Durante a divisão celular as Aurora-quinases (AURKA e AURKB) participam da formação e controle das fibras do fuso mitótico enquanto as isoformas proteicas (DIDO1, DIDO2 e DIDO3), originadas do splicing alternativo do gene DIDO, auxiliam na junção dos microtúbulos aos cinetócoros. Portanto, ambas são relevantes na regulação do ciclo celular. Interessantemente, a superexpressão (ou o ganho de função) das AURKs ou a baixa expressão (ou perda de função) das isoformas de DIDO estão ambos associados com amplificação dos centrossomos e à instabilidade cromossômica (CIN), com consequente aneuploidia. Dentre as doenças hematológicas com registros de CIN, a leucemia linfoide crônica (LLC) pode apresentar amplificação dos centrossomos e alteração nos níveis de expressão das AURKs acarretando aneuplodias. Apesar disso, não existem estudos avaliando a potencial associação destes genes com CIN na LLC. Avaliando seus níveis de expressão gênica em amostras de LLC de pacientes com ou sem aberrações cromossômicas, mostramos que o aumento dos níveis de AURKA e AURKB e, inversamente, a redução dos níveis das variantes de DIDO, são significativamente associados com ganhos cromossômicos e com aumento da contagem de glóbulos brancos (WBC). Claramente, amostras de LLC sem qualquer anormalidade citogenética apresentam níveis de expressão semelhantes às amostras que contêm aberrações não-numéricas. O achado de que níveis de expressão de AURKs e variantes de DIDO são completamente opostos, mostrando um padrão discreto de inter-relação, levou-nos a investigar o potencial mecanismo regulatório por trás disso. Tendo em vista que outros, anteriormente, mostraram que o cluster oncogênico miR-17~92 é significativamente hiper-regulado em células de pacientes com LLC purificadas expressando genes IGHV não mutados (em comparação com células mutadas de pacientes) e, que o miR-17 é expresso em níveis significativamente mais elevados em células IGHV não mutadas ou ZAP-70 positivas (mau prognóstico geralmente associada à CIN), resolvemos investigar o potencial de regulação negativa dos microRNAs deste cluster sobre as variantes de DIDO. Além disso, com base no mecanismo regulatório já descrito pelo qual a superexpressão de AURKA induz a transcrição do cluster miR-17~92, mediada por E2F1 (com uma correlação entre as expressões de ambas as proteínas em diferentes tipos de câncer), decidimos investigar este eixo regulatório em LLC. Notavelmente, todas as variantes de DIDO apresentam-se preditas como fortes alvos de vários microRNAs deste cluster oncogênico. Mostramos, então, que amostras de LLC com baixa expressão de DIDO, além dos já mencionados níveis elevados de AURK, exibiram níveis significativamente mais elevados do fator de transcrição E2F1 e de seu alvo transcricional, o transcrito primário do miR-17~92 (MIR17HG). Além disso, por meio do uso da linhagem de celular NTERA-2, como modelo experimental, mostramos que o siRNA nocaute para AURKA (nos níveis transcricional e proteico, como confirmado por qPCR e western blot) é acompanhada por uma significativa redução de E2F1 e também de MIR17HG. Ainda, a transfecção de células NTERA-2 com sintéticos microRNAs miméticos do cluster miR-17~92 (ou seja, 19a-miR, miR-20a e miR-92a) resultou em uma clara e significativa redução dos níveis de transcrição de todas as variantes de DIDO. Por fim, a inibição do siRNA especifico para a variante DIDO3 (mas não às outras variantes) levou a uma redução significativa dos níveis de transcrição de todas as variantes de DIDO, indicando um mecanismo adicional contribuindo para a downregulação dos transcritos de DIDO. Ao todo, nossos resultados demonstram a existência de um potencial mecanismo regulatório interconectado entre AURK e DIDO, associado à CIN e maior contagem de WBC na LLC. Mais importante, os níveis de expressão elevada de AURKs e os baixos níveis associados das variantes de DIDO são especificamente relacionados com anormalidades citogenéticas apresentando ganhos cromossomais, com destaque para o mecanismo celular específico, subjacente à CIN, observado neste grupo distinto LLC. Dado o papel central da CIN na gênese e progressão do câncer, esses achados provavelmente terão um impacto importante no prognóstico ou tratamento da LLC. / During cell cycle division Aurora kinases (AURKA and AURKB) participate in the formation and control of mitotic spindle fibers, while, protein isoforms (DIDO1, DIDO2 and DIDO3), derived by alternative splicing of the DIDO gene, assist at the junction of microtubules to kinetochores. Thus, both are relevant to cell cycle maintenance. Interestingly, overexpression (or gain of function) of AURKs or low expression (or loss of function of DIDO) are both associated with centrosomal amplification and chromosomal instability (CIN), leading to aneuploidy. Among hematological diseases with CIN records, chronic lymphocytic leukemia (CLL) can display centrosome amplification and changes in AURKs expression levels leading to aneuploidy. Despite this, there are no studies evaluating the potential association of these genes with CIN in CLL. By evaluating their gene expression levels in CLL samples from patients with or without chromosomal aberrations, we show that increased levels of AURKA and AURKB and, conversely, reduced levels of DIDO variants, are both significantly associated with chromosomal gains and with increased white blood cell (WBC) counts. Clearly, CLL samples without any cytogenetic abnormality had expression levels similar to samples mostly harboring non-numerical aberrations. The finding that the expression levels of AURKs and DIDO variants are completely opposed, showing a discrete inter-related pattern, led us to investigate the potential regulatory mechanism behind this. Given that other have previously shown that the oncogenic miR-17~92 cluster is significantly upregulated in purified CLL patient cells expressing unmutated IGHV genes (as compared to mutated patient cells), and that miR-17 is expressed at significantly higher levels in unmutated or ZAP-70 high cases (bad prognostic cases generally associated with chromosomal instability), we investigated the potential negative regulation of DIDO variants by microRNAs from this cluster. In addition, based on the already described regulatory mechanism by which AURKA overexpression induces the E2F1-mediated transcription upregulation of the miR-17~92 cluster (with an observed expression correlation of both proteins in cancer specimens); we decided to investigate this regulatory axis in CLL. Notably, we found that all DIDO variants are predicted to be heavily targeted by several miRs of this oncogenic cluster. We show that CLL samples with low DIDO expression, in addition to the already mentioned AURK high levels, displayed significant higher levels of the transcription factor E2F1 and of its transcriptional target, the miR-17~92 primary transcript (MIR17HG). Moreover, by using the NTERA-2 cell line as a model, we show that siRNA knockdown of AURKA (at the transcript and protein level, as confirmed by qPCR and western blot) is accompanied by a striking significant reduction of E2F1 and also of MIR17HG. Furthermore, transfection of NTERA-2 cells with synthetic mimics of the miR-17~92 cluster (namely, miR-19a, miR-20a and miR-92a) results in a clear and significant reduction in the transcript levels of all DIDO variants. Finally, specific siRNA inhibition of the DIDO3 variant (but not the others) led to a significant reduction in the transcript levels of all DIDO variants, indicating an additional mechanism contributing to the downregulation of DIDO transcripts. Altogether, our results demonstrate the existence of a potential interconnected regulatory mechanism between AURK and DIDO, associated with CIN and higher WBC counts in CLL. More importantly, the high expression levels of AURKs and the associated low levels of DIDO variants are specifically associated with cytogenetic abnormalities presenting chromosomal gains, highlighting the specific cellular mechanism underlying the CIN observed in this distinct CLL group. Given the central role of CIN in cancer genesis and progression, these findings will likely have an important impact on prognosis or treatment of CLL.

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Durante a divisão celular as Aurora-quinases (AURKA e AURKB) participam da formação e controle das fibras do fuso mitótico enquanto as isoformas proteicas (DIDO1, DIDO2 e DIDO3), originadas do splicing alternativo do gene DIDO, auxiliam na junção dos microtúbulos aos cinetócoros. Portanto, ambas são relevantes na regulação do ciclo celular. Interessantemente, a superexpressão (ou o ganho de função) das AURKs ou a baixa expressão (ou perda de função) das isoformas de DIDO estão ambos associados com amplificação dos centrossomos e à instabilidade cromossômica (CIN), com consequente aneuploidia. Dentre as doenças hematológicas com registros de CIN, a leucemia linfoide crônica (LLC) pode apresentar amplificação dos centrossomos e alteração nos níveis de expressão das AURKs acarretando aneuplodias. Apesar disso, não existem estudos avaliando a potencial associação destes genes com CIN na LLC. Avaliando seus níveis de expressão gênica em amostras de LLC de pacientes com ou sem aberrações cromossômicas, mostramos que o aumento dos níveis de AURKA e AURKB e, inversamente, a redução dos níveis das variantes de DIDO, são significativamente associados com ganhos cromossômicos e com aumento da contagem de glóbulos brancos (WBC). Claramente, amostras de LLC sem qualquer anormalidade citogenética apresentam níveis de expressão semelhantes às amostras que contêm aberrações não-numéricas. O achado de que níveis de expressão de AURKs e variantes de DIDO são completamente opostos, mostrando um padrão discreto de inter-relação, levou-nos a investigar o potencial mecanismo regulatório por trás disso. Tendo em vista que outros, anteriormente, mostraram que o cluster oncogênico miR-17~92 é significativamente hiper-regulado em células de pacientes com LLC purificadas expressando genes IGHV não mutados (em comparação com células mutadas de pacientes) e, que o miR-17 é expresso em níveis significativamente mais elevados em células IGHV não mutadas ou ZAP-70 positivas (mau prognóstico geralmente associada à CIN), resolvemos investigar o potencial de regulação negativa dos microRNAs deste cluster sobre as variantes de DIDO. Além disso, com base no mecanismo regulatório já descrito pelo qual a superexpressão de AURKA induz a transcrição do cluster miR-17~92, mediada por E2F1 (com uma correlação entre as expressões de ambas as proteínas em diferentes tipos de câncer), decidimos investigar este eixo regulatório em LLC. Notavelmente, todas as variantes de DIDO apresentam-se preditas como fortes alvos de vários microRNAs deste cluster oncogênico. Mostramos, então, que amostras de LLC com baixa expressão de DIDO, além dos já mencionados níveis elevados de AURK, exibiram níveis significativamente mais elevados do fator de transcrição E2F1 e de seu alvo transcricional, o transcrito primário do miR-17~92 (MIR17HG). Além disso, por meio do uso da linhagem de celular NTERA-2, como modelo experimental, mostramos que o siRNA nocaute para AURKA (nos níveis transcricional e proteico, como confirmado por qPCR e western blot) é acompanhada por uma significativa redução de E2F1 e também de MIR17HG. Ainda, a transfecção de células NTERA-2 com sintéticos microRNAs miméticos do cluster miR-17~92 (ou seja, 19a-miR, miR-20a e miR-92a) resultou em uma clara e significativa redução dos níveis de transcrição de todas as variantes de DIDO. Por fim, a inibição do siRNA especifico para a variante DIDO3 (mas não às outras variantes) levou a uma redução significativa dos níveis de transcrição de todas as variantes de DIDO, indicando um mecanismo adicional contribuindo para a downregulação dos transcritos de DIDO. Ao todo, nossos resultados demonstram a existência de um potencial mecanismo regulatório interconectado entre AURK e DIDO, associado à CIN e maior contagem de WBC na LLC. Mais importante, os níveis de expressão elevada de AURKs e os baixos níveis associados das variantes de DIDO são especificamente relacionados com anormalidades citogenéticas apresentando ganhos cromossomais, com destaque para o mecanismo celular específico, subjacente à CIN, observado neste grupo distinto LLC. Dado o papel central da CIN na gênese e progressão do câncer, esses achados provavelmente terão um impacto importante no prognóstico ou tratamento da LLC. / During cell cycle division Aurora kinases (AURKA and AURKB) participate in the formation and control of mitotic spindle fibers, while, protein isoforms (DIDO1, DIDO2 and DIDO3), derived by alternative splicing of the DIDO gene, assist at the junction of microtubules to kinetochores. Thus, both are relevant to cell cycle maintenance. Interestingly, overexpression (or gain of function) of AURKs or low expression (or loss of function of DIDO) are both associated with centrosomal amplification and chromosomal instability (CIN), leading to aneuploidy. Among hematological diseases with CIN records, chronic lymphocytic leukemia (CLL) can display centrosome amplification and changes in AURKs expression levels leading to aneuploidy. Despite this, there are no studies evaluating the potential association of these genes with CIN in CLL. By evaluating their gene expression levels in CLL samples from patients with or without chromosomal aberrations, we show that increased levels of AURKA and AURKB and, conversely, reduced levels of DIDO variants, are both significantly associated with chromosomal gains and with increased white blood cell (WBC) counts. Clearly, CLL samples without any cytogenetic abnormality had expression levels similar to samples mostly harboring non-numerical aberrations. The finding that the expression levels of AURKs and DIDO variants are completely opposed, showing a discrete inter-related pattern, led us to investigate the potential regulatory mechanism behind this. Given that other have previously shown that the oncogenic miR-17~92 cluster is significantly upregulated in purified CLL patient cells expressing unmutated IGHV genes (as compared to mutated patient cells), and that miR-17 is expressed at significantly higher levels in unmutated or ZAP-70 high cases (bad prognostic cases generally associated with chromosomal instability), we investigated the potential negative regulation of DIDO variants by microRNAs from this cluster. In addition, based on the already described regulatory mechanism by which AURKA overexpression induces the E2F1-mediated transcription upregulation of the miR-17~92 cluster (with an observed expression correlation of both proteins in cancer specimens); we decided to investigate this regulatory axis in CLL. Notably, we found that all DIDO variants are predicted to be heavily targeted by several miRs of this oncogenic cluster. We show that CLL samples with low DIDO expression, in addition to the already mentioned AURK high levels, displayed significant higher levels of the transcription factor E2F1 and of its transcriptional target, the miR-17~92 primary transcript (MIR17HG). Moreover, by using the NTERA-2 cell line as a model, we show that siRNA knockdown of AURKA (at the transcript and protein level, as confirmed by qPCR and western blot) is accompanied by a striking significant reduction of E2F1 and also of MIR17HG. Furthermore, transfection of NTERA-2 cells with synthetic mimics of the miR-17~92 cluster (namely, miR-19a, miR-20a and miR-92a) results in a clear and significant reduction in the transcript levels of all DIDO variants. Finally, specific siRNA inhibition of the DIDO3 variant (but not the others) led to a significant reduction in the transcript levels of all DIDO variants, indicating an additional mechanism contributing to the downregulation of DIDO transcripts. Altogether, our results demonstrate the existence of a potential interconnected regulatory mechanism between AURK and DIDO, associated with CIN and higher WBC counts in CLL. More importantly, the high expression levels of AURKs and the associated low levels of DIDO variants are specifically associated with cytogenetic abnormalities presenting chromosomal gains, highlighting the specific cellular mechanism underlying the CIN observed in this distinct CLL group. Given the central role of CIN in cancer genesis and progression, these findings will likely have an important impact on prognosis or treatment of CLL.

O glioblastoma multiforme (GBM) é um dos tumores mais letais e a radioterapia permanece como um dos principais tratamentos. Novas estratégias são necessárias para coibir a resistência ao tratamento, como o silenciamento de fatores de transcrição (FTs). Nossa hipótese é a de que FTs associados a listas de genes diferencialmente expressos, os quais foram selecionados para linhagens de GBM irradiadas, ou comparando amostras de GBM à amostras de tecido cerebral, possam fornecer alvos moleculares que aumentariam a morte das células tumorais, quando silenciados. Foram analisadas a proliferação, morte e ciclo celular, além da formação e diferenciação de neuroesferas, utilizando, em quase todas as etapas, a citometria de fluxo. Os FTs HEB e E2F1, cujas funções principais estão relacionadas à neurogênese e proliferação celular, foram selecionados a partir das análises in silico de GBM irradiados ou não, ou de GBMs comparados a amostras de cérebro normal, respectivamente. Esses FTs encontram-se expressos em linhagens U87, astrócitos primários e neuroesferas provenientes das mesmas, analisadas por Western blot. O silenciamento de HEB e E2F1 na linhagem U87, de forma geral, reduziu a proliferação, induziu morte celular e diminuiu a porcentagem de células em G0/ G1, em pelo menos um dos tempos analisados (24, 48 e 72h) em relação ao grupo transfectado com a sequência scrambled. O silenciamento de HEB e E2F1 reduziu o número de neuroesferas quando comparadas às células transfectadas com a sequência scrambled. Possivelmente, a capacidade anti-proliferativa do silenciamento dos FTs HEB e E2F1 observada no cultivo em monocamada da U87, possam atuar na capacidade de formação de neuroesferas e, consequentemente, podem ter um papel na manutenção das células tronco do GBM. O silenciamento não alterou a radiorresistência da U87 cultivada em monocamada, com exceção dos efeitos do silenciamento de E2F1 em 24 h, em que houve radioproteção. A irradiação não reduziu o número de neuroesferas silenciadas para HEB em comparação ao grupo não irradiado, mas reduziu o número de células presentes nas neuroesferas, indicando uma possível atuação de HEB na resposta à irradiação em neuroesferas, fato este nunca antes descrito. O silenciamento de E2F1 não interferiu na resposta das neuroesferas à radiação. A expressão de CD133 avaliada oito dias após a dissociação das células silenciadas para E2F1 e HEB, cultivadas em meio de diferenciação, foram superiores ao do grupo scrambled, indicando uma possível diminuição na diferenciação celular. O silenciamento dos dois FTs não atuou na seleção positiva de CD133+ após a irradiação, como observado no grupo das neuroesferas transfectadas com a sequência scrambled e irradiadas, comparado às não irradiadas. Assim, E2F1 e HEB mostraram-se alvos interessantes no sentido de reduzir a proliferação, tanto em células U87 cultivadas em monocamada quanto em neuroesferas. / Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most lethal tumors, and radiation therapy remains one of the main treatments. New strategies are needed to suppress typical GBM treatment resistance and transcription factors (TFs) silencing seems to be a promising strategy. Our hypothesis is that TFs associated with lists of differentially expressed genes which were selected for irradiated compared to shamirradiated GBM cell lines, or GBM samples compared to brain tissue samples, could provide molecular targets that are supposed to increase tumor cell death when they are silenced. We analyzed proliferation, cell death and cell cycle progression, besides the formation and differentiation of neurospheres, using several analyses by flow cytometry. The TFs HEB and E2F1, whose primary functions are related to neurogenesis and cell proliferation, were selected from in silico analysis of GBM irradiated or sham-irradiated GBMs and GBM samples compared with normal brain samples, respectively. These TFs were found expressed in U87 GBM cell line, and primary astrocytes, as well as in neurospheres derivated from both, as analyzed by Western blot. Silencing of E2F1 and HEB in U87 cells, reduced proliferation, induced cell death and decreased the percentage of cells at G0/G1 (24, 48 or 72h) compared to the scrambled sequence transfected group. HEB and E2F1 silencing reduced the number of neurospheres when compared to cells transfected with scrambled sequence. Possibly, the anti-proliferative ability of silencing of HEB and E2F1 TFs observed in monolayer culture of U87, may act in neurospheres forming capacity and therefore may play a role in the maintenance of GBM stem cells. In our experiments, gene silencing did not alter the radio-resistance of U87 grown in monolayer. Irradiation did not reduce the number of neurospheres silenced for HEB compared to non-irradiated group, but reduced the number of cells present in neurospheres, indicating a possible role of HEB in response to ionizing irradiation in neurospheres, a fact that was not described yet. The silencing of E2F1 in neurospheres did not affect the response to irradiation. The expression of CD133, as assessed at eight days after the dissociation of cells silenced for E2F1 and HEB (cultured in differentiation culture media), was superior compared with the scrambled group, indicating a possible decrease in cell differentiation. The silencing of both TFs did not influence the positive selection of CD133 after irradiation, as observed in the group of neurospheres transfected with scrambled sequence, and irradiated compared to nonirradiated. Thus, E2F1 and HEB proved to be interesting targets for decreasing proliferation in both U87 cells grown as monolayer or neurospheres.

La protéine cIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein-1) de la famille des IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) est une E3 ubiquitine ligase qui présente des propriétés oncogéniques. Notre équipe s’intéresse aux processus permettant la différenciation des monocytes en macrophages. Au cours de la différenciation de nombreux modèles cellulaires (macrophages, cellules dendritiques, cellules épithéliales du colon, cellules souches hématopoïetiques, cardiomyocytes), cIAP1 sort du noyau pour se relocaliser dans le cytoplasme. La plupart des fonctions connues de cIAP1 sont liées à sa localisation cytoplasmique où elle est un régulateur important des voies de signalisation des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Lors de la différenciation macrophagique, nous avons montré que cIAP1, une fois dans le cytoplasme, induit la dégradation de TRAF-2, un adaptateur moléculaire impliqué dans la transduction du signal des voies des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Cette dégradation bloque la voie canonique de NF-κB et est essentielle à la différenciation terminale des monocytes en macrophages qui nécessite une activation transitoire de cette voie de signalisation. Cependant, cIAP1 est principalement exprimée dans le noyau de différents types cellulaires ce qui n’est pas en accord avec son rôle dans la signalisation cellulaire. Mon objectif a donc consisté à identifier les fonctions nucléaires de cIAP1 dans des cellules prolifératives ou lors de la différenciation macrophagique. Mon travail de thèse a permis d’identifier un rôle de cIAP1 dans la prolifération cellulaire. cIAP1 interagit avec le facteur de transcription E2F1 et favorise son recrutement sur les promoteurs des Cycline E et A impliquées dans les transitions G1/S et G2 du cycle cellulaire, ce qui augmente l’expression des transcrits et des protéines de ces deux cibles. Il semblerait que par cette activité, cIAP1 régule la prolifération des cellules et soit important dans l’équilibre entre la prolifération et la différenciation, deux mécanismes cellulaires étroitement liés. / The inhibitor of apoptosis protein cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) from the IAP family (Inhibitor of Apoptosis Protein) is an E3 ubiquitin ligase that displays oncogenic properties. Our team is interested in the mecanisms that allow macrophagic differentiation from monocytes. cIAP1 is relocalised from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation of many kind of cellular models (macrophages, dendritic cells, colon epithelial cells, hematopoietic stem cells, cardiomyocytes). The well-known functions of cIAP1 are associated with its cytoplasmic localisation, where it regulates the TNFα receptors and NF-κB signalling pathways. During macrophage differentiation, we show that cIAP1, once it is in cytoplasm, induces TRAF-2 degradation, a molecular adaptator of the TNFα receptors family and NF-κB signalling pathways. This degradation blocks the canonical pathway of NF-κB and is essential for the terminal differentiation into macrophages that needs a transitory activation of this pathway. However, cIAP1 is mainly expressed in the nucleus on many cell types which is not in accordance with its cell signalling activity. My objective was to investigate the nuclear function of cIAP1 in proliferative cells or during macrophage differentiation. My work identifies a function of cIAP1 in proliferation regulation. cIAP1 interacts with E2F1 transcription factor and favors its recruitment on Cyclins E and A promoters, both involved in G1/S and G2 phases of the cell cycle, which leads to high level of transcript and protein expression of these two targets. It seems that cIAP1 regulates the cellular proliferation and is important for the balance between proliferation and differentiation, two mechanisms tightly connected in cells.

Les cortico-surrénalomes (CCS) sont considérés comme des tumeurs malignes endocriniennes rares, associées à un pronostic sombre. Les trois mécanismes moléculaires les plus fréquemment altérés dans les CCS comprennent les mutations inactivatrices du gène suppresseur de tumeur TP53,la surexpression de IGF-II et l'activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/β-caténine. En utilisant des modèles de souris transgéniques, nous avons montré que ces altérations, même combinées, ne sont pas suffisantes pour permettre la progression maligne.Nous avons précédemment identifié l'histone méthyltransférase EZH2 comme le modificateur d'histone le plus dérégulé dans les CCS. Nous avons également montré que sa surexpression est associée à une progression tumorale et à un mauvais pronostic. Cependant, les mécanismes sous-jacents de cette agressivité sont largement inconnus. Dans cette étude, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de EZH2 dans les CCS, qui sont soient activés, soient réprimés. Ainsi, nous avons effectué une analyse bio-informatique des données du transcriptome de trois cohortes de patients porteurs de CCS. L’analyse montre une forte corrélation entre la surexpression de EZH2 et les gènes régulés positivement, suggérant un rôle majeur d’inducteur transcriptionnel de EZH2 dans les CCS. Nous avons montré que cette activité positive repose sur une interaction entre EZH2 et E2F1, qui entraîne la surexpression de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et la mitose tels que RRM2,PTTG1 et PRC1/ASE1. Nous avons montré que l'inhibition de RRM2 par ARN interférent ou traitement pharmacologique avec le GW8510 inhibe la croissance cellulaire, la capacité à combler les blessures, la croissance clonogénique, la migration et induit l'apoptose des cellules H295R en culture. En revanche, l'expression du facteur pro-apoptotique NOV/CCN3 est diminuée dans les CCS, ce qui est corrélé au développement de tumeurs agressives. Nos analyses moléculaires montrent que l'inhibition de EZH2 augmente l'expression de NOV/CCN3, suggérant que la surexpression de EZH2 pourrait favoriser la progression maligne des CCS en inhibant les stimulateurs de l'apoptose. Le facteur NOV a déjà été identifié comme cible négative du récepteur nucléaire SF1 dans les cellules du CCS, bien que les mécanismes moléculaires à l'origine de cette inhibition n'aient pas été identifiés. De manière intéressante, dans le cancer de la prostate, l'expression de NOV est inhibée par le récepteur des androgènes AR, grâce au recrutement de EZH2 qui pose la marque répressive H3K27me3. Nous avons pu identifier une coopération similaire entre SF1 et EZH2 pour réprimer l'expression de NOV et bloquer ainsi l'apoptose dans les CCS.Au total, ces résultats identifient SF1 et E2F1 comme deux partenaires indépendants de EZH2, induisant la répression de facteurs pro-apoptotiques et l'activation des gènes du cycle cellulaire respectivement, conduisant ainsi à l'agressivité des CCS. / Adrenocortical carcinomas (ACC) are regarded as rare endocrinemalignancies associated with dismal prognosis. The three common molecularmechanisms predominantly altered in ACC include inactivating mutations of theTP53 tumor suppressor gene, overexpression of IGF-II and constitutive activationof the Wnt/β-catenin signaling pathway. Using transgenic mouse models, wehave shown that these alterations, even when combined together, were notsufficient to induce malignant progression.We previously identified the histone methyltransferase EZH2 as the mostderegulated histone modifier in ACC. We have also shown that its overexpressionis associated with tumor progression and poor prognosis. Yet, the mechanismsunderlying this aggressiveness are largely unknown. Here, we aimed to identifyEZH2 target genes in ACC, which are either activated or repressed.Thus, we conducted a bio-informatics analysis of transcriptome data fromthree cohorts of ACC patients. The analysis showed a strong correlation betweenhighly expressed EZH2 and positively regulated genes suggesting a major role of‘transcriptional inducer‘ for EZH2 in ACC. We have shown that this positiveactivity relies on an interaction between EZH2 and E2F1 that results in theupregulation of genes implicated in cell cycle regulation and mitosis such asRRM2, PTTG1 and PRC1/ASE1. We showed that Inhibition of RRM2 by RNAinterference or pharmacological treatment with GW8510 inhibits cellular growth,wound healing, clonogenic growth, migration and induces apoptosis of H295Rcells in culture.In contrast, expression of the pro-apoptotic factor NOV/CCN3 is decreasedin ACC, which is correlated with development of aggressive tumours. Ourmolecular analyses show that EZH2 inhibition increases expression ofNOV/CCN3, suggesting that EZH2 overexpression may also favour malignantprogression in ACC by inhibition of apoptosis stimulators. NOV has previouslybeen identified as a negative target of the nuclear receptor SF1 in ACC cells,although the molecular mechanisms underlying this inhibition were unidentified.Interestingly, in prostate cancer, NOV expression is inhibited by the androgenreceptor, through recruitment of EZH2 and deposition of the H3K27me3 mark.We have been able to identify a similar cooperation between SF1 and EZH2 tosuppress NOV expression and block apoptosis in ACC.Altogether, these findings identifiy SF1 and E2F1 as two independentpartners of EZH2, inducing repression of proapoptotic factors, and activation ofcell cycle genes respectively, thus leading to aggressiveness of ACC.

Entre todos os cânceres de pele, o melanoma está entre os menos comuns, mas é responsável pela maior parte das mortes. No caso da doença metastática, não há um tratamento satisfatório capaz de prolongar a vida do paciente. Isso leva à necessidade de novas estratégias e de novos tratamentos que possam reverter a quimiorresistência do tumor. Entre as proteínas que têm seu perfil de expressão modificado no melanoma está a proibitina, cuja expressão aumenta durante a progressão tumoral. Proibitina é uma chaperona mitocondrial pertencente a uma família de proteínas que possuem um resíduo hidrofóbico SPFH, que confere a ela uma capacidade de ancoragem e de organização de espaços em membranas. Além disso, no compartimento nuclear, é um inibidor da família de fatores de transcrição E2F, juntamente com a proteína retinoblastoma (Rb). Em melanomas, proibitina localiza-se no citoplasma, associada à mitocôndria, e no núcleo. No citoplasma, proibitina faz parte da resposta a diversas drogas, como cisplatina, dacarbazina, temozolamida, vimblastina e tunicamicina pode estar relacionado com o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), já que essas drogas podem de alguma forma induzir ROS intracelular. O aumento de expressão de proibitina, nesse contexto, poderia fazer parte de uma resposta protetora da mitocôndria, o que em última análise protegeria a célula contra a morte celular, já que a inibição de proibitina sensibiliza a célula ao tratamento com cisplatina ou tunicamicina. Além disso, o estresse provocado pela privação de soro fetal bovino em linhagens de melanoma leva ao aumento de expressão de proibitina e é acompanhado pela indução de ROS. No núcleo, proibitina esta colocalizada com MCM5 e MCM7, mas não MCM2. A inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de metaloproteinases de matriz extracelular, não só em melanomas, mas também em linhagens de câncer de mama e de câncer de pulmão. Ainda, proibitina parece estar relacionada com o fenômeno da transição epitélio mesênquima, já que a inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de marcadores mesenquimais como N-caderina e vimentina e a perda de expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina. Outras funções controladas por E2F1 que proibitina pode estar modulando são a capacidade de E2F1 induzir reparo de DNA devido a lesões causadas por radiação UVB e a indução de senescência. A inibição de proibitina em linhagem de câncer de pulmão protegeu a célula contra o dano genotóxico causado pela radiação UVB, pelo aumento da proteína de reparo de DNA Gadd45a, que é induzida por E2F1. Ainda, a inibição de proibitina diminuiu a quantidade de células senescência induzida por adriamicina em linhagens de melanoma. Ainda, a expressão de proibitina responde a fatores do microambiente tumoral como TGF?, IL4 e LPS juntamente com INF? e, além disso, têm sua expressão diminuída durante a maturação de macrófagos. Esses resultados mostram que proibitina pode atuar protegendo o tumor ou bloqueando vias importantes para seu desenvolvimento, dependendo da sua compartimentalização subcelular / Among all skin cancers, melanoma is the least common, but is responsible for most deaths. In metastatic disease, no satisfactory treatment can prolong the patient\'s life. This leads to the need for new strategies and new treatments that may reverse tumor chemoresistance. Among proteins that have their expression profile altered in melanoma is prohibitin whose expression increases during tumor progression. Prohibitin is a mitochondrial chaperone belonging to a family of proteins which possess a hydrophobic residue SPFH, which gives it a capacity for anchorage and organization in membrane regions. Furthermore, in the nuclear compartment, prohibitin is an inhibitor of the E2F transcription factor family, together with the retinoblastoma protein (Rb). In melanomas, prohibitin is located in the cytoplasm, associated to the mitochondria, and inside the nucleus. In the cytoplasm, prohibitin is part of the response to various drugs such as cisplatin, dacarbazine, temozolomide, vinblastine and tunicamycin and may be associated with increased reactive oxygen species (ROS), since these drugs can somehow induce intracellular ROS. Prohibitin overxpression in this context could be part of a protective response of the mitochondria, which ultimately protect cells against death, as prohibitin inhibition sensitizes cells to cisplatin or tunicamycin treatment. Moreover, the stress caused by deprivation of fetal bovine serum in melanoma cell lines leads to prohibitin overexpression and is accompanied by ROS induction. In the nucleus, prohibitin is colocalized to MCM5 and MCM7, but not to MCM2. Inhibition of prohibitin leads to increased expression of matrix metalloproteinases, not only on melanomas but also on breast cancer and lung cancer cell lines. Further, prohibitin appears to be related to the phenomenon of epithelial mesenchymal transition, since prohibitin inhibition leads to increased expression of mesenchymal markers such as N-cadherin and vimentin and loss of expression of epithelial markers, such as E-cadherin. Other functions controlled by E2F1 that are modulated by prohibitin include be the ability of E2F1 to induce DNA repair against UVB radiation and the induction of cellular senescence. Inhibition of prohibitin in lung cancer cell line protected against genotoxic damage caused by UVB radiation, due to DNA repair protein Gadd45a overexpression, which is induced by E2F1. Also, prohibitin inhibition decreased the amount of cell senescence induced by adriamycin in melanoma cell line. Further, prohibitin expression is triggered by tumor microenvironmental factors such as TGF?, IL4, and LPS together with INF? and, in addition, prohibitin expression decreases during macrophages maturation. These results show that prohibitin may act protecting the tumor or blocking pathways important for its development, depending on its subcellular compartment distribution

No description available.

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Entre todos os cânceres de pele, o melanoma está entre os menos comuns, mas é responsável pela maior parte das mortes. No caso da doença metastática, não há um tratamento satisfatório capaz de prolongar a vida do paciente. Isso leva à necessidade de novas estratégias e de novos tratamentos que possam reverter a quimiorresistência do tumor. Entre as proteínas que têm seu perfil de expressão modificado no melanoma está a proibitina, cuja expressão aumenta durante a progressão tumoral. Proibitina é uma chaperona mitocondrial pertencente a uma família de proteínas que possuem um resíduo hidrofóbico SPFH, que confere a ela uma capacidade de ancoragem e de organização de espaços em membranas. Além disso, no compartimento nuclear, é um inibidor da família de fatores de transcrição E2F, juntamente com a proteína retinoblastoma (Rb). Em melanomas, proibitina localiza-se no citoplasma, associada à mitocôndria, e no núcleo. No citoplasma, proibitina faz parte da resposta a diversas drogas, como cisplatina, dacarbazina, temozolamida, vimblastina e tunicamicina pode estar relacionado com o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), já que essas drogas podem de alguma forma induzir ROS intracelular. O aumento de expressão de proibitina, nesse contexto, poderia fazer parte de uma resposta protetora da mitocôndria, o que em última análise protegeria a célula contra a morte celular, já que a inibição de proibitina sensibiliza a célula ao tratamento com cisplatina ou tunicamicina. Além disso, o estresse provocado pela privação de soro fetal bovino em linhagens de melanoma leva ao aumento de expressão de proibitina e é acompanhado pela indução de ROS. No núcleo, proibitina esta colocalizada com MCM5 e MCM7, mas não MCM2. A inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de metaloproteinases de matriz extracelular, não só em melanomas, mas também em linhagens de câncer de mama e de câncer de pulmão. Ainda, proibitina parece estar relacionada com o fenômeno da transição epitélio mesênquima, já que a inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de marcadores mesenquimais como N-caderina e vimentina e a perda de expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina. Outras funções controladas por E2F1 que proibitina pode estar modulando são a capacidade de E2F1 induzir reparo de DNA devido a lesões causadas por radiação UVB e a indução de senescência. A inibição de proibitina em linhagem de câncer de pulmão protegeu a célula contra o dano genotóxico causado pela radiação UVB, pelo aumento da proteína de reparo de DNA Gadd45a, que é induzida por E2F1. Ainda, a inibição de proibitina diminuiu a quantidade de células senescência induzida por adriamicina em linhagens de melanoma. Ainda, a expressão de proibitina responde a fatores do microambiente tumoral como TGF?, IL4 e LPS juntamente com INF? e, além disso, têm sua expressão diminuída durante a maturação de macrófagos. Esses resultados mostram que proibitina pode atuar protegendo o tumor ou bloqueando vias importantes para seu desenvolvimento, dependendo da sua compartimentalização subcelular / Among all skin cancers, melanoma is the least common, but is responsible for most deaths. In metastatic disease, no satisfactory treatment can prolong the patient\'s life. This leads to the need for new strategies and new treatments that may reverse tumor chemoresistance. Among proteins that have their expression profile altered in melanoma is prohibitin whose expression increases during tumor progression. Prohibitin is a mitochondrial chaperone belonging to a family of proteins which possess a hydrophobic residue SPFH, which gives it a capacity for anchorage and organization in membrane regions. Furthermore, in the nuclear compartment, prohibitin is an inhibitor of the E2F transcription factor family, together with the retinoblastoma protein (Rb). In melanomas, prohibitin is located in the cytoplasm, associated to the mitochondria, and inside the nucleus. In the cytoplasm, prohibitin is part of the response to various drugs such as cisplatin, dacarbazine, temozolomide, vinblastine and tunicamycin and may be associated with increased reactive oxygen species (ROS), since these drugs can somehow induce intracellular ROS. Prohibitin overxpression in this context could be part of a protective response of the mitochondria, which ultimately protect cells against death, as prohibitin inhibition sensitizes cells to cisplatin or tunicamycin treatment. Moreover, the stress caused by deprivation of fetal bovine serum in melanoma cell lines leads to prohibitin overexpression and is accompanied by ROS induction. In the nucleus, prohibitin is colocalized to MCM5 and MCM7, but not to MCM2. Inhibition of prohibitin leads to increased expression of matrix metalloproteinases, not only on melanomas but also on breast cancer and lung cancer cell lines. Further, prohibitin appears to be related to the phenomenon of epithelial mesenchymal transition, since prohibitin inhibition leads to increased expression of mesenchymal markers such as N-cadherin and vimentin and loss of expression of epithelial markers, such as E-cadherin. Other functions controlled by E2F1 that are modulated by prohibitin include be the ability of E2F1 to induce DNA repair against UVB radiation and the induction of cellular senescence. Inhibition of prohibitin in lung cancer cell line protected against genotoxic damage caused by UVB radiation, due to DNA repair protein Gadd45a overexpression, which is induced by E2F1. Also, prohibitin inhibition decreased the amount of cell senescence induced by adriamycin in melanoma cell line. Further, prohibitin expression is triggered by tumor microenvironmental factors such as TGF?, IL4, and LPS together with INF? and, in addition, prohibitin expression decreases during macrophages maturation. These results show that prohibitin may act protecting the tumor or blocking pathways important for its development, depending on its subcellular compartment distribution