Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JODIE DO AMARAL SODARIO.pdf: 8284737 bytes, checksum: 0998005f311495779270bf94c7d0d236 (MD5) Previous issue date: 2016-03-15 / Oral cavity cancers are considered a public health problem throughout the world and represent the sixth most common cancer. The main risk factors include tobacco, alcohol, micronutrient deficiency and the human papillomavirus (HPV). The metabolism of alcohol depends on the alcohol dehydrogenase (ADH), a family of enzymes with high frequency of genetic polymorphisms that give different individuals a wide range of susceptibility to metabolites. Thus, different genetic polymorphisms in ADH can interfere with the individual risk of cancer associated with alcohol consumption. The aim of this case-control study was to evaluate the frequency of SNP (SNP: single nucleotide polymorphism) in ADH1B gene in 61 patients with cancer of the oral cavity and in 66 healthy controls. The molecular study employed methods including polymerase chain reaction (PCR) associated to restriction fragment analysis (RFLP). The frequencies obtained for the genetic polymorphisms were calculated and compared in both groups, as well as the possible association between these polymorphisms and the characteristics of tumors. The results showed a higher prevalence of these tumors in the male population (74.3%), at ages above 45 years (88.5%), smokers (85.2%) and alcoholic (82.0%). Among the prognostic factors evaluated, the advanced stage (III and IV) was observed in 73.8% of cases and the involvement of regional lymph nodes in 39.3% of cases. Allele frequencies for ADH polymorphism R48H on group of cases were L = 82.8 and A = 17.2%, while in the control group were 79.4% and G = A = 20.6%. The genotypic frequencies obtained for the case group were AA = 16.0%; GA = 2.0% and GG = 81.0%, while for the control group, genotype frequencies were AA = 15.0%; GA = 12.0% and GG = 74.0%. The overall survival evaluated for the group was 49.9%. Significant differences in allele and genotype frequencies were observed between the groups or between the prognostic aspects evaluated. Epidemiological data from the oral cavity cancer have shown worrying trends, stressing the importance of promoting more studies related to this particular type of cancer. / Os cânceres de cavidade oral são considerados um problema de saúde pública em todo o mundo e representam a sexta neoplasia mais comum. Os principais fatores de risco incluem o tabaco, álcool, deficiência de micronutrientes e o Papilomavírus humano (HPV). O metabolismo do álcool depende da álcooldesidrogenase (ADH), uma família de enzimas com alta frequência de polimorfismos genéticos, que conferem aos diferentes indivíduos uma grande variação de suscetibilidade aos seus metabólitos. Assim, diferentes polimorfismos genéticos na ADH podem interferir no risco individual ao câncer associado ao etilismo. O objetivo deste estudo caso-controle foi avaliar a frequência de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP: single nucleotide polymorphism) no gene ADH1B em 61 pacientes com câncer de cavidade oral e em 66 controles saudáveis. O estudo empregou métodos moleculares incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR) associada à análise de fragmentos de restrição (RFLP). As frequências obtidas para os polimorfismos genéticos foram calculadas e comparadas nos dois grupos, bem como as possíveis associações entre esses polimorfismos e as características dos tumores. Os resultados mostraram uma maior prevalência desses tumores na população masculina (85,2%), em idades acima de 45 anos (88,5%), tabagistas (85,2%) e etilistas (82,0%). Dentre os fatores prognósticos avaliados, o estádio avançado (III e IV) foi observado em 73,8% dos casos e o comprometimento de linfonodos regionais em 39,3% dos casos. As frequências alélicas para o polimorfismo ADH R48Hno grupo de casos foram G=82,8 e A=17,2%, enquanto no grupo controle foram G=79,4% e A=20,6%. As frequências genotípicas obtidas para o grupo de casos foram AA=16,0%; GA=2,0% e GG=81,0%, enquanto que para o grupo controle, as frequências genotípicas foram AA=15,0%; GA=12,0% e GG=74,0%. A sobrevida global avaliada para o grupo foi de 49,9%. Diferenças significativas nas frequências alélicas e genotípicas não foram observadas entre os grupos e nem entre os aspectos prognósticos avaliados. Dados epidemiológicos do câncer de cavidade oral têm mostrado tendências preocupantes, alertando para a importância de se promover maiores estudos relacionados a este tipo particular de câncer.

Os nossos resultados demonstraram a atividade enzimática prolina desidrogenase (PRODH) do produto do gene anotado como codificante de uma prolina oxidase na base dados do genoma de Trypanosoma cruzi. A atividade da proteína codificada por esse gene foi avaliada inicialmente por complementação de uma linhagem de S. cerevisiae deficiente na expressão funcional da PRODH endógena, e posteriormente mediante a obtenção da enzima recombinante ativa expressa em um sistema bacteriano. Nos estudos feitos tanto com leveduras complementadas com o gene PRODH, quanto com as formas epimastigotas de T. cruzi, observamos que nesses organismos há uma correlação positiva entre o nível intracelular de prolina livre e a resistência ao estresse oxidativo. Através dos ensaios de RT-PCR quantitativo observamos que o RNAm do gene da PRODH é regulado ao longo do ciclo de vida do T. cruzi, com maior nível de expressão no estágio epimastigota intracelular, perfil apresentado também em experimentos de Western Blotting, o que é concordante com o papel fundamental desse aminoácido na diferenciação dessa forma para as forma tripomastigota. Nos diferentes ensaios de localização subcelular observou-se que a proteína PRODH está presente na mitocôndria. A seqüência da PRODH apresenta um sítio EF-hand de ligação a Ca2+. Mostramos experimentalmente a funcionalidade desse sítio e a sua função na regulação da atividade por Ca2+. Em ensaios de respiração mitocondrial, utilizando prolina como substrato, foi mostrado que a prolina fornece elétrons à cadeia respiratória através da PRODH, transferindo elétrons e gerando FADH2 no mesmo nível e com a mesma eficiência que o complexo II (succinato desidrogenase). O análogo de prolina T4C, inibidor do transporte de prolina, causa uma diminuição do conteúdo de prolina livre intracelular, o que foi relacionado com uma diminuição significativa da sobrevivência do parasito em combinação com o estresse nutricional e oxidativo, mostrando a participação do metabolismo de prolina na resistência a esses estresses. Todos esses dados sugerem ademais que o transportador de prolina do parasita pode ser um alvo para drogas terapêuticas de interesse quando combinada com outras drogas que agem via geração de espécies reativas de oxigênio. / In the present work, we demonstrated the proline dehydrogenase enzymatic activity (PRODH) for the protein encoded by a gene annotated as a proline oxidase in the T. cruzi genome data base. This activity was shown firstly through complementation of a S. cerevisiae lineage lacking its endogenous PRODH gene. The PRODH gene was also expressed in a bacterial system and the active recombinant protein was obtained. Experiments performed with both, complemented yeasts and T. cruzi epimastigotes, showed a correlation between the intracellular free proline levels and the oxidative stress resistance. Quantitative RT-PCR assay revealed that the PRODH gene is differentially expressed across T. cruzi life cycle, being the highest expression level shown by the intracellular epimastigote form, this result was confirmed by Western blotting. Both results are in accordance with the fact that proline is essential for the differentiation of the intracellular epimastigote into trypomastigote. Subcellular localization assays showed that PRODH is present preferentially in the mitochondria. In silico analyses of the PRODH peptidic sequence indicated the presence of an EF-hand domain, wich is, usually, involved in Ca2+ binding. In fact, our results confirm not only the ability of such domain of binding Ca2+ but also its function in the activity regulation. Mitochondrial respiration assays using proline as substrate showed that PRODH transfers electrons and generates FADH2, with an eficience comparable to that of the complex II (Succinate dehydrogenase). Experiments using the T4C, an analogue of proline that inhibits the proline uptake, caused the depletion of the intracellular free proline, which was followed by the significantly decrement of the cellular viability of the parasites under nutritional and oxidative stresses. Taken together, this data suggest that proline transporters are promising drug targets when combined with other drugs that act by generating reactive oxygen species.

Na lesão renal aguda, os mecanismos de defesa atuam como genes protetores, como a proteína heat shock 32 (HSP 32), também conhecida como heme oxigenase-1 (HO-1). A polimixina B (PmxB) é um antimicrobiano nefrotóxico. O objetivo deste estudo foi caracterizar a participação da enzima HO-1 na toxicidade da PmxB em células LLC-PK1. As células foram submetidas aos seguintes tratamentos: Controle (CTL- 0µM); Hemin (indutor de HO-1, 25µM); Hemin II (250M), Protoporfirina de zinco (ZnPP - inibidor de HO-1, 10M,); Nitro-L-arginina-metilester (L-NAME - inibidor de iNOS, 0,1mM); PmxB (375µM); PmxB + Hemin (25µM de Hemin uma hora antes da PmxB); PmxB + ZnPP (10M de ZnPP uma hora antes da PmxB); PmxB + Hemin + L-NAME (25M de Hemin e 0,1mM de L-NAME uma hora antes da PmxB). Os grupos foram avaliados em 24 e 72 horas. Foram analisados os seguintes parâmetros: desidrogenase láctica (DHL), peroxidação lipídica (MDA), expressão gênica da HO-1 por RT-PCR, síntese protéica da HO-1 por imunofluorescência, óxido nítrico (NO) pelo método de Griess e expressão protéica da HO-1 e da iNOS por western blotting. Os resultados mostraram que a PmxB elevou o DHL com aumento dos níveis de MDA. O Hemin e a ZnPP elevaram as variáveis DHL, MDA e óxido nítrico (NO). O indutor de HO-1 incrementou a expressão protéica da HO-1 e da iNOS. A PmxB se confirmou como citotóxica e a HO-1 intensificou a lesão por mecanismos oxidativos. O efeito da HO-1 na lesão celular parece ser mediado pelo NO / In the acute kidney injury, the mechanisms of defense act as protector genes, as the protein heat shock 32 (HSP 32), also known as heme oxygenase-1 (HO-1). The polymyxin B (PmxB) is a nephrotoxic antimicrobial. The aim of this study was to distinguish the role of the HO-1 enzyme in the PmxB toxicity in LLC-PK1 cells. The cells were submitted to the following treatments: Control (CTL- 0µM); Hemin (inhibitor of HO-1, 25µM); Hemin II (250M), Zinc protoporphyrin (ZnPP - inhibitor of HO-1, 10M,); NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME - inhibitor of iNOS, 0,1mM); PmxB (375µM); PmxB + Hemin (25µM of Hemin one hour before the PmxB); PmxB + ZnPP (10M of ZnPP one hour before the PmxB); PmxB + Hemin + L-NAME (25M of Hemin and 0,1mM of L-NAME one hour before the PmxB). All groups were evaluated in 24 and 72 hours. The following parameters were analysed: lactate dehydrogenase (LDH), lipid peroxidation (MDA), genic expression of HO-1 by RT-PCR, protein syntesis of HO-1 by immunofluorescence, nitric oxide (NO) by Griess method and protein expression of HO-1 and of iNOS by western blotting. The results showed that PmxB increased the LDH and the levels of MDA. Hemin and ZnPP also increased the LDH variables, MDA and nitric oxide (NO). The inducer of HO-1 improved the protein expression of HO-1 and of iNOS. The PmxB was confirmed as a cytotoxic and the HO-1 intensified the failure by oxidative mechanisms. The effect of HO-1 in the cell injury seemed to be mediated by NO

Os elementos celulares que constituem o tecido xilemático de várias espécies vegetais são amplamente utilizados em diversos setores industriais, com inúmeras aplicações, como por exemplo, a geração de energia e produção de celulose e papel. A parede celular das células vegetais é formada basicamente por celulose, hemiceluloses e lignina. A formação dos polímeros de celulose e hemicelulose dependem exclusivamente do suprimento de precursores chamados de nucleotídeos-açúcares, tais como UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-xilose, UDP-arabinose, UDP-manose e UDP-galactose. A biossíntese da parede celular é altamente regulada do ponto de vista metabólico, e envolve a participação de várias enzimas que catalisam uma série de reações. Estratégias para alterar o fluxo metabólico destes precursores, podem originar modificações na deposição dos polissacarídeos na parede celular. Em particular, para o setor de celulose e papel tal estratégia pode resultar em fibras com determinadas características, melhorando a qualidade da polpa celulósica ou do papel produzido. O UDP-glucuronato é um dos principais precursores de polissacarídeos hemicelulósicos da parede celular, sendo formado a partir de UDP-glucose pela ação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22). Esta enzima é chave na regulação da biossíntese das pentoses e hexoses da parede celular de plantas superiores. Com o objetivo de modular a síntese dos polissacarídeos hemicelulósicos na parede celular, o presente trabalho analisou o impacto da superexpressão do gene ugdh em plantas transgênicas de tabaco. Foram realizadas análises da composição química da parede celular primária e secundária de folhas e caules, bem como avaliações morfológicas das fibras do tecido xilemático, e também cortes histológicos da região basal do caule. Da parede secundária do tecido xilemático determinou-se o conteúdo de lignina klason e solúvel, bem como a concentração dos carboidratos via HPAE-PAD. No tecido xilemático, todas as plantas transgênicas apresentaram aumento do conteúdo de xilose, embora não significativo. Juntamente, ocorreu um aumento de arabinose significativo em três linhagens transgênicas. Paralelamente, todas as plantas transgênicas tiveram redução do conteúdo de lignina klason, embora significativo em apenas uma linhagem. A relação hexoses/pentoses reduziu em todas as linhagens transgênicas, sendo significativa em três linhagens. As análises histológicas do caule mostraram que os transformantes apresentaram um aumento do tecido xilemático em relação às plantas controles. As análises morfológicas das fibras mostraram que todas as plantas transgênicas apresentaram reduções significativas no comprimento, em relação às plantas controles. No tecido foliar, o conteúdo de polissacarídeos da parede celular primária apresentou uma redução significativa em todas as plantas transgênicas. / The cellular elements that constitute the xylematic tissue of various plant species are widely used in diverse industrial sectors, with numerous applications, for example, the generation of energy and production of cellulose and paper. Plant cell walls are basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of cellulose and hemicellulose polymers depend exclusively on the supply of the precursors called nucleotide sugars, such as UDPglucose, UDP-glucuronate, UPD-xylose, UDP-arabinose, UDP-mannose and UDP-galactose. The biosynthesis of the cell wall is highly regulated from the metabolic point of view and involves the participation of various enzymes that catalyse a series of reactions. Strategies to alter the metabolic flux of these precursors could give rise to modifications in the deposition of polysaccharides in the cell wall. In particular, for the cellulose and paper sector these strategies could result in fibers with determined characteristics, improving the quality of the cellulose pulp or the paper produced. UDP-glucuronate is one of the principal precursors of the hemicellulose polysaccharides of the cell wall, which is formed from UDP-glucose by the action of UDPglucose dehydrogenase (EC1.1.1.22). This is a key enzyme in the regulation of the biosynthesis of the pentoses and hexoses in the cell walls of higher plants. With the objective of modulating the synthesis of the hemicellulose polysaccharides in the cell wall, the present study analysed the impact of the superexpression of the ugdh gene in transgenic tobacco plants. Chemical analyses were performed to determine the chemical composition of the primary and secondary cell walls of leaves and stems, as well as morphological evaluations of the fibers of the xylematic tissue and histological cuts through the base of the stem. The Klason and soluble lignin content as well as the carbohydrate concentrations (using HPAE-PAD) were determined in the secondary cell walls of the xylematic tissue. All of the transgenic plants showed an increase in xylose content, albeit not significant. A significant increase in arabinose content was observed in three transgenic lines. In parallel all the transgenic plants presented a reduction in Klason lignin, but only significant in one line. The ratio hexose/pentose was reduced in all transgenic lines, being significant in three. Histological analyses on the stem showed that the transformants presented an increase in the xylematic tissue when compared to the controls. The morphological analyses of the fibers showed that all the transgenic plants presented significant reductions in length when compared to the controls. In the leaf tissue, the polysaccharide content of the primary cell wall showed a significant reduction in all of the transgenic plants.

A restrição calórica (RC) é uma intervenção dietética capaz de estender a longevidade de vários organismos. O modelo para RC em Saccharomyces cerevisiae consiste da diminuição da concentração de glicose no meio de cultura e mostra um aumentado tanto do tempo de vida cronológico quanto replicativo. Nosso objetivo foi investigar experimentalmente a ação da RC, focando principalmente nas causas e consequências das modificações de geração de EROs mitocondriais e como estas estão associadas ao processo de envelhecimento. Em um primeiro período de estudos, verificamos quais as fontes mitocondriais de EROs, e comprovamos que uma quantidade significativa se origina de proteínas da matriz mitocondrial, e não da cadeia de transporte de elétrons. Nós estudamos a participação de glicose e de outras fontes de carbono sobre o tempo de vida cronológico em leveduras e mostramos que o aumento da longevidade promovida pela RC está associado à uma mudança de metabolismo fermentativo para respiratório, com participação da via de sinalização de glicose. No estágio realizado no laboratório do Professor Francis Sluse na Université de Liegè, Bélgica, estudamos a ação da RC em leveduras focando nas consequências das modificações no proteoma mitocondrial. Em nosso estudo proteômico, encontramos grandes modificações em proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos. Monitoramos a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e o tempo de vida cronológico de S. cerevisiae e as mutantes nulas bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ e gdh3Δ, que codificam a aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada citosólica, NADP glutamato desidrogenase citosólica, a NAD glutamato desidrogenase mitocondrial, e a NADP glutamato desidrogenase mitocondrial, respectivamente. A atividade da NAD glutamato desidrogenase é aumentada em RC, mas a de NADP glutamato desidrogenase decresce em células controle. Aumentos do tempo de vida cronológico foram observados nas mutantes bat2Δ e gdh1Δ devido a RC, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nas mutantes nulas para Gdh2p e Gdh3p em fase estacionária, indicando que essas proteínas são essenciais para os efeitos benéficos da RC. Nessas células WT crescidas em condições normais e as mutantes nulas apresentam iguais longevidades. Juntos, nossos resultados indicam que o aumento da longevidade em S. cerevisiae promovida pela RC depende da interação entre o sinal de glicose e o metabolismo de aminoácidos. / Calorie restriction (CR) is a dietary intervention capable of extending lifespans in a wide range of organisms. A yeast model of CR has been developed in which limiting the concentration of glucose in growth media of Saccharomyces cerevisiae leads to enhanced chronological and replicative life spans. Our aim was to experimentally investigate the effects of CR, focusing mainly on the causes and consequences of changes in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation and how these are associated with the aging process. Initially, we looked for sources of mitochondrial ROS, and found that a significant amount of ROS comes from mitochondrial matrix enzymes and not from the electron transport chain. We studied the participation of glucose and other carbon sources in chronological lifespan and show that increased longevity promoted by CR is associated with a metabolism change from fermentation to respiration, with participation of glucose repression pathway. During studies performed in the laboratory of Professor Francis Sluse at the Université de Liège, Belgium, we studied the effect of CR in yeast with focus on the consequences of changes in the mitochondrial proteome. We found large proteomic changes in proteins involved in amino acid metabolism. We monitored the activity of enzymes related to amino acid metabolism and chronological life span of S. cerevisiae null mutants bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ, and gdh3Δ, which encode for the cytosolic branched-chain amino acid aminotransferase, cytosolic NADP glutamate dehydrogenase, mitochondrial NAD glutamate dehydrogenase and mitochondrial NADP glutamate dehydrogenase, respectively. The activity of NAD glutamate dehydrogenase is increased in CR, but NADP glutamate dehydrogenase decreases in control cells. Increases in chronological life span due to RC were observed in bat2Δ and gdh1Δ mutants, but no significant difference was found in Gdh2p and Gdh3p null mutants in the stationary phase, indicating that these proteins are essential for the beneficial effects of CR. In rich medium, WT cells and null mutants have similar life spans. Together, our results indicate that longevity enhancement by CR in S. cerevisiae depends on the interaction between glucose signals and amino acid metabolism

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-05-20T22:24:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_DistribuicaoEnzimasNADPH.pdf: 3742931 bytes, checksum: aff3cba8ac3c63bc8f6a64965ce54c8b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-05-27T13:21:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_DistribuicaoEnzimasNADPH.pdf: 3742931 bytes, checksum: aff3cba8ac3c63bc8f6a64965ce54c8b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-27T13:21:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_DistribuicaoEnzimasNADPH.pdf: 3742931 bytes, checksum: aff3cba8ac3c63bc8f6a64965ce54c8b (MD5) Previous issue date: 2010 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Toxoplasma gondii é um protozoário parasita intracelular obrigatório de prevalência mundial e importante causador de doenças em humanos e animais domésticos. No Brasil, até 80% da população pode estar infectada, dependendo da região. Os pacientes infectados agudamente geralmente apresentam infecção assintomática com posterior desenvolvimento de cistos teciduais, que são mais comumente encontrados nos músculos estriados, retina e cérebro. A infecção latente pode alterar o comportamento dos animais hospedeiros e provocar sintomas psicóticos em humanos. Estudos sugerem que esta infecção pode contribuir para a ocorrência de desordens neurológicas e psiquiátricas, como por exemplo, a doença de Parkinson e esquizofrenia, que são associadas com anormalidades do sistema dopaminérgico. Neste estudo, avaliou-se a imunoreatividade contra a enzima tirosina hidroxilase (TH) e a atividade da NADPH-diaforase na substância negra do cérebro de camundongos infectados. Camundongos machos da linhagem Swiss Webster (Mus musculus) receberam por gavagem 10 cistos contendo bradizoítos da cepa Me-49 do Toxoplasma gondii. Os cérebros destes camundongos foram removidos após eutanásia por decapitação após os períodos de 30 e 60 dias de inoculação. A análise das secções mostrou uma reduzida marcação histoquímica para NADPHdiaforase na substância negra dos animais infectados quando comparados com os animais controle. Esta redução foi observada também na imunoreatividade contra a enzima TH na substância negra. Estes resultados indicam que a presença do T. gondii modifica o metabolismo na região da substância negra, modulando os níveis de óxido nítrico (NO) e dopamina, o que pode ser responsável pelas alterações comportamentais presentes nos hospedeiros intermediários infectados. / Toxoplasma gondii is a worldwide intracellular protozoan parasite and an important cause of disease in both humans and domestic animals. In Brazil, up to 80% of the population may be infected, depending on the region. Acute infection is generally asymptomatic, with posterior development of tissues cysts located mostly in muscles, retina and the central nervous system. The latent infection can alter behavior in animals and provoke psychotic symptoms in humans. Studies suggest that this infection may contribute to the occurrence of both schizophrenia and Parkinson’s disease, which are associated with abnormalities of the dopaminergic system. In this study we evaluated immunoreactivity for tyrosine hydroxylase (TH) and NADPH-diaphorase activities in the substantia nigra of infected male swiss mice. The animals were inoculated with bradyzoites (10 cysts) from a Toxoplasma gondii (Me-49 strain). The brains were removed after 30 and 60 days, sectioned and submitted to protocols to reveal NADPH-diaforase activity and immunohistochemistry anti-TH. The densitometric analysis showed a lower reactivity to NADPH-diaforase in the substantia nigra of infected animals when comparated with non-infected controls. A similar reduction was also observed in immunoreactivity against TH in the substantia nigra. These results indicate that T. gondii may change the dopaminergic system in infected brains.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A hipóxia isquemia (HI) pré-natal é uma das principais causas de mortalidade e doenças neurológicas crônicas em neonatos, que podem apresentar déficits remanentes como: retardamento, paralisia cerebral, dificuldade de aprendizado ou epilepsia. Estes prejuízos, provavelmente, estão relacionados com o atraso no desenvolvimento neural, astrogliose e com a perda de neurônios e oligodendrócitos. Déficits funcionais e cognitivos estão associados à degeneração de vias dopaminérgicas e de estruturas hipocampais. A enzima tirosina hidroxilase (TH) é a enzima limitante na síntese de dopamina e seus níveis são alterados em eventos de HI. O óxido nítrico (NO) é um gás difusível que atua modulando diferentes sistemas, participando de eventos como plasticidade sináptica e neuromodulação no sistema nervoso central e é produzido em grandes quantidades em eventos de injúria e inflamação, como é o caso da HI. O presente estudo teve por objetivos avaliar, utilizando o modelo criado por Robinson e colaboradores em 2005, os efeitos da HI sobre o comportamento motor e avaliar o desenvolvimento de estruturas encefálicas relacionadas a este comportamento como a substância negra (SN) e o complexo hipocampal. A HI foi induzida a partir do clampeamento das artérias uterinas da rata grávida, por 45 minutos no décimo oitavo dia de gestação (grupo HI). Em um grupo de fêmeas a cirurgia foi realizada, mas não houve clampeamento das artérias (grupo SHAM). A avaliação do comportamento motor foi realizada com os testes ROTAROD e de campo aberto em animais de 45 dias. Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P9, P16, P23 e P90, sendo então realizada imunohistoquímica para TH e histoquímica para NADPH diaforase (NADPH-d), para avaliação do NO. Nossos resultados demonstraram redução da imunorreatividade para a TH em corpos celulares na SN aos 16 dias no grupo HI e aumento na imunorreatividade das fibras na parte reticulada aos 23 dias, com a presença de corpos celulares imunorreativos nesta região no grupo HI. Demonstramos também aumento do número de células marcadas para NADPH-d no giro dentado nos animais HI, nas idades analisadas, assim como aumento na intensidade de reação no corno de Ammon (CA1 e CA3) aos 9 dias no grupo HI, e posterior redução nesta marcação aos 23 e 90dias neste mesmo grupo. Nos testes comportamentais, observamos diminuição da atividade motora no grupo HI com uma melhora do desempenho ao longo dos testes no ROTAROD, sem entretanto atingir o mesmo nível do grupo SHAM. Os animais HI não apresentaram maior nível de ansiedade em relação ao grupo SHAM, descartando a hipótese das alterações observadas nos testes de motricidade estarem relacionadas a fatores ansiogênicos. O modelo de clampeamento das artérias uterinas da fêmea se mostrou uma ferramenta importante no estudo das alterações decorrentes do evento de HI pré-natal, por produzir diversos resultados que são similares aos ocorridos em neonatos que passam por este evento. / Perinatal hypoxia-ischemia (HI) is one of the major causes of mortality and chronic neurological diseases in newborns that can show permanent effects such as mental retardation, cerebral palsy, learning difficulty and epilepsy. It is probable that these impairs may be related to a delay in the neural development, astrogliosis and to the death of neurons and oligodendrocytes. Cognitive and functional deficits are related to degeneration of dopaminergic pathways and hippocampus. The enzyme tyrosine hydroxylase (TH) is a limiting step in the dopamine synthesis and its levels are impaired in HI insults. Nitric oxide (NO) is a diffusible gas that acts by modulating different systems and participates in several phenomena such as synaptic plasticity and neuromodulation in the central nervous system and is produced in higher levels in events of injury and inflamation as in the case of HI. This study aimed to evaluate the effects of HI on the motor behavior and to evaluate the development of brain structures related to this behavior as the substantia nigra (SN) and the hippocampal complex, using the model developed by Robinson and colleagues in 2005. HI was induced by clamping the uterine arteries of pregnant rats, for 45 minutes, on the eighteenth day of gestation (group HI). In a group of females, the surgery was performed, but no clamping of the arteries (group SHAM) was made. Assessment of motor behavior was performed with the ROTAROD test and open field test in animals of 45 days (P45) of age. The brains were processed histologically at ages P9, P16, P23 and P90, and then submitted to immunohistochemistry for TH and NADPH diaphorase (NADPH-d) histochemistry for evaluation of NOS. Our results demonstrated an apparent decrease in TH immunoreactivity in cell bodies in the SN at P16 in the HI group and an increase in immunoreactivity of the fibers in the SN pars reticulata at P23 with the presence of TH immunoreactive cell bodies at this same region in the HI group. We also showed an increase in the number of NADPH-d stained cells in the dentate gyrus in the HI group, at all ages, as also an increase in the intensity of staining in the Ammons horn (CA1 and CA3) at P9 in the HI group and, after that, a decrease in this staining at P23 and P90 in this same group. In the behavioral tests we observed a decrease in the motor activity in the HI group with a partial recovery all over the several sessions in the ROTAROD test, however this group did not reach the same performance as the SHAM group. HI animals did not show a higher level of anxiety when compared to SHAM animals, ruling out the hypothesis that anxiogenic factors may be impairing the results in the motor behavior tests. Our results showed that the model of uterine arteries clamping could be an important tool in the study of the effects of perinatal HI, by producing several consequences that are very similar to the effects observed in newborn children who suffered an HI event.

\'Trypanosoma cruzi\' é o agente etiológico da doença de Chagas, esta considerada um problema de saúde pública na América Latina. Cerca de 10 a 14 milhões de pessoas estão infectadas com o \'Trypanosoma cruzi\' e 40120 milhões de pessoas correm o risco de contrair a doença. Diidroorotato desidrogenase (DHODH) é uma flavoenzima que catalisa a oxidação de L-diidroorotato em orotato, a quarta e única reação redox na biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas. Atualmente, existe um grande interesse em inibidores da DHODH como agentes terapêuticos para o tratamento de câncer, artrite reumatóide e doenças parasitarias. Em particular, estudos genéticos têm mostrado que DHODH é essencial para a sobrevivência do \'T. cruzi\', validando a idéia de que DHODH pode ser considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de drogas antichagásicas. Neste trabalho, reportamos a estrutura cristalográfica da enzima DHODH de \'Trypanosoma cruzi\' cepa Y (TcDHODH), uma cepa parcialmente resistente a drogas e altamente virulenta. O gene de TcDHODH que codifica um polipeptídeo consistindo de 314 aminoácidos foi clonado em pET-28a entre os sítios de restrição BamHI e NotI. A enzima TcDHODH foi expressa como uma proteína solúvel em E. coli BL21 (DE3) através da indução com 1 mM IPTG por 5 h a 25 °C e purificada utilizando cromatografia por afinidade em resina Ni-NTA. A cristalização de TcDHODH foi realizada utilizando o método de difusão de vapor em gotas suspensa e pendurada contra o reservatório contendo 1,5 M sulfato de amônio, 5% 2-propanol em 0,1 M acetato de sódio pH 5 adicionado de 2 mM ditiotreitol (DTT). A coleta de dados foi realizada na linha de luz D03B-MX1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) com radiação a 1,427 Å. Cristais de TcDHODH difratam à resolução de 2.2 Å e crescem no grupo espacial P212121 com parâmetros de cela a = 82.39, b = 123.92 e c = 128.89 Å. A estrutura foi resolvida por técnicas de substituição molecular e refinada a 2.2 Å de resolução. Uma análise detalhada da enzima TcDHODH cepa Y tem nos permitido identificar características estruturais que podem ser melhor exploradas para o desenho de inibidores altamente específicos através da tecnologia de desenho de drogas baseado em estrutura, como uma importante ferramenta no combate a doença de Chagas. / \'Trypanosoma cruzi\' is the etiological agent of Chagasdisease, considered a public health problem in Latin America. Ten to 14 million people are infected by \'Trypanosoma cruzi\' and 40120 million people are at risk of infection. Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) is a flavin mononucleotide containing enzyme, which catalyses the oxidation of L-dihydroorotate to orotate, the fourth step and only redox reaction in the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. At present, there is a great interest in inhibitors of DHODH as therapeutic agents for the treatment of cancer, rheumatoid arthrits and parasitic diasease. In particular, genetic studies have shown that DHODH is essential for \'T. cruzi\' survival, validating the idea that DHODH can be considered an attractive target for the development of antichagasic drugs. Here, we report the crystal structure of \'Trypanosoma cruzi\' DHODH from Y strain (TcDHODH), a partially drug-resistant and highly virulent strain. The TcDHODH gene that encodes a polypeptide consisting of 314 amino acid residues was cloned into BamHI and NotI restriction sites of pET-28a. The TcDHODH was functionally expressed as a soluble protein in E. coli BL21 (DE3), through induction with 1 mM IPTG for 5 h at a temperature of 25 °C and purified to homogeneity using affinity chromatography on Ni-NTA resin. The crystallization of TcDHODH was performed using vapor diffusion method in sitting and hanging drops against a reservoir solution containing 1.5 M ammonium sulfate, 5% 2-propanol in 0.1 M sodium acetate pH 5 plus the addition of 2 mM dithiothreitol (DTT). Data collection was performed at the D03B-MX1 beam line of the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS) using 1.427 Å radiation. TcDHODH crystals diffract up to 2.2 Å resolution and belong to space group P212121 with unit cell dimensions a = 82.39, b = 123.92 and c = 128.89 Å. The structure has been solved by molecular replacement techniques and refined up to 2.2 Å resolution. A detailed analysis of TcDHODH strain Y has allowed us to identify structural characteristics that can be further exploited for design of highly specific inhibitors through the technology of structure-based drug design as an important tool to fight against Chagasdisease.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de genes envolvidos no transporte de monocarboxilatos (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) e de genes específicos da oogênese (Bmp15, Gdf9 e Has2) em complexos cumulus-oócito (CCOs) selecionados pelo teste BCB. Após seleção morfológica com base no grau de compactação das células do cumulus (CCs) e no grau de homogeneidade do citoplasma, os CCOs foram corados com 26 μM BCB (azul cresil brilhante) por 90 min e divididos em dois grupos: BCB+, que apresentavam o ooplasma corado de azul, e BCB-, com ooplasma não corado. Foram utilizados dois grupos controles não expostos ao BCB: o grupo holding foi submetido às mesmas condições que os grupos corados e o outro grupo controle foi diretamente submetido à maturação in vitro (MIV), após a seleção morfológica dos CCOs. A expressão gênica relativa foi determinada por RT-PCR em CCOs coletados antes e ao final da maturação. A expressão também foi avaliada, separadamente, em oócitos desnudos (ODs) e células do cumulus (CCs) antes e após a maturação. A análise dos transcritos demonstrou que houve aumento significativo (p < 0,05) na expressão relativa de Gdf9 e Bmp15 nos grupos BCB+, BCB- e holding antes da MIV, enquanto Has2 teve aumento significativo (p < 0,01) após a MIV apenas no grupo controle. Os outros genes analisados (Mct1, Mct2 e Mct4) mantiveram-se estáveis durante a maturação. O aumento na abundância relativa de alguns transcritos durante a MIV pode ser atribuído as condições de incubações durante o teste BCB. Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, a expressão de Mct1, 2 e 4 em CCOs bovinos. Enquanto o mRNA de Mct1 e Mct4 estava presente em ODs e em CC, o Mct2 foi detectado somente em CCs. Não detectamos a expressão de transcritos de Mct3 em CCOs. As diferenças na expressão dessas três isoformas sugerem um papel único para esses transportadores durante a maturação. / The aim of this study was to determine the relative expression of genes involved in transport of monocarboxylates (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) and oogenesis specific genes (Bmp15, Gdf9 and Has2) in immature and mature bovine cumulus-oocyte complexes (COC) after selection by BCB. Immature COCs underwent morphological selection and were stained with 26 mM BCB for 90 min. Based on ooplasm staining, oocytes were distributed in two groups BCB+ (blue color) and BCB- (non-stained). The holding control group was exposed to the same incubation conditions as stained COCs, but without BCB. Control group was submitted to in vitro maturation (IVM) immediately after morphological selection. mRNA expression was investigated by RT-PCR in COCs before and after IVM. No relationship was observed in the relative expression of Has2, Gdf9, Bmp15 or Mct1, 2 and 4 transcripts between BCB- and BCB+ COCs. Transcripts analysis showed that Gdf9 and Bmp15 in BCB+, BCB- and holding groups were upregulated (p < 0.05) before IVM, while Has2 was up-regulated (p < 0.01) after IVM in the control group. Others genes remained stable during maturation (Mct1, 2 and 4). The increase in relative abundance of some transcripts during IVM may be attributed to incubation conditions during the BCB test. Our results showed, for the first time, Mct1, 2 and 4 expression in bovine COCs. Mct1 and Mct4 transcripts were present in denuded oocytes and cumulus cell, while Mct2 was detected only in cumulus cells. These differences between the three isoforms in localization suggest unique roles for each in monocarboxylate transport during maturation.