Les immunoglobulines ne sont pas les seules protéines capables de reconnaissance spécifique. D’autres systèmes d’immunité adaptative existent et beaucoup d’autres protéines peuvent aussi générer des interactions spécifiques de hautes affinités. Ce sont des ossatures/squelettes protéiques intéressants pour concevoir de nouveaux interacteurs.Une nouvelle famille de protéines synthétiques, appelées AlphaReps, basée sur la famille des protéines à HEAT repeat contenant un motif structural répété en double hélice alpha, a été construite au laboratoire. Le motif répété, d’abord identifié chez une archée thermostable, a été idéalisé en concevant une séquence consensus, grâce à l’alignement de séquences de motifs naturels. Une banque de protéines a alors été construite à partir de ce motif. Toutes les protéines de la banque ont une structure générale similaire mais elles diffèrent par le nombre de motifs insérés et par les cinq résidus hautement diversifiés situés sur la face externe de la seconde hélice de chacun des motifs. Ces nouvelles protéines sont exprimées très efficacement chez E. Coli, solubles, sans pont disulfure et très stables (50-100 mg. L-1 de culture, Tm > 70°C).Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s’intéresse à l’utilisation de ces nouvelles protéines synthétiques comme outils de reconnaissance moléculaire. Pour cela, plusieurs applications ont été développées. Dans la première partie, à l’aide de la technique du phage display, des interacteurs de hautes affinités pour la Green Fluorescent Protein ont pu être isolés au sein de la banque. Les interactions des protéines partenaires ont été caractérisées par la détermination des constantes d’affinité, ainsi que la résolution des structures cristallographiques de deux complexes contenant une AlphaRep spécifique et la GFP. Avec cette cible modèle, la possibilité d’utiliser les AlphaReps sélectionnées à l’intérieur des cellules eucaryotes vivantes pour reconnaître spécifiquement une cible protéique dans un milieu complexe a aussi été démontrée. L’utilisation des AlphaReps comme outils de diagnostique a été développée pour la détection de la cible membranaire FSHr (récepteur de l’hormone folliculo-stimulante), protéine surexprimée dans de nombreuses tumeurs. Ce projet a permis d’expérimenter des approches de sélections sur cellules entières, soulignant les progrès restant encore à accomplir pour la sélection contre des cibles plus complexes.La seconde partie de ce travail s’est intéressée à l’ingénierie et à l’évolution des AlphaReps. Ainsi, l’insertion de résidus variables sur le dernier motif (C-cap) de protéines de la banque a pu être validé. Une approche innovante de shuffling modulaire, adaptée à l’ossature AlphaRep a permis de cerner les limites de cette méthode et les améliorations à apporter pour être en mesure d’augmenter l’affinité d’interacteurs présélectionnés. La banque d’AlphaReps de phage display a également été transférée dans un vecteur de PCA (Protein Fragment Complementation Assay) utilisant la protéine scindée DHFR (Dihydrofolate Reductase) comme protéine rapportrice. Cela a permis de sélectionner des AlphaReps spécifiques pour des cibles non exploitables en phage display. L’utilisation de la cis-fusion entre une AlphaRep et sa cible, combinée à la technique de PCA, s’est révélée très efficace pour la sélection et la cristallisation de protéines réfractaires telles que la protéine ComD, ici présentée comme preuve de la réussite de cette approche.Les AlphaReps sont donc des protéines artificielles, parmi lesquelles des interacteurs spécifiques peuvent être isolés pour des cibles variées. Un large panel d’applications peut être envisagé comme le développement d’outils d’aide à la cristallogenèse ou celui d’outils de reconnaissance moléculaire in vivo. / Immunoglobulin fold is not the only basis for specific recognition proteins. Other adaptive immunity systems exist and many other proteins are also able to mediate specific high-affinity interactions. These are interesting scaffolds to generate alternative binding molecules.A new family of artificial proteins, named AlphaRep, based on HEAT repeat proteins containing an alpha-helical repeated motif, was designed in the laboratory. The repeated motif, first identified in a thermostable archae protein of unknown function was refined and idealized using a consensus design strategy. A library of artificial proteins based on this design was then constructed. All proteins from this library share the same general fold but differ both in the number of repeats and in a set of five highly randomized positions per repeat. The randomized side chains are located on the outside surface of the second helix. Sequences from this library are efficiently expressed as soluble, folded and very stable proteins (50-100 mg. L-1 of culture, Tm > 70°C).The work presented in this manuscript is focused on the use of those new synthetic proteins as molecular recognition tools. Then, different applications have been developed.In a first part, binders with high affinity for the green fluorescent protein were selected by phage display. Complexes were characterized. Affinity between partners was measured and structures of two of those complexes containing a specific AlphaRep and the protein target were solved by X-ray crystallography. Thanks to this model target, it was demonstrated that AlphaReps could be used in living cells for the specific recognition of the protein they have been selected for. AlphaReps have also been developed as a diagnostic tool to detect the membrane protein FSHr (Follicle stimulating Hormone receptor), shown to be overexpressed in various tumors. In this project, selections on entire cells have been performed, showing the limit of the selections approaches with complex targets.The second part of this work focused on engineering and evolutions of AlphaRep proteins. The insertion of randomized residues at specific positions in the last motif (C-cap) was validated. An innovative approach of modular shuffling, adjusted to the AlphaRep scaffold, was assessed. Limitations of this approach to perform affinity maturation of AlphaReps could then be understood. Finally, the AlphaRep Library was transferred to a PCA (Protein Fragment Complementation Assay) vector using the split DHFR (Dihydrofolate Reductase) as reporter protein. With this new selection system, specific Alphareps could be selected for protein targets not suitable for phage display selection. A cis-fusion strategy was employed to express the AlphaRep fused to its partner in order to increase the stability and solubility of the target as well as helping for its crystallogenesis. This approach, combined with the PCA selection, was successful to obtain crystals of the ComD protein (unstable protein), shown here as an example of success for this new method.AlphaReps are thus artificial proteins, among which specific binders can be isolated for various targets, showing a strong potential for a large range of applications from crystallogenesis helpers to in vivo molecular recognition tools.

Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d’une part le développementd’une nouvelle famille de protéines artificielles et d’autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L’objectif général était de développer une approchegénérale permettant d’obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d’anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d’expression, insensibilité à l’agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d’une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d’un motif idéalisé à partir d’une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l’architecture αRep choisie : Les protéines s’expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l’amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d’une bibliothèque d’αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d’exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L’ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l’organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées. / The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named αRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration αRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news αReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between αRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities.

Les déshydrogénases sont faiblement actives en présence de fortes concentrations (> 50 % (v/v)) de liquides ioniques (LIs) miscible à l’eau et les raisons précises de cette inactivation ne sont pas connues. La structure de la formiate déshydrogénase de Candida boidinii (FDH) en présence de ces LIs miscibles à l’eau a été étudiée par atténuation de fluorescence par de l’iode ou de l’acrylamide. Une concentration critique, la CILc ("Critical Ionic Liquid concentration"), au dessus de laquelle la fluorescence n’est pas exploitable, est déterminée. Elle se situe entre 30 et 40 % (v/v) des LIs de cette étude. Les LIs s’avèrent être de forts agents dénaturants : les constantes d’atténuation de fluorescence en présence de LI sont de 1,4 à 2 fois plus importantes qu’en présence d’urée. La FDH a été modifiée chimiquement par des cations analogues aux cations des LIs afin de la préserver de l’interaction avec les LIs. Les enzymes modifiées par des cations de plus petite taille présentent une importante activité résiduelle (30-45%) en présence de 70% (v/v) de LI tandis que l’enzyme sauvage est inactive. En présence de 30% (v/v) de LI, l’efficacité catalytique (kcat/KM) des enzymes modifiées augmente de 1,3 à 3,6 fois et la constante de Michaelis (KM) diminue de 1,7 à 4,6 fois suivant le cation utilisé. Selon la taille du cation greffé, le temps de demi-vie des enzymes modifiées augmente de 3 à 5 fois en solution tamponnée. Enfin, la structure des enzymes modifiées est préservée en présence de 40% (v/v) de LI tandis que l’enzyme native commence à se dénaturer. La technique d’évolution dirigée a également été utilisée. A ce jour, 987 mutants ont été criblés. Un mutant (M60) présente une activité résiduelle de 35% à 70% (v/v) de LI tandis que l’enzyme sauvage est inactive. Ce dernier porte deux mutations, N187S et T321S, situées à la surface de la structure protéique. En présence de 30 % (v/v) de LI, le mutant 60 fixe les substrats avec des valeurs de de KMNAD et de KDN3 (N3 est l’azide, un inhibiteur compétitif du formiate) 2 fois plus faibles que celles de l’enzyme sauvage. / The dehydrogenases are weakly active in the presence of high concentration (> 50% (v/v)) of water-miscible ionic liquids (ILs) and the mechanism of enzyme inactivation in ILs is not fully understood. The structure of the formate dehydrogenase Candida boidinii (FDH) in ILs has been studied by quenching of fluorescence experiments in the presence of iodide or acrylamide. A critical concentration, the CILc (“Critical Ionic liquid concentration"), is defined as the concentration of IL above which the fluorescence is not relevant. In this work, the CILc is comprised between 30 and 40 % (v/v) of the ILs. The ILs have revealed to be denaturing agents which increase the quenching of fluorescence efficiency by 1.4 to 2 times more than in urea. The FDH is chemically modified by analogous cations found in ILs in order to preserve the biocatalyst from the direct interaction with ILs. The enzymes modified by the smaller cations shown 30 45% residual activity at 70% (v/v) of ILs while the native enzyme is fully inactive. In the presence of 30% (v/v) of ILs, the kinetic efficiency (kcat/KM) of the grafted enzymes is improved by a 1.3-3.6 fold factor and the constant of Michaelis (KM) is reduced by a 1.7-4.6 fold factor depending on the grafted cations. In aqueous solution, the half-lives of modified enzymes are 3 to 5 fold higher than the native FDH depending on the size of the cation grafted. Finally, the structure of the grafted enzymes is somehow maintained in the presence of 40% (v/v) of ILs while the native FDH begins to unfold. We also used directed evolution to improve the FDH activity in the presence of ILs. At this stage, 987 mutants have been screened and one mutant (M60) shows 35% of residual activity at 70% (v/v) of ILs. In the presence of 30% (v/v) of ILs, the mutant binds the substrates in a greater extent than the native FDH, the values of KMNAD and the KDN3 (N3 is the azide, a competitive inhibitor of formate) are reduced by a 2 fold factor by comparison to the native enzyme.

<p>Glutathione transferases (GSTs) are detoxication enzymes involved in the cellular protection against a wide range of reactive substances. The role of GSTs is to catalyze the conjugation of glutathione with electrophilic compounds, which generally results in less toxic products. </p><p>The ability to catalyze the denitrosation of the anticancer drug 1,3-bis(2-chloroethyl)- 1-nitrosourea (BCNU) was measured in twelve different GSTs. Only three of the enzymes showed any measurable activity with BCNU, of which human GST T1-1 was the most efficient. This is of special interest, since human GST T1-1 is a polymorphic protein and its expression in different patients may be crucial for the response to BCNU.</p><p>DNA shuffling was used to create a mutant library by recombination of cDNA coding for two different Theta-class GSTs. In total, 94 randomly picked mutants were characterized with respect to their catalytic activity with six different substrates, expression level and sequence. A clone with only one point mutation compared to wild-type rat GST T2-2 had a significantly different substrate-activity pattern. A high expressing mutant of human GST T1-1 was also identified, which is important, since the yield of the wild-type GST T1-1 is generally low. </p><p>Characterization of the Theta library demonstrated divergence of GST variants both in structure and function. The properties of every mutant were treated as a point in a six-dimensional substrate-activity space. Groups of mutants were formed based on euclidian distances and K-means cluster analyses. Both methods resulted in a set of five mutants with high alkyltransferase activities toward dichloromethane and 4-nitrophenethyl bromide (NPB). </p><p>The five selected mutants were used as parental genes in a new DNA shuffling. Addition of cDNA coding for mouse and rat GST T1-1 improved the genetic diversity of the library. The evolution of GST variants was directed towards increased alkyltransferase activity including activity with the anticancer drug BCNU. NPB was used as a surrogate substrate in order to facilitate the screening process. A mutant from the second generation displayed a 65-fold increased catalytic activity with NPB as substrate compared to wild-type human GST T1-1. The BCNU activity with the same mutant had increased 175-fold, suggesting that NPB is a suitable model substrate for the anticancer drug. Further evolution presented a mutant in the fifth generation of the library with 110 times higher NPB activity than wild-type human GST T1-1.</p>

Glutathione transferases (GSTs) are detoxication enzymes involved in the cellular protection against a wide range of reactive substances. The role of GSTs is to catalyze the conjugation of glutathione with electrophilic compounds, which generally results in less toxic products. The ability to catalyze the denitrosation of the anticancer drug 1,3-bis(2-chloroethyl)- 1-nitrosourea (BCNU) was measured in twelve different GSTs. Only three of the enzymes showed any measurable activity with BCNU, of which human GST T1-1 was the most efficient. This is of special interest, since human GST T1-1 is a polymorphic protein and its expression in different patients may be crucial for the response to BCNU. DNA shuffling was used to create a mutant library by recombination of cDNA coding for two different Theta-class GSTs. In total, 94 randomly picked mutants were characterized with respect to their catalytic activity with six different substrates, expression level and sequence. A clone with only one point mutation compared to wild-type rat GST T2-2 had a significantly different substrate-activity pattern. A high expressing mutant of human GST T1-1 was also identified, which is important, since the yield of the wild-type GST T1-1 is generally low. Characterization of the Theta library demonstrated divergence of GST variants both in structure and function. The properties of every mutant were treated as a point in a six-dimensional substrate-activity space. Groups of mutants were formed based on euclidian distances and K-means cluster analyses. Both methods resulted in a set of five mutants with high alkyltransferase activities toward dichloromethane and 4-nitrophenethyl bromide (NPB). The five selected mutants were used as parental genes in a new DNA shuffling. Addition of cDNA coding for mouse and rat GST T1-1 improved the genetic diversity of the library. The evolution of GST variants was directed towards increased alkyltransferase activity including activity with the anticancer drug BCNU. NPB was used as a surrogate substrate in order to facilitate the screening process. A mutant from the second generation displayed a 65-fold increased catalytic activity with NPB as substrate compared to wild-type human GST T1-1. The BCNU activity with the same mutant had increased 175-fold, suggesting that NPB is a suitable model substrate for the anticancer drug. Further evolution presented a mutant in the fifth generation of the library with 110 times higher NPB activity than wild-type human GST T1-1.

This thesis presents the application of different protein engineering methods on enzymes and non-catalytic proteins that act upon xyloglucans. Xyloglucans are polysaccharides found as storage polymers in seeds and tubers, and as cross-linking glucans in the cell wall of plants. Their structure is complex with intricate branching patterns, which contribute to the physical properties of the polysaccharide including its binding to and interaction with other glucans such as cellulose. One important group of xyloglucan-active enzymes is encoded by the GH16 XTH gene family in plants, including xyloglucan endo-transglycosylases (XET) and xyloglucan endo-hydrolases (XEH). The molecular determinants behind the different catalytic routes of these homologous enzymes are still not fully understood. By combining structural data and molecular dynamics (MD) simulations, interesting facts were revealed about enzyme-substrate interaction. Furthermore, a pilot study was performed using structure-guided recombination to generate a restricted library of XET/XEH chimeras. Glycosynthases are hydrolytically inactive mutant glycoside hydrolases (GH) that catalyse the formation of glycosidic linkages between glycosyl fluoride donors and glycoside acceptors. Different enzymes with xyloglucan hydrolase activity were engineered into glycosynthases, and characterised as tools for the synthesis of well-defined homogenous xyloglucan oligo- and polysaccharides with regular substitution patterns. Carbohydrate-binding modules (CBM) are non-catalytic protein domains that bind to polysaccharidic substrates. An important technical application involves their use as molecular probes to detect and localise specific carbohydrates in vivo. The three-dimensional structure of an evolved xyloglucan binding module (XGBM) was solved by X-ray diffraction. Affinity-guided directed evolution of this first generation XGBM resulted in highly specific probes that were used to localise non-fucosylated xyloglucans in plant tissue sections. / QC 20100902

The prospect of the work presented in this thesis has been to engineer Cre recombinase to recognize and recombine a sequence from an HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR), characterize the recombination proficiency of the evolved recombinase in mammalian cells and explore the potential of the recombinase for a novel antiretroviral strategy.

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Evolución dirigida de proteínas: La evolución dirigida es una técnica que nos permite explorar funciones enzimáticas que no son requeridas en el ambiente natural. Esta técnica, simula procesos genéticos naturales y de selección. Esta estrategia se utiliza cuando un diseño racional es muy complicado. Consiste en una repetición de ciclos de diversificación y selección que llevan a la acumulación de mutaciones benéficas. Aquí se presenta dos ejemplos de evolución dirigida con los cuales se ha trabajado directamente: la ADN polimerasa del organismo  Thermus aquaticus usada comúnmente en PCR, y la proteína LacI que regula la expresión de genes usados para el metabolismo de lactosa en E. Coli. / Directed evolution allows us to explore protein functionalities not required in the natural environment. It mimics natural genetic processes and selective pressures. This approach is used when the molecular basis is not completely understood and rational design is a difficult task. This approach consists of serial cycles of consecutive diversification and selection which eventually lead to the accumulation of beneficial mutations. Here are presented two cases where directed evolution is used to modify two different proteins: Taq polymerase, enzyme used for DNA extension in PCR, and the LacI repressor protein which regulates gene expression on E.coli.

Les protéines fluorescentes (PF) homologues d’AvGFP (Green Fluorescent Protein de la méduse Aequorea victoria) sont des outils incontournables de l’imagerie des processus de la cellule vivante. Leurs performances conditionnent la précision de l’analyse quantitative des signaux de fluorescence. Le développement de nouvelles PF demande donc à la fois de parvenir à une forte brillance tout en contrôlant la réponse de la protéine aux variations des paramètres physico-chimiques de la cellule en fonction de la question biologique étudiée. A ce jour, les PF jaunes disponibles montrent une forte sensibilité au pH. Afin d’élaborer des mutants moins sensibles, deux approches ont été considérées : une première consiste à mieux appréhender l’incidence de la dynamique du réseau de liaisons hydrogène entourant le chromophore sur son équilibre acido-basique. La seconde vise à identifier les facteurs structuraux à l’origine de la brillance particulièrement élevée de nouvelles PF jaunes et jaune-vert provenant d’un ver marin, Branchiostoma lanceolatum.J’ai d’abord mis au point un algorithme recherchant l’ensemble des liaisons hydrogène présentes au sein d’une protéine et qui étudie leur dynamique au cours de simulations par dynamique moléculaire. Il permet leur agrégation en réseaux, l’identification des réseaux connectés à un atome d’intérêt ainsi que le suivi de leur dynamique. Pour validation, cet algorithme a été appliqué à la recherche des réseaux de liaisons hydrogène présents au sein de différents mutants d’AvGFP pour lesquels un transfert de proton à l'état excité a été étudié expérimentalement. Cet algorithme pourra également servir à comprendre de façon dynamique le mécanisme d’autres systèmes biologiques dont la fonction repose sur le transfert de protons.D’autre part, j’ai résolu la structure de la protéine fluorescente jaune naturelle lanYFP de Branchiostoma lanceolatum, particulièrement brillante mais à la structure quaternaire tétramérique. Cette protéine a été rendue monomérique par évolution dirigée, ce qui a donné la protéine mNeonGreen à la fluorescence jaune-vert, protéine désormais étalon dans cette gamme spectrale, et dont j’ai également résolu la structure. Mon étude a permis de rationaliser a postériori l’ensemble des mutations introduites au cours de l’évolution. Enfin, j’ai réalisé une étude du dégât d’irradiation spécifique des rayons X permettant de comprendre le changement remarquable de couleur observé sur les cristaux de mNeonGreen après collecte de données de diffraction.L’ensemble des résultats obtenus au cours de ma thèse permet de proposer un cadre de compréhension à la fois théorique et expérimental des déterminants contrôlant les propriétés de fluorescence des PF jaunes. / Fluorescent Proteins (FPs) homologous to AvGFP (Green Fluorescent Protein from the jellyfish Aequoria victoria) are versatile tools used in live cell imaging. The amount of information that can be derived from the fluorescence signals depends on the spectroscopic performances of the FP. The development of new FPs should focus on both brightness increase and control of the protein response to physicochemical parameter variations within the cell. Current yellow FPs exhibit a strong sensitivity to pH. In order to engineer less sensitive variants, two complementary approaches have been used: the first one consists in studying the influence of the hydrogen bond network dynamics around the chromophore on its protonation state. In the second one, I have sought to identify the structural determinants of the particularly high brightness of newly discovered yellow FPs from a sea worm, Branchiostoma lanceolatum.First, I wrote an algorithm that can identify all hydrogen bonds within a protein and analyse their dynamics along molecular dynamics simulations. It allows for their clustering in networks, the identification of networks connected to a given atom and the monitoring of their dynamics. The method was validated by using the algorithm on various AvGFP mutants for which excited state proton transfer has been experimentally studied. This algorithm should also be useful for the study of other biological systems whose function is based on proton transfer.Besides, I solved the structure of the natural yellow FP lanYFP from Branchiostoma lanceolatum, which is particularly bright, but presents a tetrameric arrangement. This protein was monomerized by directed evolution, which led to the yellow-green FP mNeonGreen, now a benchmark in this spectral range. I also solved the structure of mNeonGreen, which allowed me to rationalize a posteriori the mutations that have been introduced during the evolution process. Finally, I performed a specific radiation damage study in order to explain the remarkable change in colour of mNeonGreen crystals upon X-ray data collection. Altogether, the results of my PhD work provides a theoretical and experimental framework of the determinants that drive the fluorescence properties of yellow FPs.