O sorodiagnóstico da toxocaríase humana é geralmente baseado na detecção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. em amostras de soro pelo teste ELISA utilizando os antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis (TES). No entanto, observa-se uma ocorrência de reatividade cruzada com outras helmintíases nas áreas endémicas de poliparasitismo. Vários estudos têm mostrado que as glicanas presentes nos antígenos dos helmintos podem ser as responsáveis pela reatividade cruzada. Neste estudo, avaliamos o efeito da deglicosilação dos antígenos TES na sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA e Western-blotting para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE. Para a deglicosilação dos antígenos TES, estes foram tratados com diferentes concentrações de hidróxido de sódio (NaOH) ou metaperiodato de sódio (NaIO4) e foram testados 58 amostras de soro de pacientes com toxocaríase visceral, 75 amostras de soros de pacientes com outras helmintíases, e 95 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Nossos resultados mostraram que os antígenos TES foram totalmente deglicosilados com NaOH 100mM por 4 horas a 37°C (dTES), enquanto que o tratamento com NaIO4 não gerou bons resultados. A sensibilidade e especificidade dos antígenos TES e dTES na detecção de anticorpos IgG pelo teste de ELISA foi de 100%, com menor reatividade cruzada (5,3%) para os antígenos dTES, se comparada com os antígenos TES (13,3%). Todos os pacientes com toxocaríase mostraram anticorpos IgG contra as cinco frações dos antígenos TES (32, 45, 55, 70 e 120 kDa) e contra a única fração de 26kDa dos antígenos dTES, com sensibilidades e especificidades de 100% para ambos os antígenos. A reatividade cruzada, observada com as frações de 70 kDa, 55 kDa e 32 kDa dos antígenos TES, foi eliminada totalmente quando utilizaram-se os antígenos dTES. A detecção de anticorpos IgM pelo teste de ELISA mostrou reatividade inespecífica nos três grupos estudados, com sensibilidades de 39,7% e 34,5% e especificidades de 95,8% e 96,8%, para os antígenos TES e dTES, respectivamente, porém com ocorrência de reatividade cruzada de 24% e 28% para ambos os antígenos. Os três grupos estudados apresentaram reatividade contra quase todas as frações dos antígenos TES e dTES. A detecção de anticorpos IgE apresentou sensibilidades de 63,79% e 62,07% e uma especificidade de 100%, e uma reatividade cruzada de 26,6% e 53,3% para ambos os antígenos. A maioria dos pacientes com toxocaríase (74,1%) mostraram anticorpos contra as frações de 32, 55 e 70 kDa, em quanto que não houve reatividade nos pacientes com outras helmintíases ou nos indivíduos saudáveis. Estes resultados mostraram que a deglicosilação dos antígenos TES permite reduzir a ocorrência de reatividade cruzada nos pacientes com outras helmintíases, elevando o valor diagnóstico da detecção de anticorpos IgG. No entanto, este procedimento não permite melhorar a sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos IgM e não permite elevar a sensibilidade na detecção de anticorpos IgE pelo teste de ELISA. Por outro lado, os resultados discordantes na especificidade do Western-blotting para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE sugerem a presença de epítopos conformacionais presentes no estado nativo dos antígenos TES que estariam implicados na reação cruzada observada no teste de ELISA / Serodiagnosis of human toxocariasis is usually based on the detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies in serum samples by ELISA test using T.canis larvae excretory-secretory (TES) antigens. However, a cross-reactivity occurrence is observed in endemic areas of polyparasitism. Many studies have shown that the glycan structures, present in helminth antigens, can be the responsible for the cross-reactivity. In this study, we evaluated the deglycosylation of the TES antigens on the sensitivity and specificity of both the ELISA and Western-blotting for the detection of IgG, IgM, and IgE antibodies. For the deglycosylation of the TES antigens, they were treated with different concentrations of sodium hydroxide (NaOH) or sodium metaperiodate (NaIO4), and 58 serum samples of 58 patients with visceral toxocariasis, 75 serum samples of patients with other helminth infections, and 95 serum samples of healthy individuals. Our results show that the TES antigens were totally deglycosylated with 100 mM NaOH for 4 hours at 37°C (dTES), whereas not good results were obtained with sodium metaperiodate. The sensitivity and specificity of both TES and dTES antigens were 100% in detecting IgG antibodies by ELISA; the cross-reactivity observed with TES antigens (13.3%) was reduced (5.3%) when dTES antigens were used. All toxocariasis patients showed IgG antibodies against the five fractions of TES antigens (32, 45, 55, 70, and 120 kDa), but also with the 26-kDa single fraction of dTES antigens, with sensitivities and specificities of 100% for both antigens. The occurrence of cross-reactivity, observed mainly with the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, was totally eliminated when the dTES antigens were used. The detection of IgM antibodies by ELISA test showed unspecific reactivity in all studied groups, with sensitivities of 39.7% and 34.5%, and specificities of 95.8% and 96.8% for both antigens; the occurrence of cross-reactivity for both antigens were 24% and 28%, respectively. All studied groups have IgM antibodies against almost all fractions of TES antigens and the single fraction of dTES. The detection of IgE antibodies by ELISA test showed sensitivities of 63.8% and 62%, specificities of 100%, and occurrence of reactivity of 26.6% and 53.3% for TES and dTES antigens, respectively. The majority of the toxocariasis patients (74.1%) showed IgE antibodies against the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, whereas there was not reactivity in sera from patients with other helminth infections or healthy individuals. These results showed that the deglycosylation of the TES antigens reduces the occurrence of cross-reactivity in patients with other helminth infections, increasing the diagnostic value for the detection of IgG antibodies. However, this procedure does not improve the sensitivity nor reduces the occurrence of cross-reactivity in the detection of IgM antibodies. Likewise, this procedure does not improve the sensitivity in the detection of IgE antibodies by the ELISA test. On the other hand, the high specificity obtained in the detection of IgG, IgM, and IgE by Western-blotting suggest that conformational epitopes of the TES antigens may also be the responsible for the cross-reactivity in the ELISA test

O ovo é o alimento naturalmente mais completo, uma vez que possui todos os nutrientes necessários, como vitaminas, aminoácidos e minerais essenciais para manter uma vida. Porém, em contra partida, possui várias proteínas promotoras de alergias em considerável parcela da população mundial. Para determinar as proteínas dos alimentos alergênicos, um dos testes mais utilizados é o imunoensaios tais como ELISA (ensaio imunoenzimático - enzyme linked immunosorbent assay), onde o anticorpo reconhece o antígeno e essa conexão é mostrada por um sistema enzimático, em outras palavras, a densidade óptica. O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência do anticorpo policlonal, produzido em laboratório, para identificar a presença do antígeno ovomucóide em ovos tratados por irradiação gama para a sua desativação. Para avaliar os tratamentos, o anticorpo policlonal foi produzido em quatro (04) coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo feminino, com 45 dias de vida, imunizadas com ovomucóide bioconjugado. Foi utilizado o adjuvante de Freund completo na primeira imunização e a solução tampão PBS, foram realizadas, posteriormente, quatro imunizações a cada quinze dias, mais um reforço 48 horas antes da retirada do plasma sanguíneo. O soro sangüíneo foi titulado por PTA-ELISA (Plate trapped antigen). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal do Instituto de Ciência Animal e Pastagens (IZ) e precedida de acordo com as normas europeias para o bem-estar e ética animal. Foram utilizados ovos comerciais in natura, fornecidos pelo Departamento de Genética da Universidade de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" - ESALQ / USP. As amostras foram submetidas à radiação gama proveniente de uma fonte de Co60, do tipo Multipropósito no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), sob uma taxa de dose de 19,4 e 31.8Gy/hora, nas doses: 0 (controle); 10kGy; 20KGy e 30KGy, em todas as taxas. Pelo teste de ELISA, foi encontrado o alérgeno ovomucóide das amostras ovo e, pelo resultado apresentados, constatou-se que o tratamento da radiação não mostrou alterações significativas, quando avaliado por anticorpos policlonais. Assim, podemos concluir que o anticorpo produzido é capaz de identificar a proteína alergênica ovomucóide e, a irradiação gama em tais taxas não apresenta mudanças na estrutura da proteína, por esta forma de avaliação. Porém, apresentou algumas alterações na cor e viscosidade visual das amostras de ovos / The egg is the most complete natural food; it has all the necessary nutrients such as vitamins, aminoacids and essential minerals to maintain a life. However, although, has several proteins that promote allergies in considerable part of the world population. To determine allergenic food proteins, one of the most used tests is the immunoassays such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), where the antibody recognizes the antigen and this connection is showed by an enzymatic system, in other words, optical density. The aim of this study was to determine the polyclonal antibody efficiency, produced in laboratory, to identify the presence the ovomucoid antigen in treated eggs by gamma irradiation for its inactivation. To evaluate the treatments, polyclonal antibody was produced in four New Zealand female rabbits, at 45 days old, immunized with bioconjugated ovomucoid. Was used Freund Complete Adjuvant at first immunization and PBS Buffer at four subsequently immunizations every fifteen days, plus a booster 48 hours before the blood retreated. The blood serum was tittered by PTAELISA (Plate trapped antigen). All procedures were approved by Institute of Animal Science and Pastures (IZ)´s Committee of Ethical and Animal Experimentation and preceded according to European Norms for ethical and animal welfare. It was used, in nature, commercial laying eggs, from the Genetic Department of Agricultural University Luiz de Queiroz ESALQ/USP. So the samples were submitted to the gamma radiation coming from a source of Co60, type Multipurpose at the Energetically Researches and Nuclear Institute (IPEN), under a dose rate of 19.4 and 31.8Gy/hour, in the doses: 0 (control); 10KGy; 20KGy and 30KGy, in all rates. By the ELISAs test we can find the egg allergen ovomucoid and the radiation treatment do not showed considerable changes. So we can concluded that the antibody produced is capable of identify the ovomucoid allergenic protein and the gamma irradiation in such rates does not shows changes in that protein, therefore showed some changes in the color and visual viscosity of the egg samples

Este estudo representa a primeira avaliação ovariana, imunológica e hormonal realizada em duas espécies de felinos brasileiros ameaçados: L. pardalis (n=5) e L. tigrinus (n=4), antes e após 4 a 6 tratamentos alternados com as gonadotrofinas exógenas eCG/hCG e pFSH/pLH. Os animais foram submetidos a superovulação alternada com eCG-hCG e pFSH-pLH a cada quatro meses pelo período de dois anos, perfazendo um total de 6 intervenções. Os oócitos foram recuperados por vídeo laparoscopia, caracterizados quanto à morfologia e utilizados para determinação dos estágios do ciclo meiótico por análise citogenética e maturação pela caracterização de metáfase II. Avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão e varredura foi realizada para caracterização da morfologia dos oócitos. Antes e após cada intervenção sangue foi colhido e utilizado em análises hormonais séricas (progesterona e estradiol) por RIE e pesquisa de anticorpos para gonadotrofinas exógenas por ELISA. Comparando os tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) no número total de estruturas ovarianas observadas em superovulações alternadas sucessivas, nas duas espécies estudadas. Também não houve diferença significativa em relação ao total de estruturas ovarianas encontradas em cada tratamento (5,7±1,2 eCG/hCG; 7,9±0,9 pFSH/pLH) para L. pardalis e (eCG/hCG 2,6±0,7; pFSH/pLH 2,0±0,5) para L. tigrinus. Embora L. pardalis tenham apresentado maior número de estruturas ovarianas por estimulação que L. tigrinus (p<0,05), a porcentagem de oócitos maduros em relação aos oócitos totais não diferiu, indicando que a metodologia utilizada foi eficiente. L. pardalis apresentaram maior número de oócitos totais e maduros nos tratamentos com pFSH/pLH (p<0,05), sendo que em L. tigrinus ambos tratamentos se comportaram de maneira semelhante (p>0,05). Não foi possível a caracterização dos estágios do ciclo meiótico pela avaliação da configuração cromossômica nos oócitos, sendo que nenhum oócito apresentou-se em metáfase II. Ultraestruturalmente os oócitos apresentaram características semelhantes aos observados em mamíferos de maneira geral. Dosagens hormonais séricas demonstraram um aumento de estradiol após as superovulações. Elevações de progesterona foram observadas em alguns momentos pré e pós superovulações. Embora alguns animais tenham demonstrado desenvolvimento de títulos para imunoglobulinas anti-gonadotrofinas exógenas, essa resposta imune humoral não parece interferir com a indução da atividade ovariana produzida pela superovulação, já que os animais responderam bem aos tratamentos alternados. Com estes resultados podemos concluir que essas espécies podem ser manejadas intensivamente usando tratamentos alternados com gonadotrofinas exógenas para procedimentos de reprodução assistida sem comprometer a resposta ovariana a esses hormônios. / This study represents the first assessment of ovarian, immunological and hormonal responses of two endangered Brazilian felids: L. pardalis (n=5) and L. tigrinus (n=4), treated with two exogenous gonadotropin regimens eCG/hCG and pFSH/pLH. Females were treated with four to six times alternating eCG/hCG and pFSH/pLH protocols using an interval of four months between each treatment. Ovarian follicular development and oocytes recovery were performed through laparoscopy. Recovered oocytes were submitted to the cytogenetical analysis and to the electron microscopy in order to evaluate the maturation (metaphase II) and the morphological and ultrastructural status, respectively. Blood samples were collected before each treatment and during the laparoscopy in order to measure progesterone and estradiol by RIA and to evaluate the immunological response to the exogenous gonadotropins by ELISA. Our results suggest that L. pardalis and L. tigrinus do not show a decrease (p>0.05) in ovarian response after repeated and alternate exposure to different gonadotropin treatments. In both L. pardalis and L. tigrinus, no differences were found regarding to the number of total ovarian structures (p>0.05) during successive gonadotropin treatments. When comparing the eCG/hCG and the pFSH/pLH treatments, there were no differences (p>0.05) regarding to the total number of ovarian structures in L. pardalis (5.7 ± 1.2 and 7.9 ± 0.9, respectively) or L. tigrinus (2.6 ± 0.7 and 2.0 ± 0.5, respectively). Despite the fact that the L. pardalis showed a higher number of follicles and CLs per stimulation (p<0.05) when compared to the L. tigrinus, no differences were found when analyzing the percentage of mature oocytes (p>0.05). Within species, both gonadotropin regimens were equally effective (p>0.05) to induce the follicular growth. No decreases (p>0.05) on the total number of ovarian structures and on the oocyte maturation percentages were observed between the sequential stimulations, but. L. pardalis showed a higher number of mature and total oocytes when treated with pFSH/pLH (p<0.05). L. Tigrinus didn’t show any differences regarding to the number of total and mature oocytes (p>0.05) when comparing both gonadotropin regimens. No oocytes in metaphase II were observed in the cytogenetic analyses. Oocytes histological evaluation showed that morphological characteristics were the same observed in others mammals. Hormonal analyses showed increased estradiol levels after superovulations. Higher levels of progesterone were observed before and after superovulations. Although some of these cats do demonstrate the development of anti-gonadotropin immunoglobulin titers, these humoral immune responses do not appear to interfere with gonadotropininduced ovarian stimulation. In this study, animals treated repeatedly with alternating regimens of eCG/hCG and pFSH/pLH showed no decrease in total ovarian structures after four to six successive treatments. These findings are potentially valuable for the ongoing efforts to develop and apply assisted reproductive technologies to the management and conservation of endangered felid populations.

A neurocisticercose (NC) é uma doença provocada por larvas de Taenia solium (Tso) no sistema nervoso central. Seu diagnóstico fundamenta-se em critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. A utilização de antígenos parasitários no imunodiagnóstico apresenta desvantagens como: necessidade de animais, ausência de homogeneidade entre lotes, baixo rendimento, e contaminação com proteínas suínas. Assim, os antígenos recombinantes podem otimizar o imunodiagnóstico da NC, pois são reagentes simples e reprodutíveis, sem requerer animais. Este estudo teve como objetivo a obtenção, caracterização e análise da reatividade de proteína recombinante baseada em antígenos de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra). Assim, o cDNA foi obtido por amplificação a partir de RNAm de cisticercos de Tcra. A proteína recombinante Tc14 foi produzida em Escherichia coli (DE3) BL21 utilizando-se o vetor de expressão pET-22b e purificada por cromatografia de afinidade. A caracterização antigênica deu-se por Imunoblot (IB) utilizando anticorpos monoclonais (AcMo). Houve reatividade com todos os AcMo utilizados (AcMo anti-antígeno de excreção/secreção de Tcra, AcMo anti-líquido vesicular de Tcra, AcMo antilíquido vesicular de Tso e AcMo anti-antígeno total de Tso), exceto com o AcMo anti-antígeno de escólex de Tso. Utilizando-se 22 amostras de soro e 19 de líquor (LCR) de pacientes com NC, 48 soros e 28 LCR do grupo controle negativo (GCN) e 17 soros de hidatidose do grupo outras parasitoses (OP) em Imunoblot foi observada reatividade na região de 14kDa, correspondente a Tc14, em todas as amostras NC, mas não nos GCN e OP. Em ELISA com Tc14 obteve-se sensibilidade (S) e especificidade (E) de 100% com LCR (29 amostras de NC e 35 do GCN) e S de 95,1% e E de 100% com soro (41 amostras de NC, 52 do GCN). Dentre 51 soros de OP, mostraram-se reagentes um de hidatidose e outro de estrongiloidíase. A análise comparativa entre diferentes antígenos e testes sorológicos apresentou índice de positividade de 100% em IB utilizando os antígenos Tc14 ou LLG (antígeno purificado de Tso com lentil-lectina); já em ELISA, os índices foram de 83,4% para Tc14 e 91,6% para 18/14 (antígeno purificado de líquido vesicular de Tcra com AcMo). Em ensaios de linfoproliferação a porcentagem de respondedores no grupo NC foi de 16,6% (com 0,05 e 0,6 &#181;g de Tc14/poço), 50% (com 0,4 &#181;g de Tc14/poço), 44,4% (com 1,0 &#181;g de Tc14/poço) e 20% (com 2,0 &#181;g de Tc14/poço). Não houve proliferação no GCN. A dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura apresentou reatividade diferenciada entre o GCN e NC para IL-10, sendo uma amostra do GCN reagente e duas amostras de NC não reagentes. Não foi possível detectar IFN-&#947;. Em ELISA para IgG total 91,7% dos plasmas do grupo NC apresentaram reatividade, sendo a positividade para os isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente, de 75; 33,3; 50 e 25%. O antígeno recombinante mostrou-se como ferramenta promissora para imunoensaios na NC, abrindo nova perspectiva envolvendo estudos a serem realizados sobre diferentes sistemas de expressão e antigenicidade frente a um número maior de amostras. / The neurocisticercosis (NC) disease is caused by the presence of Taenia solium (Tso) larvae in the central nervous system. Its diagnosis is based on clinical criteria, epidemiological studies and laboratorial exams. Nevertheless, the use of parasite antigenic extracts into the immunodiagnosis presents some disadvantages: it requires animals, lacks of homogeneity between lots, low yield and may become contaminated with swine proteins. Consequently, the utilization of recombinant antigens could optimize the immunodiagnostic of NC, as they are simple and reproducible reagents that do not require animals. This study aimed the capture, characterization and reactivity analysis of the recombinant protein based on antigens of the vesicular fluid of Taenia crassiceps (Tcra). In order to do so, the cDNA was obtained through the amplification deriving from RNAm of cysticerci of Tcra. The recombinant protein Tc14 was produced in Escherichia coli (DE3) BL21 using the expression vector pET-22b and purified by affinity chromatography (nickel resin). The antigenic characterization was performed by immunoblotting (IB) using monoclonal antibodies (MoAb). The recombinant protein presented reactivity with all the MoAb used (Anti-secretion/excretion antigens from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tso MoAb and anti- total antigen from Tso MoAb), except with the anti-antigen from Tso scolex MoAb. The immunoblot was performed using 22 serum samples and 19 cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC, 48 serum and 28 CSF from the negative control group (GCN) and 17 hydatidosis serum from other parasitosis\' group (OP). It showed reactivity in the 14kDa region, correlated to Tc14, in all NC samples, but not presented on GCN and OP. In ELISA with Tc14, the sensibility (S) and specificity (E) of 100% was obtained with CSF (29 NC samples and 35 GCN samples) and 95.1% of S and 100% of E with serum (41 NC samples, 52 GCN samples). Among 51 OP serums, one from hydatidosis and one from strongyloidiasis demonstrated reactivity. The comparative analysis amongst different antigens and serological tests demonstrated positivity of 100% in IB when using the Tc14 antigens or LLG (purified antigen of Tso with lentil lectin). In ELISA, the positivity indicated was of 83.4% for Tc14 and 91.6% for 18/14 (vesicular fluid purified antigen with MoAb from Tcra). In lymphoproliferation tests, the percentage of responders in NC group was of 16.6% (with .0.5 and 6 &#181;g of Tc14/well), 50% (with 0.4 &#181;g of Tc14/well). No proliferation occurred in GCN. The dosage of cytokines in culture supernatants presented different reactivity amongst GCN and NC for IL-10, as one sample of GCN reacted and two NC samples did not. It was not possible to detect IFN-&#947;. In ELISA for total lgG, 91.7 % of plasmas from NC group presented reactivity, with positivity for the isotypes lgG1, lgG2, lgG3 and lgG4, 75 %, 33.3 %, 50 % and 25 %, respectively. The recombinant antigen prevails as a promising tool for immunoassays in NC, opening a new perspective involving studies to be performed concerning different expression and antigenicity ahead of a larger number of samples.

Nessa pesquisa são relatados os resultados da determinação das concentrações de microcistina e de biomassa algal após as várias etapas de tratamento de amostras de água coletadas junto ao reservatório de Barra Bonita-SP visando obtenção de água potável. O tratamento foi realizado em escala de laboratório com e sem aplicação de carvão ativado em pó (CAP) e as etapas foram: coagulação com aplicação de cloreto férrico, sedimentação, filtração em papel de filtro. Foi possível observar que a pré-clarificação desse tipo de água por coagulação seguida de sedimentação requereu dosagens relativamente elevadas de cloreto férrico (80 mg/L), tendo sido verificada eficiência muito baixa de remoção de microcistina nas etapas de tratamento por sedimentação seguida de filtração, quando não foi aplicado CAP. Apenas com a aplicação de CAP a microcistina foi reduzida à níveis que atendessem os padrões de potabilidade previstos na Portaria 518/04 (concentração menor que 1 &#956g/L). A determinação de microcistina pelo método que utiliza Imunoadsorventes Ligados à Enzima (ELISA) mostrou-se uma ferramenta útil e confiável para detectar e quantificar essa toxina, embora ainda apresente custo relativamente elevado. / This report presents the results of the quantification of microcystins and algae biomass concentrations after treatment of water samples taken from the Barra Bonita reservoir, for production of potable water. Bench-scale tests were carried out with and without powdered activated carbon (PAC) and the treatment processes used were: coagulation with ferric chloride (FeCl3), sedimentation and filtration with paper filter. It was determined that pre-clarification followed by sedimentation required substantial dosages of ferric chloride (80 mg/L). The removal of microcystins using sedimentation followed by filtration was ineffective without PAC. The use of PAC is required to produce water that meets current potability standards for microcystins removal as specified in Decree 518/04 (concentration less than 1 &#956g/L). Analysis of microcystins using the Enzime-Linked Immunosorbent Assay Method (ELISA) has proven to be an effective and reliable procedure to detect and quantify this toxin, although relatively expensive.

Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

A avaliação de microalbuminúria (MA) é frequentemente utilizada em medicina humana para o diagnóstico precoce de doença renal precoce em humanos que pode evoluir concomitantemente durante o curso de várias outras afecções. Quando a doença renal progride para insuficiência renal, a albuminúria pode atingir concentrações elevadas (&gt;30 mg/dL), que recebe, neste momento, a denominação de macroalbuminúria, que, por sua vez, resulta em proteinúria maciça. A coexistência de hipertensão arterial sistêmica pode acelerar a progressão da doença. Em Medicina Veterinária, não há relatos sobre a magnitude desta albuminúria em cães já diagnosticados com insuficiência renal crônica (IRC) como também sobre o grau de coexistência de hipertensão, parâmetros estes que constituíram o escopo do presente estudo. As concentrações urinárias de albumina, detectadas pela técnica ELISA, foram determinadas em 40 cães com IRC e em 40 cães sadios (controles). As pressões sangüíneas sistólicas também foram mensuradas para comparações. A concentração de albumina normalizada (AN), relação albumina:creatinina (RAC) e relação proteína:creatinina (RPC) foram calculadas para todos os cães. Todos os cães controles apresentaram valores abaixo da faixa de microalbuminúria para ambos os índices (AN e RAC).. Nos cães com IRC, 42,5% e 65% apresentaram-se dentro da faixa microalbuminúrica segundo seus valores de AN e RAC, respectivamente. Um aumento gradual nos valores de RPC foi seguido por um aumento igualmente gradual nos valores de RAC. Similarmente, um aumento nos valores de RAC foi acompanhado por um aumento na porcentagem de cães doentes com hipertensão, a qual compreendeu de 87,5 % e 85,7% dos cães macroalbuminúricos, segundo seus valores de AN e RAC, respectivamente. Finalmente, os cães com IRC hipertensos (&gt; 180 mmHg de pressão sistólica) apresentaram valores mais altos de RAC que os cães não hipertensos (P = 0,023). Portanto, como primeiro relato na literatura veterinária, foi demonstrado que a hipertensão pode exercer um efeito adverso sobre o rim de cães com IRC, similarmente ao que é observado na medicina humana. / Detection of microalbuminuria (MA) is commonly recommended by human clinicians to diagnose early renal disease in people presenting different diseases. When kidney disease has progressed to renal failure, albuminuria can reach higher levels (&gt;30 mg/dL), considering that stage as macroalbuminuria, which, in turn, eventually results in overt proteinuria. In veterinary medicine, no data related to what levels of albuminuria can be observed in dogs with chronic renal failure (CRF), as well as the degree of correlation with systemic hypertension, is available, being therefore, the scope of this study. Urinary albumin concentrations, detected by ELISA, were determined in 40 dogs with CRF and 40 healthy dogs (controls). Arterial pressures were registered for comparisons. Normalized albumin concentrations (NAC), urinary albumin to urinary creatinine ratio (UAC) and urinary protein to urinary creatinine ratio (UPC) were calculated for all dogs. All control dogs were below the microalbuminuric range for both parameters. In dogs with CRF, 42,5% and 65% were within the microalbuminuric range based on their AN and UAC values, respectively. A gradual increase in the level of UPC was followed by an also gradual increase in UAC values. Similarly, an increase in the UAC values was accompanied by an increase of the percentage of dogs with hypertension, which affected 87,5 % and 85.7% of the macroalbuminuric CRF dogs, according to their AN and RAC values, respectively. Finally, hypertensive CRF dogs (&gt;180 mmHg mean systolic pressure) had greater UAC values than normotensive CRF dogs (P = 0.023). Thus, for the first time in veterinary literature, it is shown that hypertension seems to exert an adverse effect on renal function of CRF dogs, similarly to what is observed in human medicine.

Os programas de melhoramento de figueira (Ficus carica L.) por métodos convencionais tais como cruzamentos dirigidos, para a obtenção de novos cultivares, são inviáveis em muitos países, como no Brasil, principalmente pela pequena variabilidade genética encontrada, e pela dificuldade de obtenção de plantas originadas pela fusão de gametas, uma vez que a vespa Blastophaga psenes, responsável pela polinização natural, não existe no país. Desse modo, o melhoramento genético, com o uso de mutagênicos, se torna uma linha de pesquisa importante para a melhoria da cultura, sendo necessário reunir informações sobre essa espécie, principalmente, em relação à sua variabilidade genética, para que projetos de propagação e manejo adequados sejam realizados. Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi verificar a existência de variabilidade epigenética devido à metilação do DNA em seleções irradiadas de figueiras, entre si e quando comparadas ao principal cultivar comercial, Roxo-de-Valinhos, utilizando as técnicas de MSAP e ELISA, e posterior sequenciamento do DNA, tratado com bissulfito de sódio, para detecção do posicionamento das regiões polimórficas, analisado por ferramentas de bioinformática. Amostras do DNA genômico foram duplamente digeridas com a enzima HpaII (sensível à metilação) ou com o seu isoesquizomero MspI (não sensível à metilação), juntamente com a enzima EcoRI. Foram testadas 14 combinações de primers e obteve-se 87.9%, 10.1% e 2.0%, respectivamente, de regiões não metiladas CCGG, regiões metiladas CmCGG e regiões hemimetiladas hmCCGG, de um total de 553 produtos de amplificação, demostrando que a técnica MSAP é eficiente para detecção de sítios diferencialmente metilados no material genômico estudado, evidenciando sua divergência epigenética. Com o sequenciamento do DNA isolado desses sítios diferencialmente metilados, foi possível verificar diferentes padrões de metilação nos mesmos pelo sequenciamento dos DNAs tratados com bissulfito de sódio, em regiões codificadoras de genes regulatórios do desenvolvimento e amadurecimento dos frutos, além de terem sido encontrados no DNA mitocondrial dos tratamentos, o qual regula o fornecimento de energia em forma de ATP para as plantas, estando intimamente relacionado com o desenvolvimento das mesmas, justificando os diferentes fenótipos encontrados, tanto nos frutos, quanto no crescimento das plantas que sofreram estresse devido à exposição à radiação gama. Pela técnica de imunoquímica (ELISA), utilizando anticorpos anti 5-mC, foram observadas diferenças significativas pelo teste de Tukey, a 95 % de confiabilidade, no conteúdo global de metilação dos DNAs dos tratamentos, indicando que este fator abiótico foi responsável pelas alterações no epigenoma das plantas. Como o material utilizado como controle se encontrou também metilado, uma possível desmetilação dos materiais genômicos pode ser a responsável pela variação fenotípica entre os tratamentos. Diante disso, o estudo futuro da expressão gênica entre os tratamentos torna-se uma estratégia de extrema importância para o entendimento dos complexos sistemas regulatórios, levando à identificação de genes de interesse agronômico para a cultura da figueira, possibilitando a sua manipulação subsequente e propagação de cultivares melhorados para fins comerciais. / The fig tree (Ficus carica L.) breeding programs by conventional methods such as directed crosses, in order to obtain new cultivars, are unworkable in many countries, as in Brazil, mainly by small genetic variability found, and by the difficulty for obtaining plants originated from the fusion of gametes, since the wasp Blastophaga psenes, responsible for natural pollination, doesn`t exist in the country. In this way, the genetic breeding, with the use of mutagenic, becomes an important research line for the improvement of culture, being necessary to gather information about this species, mainly in relation to its genetic variability, for perform propagation projects and appropriate management. Given the above, The objective of this study was to verify the existence of epigenetic variability due to DNA methylation in irradiated fig selections, with each other and when compared to the main commercial cultivar, Roxo-de-Valinhos, using MSAP and ELISA techniques, and subsequent DNA sequencing, treated with sodium bisulfite, for detection of the position of the polymorphic regions, analyzed by bioinformatics tools. Samples of genomic DNA were double-digested with the HpaII enzyme (sensitive to methylation) with its isoschizomer MspI (insensitive to methylation), together with the EcoRI enzyme. Fourteen primer combinations were tested and it was obtained 87.9%, 10.1% e 2.0%, respectively, unmethylated CCGG, methylated CmCGG and hemimethylated regions hmCCGG, from a total of 553 amplification products, displaying, the MSAP technique, efficient for detection of differentially methylated sites in the genomic material studied, demonstrating their epigenetic divergence. With the sequencing of DNA isolated of these differentially methylated sites, it was possible to verify different patterns of methylation in them by sequencing the DNA treated with sodium bisulfite, in coding regions of regulatory genes of the development and fruits ripening, besides they have been found in the mitochondrial DNA of treatments, which regulates the supply of energy in ATP form for the plants, being closely related to their development, justifying the different phenotypes found in both fruits and plant growth that suffered stress due to exposure to gamma radiation. By the technique of immunochemistry (ELISA), using 5-mC antibodies, significant differences were observed by Tukey test, at 95% of trustworthiness, in the global content methylation of the treatments DNA, indicating that this abiotic factor was responsible for the changes in the epigenome of the plants. Since the material used as control was found also methylated, a supposed demethylation of the genomic material may be responsible for phenotypic variation among treatments. Considering this, future study of gene expression between treatments becomes an extreme important strategy for understanding the complex regulatory systems, leading to the identification of genes with agronomic interest for the fig culture, allowing its subsequent manipulation and propagation of improved cultivars for commercial purposes.

A malária transmitida por transfusão (MTT), embora seja um evento raramente relatado em áreas não endêmicas ou de baixa endemicidade, representa um desafio devido à ocorrência de infecções assintomáticas e à possibilidade de sobrevivência de Plasmodium em hemácias estocadas por até três semanas a temperaturas entre 2 e 6ºC. No Estado de São Paulo, quatro casos de MTT foram relatados, incluindo uma morte. Os doadores infectados foram identificados como portadores assintomáticos que viviam ou haviam se deslocado para o bioma Mata Atlântica do estado. Nesses doadores, geralmente as densidades parasitárias são baixas e indetectáveis pela gota espessa ou testes rápidos. O uso de plataformas incluindo testes sorológicos poderia detectar doadores suspeitos de infecção por Plasmodium, minimizando a possibilidade de MTT. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi padronizar a produção de antígeno recombinante MSP119 de P. vivax, que é a espécie mais prevalente no Brasil, e validar o teste ELISA-PvMSP119, visando à aplicação em serviços hemoterápicos brasileiros de áreas não endêmicas para malária. O antígeno recombinante produzido em condições desnaturantes mostrou-se adequado para a produção em larga escala, pela facilidade de obtenção e purificação. Os resultados de estabilidade obtidos em três lotes-piloto indicaram validade de pelo menos 27 meses sem perda de reatividade. Além disso, o teste apresentou 96,95% de sensibilidade em 197 soros de pacientes com gota espessa positiva para P. vivax e especificidade de 100,00% utilizando soros de 101 indivíduos controles sadios e 99,26% quando considerados também 168 amostras de soro de pacientes com outras doenças. O coeficiente de variação das amostras positivas foi <= 3,8% para a repetitividade e <= 10,6% para a reprodutibilidade. Quanto à reatividade cruzada, obtiveram-se falsos resultados positivos com amostras de doença de Chagas (5,88%) e fator reumatoide (6,67%). Após a validação, avaliou-se a prevalência de anticorpos IgG anti-MSP119 de P. vivax entre doadores de sangue do Sudeste do Brasil, considerados aptos à doação, ensaiando 1.974 amostras de plasma de bancos de sangue, sendo 1.309 do Estado São Paulo (SP) e 665 do Estado do Rio de Janeiro (RJ). A positividade entre as amostras de SP foi 1,15% (N = 15) e entre as do RJ foi 1,65% (N = 11). O índice de reatividade (IR) das amostras positivas variou entre 8,98-1,16 (SP) e 13,03-1,08 (RJ). Em SP e RJ, maior positividade foi encontrada nos municípios que têm contato com o bioma Mata Atlântica e no RJ, também no bairro da Tijuca, onde se encontra a Floresta da Tijuca. A presença de anticorpos IgG anti-P. vivax não é necessariamente um marcador de parasitemia ou doença, porém aponta para o risco de MTT, mesmo em áreas de baixa endemicidade, pois doadores assintomáticos podem ser aceitos com base em triagem clínica. Estes achados constituem-se em alerta que nos impele a rever os critérios adotados para a seleção dos doadores, com o objetivo de reduzir o risco de MTT nessas áreas sem perder doações. / In non-endemic and low endemic areas, transfusion-transmitted malaria (TTM) is a rarely reported event, representing a major challenge, essentially due to the occurrence of asymptomatic infections and to the possibility of Plasmodium survival up to three weeks in stored red blood cells at temperatures between 2 and 6ºC. In São Paulo State, four TTM were detected, including one death. Infected donors were identified as asymptomatic carriers that lived or that had displacements to the Atlantic forest biome in the state. In these donors generally the parasite densities are low and undetectable in the thick blood smear or rapid diagnostic tests. The use of platforms including serological tests might point out donors suspected of harboring Plasmodium, minimizing the possibility of TTM. Accordingly, the aim of this study was to standardize the production of P. vivax MSP119 recombinant antigen, which is the most prevalent species in Brazil, and validate ELISA-PvMSP119, aiming at the application in Brazilian haemotherapic services in malaria non-endemic areas. The recombinant antigen produced under denaturing conditions was suitable for large-scale production, due to the ease of obtaining and purification. The results of stability obtained in three pilot batches indicated that it was valid for at least 27 months without loss of reactivity. Furthermore, the test showed 96.95% sensitivity in sera from 197 patients with positive thick-blood smear for P. vivax and 100.00% specificity in sera from 101 healthy controls, and 99.26% when considered also 168 samples from patients with other diseases. The variation coefficient of positive samples was <= 3.8% for repeatability and <=10.6% for reproducibility. For cross-reactivity, false positive results were obtained with Chagas\' disease (5.88%) and rheumatoid factor (6.67%) samples. After validation, we evaluated the prevalence of IgG anti-MSP119 antibodies to P. vivax among blood donors in Southeastern Brazil, considered suitable for donation, rehearsing 1,974 plasma samples from blood banks, being 1,309 from the State of São Paulo (SP) and 665 from the State of Rio de Janeiro (RJ). The positivity among samples from SP was 1.15% (N = 15) and in RJ was 1.65% (N = 11). The reactivity index (RI) of the positive samples ranged from 8.98 to 1.16 (SP) and from 13.03 to 1.08 (RJ). In SP and RJ, highest positivity was seen in Municipalities in contact to the Atlantic Forest biome, and in RJ, also in the Tijuca neighborhood, where there is the Tijuca Forest. The detection of IgG antibodies is not necessarily a marker of parasitemia or disease, however, points out to the risk of TTM, even in areas of low endemicity, since asymptomatic donors could be accepted based on clinical screening. These findings constitute an alert that impel us to review the adopted criteria for screening of the donors aiming to reduce the risk of TTM in these areas without losing donations.

A Leishmaniose Visceral Humana (LVH) é uma protozoonose sistêmica grave que tem apresentado mudança no comportamento epidemiológico, com uma tendência crescente no Brasil. Na Região Norte, com a criação do Estado do Tocantins em 1989, houve aumento da incidência de LV em decorrência das modificações ecoepidemiológicas. Foi realizado um estudo descritivo de corte transversal para avaliar o quadro da LVH no município de Araguaína (TO) no período de janeiro de 2007 a agosto de 2010. Adicionalmente, foram realizados ensaios para comparar as abordagens diagnósticas sorológicas para o diagnóstico da doença. Na distribuição dos casos de LVH nos municípios do norte do estado do Tocantins, Araguaína representa 79,8% no total dos casos no período de 2.007 a agosto de 2.010. Os resultados deste estudo revelaram que, nesse período, 769 casos foram confirmados, sendo que 98,7% foram de casos novos. Houve um predomínio do sexo masculino de 57,8% e a faixa etária mais acometida foi a de 0 a 14 anos, com 71,3% dos casos notificados. Na distribuição por zona de residência, foram notificados 98,5% dos casos na zona urbana, mostrando a urbanização da doença. Nos ensaios, foram utilizadas uma abordagem usual da rede do SUS: um ensaio de imunofluorescência indireta (IFI), um ELISA convencional, somados a um ELISA dissociativo. Os ensaios de ELISA apresentaram alta reprodutibilidade. Os pacientes positivos à IFI apresentaram uma frequência de 4% de falso-positivos quando testados em ambos os ELISA. Entre os pacientes suspeitos, houve uma alta frequência de positivos ao ELISA, maior no ELISA dissociativo do que no ELISA convencional. Na população assintomática, houve um achado de amostras positivas ao ELISA dissociativo. A presença de imunocomplexos em pacientes assintomáticos no início da doença ou sua presença em pacientes com resposta humoral menos intensa, como crianças, pode explicar estes achados de maior positividade no ELISA dissociativo. A confirmação destes resultados depende da pesquisa parasitológica em pacientes positivos ao ELISA dissociativo. Estes resultados mostram a importância de novas abordagens sorológicas no diagnóstico da LVH que viabilizariam uma triagem de paciente para diagnóstico parasitológico invasivo. / Human visceral leishmaniasis (HVL) is a severe systemic protozoonosis that has presented changes at the epidemiological behavior, with a growing trend in Brazil. It has been conducted a cross sectional study to assess the context of HVL in the city of Araguaina (TO) from January 2007 to August 2010. Additionally, tests were conducted to compare the diagnostic approaches for the serological diagnosis. In the distribution of cases of HVL in the districts of northern state of Tocantins, Araguaina represents 79.8% of the total cases in the period from 2007 to August 2010. The results of this study revealed that in this period, 769 cases were confirmed, while 98.7% are new cases. There was a male predominance of 57.8% and the most affected age group was 0-14 years, with 71.3% of reported cases. In the distribution by area of residence were reported 98.5% of cases in the urban area, showing the urbanization of the disease. In tests, we used the usual approaches network: an indirect immunofluorescence assay (IFA) and a conventional ELISA, plus a dissociative ELISA. ELISA assays showed high reproducibility. Positive patients with IFAT showed a frequency of 4% false-positive when tested in both ELISA. Among patients suspected there was a high frequency of positive to ELISA, the ELISA dissociative higher than in the conventional ELISA. In the asymptomatic population, there was a finding of positive samples by ELISA dissociative. The presence of immune complexes in asymptomatic patients early in the disease or its presence in patients with less intense humoral response, as children, these findings may explain the higher dissociative ELISA positive. Confirmation of these results depends on parasitologic research on dissociative ELISA-positive patients. These results show the importance of new approaches in the serological diagnosis LVH that would make a screening of patients for invasive diagnostic parasitology.