling in CD8?+XCR1+ dendritic cells (DCs), which was crucial for IL-12 production through the phosphorylation of p38 and JNK. As a consequence, Nod2-/- and Rip2-/- mice showed a Th1 defective response, more Th17, and higher parasite loads compared to WT mice. Together, the data demonstrate that NOD2-RIP2 signaling pathway plays a role in shaping adaptive immunity and promotes protection against VL caused by L. infantum

A predisposição genética associada à predisposição dos neonatos em gerar uma resposta do tipo Th2 ao alérgeno pode favorecer o desenvolvimento de alergia no período neonatal. O presente projeto tem como proposta investigar os mecanismos regulatórios decorrentes da imunização com ovalbumina pré-concepção na resposta IgE da prole. A imunização materna transfere intensamente anticorpos à prole pelas vias placentária e da amamentação. Além disto, a imunização materna é capaz de inibir o desenvolvimento da resposta IgE da prole, aumentar a expressão de CD80 nas células dendríticas (DCs) da prole e manter equilibrado o percentual de células TCD4+CD25+FoxP3+. As DCs da prole co-cultivadas com células T antígeno-específicas induzem células T reguladoras. A imunização materna influencia diretamente no sistema imune do neonato essencialmente por anticorpos que impedem a sensibilização da prole e modulam negativamente a resposta alérgica. / Genetic predisposition in association to the predisposition of neonates to generate a Th2-type response to the allergen can favor the development of allergy in the neonatal period. This project aimed to investigate the regulatory mechanisms in the preconception immunization with ovalbumin in the offspring IgE response. Maternal immunization transferred intensively antibodies to offspring through both placenta and breastfeeding routes. Moreover, maternal immunization is able to inhibit the development of IgE response of the offspring, increase the CD80 expression on dendritic cells (DCs) from offspring and to maintain balanced the percentage of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells. The DCs from offspring co-cultured with antigen-specific T cells induce regulatory T cells. Maternal immunization directly influences the infant\'s immune system mainly by antibodies preventing the offspring sensitization and negatively modulating the allergic response.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos (APCs). Foi proposto que as DCs selecionam os Ags que serão apresentados em MHC-II baseado na presença de ligantes para TLR na partícula fagocitada. Contudo, esse fenômeno não foi estudado em classe I. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar se o acoplamento de Ags particulados a um agonista de TLR melhoraria a apresentação cruzada (AC) dos mesmos por DCs humanas tratadas com as moléculas acopladas. Nós vimos que a presença de um ligante de TLR no material fagocitado não contribuiu nem para a maturação do fagossomo, nem para a via endossômica de AC. A AC não envolve acidificação endossômica e depende de moléculas de MHC recém-sintetizadas do retículo endoplasmático. Nossos dados confirmam também a importância do estado de maturação das DCs para a indução de proliferação de LT CD8+, embora este não tenha sido associado com o nível de apresentação do complexo MHC-I/peptídeo, ou com as moléculas normalmente utilizadas para indicar a maturação das DCs. / Dendritic cells (DCs) are the main antigen presenting cells (APCs). It was proposed that DCs select the Ags that will be presented at their surfaces on class II based on the presence of a TLR-ligand on the cargo. However, the relevance of the coupling of the Ag to a TLR-ligand on class I was not yet addressed. Thus, the goal of this study was to investigate whether the coupling of particulate Ags to a TLR-agonist improve the cross-presentation (CP). We saw that the CP does not involve endosomal acidification and it relies on newly synthesized MHC-I molecules from the endoplasmic reticulum. Also, the presence of a TLR-ligand on the cargo neither contributed to the phagosome maturation nor to the endosomic route of CP. Furthermore, the maturation status of DCs was crucial for the induction of CD8+ T cells proliferation. Although the coupling of the Ag to the adjuvant has neither changed the expression of the markers related to maturation nor the presentation of the complex MHC-I/peptide at the DC surface, it affected its capacity of stimulating CD8+ T cells.

Células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos usadas em estratégias imunoterapêuticas, como as que utilizam híbridos de DCs e células tumorais. Este projeto avaliou a possibilidade de utilizar, como parceiro de fusão das DCs, células de linhagem tumoral previamente transfectadas com mRNA amplificado de células tumorais contra as quais se pretende induzir resposta. Os híbridos foram capazes de induzir uma resposta antígeno-específica e foi possível enriquecer uma célula com antígenos de outra, uma vez que células transfectadas passaram a apresentar mRNAs da célula doadora, e expressar GFP quando a célula doadora era positiva para GFP. Foi possível amplificar integralmente o mRNA para GFP e amplificar os mRNAs de uma célula, gerando um material contendo mRNAs do preparado inicial mas incapaz de aumentar a expressão das moléculas avaliadas nas células transfectadas, mostrando que o protocolo ainda precisa ser aperfeiçoado. Em conjunto, os resultados mostraram que a estratégia de imunoterapia aqui explorada é promissora e merece maior investigação. / Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells widely used in immunotherapy strategies, as the ones that utilize dendritic cell tumor cell hybrids. The present project evaluated the possibility of using cells from tumor cell lines, which were previously transfected with mRNA amplified from tumor cells against which a response is aimed, to fuse with DCs. The hybrids were able to induce a specific immune response. Also, it was possible to enriched one cell with antigens from another one, since transfected cells increased the amount of mRNAs from the donator cell, and expressed GFP when the donator cells expressed this protein. It was possible to successfully amplify the GFP specific mRNA. The mRNAs amplified from RNA of different cell lines contained mRNAs that were present in the total extracted RNA, but were not able to increase the expression of the molecules we attempted to detect in the transfected cells, showing that the protocol still need to be improved. Together, these results show that this new strategy is promising and deserves further investigation.