Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-29T19:15:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-29T19:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T19:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2011-08-31 / Dermatophytes comprise a group of filamentous fungi of great interest on public health because of their ability to parasitize keratinized tissues, such as skin, hair and nails, and for their wide distribution in the world. As a consequence of this parasitism, an infectious process of dermatophytosis is established, from which a variety of clinical manifestations can occur, affecting people of both genders and all age groups. Laboratory methods for mycological diagnosis do not always allow a clear an especific definition of the agent. In this study, different strategies for extraction of DNA, and molecular typing by PCR-RFLP, of seven dermatophyte species were assessed. Two target regions: ITS/rDNA and the topoisomerase II gene were evaluated, by testing three PCR protocols and three restriction enzymes (DdeI, HinfI, HaeIII). For the DNA extraction, the glass bead shaking technique for cell lysis, followed by Gustincich (1991) based mehod for DNA separation, demonstrated more advantages. Our results has demonstrated that the topoisomerase II gene is a suitable target region for identification of the seven major pathogenic dermatophyte fungal species, reinforcing previous studies, and pointed to a new PCR-RFLP protocol, which is based on a PCR of this gene using dPsD2 primer, followed by digestion of PCR products with HaeIII restriction enzyme. / Os dermatófitos compreendem um grupo de fungos filamentosos de grande interesse na área da saúde, devido à sua capacidade de parasitar os tecidos queratinizados, como a pele, pêlos e unhas, e à sua ampla distribuição no mundo. Como conseqüência desse parasitismo instala-se um processo infeccioso de dermatofitose, a partir do qual pode ocorrer uma diversidade de manifestações clínicas, acometendo pessoas de ambos os gêneros e de todos os grupos etários. Os métodos laboratoriais para o diagnóstico micológico nem sempre permitem uma clara definição do agente em nível de espécie. No presente estudo foram analisadas diferentes estratégias para a extração de DNA e para a identificação molecular por PCR-RFLP das principais espécies de dermatófitos. Duas regiões alvo, a região ITS/DNAr e o gene da topoisomerase II foram analisadas, testando-se três protocolos de PCR e três enzimas de restrição (DdeI, HinfI, HaeIII). Na extração do DNA, o método de lise utilizando pérolas de vidro e a separação do DNA com base no método de Gustincich (1991) demonstrou importantes vantagens. Nossos resultados demonstraram que o gene da topoisomerase II é uma região alvo adequada para identificação das sete principais espécies de fungos dermatófitos patogênicos, reforçando estudos anteriores, e apontaram para um novo protocolo de RFLP-PCR, que se baseia em uma PCR desse gene utilizando o primer dPsD2, seguido da digestão dos produtos obtidos com a enzima de restrição HaeIII.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao-simonebrmaifrede.pdf: 1273260 bytes, checksum: d5439bcf28dc75da348359e5efa529ef (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / INTRODUÇÃO: Onicomicose é a infecção da unha causada por amplo espectro de espécies fúngicas, incluindo leveduras e fungos filamentosos dermatófitos e nãodermatófitos. Devido à variável suscetibilidade dos diversos agentes etiológicos às drogas antifúngicas, o diagnóstico laboratorial vem sendo considerado uma ferramenta importante para se estabelecer a etiologia e auxiliar na escolha do tratamento da onicomicose. Com base na elevada porcentagem de falha terapêutica no tratamento da onicomicose, tem-se evidenciado o interesse na padronização de testes de suscetibilidade in vitro de fungos filamentosos. OBJETIVOS: Estabelecer a freqüência das onicomicoses em relação a outras dermatomicoses; definir a etiologia das onicomicoses através do isolamento e identificação dos fungos; comparar o padrão de suscetibilidade entre fungos dermatófitos e não-dermatófitos às drogas fluconazol, cetoconazol, itraconazol, miconazol, ciclopirox, terbinafina e griseofulvina. MÉTODOS: As amostras clínicas foram colhidas através de raspagem e/ou fragmentação da unha e o exame microscópico direto foi realizado através do tratamento destas amostras com hidróxido de potássio (KOH) a 20% e tinta Parker. As culturas foram realizadas nos meios de ágar Sabouraud dextrose adicionado de 0,05 mg.mL-1 de cloranfenicol e ágar Mycose, incubados à temperatura ambiente e por um período de até 15 dias. A identificação dos fungos filamentosos foi baseada na observação de suas características macroscópicas e microscópicas e os testes de suscetibilidade in vitro a drogas antifúngicas foram baseados no Documento M38-A do CLSI. RESULTADOS: O diagnóstico laboratorial das dermatomicoses foi estabelecido em 69% dos 1.008 pacientes com lesões sugestivas de dermatomicoses encaminhados ao Laboratório de Diagnóstico Micológico do Depto. de Patologia / UFES, no período de 12/03/2004 a 14/08/2008. Onicomicose foi diagnosticada em 333 pacientes e os grupos de fungos mais isolados foram: leveduras 55,6%, fungos filamentosos não-dermatófitos 27,2% e dermatófitos 17,3%. Fungos dermatófitos foram mais inibidos in vitro que fungos não-dermatófitos. As drogas fluconazol e griseofulvina inibiram apenas fungos dermatófitos, enquanto a terbinafina foi a droga que mais inibiu os dois grupos de fungos e em baixas concentrações. A quantificação do inóculo por contagem em hemocitômetro e em placas de ágar Sabouraud revelou que o acerto do inóculo em espectrofotômetro pode ter uma boa correspondência se estabelecido em faixas de transmitância diferenciadas para os diversos tipos de fungos. CONCLUSÃO: É necessário estabelecer o diagnóstico laboratorial das onicomicoses, já que estas podem ser causadas por diversos agentes etiológicos e com diferentes suscetibilidades in vitro a várias drogas antifúngicas. / INTRODUCTION: Onychomycosis is the nail infection caused by a wide spectrum of fungi species, including yeasts, dermatophyte and nondermatophyte mould. Due to the variable susceptibility of the several etiologic agents to the antifungal drugs, the laboratorial diagnosis is being considered an important tool to establish the etiology and to help in the choice of the treatment of onychomycosis. Based on the high percentage of therapeutic flaw in the treatment of onychomycosis, there has been some evident interest in the standardization of the susceptibility tests in vitro of filamentous fungi. OBJECTIVES: To establish the frequency of the onychomycosis in relation to other dermatomycosis; to define the etiology of the onychomycosis by the isolation and identification of the fungi; to compare the pattern of susceptibility among dermatophytes and nondermatophytes mould to drugs such as fluconazole, cetoconazole, itraconazole, miconazole, ciclopirox, terbinafine and griseofulvine. METHODS: The clinical samples were collected by the scratching and/or fragmentation of the nail and the direct microscopic examination was made by the treatment of these samples with potassium hydroxide (KOH) at 20% and Parker ink. The cultures were made in dextrose agar Sabouraud with 0,05 mg.mL-1 of cloranphenicol and agar Mycosel, incubated to room temperature and for a period of up to 15 days. The identification of the filamentous fungi was based on the observation of its macroscopic and microscopic characteristics and the tests of susceptibility in vitro to the antifungal drugs were based on CLSI M38-A reference method. RESULTS: The laboratorial diagnosis of the dermatomycosis was established in 69% of the 1.008 patients with lesions that suggested dermatomycosis sent to the Laboratory of Mycologic Diagnosis from the Dept. of Pathology / UFES, in the period of 03/12/2004 to 08/14/2008. Onychomycosis was diagnosed in 333 patients and the groups of more isolated fungi were: yeasts 55,6%, nondermatophyte mould 27,2% and dermatophytes 17,3%. Dermatophytes were more inhibited in vitro than nondermatophytes ones. Drugs such as fluconazole and griseofulvine inhibited just dermatophytes fungi while terbinafine was the drug which most inhibited both groups of fungi and in low concentrations. The quantification of the inoculum for counting in haemocytometer and in plates of agar Sabouraud revealed that the correctness of the inoculum in espectrofotometer may have established a good correspondence in transmission bands differentiated for the various types of fungi. CONCLUSION: It is necessary to establish the laboratorial diagnosis of the onychomycosis, as these may be caused by several etiologic agents and with different susceptibilities in vitro to several antifungal drugs.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Adrielle Hoffmann.pdf: 1434617 bytes, checksum: 427eb50baa714de01ab9deab183c0308 (MD5) Previous issue date: 2011-08-10 / As onicomicoses, infecções fúngicas de unhas, são causadas por fungos filamentosos dermatófitos e não-dermatófitos e leveduras e representam as micoses superficiais mais difíceis de serem diagnosticadas e tratadas. O tratamento é através do uso tópico e/ou oral com drogas antifúngicas e pode ainda envolver a remoção da unha. O uso de agentes tópicos concomitante à terapia sistêmica leva à melhores resultados clínicos e micológicos. A eficácia da associação medicamentosa pode estar associada à ação complementar entre as drogas, envolvendo diferentes níveis de penetração ungueal e, dependendo dos antifúngicos, de diferentes alvos de ação na célula fúngica. O objetivo do presente estudo consistiu em estabelecer a ocorrência de fungos filamentosos na etiologia das onicomicoses e a suscetibilidade in vitro destes às drogas terbinafina, ciclopirox olamina, cetoconazol e itraconazol, conforme o documento M38-A2 (2008) do CLSI. Foi tambem avaliada a combinação entre estas drogas antifúngicas através do cálculo do índice fracionário de concentração inibitória (IFCI). Nossos resultados demonstraram que prevalência das onicomicoses, no período de janeiro de 2009 a abril de 2011, em Vitória, ES, foi de 50% dentre as dermatomicoses. A maioria dos isolados (77%) foi obtido de pacientes do sexo feminino e o local de maior acometimento foram as unhas dos pés para ambos os sexos. As unhas das mãos foram mais acometidas por leveduras e as unhas dos pés, por fungos filamentosos. Em geral, os gêneros de fungos filamentosos mais predominantes na etiologia das onicomicoses foram Trichophyton spp (21,7%), Fusarium spp. (11,2%) e Scytalidium spp.(8,4%). Para fungos filamentosos, os testes de suscetibilidade in vitro mostraram que isolados de dermatófitos foram mais sensíveis que isolados do grupo não-dermatófitos. Entre os nãodermatófitos, Fusarium spp. foi menos inibido que Scytalidium spp., que por sua vez, foi menos inibido que o dermatófito Trichophyton spp. Dentre as combinações testadas não houve nenhum efeito antagônico e,, com exceção daquela entre itraconazol e cetoconazol, as demais apresentaram efeito sinérgico sobre algum isolado. A combinação entre drogas apresentou maiores índices de sinergismo para o gênero Scytalidium spp. O melhor resultado para este gênero foi também obtido pela combinação itraconazol e terbinafina / The onychomycosis, fungal nail infections, are caused by filamentous fungi dermatophytes and non-dermatophytes and yeasts and represent the most difficult superficial mycosis to be diagnosed and treated. Treatment involves use of topical and/or oral antifungal drugs, as well as removal of the nail. The use of topical agents concomitant to systemic therapy leads to better clinical and mycological results. The efficacy of combination therapy may be associated with a complementary action between the drugs, involving different levels of nail penetration and, depending on the antifungal, different targets of action in the fungal cell. The purpose of this study was to establish the occurrence of filamentous fungi in the etiology of onychomycosis and in vitro susceptibility to the drugs terbinafine, ciclopirox olamine, ketoconazole and itraconazole, according to document M38-A2 (2008) CLSI. It was also evaluated the combination among these antifungal drugs by calculating the fractional inhibitory concentration index (FICI). Our results showed that the prevalence of onychomycosis in the period from January 2009 to April 2011, in Vitoria, ES, Brazil, was 50% among the dermatomycosis cases. Most of the isolates (77%) were obtained from female patients and toenails were the local with greater involvement for both sexes. The fingernails were more affected by yeast and toenails, by filamentous fungi. In general, the genera of filamentous fungi more prevalent in the etiology of onychomycosis was Trichophyton spp (21.7%), Fusarium spp. (11.2%) and Scytalidium spp. (8.4%). For filamentous fungi, the in vitro susceptibility testing showed that dermatophytes were more susceptible than non-dermatophytes isolates. Among non-dermatophytes, Fusarium spp. was less inhibited than Scytalidium spp., which in turn, was less inhibited than the dermatophyte Trichophyton spp. Among the combinations tested, there was no antagonistic effect and,, with exception of ketoconazole and itraconazole, those ones showed synergistic effect for isolates. The best results were presented for combinations involving itraconazole and terbinafine. The drug combination with greater synergistic effect was observed for genus Scytalidium spp. being that the combination itraconazole and terbinafine presented also the best results for this genus

INTRODUÇÃO: Infecções fúngicas superficiais podem ser causadas por dermatófitos, leveduras ou fungos filamentosos não dermatófitos. O tipo de lesão desenvolvida eventualmente se correlaciona ao agente etiológico, à capacidade de resposta imunológica do hospedeiro, ao sítio anatômico da lesão e tecido afetado. A proposta desse trabalho é isolar e identificar agentes de onicomicose em pessoas idosas (acima de 60 anos de idade), que frequentemente apresentam alteração da resposta imune. CASUISTICA E MÉTODOS: A técnica de identificação de fungos foi a análise do resultado conjunto do exame micológico direto, isolamento e microcultura do raspado ungueal. Escamas subungueais e escamas interdigitais foram coletadas de 35 pessoas idosas, com suspeita clínica de onicomicose, institucionalizados em duas casas assistenciais no município de São Bernardo do Campo, SP, Brasil. RESULTADOS: Os materiais coletados foram analisados e, no raspado ungueal, observou-se 18 (51,40%) resultados positivos no exame direto e 15 (44,40%) no isolamento. Os dermatófitos foram evidenciados em 8 (44,40%) dos isolados, identificando-se 5 (27,80%) como Trichophyton rubrum e 1 (5,60%) de cada um como Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes e Microsporum gypseum. O segundo grupo mais isolado foram 7 (38,90%) leveduras, identificadas como: 3 (16,70%) Candida guilliermondii, 2 (11,10%) Candida parapsilosis e 1 (5,60%) Candida glabrata, 1 (5,60%) Trichosporon asahii. O último grupo foi representado por 3 (16,70%) isolados de fungos filamentosos não dermatófitos, identificados como: Fusarium sp, Aspergillus sp e Neoscytalidium sp, 1 (5,60%) de cada um. Trinta (85,70%) dos raspados interdigitais foram negativos e em 5 (14,30%), a identificação dos agentes coincidiu com o fungo causador da onicomicose (2 Trichophyton rubrum, 1 Trichophyton mentagrophytes, 1 Candida guilliermondii e 1 Fusarium sp). No grupo controle (9 pessoas idosas clinicamente sem lesão ungueal) realizou-se coleta interdigital, isolando-se Candida guilliermondii em apenas 1 (11,0%). CONCLUSÕES: Pelo método de identificação empregado, observou-se que os fungos causadores de onicomicoses encontrados neste trabalho estão de acordo com relatos da literatura recente; a apresentação clínica da unha com onicomicose por fungos filamentosos não dermatófitos foi indistinguível daquela por dermatófitos ou candidoses e, do ponto de vista etiológico, não se observou diferença entre a onicomicose de pessoas idosas institucionalizadas com os dados da ocorrência de onicomicose na população geral divulgados pela literatura / INTRODUCTION: Superficial fungal infections can be caused by dermatophytes, yeasts or filamentous non-dermatophyte fungi. The type of injury eventually correlates to the the etiologic agent, the ability of the host immune response, the anatomical site of the lesion and the kind of the affected tissue. The purpose of this study is to isolate and identify agents of onychomycosis in the elderly (people over 60 years old), who often have alterations in the immune response. MATERIAL AND METHODS: The technique for the identification of fungi was the analysis of the combined result of mycological examination, isolation and microcultures of nail scrapings. Subungual and interdigital scales were collected from 35 elderly with a clinical suspicion of onychomycosis, institutionalized in two care houses in the city of Sao Bernardo do Campo, SP, Brazil. RESULTS: The collected materials were analyzed and the nail scrapings displayed 18 (51.40%) positive results on direct examination and 15 (44.40%) in isolation. Dermatophytes were found in 8 (44.40%) isolates, 5 (27.80%) beeing identified as Trichophyton rubrum and 1 (5.60%) of each others as Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum gypseum. The second more isolated group were composed by 7 (38.90%) yeasts, identified as: 3 (16.70%) Candida guilliermondii, 2 (11.10%) Candida parapsilosis, 1 (5.60%) Candida glabrata, and 1 ( 5.60%) Trichosporon asahii. The last group was represented by 3 (16.70%) isolated of non-dermatophyte filamentous fungi, identified as Fusarium sp, Aspergillus sp and Neoscytalidium sp 1 (5.60%) of each. Thirty (85.70%) of the interdigital scrapings were negative and 5 (14.30%) positive, being the agents coincident with the onychomycosis causing fungi (2 Trichophyton rubrum, 1 Trichophyton mentagrophytes, 1 Candida guilliermondii and 1 Fusarium sp) . In the control group (9 elderly with clinically uninjured nail) interdigital collecting was held, isolating Candida guilliermondii in only one (11.0%). CONCLUSIONS: Using this identification method, it was observed that the fungi that cause onychomycosis found in this study are consistent with the reports in the recent medical literature, the clinical presentation of toenail onychomycosis caused by non-dermatophyte molds was indistinguishable from that due to candidosis or dermatophyte and, in terms of etiology, no difference was observed between the onychomycosis of the institutionalized elderly from the occurrence of onychomycosis in the general population disclosed in the literature

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico, que invade tecidos queratinizados causando infecções superficiais e cutâneas. Algumas drogas são usadas para o tratamento das dermatofitoses, sendo o ácido undecanóico (AUN) uma delas. O AUN é o mais tóxico dos ácidos graxos saturados de cadeia média, utilizado como medicamento de uso tópico. O estudo de expressão gênica e mecanismos regulatórios são fundamentais para ampliar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta à exposição a estes agentes citotóxicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos no processo adaptativo da exposição ao ácido undecanóico, através da análise global do transcriptoma e mecanismos regulatórios como o processamento alternativo. Para tanto o micélio de T.rubrum foi submetido ao ácido undecanóico por 3 e 12 h de exposição, em triplicata biológica, e o RNA resultante foi submetido ao sequenciamento por RNAseq. O sequenciamento gerou aproximadamente 58 milhões de reads por biblioteca, as quais foram filtradas e alinhadas com o genoma de referência utilizando-se os softwares FASTQC e bowtie2, respectivamente. A análise de expressão gênica diferencial foi feita por meio do pacote do Bioconductor DESeq e, para esta análise, foi utilizada a amostra de 0h como referência. Foram identificados 492 genes diferencialmente expressos em resposta ao AUN, sendo 385 e 210 genes modulados em resposta a 3 e 12 horas de exposição, respectivamente. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares envolvendo transporte transmembrana, degradação de xenobióticos, metabolismo de lipídeos e aminoácidos, secreção de enzimas proteolíticas e patogênese, sugerindo que o AUN ativa duas principais vias de sobrevivência em resposta a este agente estressor, a degradação e o efluxo da droga. Posteriormente, foram realizadas as análises de processamento alternativo quanto ao uso diferencial de exons por meio do algoritmo HTSeq e DEXSeq e retenção de introns utilizando-se algoritmos construídos na linguagem Perl. Os genes envolvidos em algum tipo de processamento alternativo estão relacionados com funções metabólicas variadas como tradução, transporte vesicular, metabolismo lipídico, biogênese ribossomal, sequência de ligação ao DNA, regulação da transcrição e processamento do pré-mRNA. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta de sobrevivência perante a exposição ao AUN. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is a filamentous fungus, anthropophilic that invades keratinized tissue causing superficial infections on the skin. Some drugs are used for the treatment of dermatophytosis, being the undecanoic acid (AUN) one of them. The AUN the most toxic of the saturated medium chain fatty acids, is used as a topical medicine. The study of gene expression and the regulatory mechanisms are fundamental to understand the molecular mechanisms involved in response to exposure of these cytotoxic agents. So, the aim of this study was to characterize the molecular mechanisms involved in the adaptive process of the exposure to undecanoic acid, by the global analysis of the transcriptome and regulatory mechanisms such as alternative splicing. To this end, the mycelium of T. rubrum was exposed to undecanoic acid for 3 or 12 hours in biological triplicate, and the resulting RNA was sequenced by RNA-Seq. The sequencing generated approximately 58 million of reads per library, which were filtered and aligned with the reference genome using the softwares and Bowtie2 and FASTQC, respectively. The analysis of differential gene expression was performed through the Bioconductor package DESeq and, for this analysis, we used as reference sample the 0h time. We identified 492 differentially expressed genes in response to UDA, being 385 and 210 genes modulated in response to 3 and 12 hours of exposure, respectively. These genes are related to various cellular processes involving the transmembrane transport, xenobiotics degradation, lipids and amino acids metabolism, secretion of proteolytic enzymes and pathogenesis, suggesting the activation of two major survival pathways in response to this stressor, degradation and drug efflux, by UDA. Also, the alternative splicing analysis was performed through the differential use of exons using the algorithms HTSeq and DEXSeq and intron retention using algorithms built in Perl language. The genes involved in some kind of alternative splicing are associated with various metabolic functions such as translation, vesicular transport, lipid metabolism, ribosomal biogenesis, DNA binding sequence, transcription regulation and processing of pre-mRNA. These results contribute to increase the knowledge of the molecular mechanisms involved in the survival response upon exposure to the AUN.

de pele é o tipo mais frequente, correspondendo a cerca de 25% de todos os tumores malignos registrados no Brasil. Há que se destacar que uma formulação de uso tópico foi desenvolvida pelo grupo para uso contra câncer de pele e o estudo da estabilidade acelerada desta formulação foi avaliado nesse trabalho. Os frutos da espécie S. lycocarpum foram coletados, secos, triturados, submetidos à extração ácido-base e o precipitado foi suspenso em etanol e filtrado. Os heterosídeos alcaloídicos, SS e SM, foram isolados por cromatografia em coluna a vácuo e purificados em CLAE semipreparativa. A formulação contendo extrato alcaloídico armazenada em temperatura ambiente (27 ± 2 oC) apresentou a melhor estabilidade física. Ensaios para avaliação da atividade antifúngica in vitro do extrato alcaloídico, SS, SM e aglicona (SD) foram realizados com cepas de fungos dermatófitos e Candida spp., sendo que a SM apresentou o menor valor de concentração inibitória. No ensaio de citotoxidade em células humanas de carcinoma espinocelular (A431) e células de fibroblastos de camundongos (L929) foi possível observar a toxidade do extrato alcaloídico e das substâncias, SS, SM e SD frente às células cancerígenas. No ensaio in vivo, os animais foram induzidos ao câncer de pele não-melanoma do tipo espinocelular com células A431 e verificou-se que apenas o grupo de animais tratados com a formulação Curaderm BEC 5 apresentou redução tumoral. Em contrapartida, o grupo tratado com formulação contendo extrato alcaloídico se comportou da mesma maneira que os grupos controle da formulação e controle negativo. Com auxílio da histologia confirmou-se que o câncer de pele induzido nos animais foi do tipo espinocelular. No ensaio imunoistoquímico foi utilizado o anticorpo caspase-3 para marcar as células em apoptose nos tumores, sendo que o maior número de células apoptóticas foi verificada no grupo tratado com a formulação Curaderm BEC 5. / Solanum lycocarpum A. Saint-Hilaire (Solanaceae), commonly known as wolf apple or wolf´s fruit, is a plant native of Brazil very common in the Brazilian savanna. High concentrations of steroidal alkaloids are found in S. lycocarpum fruits, and solasonine (SS) and solamargine (SM) are the most important ones. These two alkaloids present potential antifungal and anticancer activities. Dermatophytic fungi are the most common agents responsible for superficial mycoses in humans and animals, by infecting exclusively the stratum corneum of skin, hair and nails. Skin cancer is the most frequent type corresponding to roughly 25% of all the malignant tumors registered in Brazil. A topical formulation for skin cancer treatment was developed by our research group and its stability tests are reported in this work. The S. lycocarpum fruits were collected, dried, milled and submitted to acid-base extraction furnishing a precipitate, which was solubilized in ethanol and then filtered. The heterosidic alkaloids SS and SM were isolated by using vacuum column chromatography and purified by semi-preparative HPLC. The formulation containing the alkaloidic extract stored at room temperature (27 ± 2 oC) was more stable than the ones in other conditions. Antifungal in vitro test of the alkaloidic extract, SS, SM and the aglycone (SD) were performed with Candida spp and dermatophytic fungi strains. The alkaloid SM displayed the lower inhibitory concentration. The toxicity of the alkaloidic extract, SS, SM and SD was verified in a cytotoxicicity test performed with both cultured human cells of spinocellular carcinoma (A431) and mice fibroblast cells (L929). An in vivo cytotoxicicity test was performed by inducing non-melanoma skin cancer in mice with spinocellular cells A431, in which only the animals treated with a commercial formulation Curaderm BEC 5, showed tumor reduction. There was no statistical difference between the group treated with the formulation containing the alkaloidic extract and control groups. Histological analysis confirmed that the skin cancer induced in the animals were spinocellular type. In an immunohistoquimic test, caspase-3 antibody was employed to stain the cells in apoptosis in the tumors, showing that apoptotic cells were more numerous in the group treated with the formulation Curaderm BEC 5.

Dermatófitos são fungos filamentosos que infectam substratos queratinizados como pele, unha e cabelo em busca de nutrientes para se desenvolverem e permanecerem no hospedeiro. Pertencem aos gêneros Epidermophyton, Microsporum ou Trichophyton, os quais, dependendo de seu habitat natural, são classificados em espécies geofílicas, zoofílicas ou antropofílicas. O uso indiscriminado de antifúngicos levou à seleção de cepas resistentes, e o comportamento invasivo desses patógenos em pacientes imunodeprimidos aumentou nos últimos anos, dificultando o tratamento das dermatofitoses. Há, portanto, a necessidade de estudos para um melhor entendimento da biologia dos dermatófitos devido as suas importâncias médica e/ou veterinária e o escasso conhecimento da interação destes patógenos com os hospedeiros. No presente trabalho, analisamos oito espécies de dermatófitos: Arthroderma benhamiae, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans e Trichophyton verrucosum. Análises de genômica comparativa e de expressão de genes potencialmente envolvidos na degradação de queratina foram realizadas. Além disso, efetuamos o sequenciamento genômico em larga escala de uma das linhagens. A estrutura dos genes sub3, sub5 e sub7, que codificam serina endopeptidases com atividade queratinolítica, mep3 e mep4, que codificam proteínas pertencentes ao grupo das metaloendopeptidases, dppV, lap1 e lap2, que codificam exopeptidases, foi analisada por meio de ferramentas computacionais. Essas análises revelaram que os genes que codificam proteases possuem alto grau de conservação em suas estruturas, que é menor quando comparadas apenas suas regiões não codificadoras. As análises permitiram também a identificação em regiões promotoras de consensos específicos a gêneros de dermatófitos. Observamos que o acúmulo de transcritos destes genes, avaliados durante o cultivo em queratina, mimetizando o processo infeccioso, não está correlacionado à similaridade das sequências gênicas entre as espécies. Não encontramos correlação entre o nicho preferencial dos dermatófitos e suas sequências gênicas ou níveis transcricionais. Observamos que, na grande maioria das vezes, genes que codificam endo e exopeptidases, possuem acúmulo de transcritos em períodos iniciais de degradação de queratina. Nossos resultados sugerem que diferenças pontuais na sequencia gênica, diferenças em regiões promotoras ou, até mesmo, expressão variável destes genes que codificam um conjunto proteico com funções sinérgicas e provavelmente compensatórias, contribuam para os diferentes graus de reações inflamatórias no hospedeiro, bem como para a especificidade patógeno-hospedeiro. / Dermatophytes are filamentous fungi that infect keratinized substrates such as skin, nail and hair, searching for nutrients for their development and permanence in the host. They belong to the genera Epidermophyton, Microsporum or Trichophyton, and, depending on their natural habitat, are classified into geophilics, zoophilics or anthropophilics species. The indiscriminate use of antifungals has led to the selection of resistant strains, and the invasive behaviour of these pathogens in immunocompromised patients increased in the last years, hampering the treatment of the dermatophytoses. Therefore, there is a need of studies for a better understanding of the biology of the dermatophytes due to their medical and/or veterinary importance and the scarce knowledge about the interaction of these pathogens with their hosts. In this work, we analyzed eight species of dermatophytes: Arthroderma benhamiae, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, and Trichophyton verrucosum. Comparative genomics and gene expression analyses of genes potentially involved in keratin degradation were performed. Moreover, we performed a large-scale genome sequencing of one of the strains. The structure of the genes sub3, sub5, and sub7, which encode serine endopeptidases with keratinolytic activity, mep3, and mep4, which encode proteins belonging to the group of the metalloendopeptidases, dppV, lap1, and lap2, encoding exopeptidases, were analyzed by computational tools. These analyses revealed that the genes encoding proteases possesses high degree of conservation in their structures, which are lower when their non-coding regions are compared. The analyses also allowed the identification of consensus in promoter regions, specific of dermatophytes genera. We observed that the transcripts accumulation of these genes, evaluated during the cultivation in keratin, mimicking the infection process, is not correlated to the gene sequence similarities among the species. We have not found any correlation between the preferential niche of dermatophytes and their gene sequences or transcription levels. Most of the times, we observed that genes encoding endo and exopeptidases accumulated transcripts at the beginning of keratin degradation. Our results suggest that specific differences in the genic sequencing, differences in promoter regions, or even variable expression of these genes encoding a set of proteins with synergic and probably compensatory functions, contribute to different levels of inflammatory reactions in the host, as well as to the host-pathogen specificity.

Onicomicose é um termo geral usado para definir infecção fúngica da unha. Seus agentes podem ser dermatófitos, leveduras ou fungos filamentosos não dermatófitos - FFNDs. Estes são comumente encontrados na natureza como saprófitas do solo e de restos vegetais e patógenos de plantas e têm sido considerados fungos patógenos primários de lesões cutâneas. Não existe até o momento terapêutica padrão para o tratamento de onicomicoses por Scytalidium spp., sendo escassos os dados na literatura pesquisada. Este trabalho tem como objetivo avaliar e comparar a resposta terapêutica a três abordagens diferentes de tratamento combinado para onicomicose por Scytalidium spp., todos associados à onicoabrasão. Foram selecionados 30 pacientes com diagnóstico de onicomicose provocada por Scytalidium spp., divididos em três grupos de dez, recebendo cada um os seguintes tratamentos, além da onicoabrasão: Grupo I: Terbinafina oral e esmalte de ciclopiroxolamina 8%, duas vezes por semana por 12 meses; Grupos II e III: Esmalte de ciclopiroxolamina 8%, duas e 5 vezes por semana, respectivamente, por 12 meses. Os parâmetros de avaliação da eficácia foram clínico e micológico ao término do tratamento e seis meses após. Foram utilizados os critérios de cura total, cura parcial, falha terapêutica aos 12 meses e recidiva/reinfecção no acompanhamento de seis meses. Vinte e cinto pacientes completaram o estudo. Não houve diferença estatística entre os grupos nos diversos parâmetros utilizados para avaliação da resposta terapêutica. A avaliação do resultado terapêutico mostra que ao final de 12 meses de tratamento apenas um paciente preencheu os critérios para cura total, e que 32% dos pacientes de todos os grupos apresentaram cura parcial. Todos os pacientes que completaram o estudo obtiveram melhora clínica, que se manteve no período de acompanhamento. A presença dos fungos na lâmina ungueal foi constante, mesmo com a melhora clínica. Embora não se possa afirmar qual a melhor forma de intervenção entre as três terapêuticas propostas devido ao pequeno número de pacientes do estudo, deduz-se, deste trabalho, que não houve vantagem na administração de terapia sistêmica concomitante. É possível considerar que a terapia tópica exclusiva, seja duas ou cinco vezes por semana, possa constituir opção mais adequada para o tratamento da onicomicose por Scytalidium spp. / Onychomycosis is a general term used to define a fungal infection of the nail. Its officials may be dermatophytes, yeasts and non-dermatophyte moulds. These are commonly found in nature as soil saprophytes and plant remains and plant pathogens. In recent years fungi have been considered primary pathogens of skin lesions. The main ones are Scopulariopsis and Scytalidium spp. There isnt by now a standard therapy for treatment of onychomycosis by Scytalidium spp., and there are few data in the literature. To evaluate and compare the therapeutic response to three different approaches of combined treatment of onychomycosis by Scytalidium spp., all associated with onicoabrasão. We selected 30 patients diagnosed with onychomycosis caused by Scytalidium spp, divided into three groups, each receiving the following treatments, besides receiving mechanical abrasion: Group I: oral terbinafine and ciclopirox 8% nail polish twice a week for 12 months; Groups II and III: Nail polish of ciclopirox 8% two and five times per week, respectively, for 12 months. Twenty-five patients completed the study. There was no statistical difference between groups in the various parameters used to evaluate therapeutic response. The evaluation of the therapeutic result shows that after 12 months of treatment only one patient met the criteria for cure, and that 32% of patients in all groups showed partial healing. All patients who completed the study achieved clinical improvement, which persisted during the follow-up period. The presence of fungi in the nail plate was constant, even with clinical improvement. Although one cannot say what the best form of intervention among the three therapeutic proposals due to the small number of patients studied, it appears in this study there was no advantage in the concomitant administration of systemic therapy. One may consider that topical therapy alone, or two or five times a week may be more suitable option for the treatment of onychomycosis caused by Scytalidium spp.

Orientador: Eduardo Bagagli / Resumo: Os dermatófitos são um grupo de fungos constituídos pelos gêneros Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum que têm a habilidade de degradar a queratina. É por essa razão que podem colonizar a pele do homem e dos animais, embora também possam crescer no ambiente, geralmente em solos com restos de queratina. As características morfológicas permitem a identificação e classificação taxonômica das espécies, mas realizar um diagnóstico baseado nestas características pode levar a erros. As técnicas moleculares ajudam a realizar diagnósticos mais rápidos baseados em uma identificação molecular e também têm possibilitado importantes avanços quanto aos estudos filogenéticos, sendo as sequências ITS1-5.8S-ITS2 as mais utilizadas. No entanto, estes marcadores não são suficientes para identificar e elucidar todas as relações filogenéticas e taxonômicas dos dermatófitos devido à ampla variedade de espécies existentes, -sendo necessário novos marcadores genéticos, como o intein PRP8. Os inteins são elementos genéticos parasitas, de natureza proteica, presentes em alguns fungos e estão associados a importantes genes altamente conservados. Ointein PRP8 está localizado nogenePRP8 que codifica para a proteína PRP8 associada ao complexo do spliciosoma. O presente estudo visa caracterizar o intein PRP8 em fungos dermatófitos, de forma a empregar estes elementos genéticos como marcadores moleculares para uma correta identificação destas espécies e elucidações das relações filogenéticas do grupo.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dermatophytes are a fungal group composed by the genera Trichophyton, Epidermophyton and Microsporum with the ability to degrade keratin. That is why they can colonize the skin of man and animals, although they can also grow in the environment, usually in soils with remains of keratin. The morphological characteristics allow the identification and taxonomic classification of the species, but a diagnosis based on these characteristics is difficult. Molecular techniques made diagnoses based on molecular identification faster and made possible important advances in phylogenetic studies, with ITS1-5.8s-ITS2 sequences being the most used. However, these markers are not enough to elucidate all the phylogenetic relationships and taxonomic of dermatophytes due to the wide variety of existing species, and new genetic markers may be needed for correct identification and phylogenetic studies, such as the PRP8 intein. Inteins are parasitic genetic elements of a protein nature present in some fungi and are associated with important highly conserved genes. The PRP8 intein is located within the PRP8 gene coding for the PRP8 protein associated with the spliciosome complex. The present study aims to characterize the PRP8 intein in dermatophyte fungi, in order to use these genetic elements as molecular markers for a correct identification of these species and elucidations of the phylogenetic relationships of the group. To accomplish this goal, 45 strains were molecularly characterized using th... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Orientador no exterior: Joshua Daniel Nosanchuk / Coorientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Carlos Pelleschi Taborda / Banca: Mauro Cintra Giudice / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Maria Aparecida de Resende Stoianoff / Resumo: Dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir os tecidos queratinizados do homem e dos animais, produzindo a dermatofitose. Biofilmes são comunidades estruturadas de microrganismos que se agrupam de maneira organizada a uma superfície ou que se aderem uns aos outros, dentro de uma matriz extracelular que eles mesmos produzem. Pela primeira vez, neste trabalho, foi descrita a formação de biofilmes por isolados clínicos e cepas ATCC de dermatófitos. Também se avaliou a sensibilidade das cepas frente aos antifúngicos convencionais e derivados sintéticos do ácido protocatecuico, determinando sua toxicidade e eficiência, tanto nas formas planctônicas como de biofilme. A identificação molecular dos isolados clínicos mostrou concordância com a identificação convencional. Todas as cepas e isolados foram capazes de formar biofilmes nos quatro meios testados. Trichophyton. rubrum ATCC 28189, ATCC MYA-4438, T. rubrum 143 e Trichophyton. mentagrophytes 66 produziram mais biomassa e matriz extracelular que T. mentagrophytes ATCC 11481 (p<0.05). RPMI 1640, BHI e DMEM estimularam maior produção de biomassa e matriz extracelular que o meio de queratinócitos. Todas as espécies foram capazes de formar biofilmes maduros em 72 h e uma rede de hifas circundadas em vários pontos por uma matriz extracelular foi mostrada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Na microscopia confocal, aparentemente os meios RPMI e DMEM produziram biofilmes mais espessos e o meio BHI, biofilmes mais densos e compactos. As melhores atividades anti-dermatófitos foram expressas pelos protocatecuatos de butila, pentila, hexila, nonila e decila, que exibiram baixa toxicidade para as células HaCat, NHOK e HepG2 nas regiões da concentração inibitória mínima (CIM). Nonila foi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dermatophytes are fungi that have the ability to invade keratinized tissues of human and animals, producing a condition called dermatophytosis. Biofilms are structured microbial communities that are organized by adhering to a surface, as well as to each other via an extracellular polymeric matrix. For the first time, in this work, the biofilm formation by ATCC strains and clinical isolates of dermatophytes was described. Also, the susceptibilities of the strains to conventional antifungal drugs and to the synthetic derivatives of protocatechuic acid were evaluated, determining its toxicity and efficacy. The molecular identification corroborated with the conventional one. All strains were able to form biofilms in the four media tested. Trichophyton. rubrum ATCC 28189, Trichophyton. mentagrophytes 66, and T. rubrum 143 produced more biomass, polysaccharide structures and extracellular matrix than T. mentagrophytes ATCC 11481 (p <0.05). RPMI 1640, BHI and DMEM stimulated increased production of biomass and extracellular matrix when compared to the medium for keratinocytes. All species were able to form mature biofilms in 72 hours. The SEM results showed a coordinated network of hyphae in all directions, surrounded by an extracellular matrix. In confocal microscopy, apparently RPMI and DMEM media produced thicker biofilms, while the BHI produced denser and compact biofilms. The greatest antidermatophytes activities were expressed by butyl, pentyl, hexyl, nonyl and decyl, protocatechuates, which exhibit low toxicity to HaCat, HepG2 and NHOK cells in the regions of minimal inhibitory concentrations (MIC). Nonyl was the compound with improved selectivity index for HaCat and HepG2 cells; for NHOK cells, the most selective compounds were nonyl and hexyl. Fluconazole, griseofulvin... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor