O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de ELISA para detecção de anticorpos IgG anti-Cryptosporidium sp para aplicação em estudos epidemiológicos da criptosporidiose em imunocompetentes. Para obtenção de antígeno, bezerros foram oralmente infectados. Os oocistos foram recuperados das fezes doanimal, com a utilização do gradiente de sacarose modificado, técnica de concentração onde se obteve o melhor rendimento. Para preparação do antígeno, os oocistos foram rompidos através de ciclos de congelamento/descongelamento e ultra-som. Soros controle positivo foram escolhidos entre o grupo de funcionários do laboratório de Parasitologia, pois apresentavam anticorpos anti-Cryptosporidium e devido as suas atividades no laboratório era um grupo mais exposto; soros controle negativo foram escolhidos entre aqueles com leituras de densidade óptica menores que 0,300 no ELISA para detecção de anticorpos anti-Cryptosporidium. Diferentes grupos de soros de indivíduos clinicamente normais (funcionários da parasitologia, doadores de sangue, pacientes que fizeram o Pré-Natal) ou outras infecções parasitárias (cisticercose, toxoplasmose, esquistossomose, Doença de Chagas, leishmaniose), foram avaliados para presença de anticorpos anti-Cryptosporidium. A alta freqüência foi observada para o grupo de pacientes com Doença de Chagas (66,6%) e baixa freqüência para o grupo de pacientes com esquistossomose e toxoplasmose (20,0%). A especificidade do teste ELISA para Cryptosporidium foi demonstrada com significante redução nas leituras de 0.0. observada em alguns soros após absorção dos anticorpos anti-Cryptosporidium. Além disso, no grupo de pacientes Pré-Natal 14,6%, quando comparada a alta freqüência de anticorpos anti-Cryptosporidium 52,0%, indica provável ausência de reações cruzadas entre os dois antígenos. Enfim, os resultados obtidos sugerem que a técnica de ELISA pode ser uma importante metodologia para aplicação em estudos soroepidemiológicos da criptosporidiose. / The aim of the present study was to standardize an immunoenzymatic assay, ELISA, for detection of IgG antibodies to Cryptosporidium sp for use in epidemiologic studies on cryptosporidiosis. For antigen preparation, oocysts were obtained from fecal samples of orally infected calves. A modified sucrose gradient, concentration technique was used for recovered and purification of oocysts, which were ruptured by using freezethaw cycles and ultra-sonication. Positive control sera were chosen among the Parasitology workers, who presented anti-Cryptosporidium antibodies and had been exposed to this parasite, because of their activities in the laboratory; and negative control sera were chosen among the ones with optical density (O.D.) readings lower than 0,300 at ELISA for anti- Cryptosporidium antibodies. Oifferent groups of sera from clinically normal individuais (parasitology workers, blood donors, pregnant patients) or with other parasite infection (cysticercisis, toxoplasmosis, schistosomiasis, Chagas disease, leishmaniasis) were evaluated for the presence of Cryptosporidium antibodies. The higher frequency was observed for the group of patients with Chagas disease (66.6%) and the lower frequency for the group patients with schistosomiasis and toxoplasmosis (20.0%). The specificity of the Cryptosporidium-ELISA test was demonstrated when significant reduction of the 0.0. readings was observed for some serum samples after absorption of the anti-Cryptosporidium antibodies. Also, in the group of pregnant patients, the high frequency of 52.0% for anti-Cryptosporidium antibodies when compared to the low frequency of 14.6% for anti-Toxoplasma antibodies might suggest possible absence of cross reactions between these two closely related parasite antigens. The ELISA for detection of anti-Cryptosporidium antibodies, as standardized in the present work, can constitute a good toel for epidemiological studies of cryptosporidiosis.

Em função da proximidade cada vez maior entre o cavalo e o homem, é de extrema importância ter conhecimentos das doenças que acometem os equinos, que por ventura, podem acometer seres humanos. Dentre muitas doenças, pode-se citar duas, que promovem grandes perdas econômicas aos rebanhos eqüinos, tanto no tratamento desses rebanhos, como com a morte dos mesmos, dificultando a importação e exportação de animais: a babesiose e a erliquiose (anaplasmose), que podem estar ou não associadas, acometendo um animal, concomitantemente. A presente pesquisa teve como objetivo investigar e diagnosticar doença concomitante babesiose (por Babesia equi ou Theileria equi) e Erliquiose (por Erliquia equi ou Anaplasma phagocytophilum), no estado de São Paulo, em rebanhos eqüinos, utilizando as técnicas de Nested PCR (Nested polymerase chain reaction reação em cadeia pela polimerase para diagnóstico de T. equi e A. phagocytophilum) e c-ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay para diagnóstico de T. equi) ou ELISA indireto (para diagnóstico de A. phagocytophilum) e comparar os resultados obtidos nas diferentes técnicas em 250 amostras de eqüino (sangue total e soro). Como resultado, obteve-se 38,4%, 46% e 36% de positividade, respectivamente, nos testes de pesquisa de hematozoário, c-ELISA e Nested PCR para Theileria equi e 0%, 3% e 0% de positividade, respectivamente, nos testes de pesquisa de hemoparasita, ELISA indireto e Nested PCR para Anaplasma phagocytophilum, não sendo observada a co-infecção de Babesiose e Anaplasmose no rebanho estudo / Due to the increasing proximity between horse and man, it is of extreme importance to understand the diseases that affect horses which by chance may affect humans. Among many diseases, babesiosis and ehrlichiosis (anaplasmosis) promote high economic losses to horses herds in consequence of costs of treatment and also death, making it difficult to import and export animals: They can or not be linked affecting an animal at the same time. This study aimed to investigate and diagnose concomitant babesiosis (Babesia equi and Theileria equi) and ehrlichiosis (for ehrlichia equipment or Anaplasma phagocytophilum) in equine herds of the state of Sao Paulo, using the techniques of Nested PCR (Nested polymerase chain reaction for the diagnosis of T. equi and A. phagocytophilum) and c-ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of T. equi) or ELISA (for diagnosis of A. phagocytophilum). Also to compare results obtained in these different techniques in 250 samples of horse (whole blood and serum). Results showed 38.4%, 46% and 36% positivity, respectively, in tests for the detection of Theileria equi through hematozoan, c-ELISA and Nested PCR and 0%, 3% and 0% positivity, respectively, in tests for the detection of Anaplasma phagocytophilum through blood parasites, indirect ELISA and Nested PCR. It was not observed co-infection Babesiosis and anaplasmosis in the herd study

A toxoplasmose é uma infecção mundial que é transmitida por carne contendo cistos teciduais, água ou legumes crus contaminados com oocistos, contato com felinos, ou transmissão vertical. A toxoplasmose é usualmente assintomática, mas pode causar doença severa no feto quando transmitida durante fase aguda na mãe. O rastreamento da toxoplasmose congênita é normalmente executado durante o pré-natal, pela detecção de anticorpos IgM específico ou pela demonstração de aumento dos títulos de anticorpos IgG para T.gondii. Neste trabalho, 160 mães IgM positivas em rastreamento externo foram avaliadas para IgM, IgG, IgA e avidez dos anticorpos IgG em ensaios usando Uréia e NH4SCN como agente caotrópico, e extrato salino e uma proteína recombinante ROP2 como antígeno. A maioria das mães com resultado positivo de IgM eram negativas (124) quando retestadas, 16 negativas para todos os testes e somente 36 casos de IgM e IgG positivos. Nossa reação foi convalidada pelo Kit VIDAS Toxo IgG (Biomerieux), as 15 amostras aleatórias foram concordantes na maioria das amostras, incluindo as 3 de baixa avidez. A maioria das mães com IgG e IgM positivas confirmadas apresentaram índices intermediário e alto de avidez, e apenas 3 com índice baixo de avidez, que é sugestivo de infecção aguda. O uso de proteína recombinante Rop2 como antígeno resultou em muitos falsos negativos. O rastreamento de toxoplasmose congênita em áreas de alta prevalência induz uma baixa eficiência da sorologia, altos índices de pacientes tratados e baixa detecção. Ensaios de avidez são promissores, mas a sua padronização é obrigatória. / Toxoplasmosis is a worldwide infection transmitted by meat containing tissue cysts, water or crude vegetables contaminated with oocysts, contact with feline or vertical transmission. Toxoplasmosis is usually asymptomatic, but it can cause severe disease to the fetus during acute mother infection. The screening of congenital toxoplasmosis is usually been performed during prenatal, by detecting specific IgM antibodies or by demonstration of a significant increase specific IgG antibodies. In this work, 160 confirmed IgM positive mothers by external screening were evaluated for IgM, IgG, IgA, and avidity by several approaches using Urea and NH4SCN as chaotropic agents, and saline extract and a recombinant protein Rop2 as antigen. Most mother (124) were IgM negative when retested, 16 negative for all T.gondii tests and only 36 IgM and IgG positive. Our avidity reaction was convalidated by Kit VIDAS Toxo IgG (Biomerieux), 15 aleatory samples were concordant in most samples, including the 03 low avidity. Most of confirmed IgG and IgM positive mothers presented intermediary or high avidity indexes, only 3 presenting low avidity index, sugestive of acute infection. Use of recombinant proteins Rop 2 as antigen resulted in high false negative. Screening congenital toxoplasmosis in high prevalent areas by IgM serology showed low efficiency, higher treatment rates and low detection of acute infection. Avidity assays are promising markers of recent infection, but false negatives could be frequent.

O sorodiagnóstico da toxocaríase humana é geralmente baseado na detecção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. em amostras de soro pelo teste ELISA utilizando os antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis (TES). No entanto, observa-se uma ocorrência de reatividade cruzada com outras helmintíases nas áreas endémicas de poliparasitismo. Vários estudos têm mostrado que as glicanas presentes nos antígenos dos helmintos podem ser as responsáveis pela reatividade cruzada. Neste estudo, avaliamos o efeito da deglicosilação dos antígenos TES na sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA e Western-blotting para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE. Para a deglicosilação dos antígenos TES, estes foram tratados com diferentes concentrações de hidróxido de sódio (NaOH) ou metaperiodato de sódio (NaIO4) e foram testados 58 amostras de soro de pacientes com toxocaríase visceral, 75 amostras de soros de pacientes com outras helmintíases, e 95 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Nossos resultados mostraram que os antígenos TES foram totalmente deglicosilados com NaOH 100mM por 4 horas a 37°C (dTES), enquanto que o tratamento com NaIO4 não gerou bons resultados. A sensibilidade e especificidade dos antígenos TES e dTES na detecção de anticorpos IgG pelo teste de ELISA foi de 100%, com menor reatividade cruzada (5,3%) para os antígenos dTES, se comparada com os antígenos TES (13,3%). Todos os pacientes com toxocaríase mostraram anticorpos IgG contra as cinco frações dos antígenos TES (32, 45, 55, 70 e 120 kDa) e contra a única fração de 26kDa dos antígenos dTES, com sensibilidades e especificidades de 100% para ambos os antígenos. A reatividade cruzada, observada com as frações de 70 kDa, 55 kDa e 32 kDa dos antígenos TES, foi eliminada totalmente quando utilizaram-se os antígenos dTES. A detecção de anticorpos IgM pelo teste de ELISA mostrou reatividade inespecífica nos três grupos estudados, com sensibilidades de 39,7% e 34,5% e especificidades de 95,8% e 96,8%, para os antígenos TES e dTES, respectivamente, porém com ocorrência de reatividade cruzada de 24% e 28% para ambos os antígenos. Os três grupos estudados apresentaram reatividade contra quase todas as frações dos antígenos TES e dTES. A detecção de anticorpos IgE apresentou sensibilidades de 63,79% e 62,07% e uma especificidade de 100%, e uma reatividade cruzada de 26,6% e 53,3% para ambos os antígenos. A maioria dos pacientes com toxocaríase (74,1%) mostraram anticorpos contra as frações de 32, 55 e 70 kDa, em quanto que não houve reatividade nos pacientes com outras helmintíases ou nos indivíduos saudáveis. Estes resultados mostraram que a deglicosilação dos antígenos TES permite reduzir a ocorrência de reatividade cruzada nos pacientes com outras helmintíases, elevando o valor diagnóstico da detecção de anticorpos IgG. No entanto, este procedimento não permite melhorar a sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos IgM e não permite elevar a sensibilidade na detecção de anticorpos IgE pelo teste de ELISA. Por outro lado, os resultados discordantes na especificidade do Western-blotting para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE sugerem a presença de epítopos conformacionais presentes no estado nativo dos antígenos TES que estariam implicados na reação cruzada observada no teste de ELISA / Serodiagnosis of human toxocariasis is usually based on the detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies in serum samples by ELISA test using T.canis larvae excretory-secretory (TES) antigens. However, a cross-reactivity occurrence is observed in endemic areas of polyparasitism. Many studies have shown that the glycan structures, present in helminth antigens, can be the responsible for the cross-reactivity. In this study, we evaluated the deglycosylation of the TES antigens on the sensitivity and specificity of both the ELISA and Western-blotting for the detection of IgG, IgM, and IgE antibodies. For the deglycosylation of the TES antigens, they were treated with different concentrations of sodium hydroxide (NaOH) or sodium metaperiodate (NaIO4), and 58 serum samples of 58 patients with visceral toxocariasis, 75 serum samples of patients with other helminth infections, and 95 serum samples of healthy individuals. Our results show that the TES antigens were totally deglycosylated with 100 mM NaOH for 4 hours at 37°C (dTES), whereas not good results were obtained with sodium metaperiodate. The sensitivity and specificity of both TES and dTES antigens were 100% in detecting IgG antibodies by ELISA; the cross-reactivity observed with TES antigens (13.3%) was reduced (5.3%) when dTES antigens were used. All toxocariasis patients showed IgG antibodies against the five fractions of TES antigens (32, 45, 55, 70, and 120 kDa), but also with the 26-kDa single fraction of dTES antigens, with sensitivities and specificities of 100% for both antigens. The occurrence of cross-reactivity, observed mainly with the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, was totally eliminated when the dTES antigens were used. The detection of IgM antibodies by ELISA test showed unspecific reactivity in all studied groups, with sensitivities of 39.7% and 34.5%, and specificities of 95.8% and 96.8% for both antigens; the occurrence of cross-reactivity for both antigens were 24% and 28%, respectively. All studied groups have IgM antibodies against almost all fractions of TES antigens and the single fraction of dTES. The detection of IgE antibodies by ELISA test showed sensitivities of 63.8% and 62%, specificities of 100%, and occurrence of reactivity of 26.6% and 53.3% for TES and dTES antigens, respectively. The majority of the toxocariasis patients (74.1%) showed IgE antibodies against the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, whereas there was not reactivity in sera from patients with other helminth infections or healthy individuals. These results showed that the deglycosylation of the TES antigens reduces the occurrence of cross-reactivity in patients with other helminth infections, increasing the diagnostic value for the detection of IgG antibodies. However, this procedure does not improve the sensitivity nor reduces the occurrence of cross-reactivity in the detection of IgM antibodies. Likewise, this procedure does not improve the sensitivity in the detection of IgE antibodies by the ELISA test. On the other hand, the high specificity obtained in the detection of IgG, IgM, and IgE by Western-blotting suggest that conformational epitopes of the TES antigens may also be the responsible for the cross-reactivity in the ELISA test

O ovo é o alimento naturalmente mais completo, uma vez que possui todos os nutrientes necessários, como vitaminas, aminoácidos e minerais essenciais para manter uma vida. Porém, em contra partida, possui várias proteínas promotoras de alergias em considerável parcela da população mundial. Para determinar as proteínas dos alimentos alergênicos, um dos testes mais utilizados é o imunoensaios tais como ELISA (ensaio imunoenzimático - enzyme linked immunosorbent assay), onde o anticorpo reconhece o antígeno e essa conexão é mostrada por um sistema enzimático, em outras palavras, a densidade óptica. O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência do anticorpo policlonal, produzido em laboratório, para identificar a presença do antígeno ovomucóide em ovos tratados por irradiação gama para a sua desativação. Para avaliar os tratamentos, o anticorpo policlonal foi produzido em quatro (04) coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo feminino, com 45 dias de vida, imunizadas com ovomucóide bioconjugado. Foi utilizado o adjuvante de Freund completo na primeira imunização e a solução tampão PBS, foram realizadas, posteriormente, quatro imunizações a cada quinze dias, mais um reforço 48 horas antes da retirada do plasma sanguíneo. O soro sangüíneo foi titulado por PTA-ELISA (Plate trapped antigen). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal do Instituto de Ciência Animal e Pastagens (IZ) e precedida de acordo com as normas europeias para o bem-estar e ética animal. Foram utilizados ovos comerciais in natura, fornecidos pelo Departamento de Genética da Universidade de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" - ESALQ / USP. As amostras foram submetidas à radiação gama proveniente de uma fonte de Co60, do tipo Multipropósito no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), sob uma taxa de dose de 19,4 e 31.8Gy/hora, nas doses: 0 (controle); 10kGy; 20KGy e 30KGy, em todas as taxas. Pelo teste de ELISA, foi encontrado o alérgeno ovomucóide das amostras ovo e, pelo resultado apresentados, constatou-se que o tratamento da radiação não mostrou alterações significativas, quando avaliado por anticorpos policlonais. Assim, podemos concluir que o anticorpo produzido é capaz de identificar a proteína alergênica ovomucóide e, a irradiação gama em tais taxas não apresenta mudanças na estrutura da proteína, por esta forma de avaliação. Porém, apresentou algumas alterações na cor e viscosidade visual das amostras de ovos / The egg is the most complete natural food; it has all the necessary nutrients such as vitamins, aminoacids and essential minerals to maintain a life. However, although, has several proteins that promote allergies in considerable part of the world population. To determine allergenic food proteins, one of the most used tests is the immunoassays such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), where the antibody recognizes the antigen and this connection is showed by an enzymatic system, in other words, optical density. The aim of this study was to determine the polyclonal antibody efficiency, produced in laboratory, to identify the presence the ovomucoid antigen in treated eggs by gamma irradiation for its inactivation. To evaluate the treatments, polyclonal antibody was produced in four New Zealand female rabbits, at 45 days old, immunized with bioconjugated ovomucoid. Was used Freund Complete Adjuvant at first immunization and PBS Buffer at four subsequently immunizations every fifteen days, plus a booster 48 hours before the blood retreated. The blood serum was tittered by PTAELISA (Plate trapped antigen). All procedures were approved by Institute of Animal Science and Pastures (IZ)´s Committee of Ethical and Animal Experimentation and preceded according to European Norms for ethical and animal welfare. It was used, in nature, commercial laying eggs, from the Genetic Department of Agricultural University Luiz de Queiroz ESALQ/USP. So the samples were submitted to the gamma radiation coming from a source of Co60, type Multipurpose at the Energetically Researches and Nuclear Institute (IPEN), under a dose rate of 19.4 and 31.8Gy/hour, in the doses: 0 (control); 10KGy; 20KGy and 30KGy, in all rates. By the ELISAs test we can find the egg allergen ovomucoid and the radiation treatment do not showed considerable changes. So we can concluded that the antibody produced is capable of identify the ovomucoid allergenic protein and the gamma irradiation in such rates does not shows changes in that protein, therefore showed some changes in the color and visual viscosity of the egg samples

Este estudo representa a primeira avaliação ovariana, imunológica e hormonal realizada em duas espécies de felinos brasileiros ameaçados: L. pardalis (n=5) e L. tigrinus (n=4), antes e após 4 a 6 tratamentos alternados com as gonadotrofinas exógenas eCG/hCG e pFSH/pLH. Os animais foram submetidos a superovulação alternada com eCG-hCG e pFSH-pLH a cada quatro meses pelo período de dois anos, perfazendo um total de 6 intervenções. Os oócitos foram recuperados por vídeo laparoscopia, caracterizados quanto à morfologia e utilizados para determinação dos estágios do ciclo meiótico por análise citogenética e maturação pela caracterização de metáfase II. Avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão e varredura foi realizada para caracterização da morfologia dos oócitos. Antes e após cada intervenção sangue foi colhido e utilizado em análises hormonais séricas (progesterona e estradiol) por RIE e pesquisa de anticorpos para gonadotrofinas exógenas por ELISA. Comparando os tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) no número total de estruturas ovarianas observadas em superovulações alternadas sucessivas, nas duas espécies estudadas. Também não houve diferença significativa em relação ao total de estruturas ovarianas encontradas em cada tratamento (5,7±1,2 eCG/hCG; 7,9±0,9 pFSH/pLH) para L. pardalis e (eCG/hCG 2,6±0,7; pFSH/pLH 2,0±0,5) para L. tigrinus. Embora L. pardalis tenham apresentado maior número de estruturas ovarianas por estimulação que L. tigrinus (p<0,05), a porcentagem de oócitos maduros em relação aos oócitos totais não diferiu, indicando que a metodologia utilizada foi eficiente. L. pardalis apresentaram maior número de oócitos totais e maduros nos tratamentos com pFSH/pLH (p<0,05), sendo que em L. tigrinus ambos tratamentos se comportaram de maneira semelhante (p>0,05). Não foi possível a caracterização dos estágios do ciclo meiótico pela avaliação da configuração cromossômica nos oócitos, sendo que nenhum oócito apresentou-se em metáfase II. Ultraestruturalmente os oócitos apresentaram características semelhantes aos observados em mamíferos de maneira geral. Dosagens hormonais séricas demonstraram um aumento de estradiol após as superovulações. Elevações de progesterona foram observadas em alguns momentos pré e pós superovulações. Embora alguns animais tenham demonstrado desenvolvimento de títulos para imunoglobulinas anti-gonadotrofinas exógenas, essa resposta imune humoral não parece interferir com a indução da atividade ovariana produzida pela superovulação, já que os animais responderam bem aos tratamentos alternados. Com estes resultados podemos concluir que essas espécies podem ser manejadas intensivamente usando tratamentos alternados com gonadotrofinas exógenas para procedimentos de reprodução assistida sem comprometer a resposta ovariana a esses hormônios. / This study represents the first assessment of ovarian, immunological and hormonal responses of two endangered Brazilian felids: L. pardalis (n=5) and L. tigrinus (n=4), treated with two exogenous gonadotropin regimens eCG/hCG and pFSH/pLH. Females were treated with four to six times alternating eCG/hCG and pFSH/pLH protocols using an interval of four months between each treatment. Ovarian follicular development and oocytes recovery were performed through laparoscopy. Recovered oocytes were submitted to the cytogenetical analysis and to the electron microscopy in order to evaluate the maturation (metaphase II) and the morphological and ultrastructural status, respectively. Blood samples were collected before each treatment and during the laparoscopy in order to measure progesterone and estradiol by RIA and to evaluate the immunological response to the exogenous gonadotropins by ELISA. Our results suggest that L. pardalis and L. tigrinus do not show a decrease (p>0.05) in ovarian response after repeated and alternate exposure to different gonadotropin treatments. In both L. pardalis and L. tigrinus, no differences were found regarding to the number of total ovarian structures (p>0.05) during successive gonadotropin treatments. When comparing the eCG/hCG and the pFSH/pLH treatments, there were no differences (p>0.05) regarding to the total number of ovarian structures in L. pardalis (5.7 ± 1.2 and 7.9 ± 0.9, respectively) or L. tigrinus (2.6 ± 0.7 and 2.0 ± 0.5, respectively). Despite the fact that the L. pardalis showed a higher number of follicles and CLs per stimulation (p<0.05) when compared to the L. tigrinus, no differences were found when analyzing the percentage of mature oocytes (p>0.05). Within species, both gonadotropin regimens were equally effective (p>0.05) to induce the follicular growth. No decreases (p>0.05) on the total number of ovarian structures and on the oocyte maturation percentages were observed between the sequential stimulations, but. L. pardalis showed a higher number of mature and total oocytes when treated with pFSH/pLH (p<0.05). L. Tigrinus didn’t show any differences regarding to the number of total and mature oocytes (p>0.05) when comparing both gonadotropin regimens. No oocytes in metaphase II were observed in the cytogenetic analyses. Oocytes histological evaluation showed that morphological characteristics were the same observed in others mammals. Hormonal analyses showed increased estradiol levels after superovulations. Higher levels of progesterone were observed before and after superovulations. Although some of these cats do demonstrate the development of anti-gonadotropin immunoglobulin titers, these humoral immune responses do not appear to interfere with gonadotropininduced ovarian stimulation. In this study, animals treated repeatedly with alternating regimens of eCG/hCG and pFSH/pLH showed no decrease in total ovarian structures after four to six successive treatments. These findings are potentially valuable for the ongoing efforts to develop and apply assisted reproductive technologies to the management and conservation of endangered felid populations.

A neurocisticercose (NC) é uma doença provocada por larvas de Taenia solium (Tso) no sistema nervoso central. Seu diagnóstico fundamenta-se em critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. A utilização de antígenos parasitários no imunodiagnóstico apresenta desvantagens como: necessidade de animais, ausência de homogeneidade entre lotes, baixo rendimento, e contaminação com proteínas suínas. Assim, os antígenos recombinantes podem otimizar o imunodiagnóstico da NC, pois são reagentes simples e reprodutíveis, sem requerer animais. Este estudo teve como objetivo a obtenção, caracterização e análise da reatividade de proteína recombinante baseada em antígenos de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra). Assim, o cDNA foi obtido por amplificação a partir de RNAm de cisticercos de Tcra. A proteína recombinante Tc14 foi produzida em Escherichia coli (DE3) BL21 utilizando-se o vetor de expressão pET-22b e purificada por cromatografia de afinidade. A caracterização antigênica deu-se por Imunoblot (IB) utilizando anticorpos monoclonais (AcMo). Houve reatividade com todos os AcMo utilizados (AcMo anti-antígeno de excreção/secreção de Tcra, AcMo anti-líquido vesicular de Tcra, AcMo antilíquido vesicular de Tso e AcMo anti-antígeno total de Tso), exceto com o AcMo anti-antígeno de escólex de Tso. Utilizando-se 22 amostras de soro e 19 de líquor (LCR) de pacientes com NC, 48 soros e 28 LCR do grupo controle negativo (GCN) e 17 soros de hidatidose do grupo outras parasitoses (OP) em Imunoblot foi observada reatividade na região de 14kDa, correspondente a Tc14, em todas as amostras NC, mas não nos GCN e OP. Em ELISA com Tc14 obteve-se sensibilidade (S) e especificidade (E) de 100% com LCR (29 amostras de NC e 35 do GCN) e S de 95,1% e E de 100% com soro (41 amostras de NC, 52 do GCN). Dentre 51 soros de OP, mostraram-se reagentes um de hidatidose e outro de estrongiloidíase. A análise comparativa entre diferentes antígenos e testes sorológicos apresentou índice de positividade de 100% em IB utilizando os antígenos Tc14 ou LLG (antígeno purificado de Tso com lentil-lectina); já em ELISA, os índices foram de 83,4% para Tc14 e 91,6% para 18/14 (antígeno purificado de líquido vesicular de Tcra com AcMo). Em ensaios de linfoproliferação a porcentagem de respondedores no grupo NC foi de 16,6% (com 0,05 e 0,6 &#181;g de Tc14/poço), 50% (com 0,4 &#181;g de Tc14/poço), 44,4% (com 1,0 &#181;g de Tc14/poço) e 20% (com 2,0 &#181;g de Tc14/poço). Não houve proliferação no GCN. A dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura apresentou reatividade diferenciada entre o GCN e NC para IL-10, sendo uma amostra do GCN reagente e duas amostras de NC não reagentes. Não foi possível detectar IFN-&#947;. Em ELISA para IgG total 91,7% dos plasmas do grupo NC apresentaram reatividade, sendo a positividade para os isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente, de 75; 33,3; 50 e 25%. O antígeno recombinante mostrou-se como ferramenta promissora para imunoensaios na NC, abrindo nova perspectiva envolvendo estudos a serem realizados sobre diferentes sistemas de expressão e antigenicidade frente a um número maior de amostras. / The neurocisticercosis (NC) disease is caused by the presence of Taenia solium (Tso) larvae in the central nervous system. Its diagnosis is based on clinical criteria, epidemiological studies and laboratorial exams. Nevertheless, the use of parasite antigenic extracts into the immunodiagnosis presents some disadvantages: it requires animals, lacks of homogeneity between lots, low yield and may become contaminated with swine proteins. Consequently, the utilization of recombinant antigens could optimize the immunodiagnostic of NC, as they are simple and reproducible reagents that do not require animals. This study aimed the capture, characterization and reactivity analysis of the recombinant protein based on antigens of the vesicular fluid of Taenia crassiceps (Tcra). In order to do so, the cDNA was obtained through the amplification deriving from RNAm of cysticerci of Tcra. The recombinant protein Tc14 was produced in Escherichia coli (DE3) BL21 using the expression vector pET-22b and purified by affinity chromatography (nickel resin). The antigenic characterization was performed by immunoblotting (IB) using monoclonal antibodies (MoAb). The recombinant protein presented reactivity with all the MoAb used (Anti-secretion/excretion antigens from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tso MoAb and anti- total antigen from Tso MoAb), except with the anti-antigen from Tso scolex MoAb. The immunoblot was performed using 22 serum samples and 19 cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC, 48 serum and 28 CSF from the negative control group (GCN) and 17 hydatidosis serum from other parasitosis\' group (OP). It showed reactivity in the 14kDa region, correlated to Tc14, in all NC samples, but not presented on GCN and OP. In ELISA with Tc14, the sensibility (S) and specificity (E) of 100% was obtained with CSF (29 NC samples and 35 GCN samples) and 95.1% of S and 100% of E with serum (41 NC samples, 52 GCN samples). Among 51 OP serums, one from hydatidosis and one from strongyloidiasis demonstrated reactivity. The comparative analysis amongst different antigens and serological tests demonstrated positivity of 100% in IB when using the Tc14 antigens or LLG (purified antigen of Tso with lentil lectin). In ELISA, the positivity indicated was of 83.4% for Tc14 and 91.6% for 18/14 (vesicular fluid purified antigen with MoAb from Tcra). In lymphoproliferation tests, the percentage of responders in NC group was of 16.6% (with .0.5 and 6 &#181;g of Tc14/well), 50% (with 0.4 &#181;g of Tc14/well). No proliferation occurred in GCN. The dosage of cytokines in culture supernatants presented different reactivity amongst GCN and NC for IL-10, as one sample of GCN reacted and two NC samples did not. It was not possible to detect IFN-&#947;. In ELISA for total lgG, 91.7 % of plasmas from NC group presented reactivity, with positivity for the isotypes lgG1, lgG2, lgG3 and lgG4, 75 %, 33.3 %, 50 % and 25 %, respectively. The recombinant antigen prevails as a promising tool for immunoassays in NC, opening a new perspective involving studies to be performed concerning different expression and antigenicity ahead of a larger number of samples.

Nessa pesquisa são relatados os resultados da determinação das concentrações de microcistina e de biomassa algal após as várias etapas de tratamento de amostras de água coletadas junto ao reservatório de Barra Bonita-SP visando obtenção de água potável. O tratamento foi realizado em escala de laboratório com e sem aplicação de carvão ativado em pó (CAP) e as etapas foram: coagulação com aplicação de cloreto férrico, sedimentação, filtração em papel de filtro. Foi possível observar que a pré-clarificação desse tipo de água por coagulação seguida de sedimentação requereu dosagens relativamente elevadas de cloreto férrico (80 mg/L), tendo sido verificada eficiência muito baixa de remoção de microcistina nas etapas de tratamento por sedimentação seguida de filtração, quando não foi aplicado CAP. Apenas com a aplicação de CAP a microcistina foi reduzida à níveis que atendessem os padrões de potabilidade previstos na Portaria 518/04 (concentração menor que 1 &#956g/L). A determinação de microcistina pelo método que utiliza Imunoadsorventes Ligados à Enzima (ELISA) mostrou-se uma ferramenta útil e confiável para detectar e quantificar essa toxina, embora ainda apresente custo relativamente elevado. / This report presents the results of the quantification of microcystins and algae biomass concentrations after treatment of water samples taken from the Barra Bonita reservoir, for production of potable water. Bench-scale tests were carried out with and without powdered activated carbon (PAC) and the treatment processes used were: coagulation with ferric chloride (FeCl3), sedimentation and filtration with paper filter. It was determined that pre-clarification followed by sedimentation required substantial dosages of ferric chloride (80 mg/L). The removal of microcystins using sedimentation followed by filtration was ineffective without PAC. The use of PAC is required to produce water that meets current potability standards for microcystins removal as specified in Decree 518/04 (concentration less than 1 &#956g/L). Analysis of microcystins using the Enzime-Linked Immunosorbent Assay Method (ELISA) has proven to be an effective and reliable procedure to detect and quantify this toxin, although relatively expensive.

Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

A avaliação de microalbuminúria (MA) é frequentemente utilizada em medicina humana para o diagnóstico precoce de doença renal precoce em humanos que pode evoluir concomitantemente durante o curso de várias outras afecções. Quando a doença renal progride para insuficiência renal, a albuminúria pode atingir concentrações elevadas (&gt;30 mg/dL), que recebe, neste momento, a denominação de macroalbuminúria, que, por sua vez, resulta em proteinúria maciça. A coexistência de hipertensão arterial sistêmica pode acelerar a progressão da doença. Em Medicina Veterinária, não há relatos sobre a magnitude desta albuminúria em cães já diagnosticados com insuficiência renal crônica (IRC) como também sobre o grau de coexistência de hipertensão, parâmetros estes que constituíram o escopo do presente estudo. As concentrações urinárias de albumina, detectadas pela técnica ELISA, foram determinadas em 40 cães com IRC e em 40 cães sadios (controles). As pressões sangüíneas sistólicas também foram mensuradas para comparações. A concentração de albumina normalizada (AN), relação albumina:creatinina (RAC) e relação proteína:creatinina (RPC) foram calculadas para todos os cães. Todos os cães controles apresentaram valores abaixo da faixa de microalbuminúria para ambos os índices (AN e RAC).. Nos cães com IRC, 42,5% e 65% apresentaram-se dentro da faixa microalbuminúrica segundo seus valores de AN e RAC, respectivamente. Um aumento gradual nos valores de RPC foi seguido por um aumento igualmente gradual nos valores de RAC. Similarmente, um aumento nos valores de RAC foi acompanhado por um aumento na porcentagem de cães doentes com hipertensão, a qual compreendeu de 87,5 % e 85,7% dos cães macroalbuminúricos, segundo seus valores de AN e RAC, respectivamente. Finalmente, os cães com IRC hipertensos (&gt; 180 mmHg de pressão sistólica) apresentaram valores mais altos de RAC que os cães não hipertensos (P = 0,023). Portanto, como primeiro relato na literatura veterinária, foi demonstrado que a hipertensão pode exercer um efeito adverso sobre o rim de cães com IRC, similarmente ao que é observado na medicina humana. / Detection of microalbuminuria (MA) is commonly recommended by human clinicians to diagnose early renal disease in people presenting different diseases. When kidney disease has progressed to renal failure, albuminuria can reach higher levels (&gt;30 mg/dL), considering that stage as macroalbuminuria, which, in turn, eventually results in overt proteinuria. In veterinary medicine, no data related to what levels of albuminuria can be observed in dogs with chronic renal failure (CRF), as well as the degree of correlation with systemic hypertension, is available, being therefore, the scope of this study. Urinary albumin concentrations, detected by ELISA, were determined in 40 dogs with CRF and 40 healthy dogs (controls). Arterial pressures were registered for comparisons. Normalized albumin concentrations (NAC), urinary albumin to urinary creatinine ratio (UAC) and urinary protein to urinary creatinine ratio (UPC) were calculated for all dogs. All control dogs were below the microalbuminuric range for both parameters. In dogs with CRF, 42,5% and 65% were within the microalbuminuric range based on their AN and UAC values, respectively. A gradual increase in the level of UPC was followed by an also gradual increase in UAC values. Similarly, an increase in the UAC values was accompanied by an increase of the percentage of dogs with hypertension, which affected 87,5 % and 85.7% of the macroalbuminuric CRF dogs, according to their AN and RAC values, respectively. Finally, hypertensive CRF dogs (&gt;180 mmHg mean systolic pressure) had greater UAC values than normotensive CRF dogs (P = 0.023). Thus, for the first time in veterinary literature, it is shown that hypertension seems to exert an adverse effect on renal function of CRF dogs, similarly to what is observed in human medicine.