Orientador: Roger Frigerio Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T10:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mirandola_SandraRegina_D.pdf: 3705031 bytes, checksum: e1e34dd5e1b3949d9c308b3c20a19787 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A acidemia metilmalônica (MMAemia) é uma desordem metabólica hereditária do metabolismo de aminoácidos com cadeia ramificada e de ácidos graxos com cadeia ímpar, envolvendo um defeito na conversão de metilmalonil-CoA a succinil-CoA. Manifestações sistêmicas e neurológicas nesta doença são relacionadas com o acúmulo de metilmalonato (MMA) em tecidos e fluidos biológicos e com o comprometimento do metabolismo energético. Neste trabalho, verificou-se que o MMA inibiu com grande intensidade a conversão de lactato a piruvato catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH) em homogenatos de fígado e cérebro de rato. A conversão de piruvato a lactato, catalisada pela LDH, foi menos sensível à inibição por MMA. Estudos de cinética enzimática sobre a inibição da LDH de cérebro, utilizando-se lactato como substrato, indicaram que o MMA inibe esta enzima competitivamente (Ki = 3,02 ± 0,59 mM). Propôs-se que a inibição da conversão lactato/piruvato por MMA contribui para a fisiopatologia da MMAemia, resultando, dentre outras alterações, em acúmulo de lactato e acidemia metabólica. Mostrou-se que, em mitocôndrias isoladas de cérebro e músculo de rato, concentrações milimolares de MMA inibiram o consumo de O2 mantido por succinato, enquanto nenhum efeito inibitório foi observado quando substratos para os complexos I ou IV foram utilizados. Notadamente, o efeito inibitório de MMA, mas não de malonato, no consumo mitocondrial de O2 mantido por succinato foi minimizado quando uma permeabilização não-seletiva das mitocôndrias foi induzida por alameticina. Em adição, o MMA apresentou apenas um pequeno efeito inibitório no consumo de O2 por partículas submitocondriais invertidas na presença de succinato. Não se obteve evidência de produção de malonato nas mitocôndrias tratadas com MMA. Conclui-se que o MMA inibe o consumo mitocondrial de O2 na presença de succinato por interferir na captação deste substrato pela mitocôndria. A inibição do transporte mitocondrial de substratos, induzida pelo MMA, através do carreador de dicarboxilatos, pode ter importantes implicações fisiopatológicas na MMAemia. Comparou-se a suscetibilidade de mitocôndrias isoladas de fígado, rim e coração de rato, assim como de diferentes subregiões cerebrais quanto à transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) induzida por 3-nitropropionato (3-NP) e Ca2+. A MPT foi estimada pela queda do potencial elétrico transmembrana e inchamento mitocondrial sensíveis à ciclosporina A. Mitocôndrias de cérebro e coração foram mais suscetíveis à MPT induzida por 3-NP e Ca2+ que organelas isoladas de fígado e rim. A comparação de mitocôndrias de diferentes regiões cerebrais indicou que uma inibição parcial da respiração por 3-NP resultou em MPT mais rapidamente em organelas estriatais que corticais ou cerebelares. Em ratos tratados sistemicamente com 3-NP, verificou-se uma inibição de mesma magnitude da succinato desidrogenase em todos os tecidos estudados. Notadamente, mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados sistemicamente com 3-NP apresentaram uma maior suscetibilidade à MPT induzida por Ca2+ quanto comparadas a controles. Propôs-se que a maior suscetibilidade do estriado à neurodegeneração induzida por 3-NP pode ser, pelo menos em parte, explicada por uma maior vulnerabilidade desta região cerebral à MPT, juntamente com a vulnerabilidade desta região ao influxo de Ca2+ citosólico mediado pelo estímulo de receptores de glutamato / Abstract: Methylmalonic acidemia (MMAemia) is an inherited metabolic disorder of branched amino acid and odd-chain fatty acid metabolism, involving a defect in the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to succinyl-coenzyme A. Systemic and neurological manifestations in this disease are thought to be associated with the accumulation of methylmalonate (MMA) in tissues and biological fluids with consequent impairment of energy metabolism. In the present work it was observed that MMA potently inhibited lactate dehydrogenase (LDH)-catalyzed conversion of lactate to pyruvate in liver and brain homogenates. LDH was about one order of magnitude less sensitive to inhibition by MMA when catalyzing the conversion of pyruvate to lactate. Kinetic studies on the inhibition of brain LDH indicated that MMA inhibits this enzyme competitively with lactate as a substrate (Ki = 3.02 ± ?0.59 mM). We proposed that inhibition of the lactate/pyruvate conversion by MMA contributes to the MMAemia physiophatology, leading to lactate accumulation and metabolic acidemia. While millimolar concentrations of MMA inhibit succinate-supported O2 consumption by isolated rat brain or muscle mitochondria, there is no effect when either a pool of NADH-linked substrates or N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamine (TMPD)/ascorbate were used as electron donors. Interestingly, the inhibitory effect of MMA, but not of malonate, on succinate-supported brain mitochondrial O2 consumption was minimized when nonselective permeabilization of mitochondrial membranes was induced by alamethicin. In addition, only a slight inhibitory effect of MMA was observed on succinate-supported O2 consumption by inside-out submitochondrial particles. Under our experimental conditions, there was no evidence of malonate production in MMA-treated mitochondria. We conclude that MMA inhibits succinate-supported mitochondrial O2 consumption by interfering with the uptake of this substrate. MMA-induced inhibition of substrate transport by the mitochondrial dicarboxylate carrier may have important physiopatological implications. The susceptibility of isolated mitochondria from liver, kidney and heart and different rat brain regions (striatum, cortex and cerebellum) was compared regarding to mitochondrial permeability transition (MPT) evoked by 3-nitropropionate (3-NP) and Ca2+ ions. In general, isolated brain mitochondria from different regions were more sensitive to 3-NP and Ca2+ toxicity than mitochondria from liver and kidney as estimated by decrease in the transmembrane electrical potential and mitochondrial swelling. The comparision of different brain regions revealed that the inhibition of 50% of the mitochondrial succinate-supported respiration elicited by 3-NP resulted in a Ca2+-induced MPT pore opening, inhibited by cyclosporin A, faster in striatal than in cortical and cerebellar mitochondria. It was verified an inhibition of succinate dehydrogenase activity from the same magnitude in all tissues studied after a 3-NP systemic treatment. Interestingly, isolated forebrain mitochondria obtained from rats systemically treated with 3-NP showed a more pronounced susceptibility to Ca2+-induced MPT pore opening when compared to control rats. We proposed that the increased susceptibility of rat striatum to 3-NP-induced neurodegeneration could be in part explain by a region-specific susceptibility to MPT together with increase vulnerability of this brain region to glutamate receptors-mediated cytosolic Ca2+ influx / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Nesta dissertação de mestrado foram estudadas duas bactérias, Sphingobacterium sp e Arthrobacter atrocyaneus, produtoras de enzimas álcool desidrogenases que se mostraram capazes de catalisar reações de oxidação enantiosseletiva de alcoóis secundários racêmicos. Inicialmente foram avaliados alguns parâmetros para a realização da resolução cinética do (RS)-1-feniletanol, assim como quantidade de substrato, biomassa das bactérias (Sphingobacterium sp e Arthrobacter atrocyaneus) e tempo reacional necessário para a oxidação completa de um dos enantiômeros do substrato. Nas reações com a bactéria Sphingobacterium sp (R1AC23) observou-se a presença de álcool desidrogenase com alta atividade catalítica, porém com moderada enantiosseletividade, pois em alguns casos observou-se a oxidação completa dos alcoóis para-substituídos derivados do (RS)-1- feniletanol a suas correspondentes cetonas. Com o estudo das reações do (RS)-1-feniletanol e a bactéria Arthrobacter atrocyaneus (R1AF57) determinou-se os principais parâmetros reacionais para alcançar uma excelente resolução cinética. Sendo assim, aplicou-se essa metodologia para diferentes alcoóis secundários em dois meios reacionais diferentes: com células em crescimento e com células ressuspensas em tampão fosfato. A atividade catalítica foi mais eficiente com as células em crescimento com conversões próximas de 50% e excesso enantiomérico >99% na maioria dos casos, destacando-se os derivados do (RS)-1-feniletanol para e meta substituídos. Empregou-se a Arthrobacter atrocyaneus em testes de resolução cinética dinâmica (RCD). Como durante as reações de oxidação um co-produto é uma cetona, estudou-se o emprego in situ do NaBH4 como redutor desse composto. Com isso, tem-se um ciclo reacional de oxidação-redução. Sendo assim, por estereoinversão, foi possível alcançar rendimentos maiores que 50% do álcool enantiomericamente puro. Com o (RS)-1-(4-metilfenil)-etanol como substrato, obteve-se o álcool enantiomericamente puro com rendimento de 79% e excesso enantiomérico >99% / In this dissertation two bacterial strains were studied, Arthrobacter atrocyaneus and Sphingobacterium sp, which are alcohol dehydrogenases producers that were able to catalyse racemic secondary alcohols enantioselective oxidation. Initially, some reaction parameters to carry out the kinetic resolution of (RS)-1- phenylethanol were evaluated, such as substrate amount, bacterial biomass (Arthrobacter atrocyaneus and Sphingobacterium sp) and the reaction time for complete oxidation of one enantiomer of the substrate. In the reactions with Sphingobacterium sp (R1AC23) was observed the presence of alcohol dehydrogenase with high catalytic activity and moderate selective. Therefore, in some cases, the total oxidation of the both enantiomers of (RS)-1- phenylethanol para-substitued derivatives to the corresponding ketones were observed. By studying the reactions of (RS)-1-phenylethanol and Arthrobacter atrocyaneus (R1AF57), the reaction parameters to achieve excellent kinetic resolution were determined. Therefore, this methodology was applied to different secondary alcohols under two different reaction media: with growing cells and resting cells in phosphate buffer. The catalytic activity was more efficient with growing cells. The conversions were next to 50% and enantiomeric excess> 99% in most of the cases, especially those reactions with alcohols derived from (RS)- 1-phenylethanol para and meta substituted. Arthrobacter atrocyaneus was employed in dynamic kinetic resolution (DKR). As during the oxidation reactions, a ketone co-product is obtained, the use of NaBH4 was studied to reduce this compound in situ. Thus, an oxidation-reduction reactional cycle was achieved. Then, by estereoinversion it was possible to achieve yields higher than 50% of the pure enantiomerically alcohol. With (RS)-1-(4-methylphenyl)-ethanol as substrate, enantiomeric excess > 99% and yield 79% of pure enantiomerically alcohol was obtained

A enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) catalisa a conversão de diidroorotato em orotato, a quarta e única reação redox da via metabólica da síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. DHODH tem sido explorada como alvo validado para terapias contra doenças proliferativas e parasitárias e, em particular, tem sido considerada um alvo atraente para o planejamento de fármacos com ação contra tripanossomatídeos, como parasitos dos gêneros Trypanosoma e Leishmania, que conjuntamente são responsáveis por doenças e mortes que acometem milhões de pessoas em todo o mundo. Neste trabalho, através da combinação de técnicas de DNA recombinante, termofluor, cristalografia de raios-X e ensaios de inibição in vitro e in silico, foi possível identificar sítios alvos na estrutura da DHODH para o desenvolvimento de ligantes, identificar inibidores potentes e seletivos contra as DHODHs de Leishmania major e Trypanosoma cruzi e, caracterizar seus mecanismos de inibição. Finalmente, o efeito leishmanicida observado em nossos ensaios anti-promastigota e os baixos níveis de citotoxicidade observados em células de mamíferos sugerem que alguns dos compostos identificados durante o desenvolvimento deste projeto como potentes inibidores da enzima DHODH poderão ser utilizados como protótipos para o desenvolvimento de fármacos com ação leishmanicida e tripanocida. Combinados, nossos resultados forneceram uma nova e importante contribuição para a compreensão do mecanismo de ação das enzimas DHODH da classe 1A e para o desenho de fármacos baseado nas estruturas das enzimas diidroorotato desidrogenase de Leishmania major e Trypanosoma cruzi. Além disso, a alta identidade sequencial e estrutural observada entre as enzimas de tripanossomatídeos sugerem que uma única estratégia para o desenho de inibidores baseado em estrutura poderá ser usada para explorar a enzima DHODH como alvo terapêutico para várias doenças negligenciadas tropicais como Leishmaniose, Doença do sono e Doença de Chagas / Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) catalyses the conversion of dihydroorote to orotate, the fourth step and only redox reaction in the de novo pyrimidine biosynthetic pathway. DHODH has been exploited as a validated target for therapy against proliferative and parasitic diseases, and in particular, has been considered to be an attractive target for drug development against trypanosomatids, such as parasites from the genera Leishmania and Trypanosoma that collectively cause disease and death in millions of humans. In this work, by combining recombinant DNA technology, thermofluor, X-ray crystallography and in vitro and in silico inhibition assays, we have been able to identify target sites for ligand design, identify potent and selective inhibitors against trypanosomatid DHODHs and fully characterize their mechanism of inibition. Finally, the anti-leishmanial effect observed in our anti-promastigote assays and the low citotoxicity levels observed against mammaliam cells strongly suggest that some of the compounds identified during the development of this project as potent DHODH inhibitors can be used as prototytes for the development of anti-leishmania and anti-trypanosoma drugs. Altogether, our findings provide a new and important contribution to the understanding of the mechanism of action of class 1A DHODHs and for the structure-assisted design of inhibitors against trypanosomatid DHODHs. Furthermore, the high sequence and structural similarity observed among trypanosomatid DHODH suggest that a single strategy of structure-based inhibitor design can be used to exploit DHODH as a druggable target against multiple neglected tropical diseases such as Leishmaniasis, Sleeping Sickness and Chagas\' Disease.

A restrição calórica (RC) é uma intervenção dietética capaz de estender a longevidade de vários organismos. O modelo para RC em Saccharomyces cerevisiae consiste da diminuição da concentração de glicose no meio de cultura e mostra um aumentado tanto do tempo de vida cronológico quanto replicativo. Nosso objetivo foi investigar experimentalmente a ação da RC, focando principalmente nas causas e consequências das modificações de geração de EROs mitocondriais e como estas estão associadas ao processo de envelhecimento. Em um primeiro período de estudos, verificamos quais as fontes mitocondriais de EROs, e comprovamos que uma quantidade significativa se origina de proteínas da matriz mitocondrial, e não da cadeia de transporte de elétrons. Nós estudamos a participação de glicose e de outras fontes de carbono sobre o tempo de vida cronológico em leveduras e mostramos que o aumento da longevidade promovida pela RC está associado à uma mudança de metabolismo fermentativo para respiratório, com participação da via de sinalização de glicose. No estágio realizado no laboratório do Professor Francis Sluse na Université de Liegè, Bélgica, estudamos a ação da RC em leveduras focando nas consequências das modificações no proteoma mitocondrial. Em nosso estudo proteômico, encontramos grandes modificações em proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos. Monitoramos a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e o tempo de vida cronológico de S. cerevisiae e as mutantes nulas bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ e gdh3Δ, que codificam a aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada citosólica, NADP glutamato desidrogenase citosólica, a NAD glutamato desidrogenase mitocondrial, e a NADP glutamato desidrogenase mitocondrial, respectivamente. A atividade da NAD glutamato desidrogenase é aumentada em RC, mas a de NADP glutamato desidrogenase decresce em células controle. Aumentos do tempo de vida cronológico foram observados nas mutantes bat2Δ e gdh1Δ devido a RC, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nas mutantes nulas para Gdh2p e Gdh3p em fase estacionária, indicando que essas proteínas são essenciais para os efeitos benéficos da RC. Nessas células WT crescidas em condições normais e as mutantes nulas apresentam iguais longevidades. Juntos, nossos resultados indicam que o aumento da longevidade em S. cerevisiae promovida pela RC depende da interação entre o sinal de glicose e o metabolismo de aminoácidos. / Calorie restriction (CR) is a dietary intervention capable of extending lifespans in a wide range of organisms. A yeast model of CR has been developed in which limiting the concentration of glucose in growth media of Saccharomyces cerevisiae leads to enhanced chronological and replicative life spans. Our aim was to experimentally investigate the effects of CR, focusing mainly on the causes and consequences of changes in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation and how these are associated with the aging process. Initially, we looked for sources of mitochondrial ROS, and found that a significant amount of ROS comes from mitochondrial matrix enzymes and not from the electron transport chain. We studied the participation of glucose and other carbon sources in chronological lifespan and show that increased longevity promoted by CR is associated with a metabolism change from fermentation to respiration, with participation of glucose repression pathway. During studies performed in the laboratory of Professor Francis Sluse at the Université de Liège, Belgium, we studied the effect of CR in yeast with focus on the consequences of changes in the mitochondrial proteome. We found large proteomic changes in proteins involved in amino acid metabolism. We monitored the activity of enzymes related to amino acid metabolism and chronological life span of S. cerevisiae null mutants bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ, and gdh3Δ, which encode for the cytosolic branched-chain amino acid aminotransferase, cytosolic NADP glutamate dehydrogenase, mitochondrial NAD glutamate dehydrogenase and mitochondrial NADP glutamate dehydrogenase, respectively. The activity of NAD glutamate dehydrogenase is increased in CR, but NADP glutamate dehydrogenase decreases in control cells. Increases in chronological life span due to RC were observed in bat2Δ and gdh1Δ mutants, but no significant difference was found in Gdh2p and Gdh3p null mutants in the stationary phase, indicating that these proteins are essential for the beneficial effects of CR. In rich medium, WT cells and null mutants have similar life spans. Together, our results indicate that longevity enhancement by CR in S. cerevisiae depends on the interaction between glucose signals and amino acid metabolism

Os elementos celulares que constituem o tecido xilemático de várias espécies vegetais são amplamente utilizados em diversos setores industriais, com inúmeras aplicações, como por exemplo, a geração de energia e produção de celulose e papel. A parede celular das células vegetais é formada basicamente por celulose, hemiceluloses e lignina. A formação dos polímeros de celulose e hemicelulose dependem exclusivamente do suprimento de precursores chamados de nucleotídeos-açúcares, tais como UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-xilose, UDP-arabinose, UDP-manose e UDP-galactose. A biossíntese da parede celular é altamente regulada do ponto de vista metabólico, e envolve a participação de várias enzimas que catalisam uma série de reações. Estratégias para alterar o fluxo metabólico destes precursores, podem originar modificações na deposição dos polissacarídeos na parede celular. Em particular, para o setor de celulose e papel tal estratégia pode resultar em fibras com determinadas características, melhorando a qualidade da polpa celulósica ou do papel produzido. O UDP-glucuronato é um dos principais precursores de polissacarídeos hemicelulósicos da parede celular, sendo formado a partir de UDP-glucose pela ação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22). Esta enzima é chave na regulação da biossíntese das pentoses e hexoses da parede celular de plantas superiores. Com o objetivo de modular a síntese dos polissacarídeos hemicelulósicos na parede celular, o presente trabalho analisou o impacto da superexpressão do gene ugdh em plantas transgênicas de tabaco. Foram realizadas análises da composição química da parede celular primária e secundária de folhas e caules, bem como avaliações morfológicas das fibras do tecido xilemático, e também cortes histológicos da região basal do caule. Da parede secundária do tecido xilemático determinou-se o conteúdo de lignina klason e solúvel, bem como a concentração dos carboidratos via HPAE-PAD. No tecido xilemático, todas as plantas transgênicas apresentaram aumento do conteúdo de xilose, embora não significativo. Juntamente, ocorreu um aumento de arabinose significativo em três linhagens transgênicas. Paralelamente, todas as plantas transgênicas tiveram redução do conteúdo de lignina klason, embora significativo em apenas uma linhagem. A relação hexoses/pentoses reduziu em todas as linhagens transgênicas, sendo significativa em três linhagens. As análises histológicas do caule mostraram que os transformantes apresentaram um aumento do tecido xilemático em relação às plantas controles. As análises morfológicas das fibras mostraram que todas as plantas transgênicas apresentaram reduções significativas no comprimento, em relação às plantas controles. No tecido foliar, o conteúdo de polissacarídeos da parede celular primária apresentou uma redução significativa em todas as plantas transgênicas. / The cellular elements that constitute the xylematic tissue of various plant species are widely used in diverse industrial sectors, with numerous applications, for example, the generation of energy and production of cellulose and paper. Plant cell walls are basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of cellulose and hemicellulose polymers depend exclusively on the supply of the precursors called nucleotide sugars, such as UDPglucose, UDP-glucuronate, UPD-xylose, UDP-arabinose, UDP-mannose and UDP-galactose. The biosynthesis of the cell wall is highly regulated from the metabolic point of view and involves the participation of various enzymes that catalyse a series of reactions. Strategies to alter the metabolic flux of these precursors could give rise to modifications in the deposition of polysaccharides in the cell wall. In particular, for the cellulose and paper sector these strategies could result in fibers with determined characteristics, improving the quality of the cellulose pulp or the paper produced. UDP-glucuronate is one of the principal precursors of the hemicellulose polysaccharides of the cell wall, which is formed from UDP-glucose by the action of UDPglucose dehydrogenase (EC1.1.1.22). This is a key enzyme in the regulation of the biosynthesis of the pentoses and hexoses in the cell walls of higher plants. With the objective of modulating the synthesis of the hemicellulose polysaccharides in the cell wall, the present study analysed the impact of the superexpression of the ugdh gene in transgenic tobacco plants. Chemical analyses were performed to determine the chemical composition of the primary and secondary cell walls of leaves and stems, as well as morphological evaluations of the fibers of the xylematic tissue and histological cuts through the base of the stem. The Klason and soluble lignin content as well as the carbohydrate concentrations (using HPAE-PAD) were determined in the secondary cell walls of the xylematic tissue. All of the transgenic plants showed an increase in xylose content, albeit not significant. A significant increase in arabinose content was observed in three transgenic lines. In parallel all the transgenic plants presented a reduction in Klason lignin, but only significant in one line. The ratio hexose/pentose was reduced in all transgenic lines, being significant in three. Histological analyses on the stem showed that the transformants presented an increase in the xylematic tissue when compared to the controls. The morphological analyses of the fibers showed that all the transgenic plants presented significant reductions in length when compared to the controls. In the leaf tissue, the polysaccharide content of the primary cell wall showed a significant reduction in all of the transgenic plants.

Sabe-se que a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase eritrocitária do marsupial brasileiro Didelphis marsupialis é cerca de 15 a 20 vezes a encontrada nos eritrócitos humanos. Pretendendo-se investigar se esta hiperatividade também se encontra ou não aumentada nas outras enzimas eritrocitárias, levou-se a efeito a dosagem das atividades das enzimas glicolíticas bem de outras enzimas relacionadas ao metabolismo óxido-redutor do eritrócito do marsupial. Alguns dados bioquímicos sorológicos, hematológicos e imunológicos foram também obtidos. Assim sendo, as seguintes enzimas eritrocitárias foram estudadas: hexoquinase, glicose fosfato isomerase, fosfofrutoquinase, aldolase, triose fosfato isomerase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, fosfogliceratoquinase, difosfoglicerato mutase, monofosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, lactato desidrogenase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, glutationa redutase, glutationa peroxidase, glutationa S-transferase, nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato diaforase, nicotinamida adenina dinucleotideo meta-hemoglobina redutase, superóxido dismutase, aspartato aminotransferase, adenilato quinase, adenosina desaminase e acetilcolinesterase. Embora a maioria das enzimas estudadas tenham revelado atividades semelhantes às encontradas nos eritrócitos humanos, foram observados aumentos significativos da hexoquinase, piruvato quinase e glutationa S-transferase. Entretanto, a atividade da glutationa peroxidase apresentou grande aumento de atividade, cerca de dez a doze vezes a encontrada nos eritrócitos humanos, talvez agindo em conjunto com a hiperatividade da glicose-6-fosfato desidrogenase da ordem de dez a quinze vezes já descrita nos eritrócitos humanos / It is known that erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase specific activity of Didelphis marsupialis is about 15-20 times higher than human red cells. In order to investigate whether this hyperactivity is extended or not to other red cell enzymes, it was proposed to ascertain the activity of the glycolytic enzymes as well as other related to the redox metabolism of the opossum erythrocyte. Some biochemical, hematological and immunological data were also assayed as well. That being so, the following red cell enzymes were assayed: hexokinase, glucose phosphate isomerase, phosphofructokinase, aldolase, triose phosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, diphosphoglycerate mutase, monophosphoglycerate mutase, enolase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, glutathione S-transferase, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase, nicotinamide adenine dinucleotide metahemoglobin reductase, superoxide dismutase, aspartate amino-transferase, adenylate kinase, adenosine deaminase and acetylcholinesterase . Although most of the enzymatic activities disclosed to be similar to humans, some enzymes exhibited high activities as the hexokinase, pyruvate kinase and glutathione-S-transferase, about three to four times in relation to human. However the glutathione peroxidase presented overwhelming activity, at the order of ten-twelve times the human enzyme, perhaps working together the glucose-6-phosphate dehydrogenase hyperactivity at the order of ten-fifteen times already described in the marsupial erythrocytes

Esta pesquisa bibliográfica teve o propósito de elucidar a via do acido aspártico, apontando como fonte deste estudo os cereais. O objetivo principal desta pesquisa consistiu em estudar a via do acido aspártico, visando descrever uma variedade de técnicas de engenharia genética e bioquímicas que podem ser empregadas para aumentar a qualidade nutricional de cereais, podendo, assim, compreender o que acarreta o aumento do acumulo de lisina, metionina e treonina nos grãos para suprir essa necessidade na formação de uma proteína balanceada nutricionalmente. Foi realizada uma busca exaustiva em bases de dados Google Scholar, Portal Capes, ISI web of Science, no período de publicação de 1970 a 2012. Foram adotados textos de referencia internacional e nacional. Esta pesquisa foi dividida em três etapas: via do acido aspártico e seus aminoácidos derivados em plantas superiores de 1970 a 1997, via metabólica do acido aspártico no período de 1997 a 2006 e estratégias interessantes para aumentar o nível dos aminoácidos essenciais da via do acido aspártico em plantas no período de 2006 ate o momento. A primeira etapa foi desenvolvida relatando o acido aspártico como precursor dos aminoácidos essenciais: metionina, lisina, treonina e isoleucina. Entre os essenciais, a lisina e um dos mais estudados devido a escassez em muitos cereais, o que contribuiu para o estudo extensivo da via do acido aspártico, revelando, assim, a importância da aspartato quinase (AK), homoserina desidrogenase (HSDH) e dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) como enzimas chaves para a regulação da síntese de lisina. A aspartato quinase (AK) exerce um controle sobre via do acido aspártico. A enzima dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) regula a síntese de lisina. Na segunda etapa foi apresentada a importância dos aminoácidos sintetizados nas plantas através de complexas vias metabólicas que são controladas por enzimas, intermediários, substratos e aminoácidos. Este estudo também relata os aspectos importantes para uma melhor compreensão da síntese e o acumulo de aminoácidos solúveis e incorporados em proteínas. A terceira etapa foi apresentar estratégias interessantes para utilização em estudos, visando aumentar o nível de aminoácidos essenciais através da manipulação de genes já existentes, como também a introdução de genes estranhos nas plantas. Devido a importância nutricional, essa via tem sido extensivamente estudada, utilizando técnicas de engenharia genética e bioquímica. Pesquisadores tem apresentado esforços considerados no estudo desta via a fim de contribuir para futuras manipulações genéticas, cujo objetivo e produzir plantas com alto conteúdo de lisina, metionina e treonina. / The aim of this research was to elucidate the aspartate metabolic pathway using grains of cereal as a source of study. Therefore, it was necessary to understand the aspartate metabolic pathway in order to depict various biochemical and genetic techniques which can be used to enhance the nutritional value in cereals. After studying theses issues, it was possible to understand the results of having cereals with a high lysine, methionine, and threonine content, so that grains can have balanced protein content. For that reason, an exhaustive research was done by using international and national scientific data published in 1970 to 2012. These data were found in Google Scholar, Portal Capes, and ISI Web of Science. This research was divided in three parts: studies of aspartate metabolic pathway and their essential amino acids derived from plants published in 1970 to 1997, studies of aspartate metabolic pathway published in the period of 1997 to 2006, and interesting strategies to enhance the level of essential amino acids of the aspartate metabolic pathway in plants from 2006 to this moment. Firstly, this investigation reported about the aspartic acid as a precursor of essential amino acids such as methionine, lysine, threonine, and isoleucyne. Among the essential amino acids, lysine has been the most researched due to its lack in many kinds of grains. Needless to say, it has contributed to the intensive study showing the relevancy of aspartate kinase (AK), homoserine dehydrogenase (HSDH), dihydrodipicolinate synthase (DHDPS), as key enzymes for lysine regulation. The aspartate kinase (AK) has an important role on the aspartate metabolic pathway, meanwhile the dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) is intrinsically involved on lysine synthesis regulation. Secondly, this investigation presented the importance of the amino acids which are synthesized by plants through metabolic pathways that are controlled by enzymes, intermediates, substrates, and amino acids. In addition, this research reported relevant aspects whereby scientists can improve their understanding about the synthesis and accumulation of soluble amino acids which are incorporated in proteins. Finally, the third part showed interesting strategies which can be used in future researches in order to increase not only the level of essential amino acids by manipulating genes, but also the introduction of odd genes in plants. Given the nutritional relevancy, this pathway has been extensively investigated by using techniques used by biochemical and genetic engineering. Hence, researchers have demonstrated a considerable effort on this matter contributing for future genetic manipulations, so that plants with high lysine, methionine, and threonine content can be produced.

O presente estudo objetivou avaliar os efeitos de um microciclo de treinamento intensivo (8 dias), associado ou não à suplementação com carboidratos (CHO), sobre parâmetros metabólicos, hormonais, marcadores de lesão tecidual e estoques de lipídios intramiocelulares em corredores de longa distância. Os efeitos cumulativos desse período de treinamento intensivo e da suplementação com CHO também foram analisados sobre uma sessão de exercício intermitente de alta intensidade e performance atlética (9º dia). Participaram do estudo 24 corredores de longa distância do sexo masculino com 28,0±1,3 anos de idade. Os corredores foram distribuídos em dois grupos (grupo CHO ou grupo controle - CON). No grupo CHO, após treinamento intensivo, foram aumentadas as concentrações dos lipídios intramiocelulares (+0,0061±0,0022 e +0,0008±0,0043 vs. CON: -0,0091±0,0053 e -0,0224±0,0151; dos músculos tibial anterior e sóleo, respectivamente), da testosterona total (694,0±54,6 ng/dL vs. CON: 610,8±47,9 ng/dL) e de sua fração livre (552,7±49,2 pmol/L vs. CON: 395,7±36,6 pmol/L). No 9º dia o protocolo consistiu em uma sessão de 10 séries de 800m (100%Vm3km), com pausa de 1min 30s entre as séries. Antes e após a sessão os atletas realizaram teste máximo de 1.000m. A queda no desempenho do 2º teste de 1.000m foi menor no grupo CHO (5,3±1,0%) vs. 10,7±1,3% no CON. As concentrações de glicose, lactato, epinefrina, cortisol e GH aumentaram após as 10x800m em ambos os grupos. No entanto, essa resposta foi atenuada no grupo CHO para cortisol (22,4±0,9 pmol/L vs. CON: 27,6±1,4 pmol/L) e GH (21,8±5,6 ng/mL vs. CON: 36,7±5,0 ng/mL). Ainda após as 10x800m, as concentrações de LDH e DNA livre foram menores no grupo CHO (509,2±23,1 U/L e 48.240,3±5.431,8 alelos/mL) quando comparadas às do grupo CON (643,3±32,9 U/L e 73.751,8±11.546,6 alelos/ mL, respectivamente). Durante o período de recuperação, a diminuição do cortisol, associada às maiores glicemias e insulinemias no grupo CHO, pode ter resultado em efeito anabólico e atenuação da resposta inflamatória. Conclui-se que a suplementação com CHO atenuou a supressão do eixo hipotalâmico-pituitáriogonadal, além de promover melhora do desempenho atlético, aumento dos estoques de lipídios intramiocelulares e menores respostas catabólicas e dos marcadores de dano tecidual / This study aimed to evaluate the effects of intensive microcycle training (8days), with and without CHO supplementation, on the metabolic and hormonal responses of long distance runners. Markers for tissue damage and intramyocellular lipid stores were also investigated, along with the cumulative effects of this kind of CHO supplementation on a further session of high intensity intermittent running and athletic performance (day9). The study included 24 male long distance runners with a mean age of 28.0±1.3 years. The runners were divided into two groups (CHO (supplementation) and CON (control)). In the CHO group, the intramyocellular lipids (+0.0061 ± 0.0022 + 0.0008 ± 0.0043 and vs. CON: -0.0091 ± 0.0053 and -0.0224 ± 0.0151; for the tibialis anterior and soleus muscles, respectively) total testosterone (694.0± 54.6 ng/dL vs CON: 610.8±47.9 ng/dL) and its free fraction (552.7±49.2 pmol/L vs CON: 395.7±36.6 pmol/L) were increased after intensive training. On the 9th day all participants ran 10X800m at 100% Vm3km intensity. An all-out 1000m run was performed before and after the 10X800m session and it was noted that the performance decrease for the second 1000m was lower for the CHO-group (5.3±1.0% vs. CON: 10.6±1.3%). Glucose, lactate, epinephrine, cortisol and GH concentrations increased after 10x800m in both groups, but an attenuated response was noted for the CHO group for cortisol (22.4±0.9 pmol/L vs. CON: 27.6±1.4 pmol/L) and GH (21.8±5.6 ng/mL vs. CON: 36.7± 5.0 ng/mL). Moreover, the LDH and free plasma DNA concentrations were lower in the CHO group (509,2±23,1 U/L e 48.240,3±5.431,8 Allels/mL) compared to the CON group ((643,3±32,9 U/L e 73.751,8±11.546,6 Allels / mL, respectively) after the 10X800m run. During the recovery period, the observed lower cortisol response in the CHO group as well as to the higher glucose and insulin concentrations may have resulted in better anabolic effects and attenuation of inflammantion response. This may be linked to. In conclusion CHO supplementation attenuates the suppression of the hypothalamic-pituitary-gonodal axis, and result in better physical performance, higher levels of intramyocellular lipid stores, and lower catabolic responses and levels of markers for tissue damage

INTRODUÇÃO: A resposta do osteossarcoma (OS) à quimioterapia (QT) préoperatória é atualmente o indicador mais sensível para o prognóstico de sobrevida dos pacientes diagnosticados com OS. Esta resposta é avaliada mediante a porcentagem de necrose encontrada pelo patologista após a extração da peça na cirurgia, utilizando- se o índice de necrose tumoral de Huvos, no qual a necrose é expressada percentualmente. Existem estudos correlacionando os valores da fosfatase alcalina (FA) e da desidrogenase lática (DHL) com a sobrevida do paciente. Neste trabalho foi pesquisada a relação que existe entre os valores sanguíneos, pré e pós QT, de FA e DHL, com a porcentagem de necrose tumoral encontrada na peça cirúrgica após a realização da QT pré-operatória. MÉTODOS: Foram estudados 647 prontuários de pacientes tratados pelo Grupo de Oncologia Ortopédica do Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, no período de 1990 até o inicio de 2013, com diagnóstico anatomopatológico de OS. Destes, 510 foram excluídos por não apresentarem dados completos para a análise posterior. Foram incluídos um total de 137 prontuários. Os valores da FA e da DHL dos pacientes incluídos foram obtidos da realização do estadiamento, antes da QT pré-operatória e dos valores reportados após a finalização da QT pré-operatória. Também foi coletado o grau de necrose tumoral de cada peça extraída na cirurgia de cada paciente. Classificamos os resultados da FA e DHL obtidos em dois grupos. No grupo I os pacientes com valores normais de FA e DHL, no grupo II, os pacientes com valores acima do limite de normalidade. A classificação utilizada para agrupar os valores de sorológicos em investigação foi adaptado do trabalho realizado por Bramer et. al. Foi reportada a porcentagem de necrose tumoral descrita pelos patologistas, obtida das peças extraídas nas cirurgias realizadas pós QT. Esta porcentagem foi classificada de acordo com a classificação de Huvos. Foram calculadas as correlações da necrose da peça cirúrgica (Huvos) com as enzimas pré, pós e alteração (pós-pré) QT e também entre as enzimas, com uso de correlações de Spearman para verificar a existência de correlação entre elas. RESULTADOS: Tanto a FA como a DHL diminuíram nos pacientes estudados, quando comparados os valores pré QT e pós QT. A média da diferença da FA obtida pré QT e pós QT foi de 795,12 U/L sendo o valor pré QT maior ao valor pós QT. A diferença entre os valores da DHL pré QT e pós QT foi em média de 437,40 U/L, sendo o valor pré QT maior ao valor pós QT. Não houve correlação estatisticamente significativa entre o índice de Huvos e os valores de FA e DHL. A ausência da relação foi observada tanto com os valores pré-quimioterapia, quanto com os valores pós-quimioterapia, não obtendo correlação com a alteração das enzimas após a quimioterapia (p < 0,05). CONCLUSÃO: A medição de FA e da DHL não são fatores preditivos sobre a resposta tumoral à quimioterapia préoperatória em pacientes portadores de osteossarcoma / BACKGROUND AND AIMS: The osteosarcoma´s (OS) response to pre surgical chemotherapy (CT) is actually the most sensible predictor for life prognosis in patients diagnosed with OS. This response is evaluated by the chemotherapy-induced necrosis percentage found by the pathologist after the removal of the surgical piece, using the Huvos tumor necrosis (TN) index, in which the necrosis is expressed in percentage. There are studies that correlate the alkaline phosphatase (AP) and the lactate deshydrogenase (LDH) with the patient\'s life prognosis. In this study we researched the relationship between the serum levels of pre and post CT of AP and LDH and the percentage of TN found in the surgical piece after the pre surgical CT. METHODS: This is a retrospective study in which we studied 647 medical history files with anatomopathologic diagnosis of OS, treated by the Orthopedic oncology group of the Orthopedic and Traumatology Institute of the Hospital das Clinicas of the Medical School of the University of São Paulo between 1990 and 2013. Out of these, 510 were excluded for not having complete data for posterior analyses. We included 137 files in the study. The AP and the LDH values were obtained before and after pre surgical CT. We also obtained the degree of chemotherapy-induces TN obtained from the surgical piece. We classified the AP and the LDH into two groups. In the first group the patients with normal AP and LDH values and in the second group those with values above normal limit. This classification was adapted from the study published by Bramer et al. We classified the percentage of TN obtained from the removed surgical pieces after CT, using the Huvos index. We calculated the correlation between the TN with the pre, post and pre-post difference CT enzymes, using the Spearman correlation. RESULTS: The AP and the LDH decreased when comparing the pre CT values to the post CT values. The mean of the difference was of 795.12 U/L, the pre CT value being higher than the post CT. The difference between the LDH values pre and post CT was of 437.40 U/L, being the pre CT higher than the post CT. There was no statistically significant correlation between the Huvos index and the AP and LDH values. This was observed with the pre CT as well as with the post CT values (p < 0,05). CONCLUSIONS: The values of AP and LDH are not predictors for the tumor\'s chemotherapy-induced necrosis to pre surgical CT in patients with osteosarcoma

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_PriscillaMunizRibeiroda_D.pdf: 2752788 bytes, checksum: a2b912ed65ab26f33708f44d094db90a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A glutamato desidrogenase (GDH) é uma enzima mitochondrial que cataliza a reação reversível de glutamato a ?-cetoglutarato. Nas ilhotas pancreáticas, está associada com a secreção de insulina por aumentar a concentração de ATP. Ratos alimentados com dieta hipoprotéica apresentam secreção de insulina diminuída. A suplementação com leucina (LEU) aumenta a secreção de insulina em resposta a agentes insulinotrópicos. O presente estudo investigou a influência da suplementação com LEU na expressão da GDH e seu envolvimento com a secreção de insulina em ratos desnutridos e suplementados com LEU. Ratos machos foram alimentados com dietas normo- (17%, NP) ou hipoprotéicas (6%, LP) por oito semanas. Após, foram divididos e suplementados com LEU (1,5%) na água de beber (NPL e LPL) pelas quatro semanas seguintes. O conteúdo protéico de GDH no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético não diferiu entre os grupos. Nas ilhotas LP, a expressão da GDH estava diminuída e a suplementação com LEU aumentou a expressão de RNAm restaurando o conteúdo protéico a valores similares a NP. A secreção de insulina estimulada por agentes insulinotrópicos ou inibidores, combinados ou não, estava diminuída em ilhotas LP comparada com NP. A suplementação com LEU aumentou a secreção de insulina a valores similares a NP, exceto quando as ilhotas LPL foram incubadas com EGCG. Ilhotas LP tiveram diminuição na [Ca2+]i quando expostas a GLN+BCH. A suplementação com LEU restaurou esses parâmetros aos valores de NP. Frente a esses resultados, podemos concluir que a diminuição na expressão da GDH induzida pela dieta LP foi central ao pâncreas endócrino e está associada à redução da secreção de insulina observada nas ilhotas LP. A suplementação com LEU foi capaz de restaurar a expressão da GDH, contribuindo para o aumento da secreção de insulina observado nas ilhotas LPL. Além disso, a GDH pode, ainda, estar associada com a secreção de insulina pelo acoplamento estímulo/secreção via regulação da [Ca2+]i / Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH) is a mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the reversible reaction of glutamate to ?-ketoglutarate. In the pancreatic islets, this enzyme is associated with insulin secretion by augmenting ATP levels. Protein malnourished rats displayed reduced insulin secretion. Leucine (LEU) supplementation augments the insulin secretion response to insulinotropic agents. The present study investigated the influence of LEU supplementation on GDH expression and its involvement with insulin secretion in malnourished rats supplemented with LEU. Male rats were fed normal- (17%, NP) or low-protein diet (6%, LP) for eight weeks. Half of rats of each group were supplemented with LEU (1.5%) in drinking water for the following four weeks (NPL and LPL groups). GDH protein content in brain, liver, kidney and skeletal muscles was not different in any group. GDH RNAm and protein content was reduced in LP islets and LEU supplementation augmented RNAm expression restoring protein content similar to NP. Insulin secretion was reduced in LP islets compared with NP when stimulated by insulinotropics agents or inhybitors, combinaned or not. LEU supplementation augmented insulin secretion to similar values as NP, an effect that was blunted when LPL islets were incubated with EGCG. LP islets showed lower [Ca2+]i when exposed to GLN+BCH. LEU supplementation augmented these patterns similar to NP. Taken together, we may conclude that diminution in GDH expression induced by LP diet was central to endocrine pancreas and was associated with reduced insulin secretion observed in LP rats. LEU supplementation was able to restore GDH expression and it was capable to restore insulin secretion via GDH restoration. Yet, GDH may contribute to insulin secretion via Ca2+ regulation stimulus/secretion coupling / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular