Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:24:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peroto_MariaClaudia_M.pdf: 1526611 bytes, checksum: 77aa753a6b4be729c0ff45854cf7bdcf (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A toxina citoletal distensora, CDT, é uma citotoxina termolábil identificada em um grande número de enteropatógenos, entre eles Escherichia coli. Os genes de CDT são designados de cdtA, cdtB e cdtC e estão arranjados em um operon e, até o momento, já foram descritos cinco diferentes alelos: I, II, III, IV e V. Cepas de Escherichia coli podem ser classificadas em quatro grupos filogenéticos ECOR: A, B1, B2 e D, nos quais as cepas pertencentes aos grupos A e B1 são consideradas comensais e patógenos oportunistas e as cepas agrupadas como B2 e D, como cepas patogênicas. Os objetivos deste trabalho foram relacionar os alelos da CDT e alguns fatores de virulência associados aos grupos filogenéticos ECOR e estudar três conjuntos de cepas por eletroforese de campo pulsado (PFGE). Foram utilizadas 80 cepas de E. coli cdt-positivas isoladas de suínos, bovinos, ovinos, humanos, água e carne. Os alelos da CDT e os grupos filogenéticos foram identificados através da reação de polimerase em cadeia (PCR). Vinte e cinco cepas dos sorotipos O91:H21, O113:H21 e O116:H21 foram estudadas por PFGE para avaliação da diversidade genética. Os resultados demonstraram que o alelo V da CDT foi o mais freqüente, presente em 45% das cepas, mostrando forte associação com VT2 (97%); o alelo III foi observado em 36,2% das cepas, mostrando associação com VT1 em 79,0% das cepas. O alelo I da CDT foi detectado em 8,7% das cepas e o alelo IV em 5,0% das cepas. No estudo filogenético, 45 cepas (56,0%) foram agrupadas em B1, 15 cepas em B2 (18,7%), 13 cepa em D (16,2%) e sete cepas em A (8,7%). Nos ensaios de PFGE foi possível identificar, entre as cepas de um mesmo sorotipo, desde clones até cepas não relacionadas entre si. Os dados obtidos permitem concluir que no conjunto de cepas estudado o alelo CDT-V está associado ao grupo filogenético B1 enquanto o alelo CDT-III está associado aos grupos B2 e D / Abstract: Cytolethal distending toxin, CDT, is a termolabile cytotoxin found in a great number of enteropathogens, including Escherichia coli. The CDT genes are called cdtA, cdtB and cdtC and they are placed in an operon and five alleles (I, II, III, IV and V) were described until the moment. E. coli strains may be classified in four ECOR phylogenetic groups: A, B1, B2 and D; strains belonging to A and B1 groups are called commensal or opportunist pathogens and strains grouped as B2 and D, as pathogenic strains. The goals of this work were to relate the CDT alleles and some virulence factors associated to four ECOR phylogenetic groups and analyze three strain sets by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). This study used 80 cdt-positive E. colistrains isolated from swines, bovines, ovines, humans, water and meat. CDT alleles and phylogenetic groups were identified using polymerase chain reaction (PCR). Twenty-five strains belonging to O91:H21, O113:H21 and O116:H21 serotypes were studied by PFGE for evaluation of genetic diversity. The results show that CDT-V was the most frequent allele, present in 45,0% of strains, and showing strong association with VT2 (97%); CDT-III was observed in 36,2% of strains, showing association with VT1 in 79,0% of strains. CDT-I was detected in 8,7% of strains and CDT-IV, in 5,0%. In the phylogenetic studies, 45 strains (56,0 %) was grouped in group B1, 15 strains (18,7%) was grouped in B2, D grouped 13 strains (16,2%) and the group A congregate 7 strains (8,7%). In PFGE studies it was possible to identify, in the same serotype, since clones until non-related strains. For the studied strains, data allows to conclude that CDT-V is associated to phylogenetic group B1 and CDT-III is associated to B2 and D groups / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Lucia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-11T09:19:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_IsisSerrano_D.pdf: 2225247 bytes, checksum: 9106b26119b1fee141fe2a577f21f1e9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A biodegradação de poluentes de petróleo em um solo contaminado foi acompanhada neste estudo, avaliando o comportamento da microbiota do solo durante a utilização de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) como fontes de carbono. Através da biomassa microbiana, da taxa de respiração no solo, bem como do quociente metabólico (eficiência em degradar os compostos recalcitrantes em questão), foi possível uma avaliação do impacto na microbiota nativa do solo contaminado e nos diferentes microcosmos bioaumentados com os consórcios de bactérias, fungos, e uma mistura destes consórcios por 12 semanas. Tanto a microbiota nativa quanto os solos bioaumentados demonstraram uma rápida resposta à adaptação neste ambiente contaminado pelo aumento da biomassa e das taxas metabólicas. Durante o período de biodegradação dos HPAs, valores de evolução de CO2 foram diminuindo e a biomassa se manteve em crescimento estável, indicando menos gasto de energia para os microrganismos sobreviverem neste solo impactado, como resposta à boa competitividade e eficiência da microbiota nativa e bioaumentada. A biodegradação dos HPAs e a presença de metabólitos intermediários foram também avaliados, apresentando uma rápida redução das concentrações dos HPAs de baixo peso molecular (menores que 4 anéis aromáticos) em comparação com os de alto peso molecular, devido à sua biodisponibilidade e alta atividade microbiana de degradação. Todavia, a bioaumentação não demonstrou ser melhor que a microbiota nativa na degradação dos HPAs. É provável que o mecanismo de cooperação metabólica por co-metabolismo tenha sido realizado pela comunidade do solo, uma vez que vários HPAs complexos foram degradados. Diversos estudos apontam a presença de HPAs de menor peso molecular e seus respectivos produtos como indutores da degradação dos HPAs de maior peso molecular. Os metabólitos intermediários produzidos foram assimilados pelos microrganismos em processo cooperativo no solo, sendo responsáveis pela indução de enzimas e suas respectivas vias degradativas. Os distúrbios causados no solo pela poluição com HPAs normalmente estimulam o crescimento de microrganismos capazes de sobreviver nestes compostos, causando mudanças na estrutura microbiana do solo devido às suas adaptações nos processos co-metabólicos para a manutenção da comunidade. Neste trabalho, um solo impactado com HPAs, estocado por vários anos sob refrigeração foi analisado quanto à habilidade da microbiota nativa em crescer em alguns HPAs, individualmente, ou ainda em mistura complexa. Perfis moleculares de microbiota foram observados pela técnica de PCR-DGGE utilizando fragmentos do gene RNA ribossômico 16S durante 4 semanas. O número de bandas observadas foi interpretado como os membros dominantes na comunidade, e os diferentes perfis mostraram diferentes dinâmicas de degradação dos HPAs em meio contendo ou não fatores essenciais de crescimento (micronutrientes e vitaminas). Espécies ativas metabolicamente mostraram-se predominantes na interação com a comunidade e na cooperação catabólica. Após enriquecimento do solo original por 6 meses, apenas duas bandas foram visulizadas em gel, correspondendo à duas colônias morfologicamente diferentes isoladas em meio ágar, sendo identificadas como sendo do gênero Pseudomona, mais provavelmente Pseudomonas stutzeri (98% de similaridade). Esta espécie possui alta capacidade de transformação natural no solo, gerando mutantes. Diferenças genéticas entre as colônias de P. stutzeri foram confirmadas por PFGE, as quais apresentaram bandas para os genes catabólicos nahA-dioxigenase, catecol-1,2 e 2,3-dioxigenases, responsáveis por codificar as respectivas enzimas atuantes nas principais vias metabólicas de degradação dos HPAs / Abstract: The biodegradation of petroleum derivatives in a contaminated soil was evaluated in this study monitoring the behavior of the soil microbiota when using polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as carbon sources. Analyzing C-biomass, respiration rates (CO2 evolution) and metabolic quotient (which means the efficiency in degrading PAHs), it was possible to evaluate the impact of the contaminated soil in the native microbiota and soil bioaugmented with bacterial and fungal consortia or a mixture of these consortia for 12 weeks in microcosms. Even the native microbiota or the bioaugmented soils performed a rapid response regarding to their adaptation into contaminated environment due to the increase of biomass and respiration rates. During the PAH biodegradation period, CO2 evolution values remained steady, indicating less loss of energy to the survival microorganism into the impacted soil, a good competitiveness, and also an efficiency of both native and bioaugmented populations. The biodegradation of PAHs and the production of metabolic intermediates were assessed, and low-molecular-weight (LMW) PAHs (less than 4 rings) had fast reduction in their concentrations comparing with the high-molecular-weight (HMW) PAHs, probably due to their bioavailability and the high microbial activity. Bioaugmentations were not better than native microbiota in the PAHs degradation performances, and it is believed that the cooperative mechanism under co-metabolism could be responsible for the degradation of HMW-PAHs. Metabolic intermediates were assimilated by microorganisms in a cooperative process, inducing some key-catabolic pathways enzymes. The pollution of soil by PAHs could stimulate the growth of organisms capable of surviving in the presence of these compounds, changing the soil microbial structure due a catabolic adaptation process. In this study, another PAH-impacted soil, collected from a manufacturing gas plant and stored for several years was analyzed regarding to the remained ability of the native microbiota to grow on individual PAHs or on its mixtures. Molecular profiles of the microbial community were observed using PCR-DGGE of the 16S rDNA fragment for 4 weeks. The number of bands was interpretated as dominant members into the community, and differences in profiles showed different PAH degradation dynamics in mineral medium with or without micronutrients and vitamins. Catabolically activated species were predominant in the community, and after several enrichment steps for 6 months, only two bands were observed in DGGE, corresponding to two colonies showing morphological differences, identified as Pseudomonas genus, very close to Pseudomonas stutzeri (98% of similarity). This specie has high capacity of natural transformation in soil, generating some mutants. Genetical differences were found between colonies using PFGE, and the presence of catabolic genes as nahA-dioxygenase, cathecol-1,2- and 2,3- dioxygenases were confirmed by PCR products in agarose gel electrophoreses / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

A avaliação das modificações no proteinograma do leite tem sido utilizada como meio de diagnóstico das mamites dos bovinos, pois, em decorrência dos processos inflamatórios na glândula mamária, ocorrem alterações, tanto na concentração dos componentes protéicos do leite, como também, surgimento de compostos protéicos não elaborados no processo de secreção láctea. A técnica de fracionamento protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida mostrou-se eficiente na detecção de pequenas quantidades de proteínas em fluídos orgânicos. As características das proteínas do leite de vacas sadias, e a avaliação de possíveis fatores de variabilidade foram determinadas em 139 amostras de leite de vacas. Os animais foram, inicialmente, submetidos a exame clínico geral e do úbere, complementado por exames físico-químicos, celulares e microbiológicos do leite, complementares ao diagnóstico das mamites. Do conjunto das amostras, 97 eram de vacas sadias, em plena lactação, sendo utilizadas para estabelecer valores padrões dos constituintes do leite de vacas sadias e avaliar a influência racial - Jersey e Gir; e do número de lactações - animais em primeira lactação, duas ou três lactações e, quatro ou mais lactações sobre o proteinograma lácteo. Além do mais a amostragem serviu de base para a avaliação da fase da lactação sobre o quadro protéico e, permitiram a formação de grupos experimentais para avaliação da influência do número de células somáticas, do isolamento bacteriano e do estado de saúde do úbere no proteinograma lácteo, obtido por eletroforese em gel de poliacrilamida. Os resultados demonstraram influência significativa de fatores raciais no teor de proteína total do soro lácteo, e de suas frações imunoglobulínica, α1-antitripsina, β-lactoglobulina, bem como de um conjunto de proteínas do soro lácteo separadas, mas não identificadas; influência do número de lactações no teor de albumina de origem plasmática, imunoglobulinas, β-lactoglobulina e α-lactoalbumina. A fase da lactação influenciou de forma significativa os teores de proteína total do leite, assim como nas frações protéicas do soro lácteo de vacas sadias, variações evidentes na fase colostral da lactação. O número de células somáticas influenciou o proteinograma do leite, apenas nas amostras com mais de 1.500.000 células somáticas/ml. Não foi demonstrada a influência significativa do isolamento bacteriano no proteinograma lácteo de vacas. Entretanto, observou-se significativa influência da mamite no proteinograma do leite de vacas, agindo, principalmente, nas proteínas não sintetizadas no ciclo fisiológico de secreção da glândula mamária. / The evaluation of the modifications in milk proteinogram is used as a diagnostic tool for bovine mastitis, once the inflammation of the mammary glands leads to changes in the concentration of milk proteic components, as well as the appearance of proteic components that are not elaborated in the milk secretion process. The technique of protein fractioning by electrophoresis in polyacrylamide gel is effective in detecting small amounts of proteins in organic fluids. The features of milk proteins of healthy cows and the evaluation of possible variability factors were determined in 139 cow milk samples. Animals were first submitted to general clinical examination and udder examination, and to physical-chemical, cellular and microbiological milk tests, complementary to mastitis diagnosis. Of the total samples, 97 were from healthy cows in full lactation, used to establish reference values for the components of healthy cow milk and to evaluate the influence of breed - Jersey and Gir, and number of lactations - first, two or three lactations, and four or more lactations on milk proteinogram. Additionally, sampling was useful as a base for the formation of experimental groups for evaluation of the influence of the number of somatic cells, bacterial isolation and health condition of the udder on milk proteinogram obtained by electrophoresis in polyacrylamide gel. Results showed a significant influence of breed related factors on the level of total protein and its fractions immunoglobulinic, α1-antitripsin, β-lactoglobulin in whey, as well as on the level of a group of separated but not identified whey proteins; influence of the number of lactations on the level of albumin of plasmatic origin, immunoglobulins, β-lactoglobulin and α-lactoalbumin. The lactation phase influenced the levels of milk serum protein significantly, as well as the proteic fractions of healthy cow milk serum, variation evident in the colostrum phase of lactation. The number of somatic cells influenced milk proteinogram only in samples with more than 1,500,000 somatic cells. No significant influence of bacterial isolation on milk proteinogram was demonstrated. However, a significant influence of mastitis on the proteinogram of cow milk was observed, affecting mostly those proteins not synthetized in the physiologic cycle of mammary gland secretion.

O boro e o cálcio são nutrientes essenciais para o desenvolvimento das plantas, entretanto existem poucos registros da atuação destes dois nutrientes de forma conjunta em organismos vegetais. Buscando identificar e quantificar as possíveis implicações do micro e macronutriente no desenvolvimento morfogenético de Eucalyptus urophylla, calos foram cultivados in vitro com diferentes concentrações de boro (0, 25, 50, 100 e 200 µM.L-1) e cálcio (0; 3,75; 7,50; 11,25 e 15 mM.L-1) sendo avaliados posteriormente quanto a morfologia externa, morfologia interna, tamanho, conteúdo de massa fresca e seca e variação das respostas bioquímicas para o teor de prolina, carboidratos não estruturais solúveis totais, proteína solúveis totais e eletroforese em gel de poliacrilamida. De maneira geral, pode-se verificar que nos dois períodos avaliados as concentrações combinadas de boro e cálcio interferiram em aspectos da morfologia interna que ocasionaram respostas diretas em aspectos visuais das estruturas calogênicas. Da mesma forma, os parâmetros bioquímicos avaliados sofreram a ação das interações nutricionais testadas, determinando a importância desta interação em mecanismos metabólicos, celulares e bioquímicos. / Boron and calcium are essential nutrients in a plant development, but there are few registers of the common action of these two nutrients in a vegetal organisms. In order to identify and to quantify the possible implications of the micro and macronutrient in the morphogenetic development of Eucalyptus urophylla, calluses were cultivated in vitro with different concentrations of boron (0, 25, 50, 100 and 200 µM.L-1) and calcium (0; 3,75; 7,50; 11,25 and 15 mM.L-1) and evaluated in relation to external and internal morphology, morphology, size, fresh and oven dry weight, and the variation of biochemical responses to proline, total non-structural soluble carbohydrates, total soluble proteins and eletrophoresys in poliacrilamida gel. In general, it could be verified that in two evaluation periods the combined concentrations of boron and calcium had intervened in aspects of the internal morphology that had caused direct answers in visual impact in visual aspects of the calluses. Similarly, the biochemical parameters evaluated had suffered action from the tested nutritional interactions, determining the importance of this interactions in metabolic, cellular and biochemical mechanisms.

A semente de milho representa uma importante fonte de proteínas para alimentação humana e de animais monogástricos. Porém, como membros da família dos cereais não apresentam proteínas com um balanço nutricional adequado, devido principalmente ao baixo conteúdo de lisina. As proteínas de reserva da semente de milho são classificadas como fração não-zeína (albumina, globulina e glutelina) e zeína. Mutantes de endosperma de milho, como o2 apresentam quantidades maiores de lisina na semente. Porém, muitos mutantes considerados “alta lisina” não foram ainda caracterizados bioquimicamente. Uma série de mutantes, opaco (o1, o2, o5, o7, o10, o11 e o13) e floury (fl1 e fl2), foram estudadas para determinar as quantidades de proteínas de reserva, o perfil electroforético das proteínas e o conteúdo de LYS na semente, endosperma e embrião. Foi observado que os mutantes apresentaram redução no conteúdo de zeína e aumentos da fração não-zeína com variações dependendo do mutante, do background genético e do tecido analisado. A análise da semente determinou aumentos principalmente da fração albumina e globulina nos mutantes, exceto para o5 com aumentos apenas da fração glutelina. No endosperma foi observado aumento principalmente de albumina em o2, o7 e o5; e globulina em fl2, o10, o11 e o13. No embrião foram registrados os níveis maiores de albumina e globulina da semente, porém a quantidade de proteínas de reserva foi similar entre os genótipos. As quantidades de lisina presentes nas frações protéicas foram sempre maiores nos mutantes, porém para o10, o11 e o13 diferenças significativas, foram observadas principalmente para LYS na fração glutelina. O perfil SDS-PAGE revelou a presença de numerosas bandas protéicas variando entre 100kDa e 10kDa, sendo que a fração não-zeína revelou maior heterogeneidade no número de bandas. Bandas protéicas de maior intensidade foram observadas nos mutantes. Análise 2D-PAGE de proteínas de reserva do endosperma de mutantes o1, o2, fl1 e fl2, revelou padrões similares de distribuição de proteínas, aumentos de intensidade de spots protéicos e a presença de spots restrita ao perfil dos mutantes. Os resultados sugerem que os mutantes opacos e floury avaliados apresentam quantidades maiores de LYS na semente quando comparados aos genótipos selvagens que lhes deram origem. A futura análise dos spots que apresentaram alterações altamente significativas permitirá uma maior compreensão dos efeitos específicos dessas mutações sobre a regulação da biossíntese das proteínas de reserva e do acúmulo de lisina no grão. / The maize seed is an important source of proteins for humans and monogastric animals. However, such as all cereals, maize storage proteins is nutritionally poor mainly due to the low content of lysine. Maize seed storage proteins can be classified as non-zeins (albumins, globulins and glutelins) and zein. Some storage proteins mutants such as the o2 mutants exhibit higher contents of lysine. However, many of these high-lysine mutants have not yet been biochemically characterized. The opaque mutants o1, o2, o5, o7, o10, o11, o13 and floury mutants fl1 and fl2 were analyzed for storage proteins contents, eletrophoretic profile and lysine content in the seeds, endosperm, and embryo. It was observed that the mutants exhibited reduction in the zein fraction and increase in the non-zein fraction which varied according to the mutant, genetic background and tissue analyzed. The whole seed analysis revealed increases mainly in albumins and globulins, with the exception of the o5 mutants which exhibited a higher increase in the glutelin fraction. In the endosperm it was observed increase in the albumin fraction in o2, o7 and o5 and in the globulin fraction in fl2, o10 and o13. Higher concentrations of albumin and globulin were observed in the embryo, but with similar concentrations of total proteins among the mutants. The lysine content was higher always higher in the storage proteins of the mutants, however, in o10, o11 and o13 significant differences for lysine content were observed mainly in the glutelin fraction. SDSPAGE analysis revealed the presence of several band varying from 10kDa to 100kDa, with a higher heterogeneity among the non-zein fraction. Bands with higher intensity have been observed in the mutants. 2D-PAGE analysis revealed that the o1, o2, fl1 and fl2 mutants exhibited similar band patterns with increases in similar spots and mutant specific bands. The results suggest that the opaque and floury mutants exhibited higher lysine content when compared to their respective wild-type counterparts. Future analysis of the protein spots that exhibited significant variations will allow a better understanding of the specific effects of each mutation on the regulation of storage protein synthesis and lysine accumulation in the seeds.

A imunidade passiva surge como uma alternativa para a manipulação da fermentação ruminal e anticorpos de origem aviária contra bactérias específicas começam a ser pesquisados. Objetivou-se com este trabalho avaliar um preparado de anticorpos policlonais contra Streptococus bovis, Fusobacterium necrophorum e algumas cepas de bactérias proteolíticas (Peptostreptococcus anacrobius, Clostridium aminophilum e Clostridium sticklandii) sobre a diversidade microbiana ruminal e degradabilidade in situ de alguns alimentos. Foram utilizadas nove vacas mestiças portadoras de cânula ruminal. O delineamento experimental foi o quadrado latino 3 x 3 replicado 3 vezes, com arranjo fatorial de tratamentos 3 x 3 referente a 2 modificadores ruminais representados pela monensina (MON) e pelo preparado de anticorpos policlonais (PAP) mais o grupo controle e 3 fontes energéticas suplementadas na dieta, representadas pelo milho seco moído (MSM), silagem de grão úmido de milho (SGUM) e polpa cítrica (PC). Cada subperíodo experimental foi composto de 21 dias, sendo 16 dias para adaptação aos tratamentos e 5 para coleta de dados. A degradabilidade in situ dos alimentos testados foi mensurada através da técnica de saco de náilon. A coleta de amostras para a análise quantitativa de protozoários ocorreu no 21° dia de cada período, às 0 e 4 horas pós-alimentação, sendo estas coletadas por varredura do assoalho ruminal. O conteúdo ruminal foi coletado no 21° dia de cada período, às 4 h pós-alimentação, para análise da diversidade microbiana através de técnica de eletroforese em gel com gradiente de desnaturação. Observou-se que dietas contendo PC apresentaram aumento de 80,6%; 75,4% e 66,8% da degradabilidade efetiva da FDN da cana-de-açúcar para as taxas de passagem de 2, 5, 8%/h, respectivamente, em relação ao grupo tratado com SGUM, mas não em relação ao grupo com MSM. O tratamento com PAP demonstrou efeito sobre a fração solúvel (a) do amido do MSM, diminuindo esta em 45,26% e 45,37% em relação ao grupo CON e grupo MON, respectivamente. Observou-se que o tratamento com MON diminuiu em 16,14% o valor da fração potencialmente degradável (b) da MS da SGUM em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo tratado com PAP. Já sobre a taxa de degradação (c), a MON aumentou o valor desta em 63,18% e 60,65% em relação ao grupo CON e PAP, respectivamente. Também a MON diminuiu a degradabilidade potencial (Dp) da MS da SGUM em 3,40% em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo tratado com PAP. Observou-se que o PAP aumentou em 93,65% a contagem relativa de Isotricha em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo MON. Já a PC aumentou em 334,42% (0h) e 399,75% (4h) a contagem relativa de protozoários do gênero Isotricha em relação às dietas de MSM e SGUM. Observou-se que o tratamento com PC aumentou em 52% a contagem do número de bandas em DGGE para a comunidade Archaea, em relação ao grupo MSM, sem diferir do grupo SGUM. Em linhas gerais, no presente experimento, não foi possível atribuir um padrão na estrutura de amplificação das comunidades Bacteria ou Archaea do conteúdo ruminal de animais tratados com dois diferentes modificadores ruminais ou 3 fontes energéticas distintas. / Passive immunity arises as an alternative for ruminal fermentation manipulation and aviary antibodies against specific bacteria starts to be studied. The objective of the present study was to evaluate a polyclonal antibody preparation (PAP) against Streptococus bovis, Fusobacterium necrophorum and some proteolytic bacteria (Peptostreptococcus anacrobius, Clostridium aminophilum and Clostridium sticklandii) on ruminal microbial community diversity and in situ degradability of some feedstuffs. Nine ruminally fistulated cows were used in a latin square 3 x 3 replicated 3 times with factorial arrangement of treatments 3 x 3 regarding to two rumen modifiers [monensin (MON) and (PAP) plus a control group (CON)] and three energetic sources supplemented in the diet represented by the dry-grounded corn grain (CG), high moisture corn silage (HMCS) and citrus pulp (CiPu). Each trial lasted 21 days where 16 days were for treatments adaptation and 5 for data collection. In situ degradability of the experimental diets was measured by nylon bag in situ technique. The collection of samples for quantitative protozoa analysis occurred on day 21 of each trial at 0 and 4 h after feeding by scanning the ruminal floor. The ruminal content was collected in the day 21 of each trial at 0 and 4 h after feeding for the analysis of microbial ruminal diversity by the denaturing gradient gel electrophoresis. Diets with CiPu presented an increase of 80.6%; 75.4% and 66.8% in effective degradability of NDF of sugar cane for outflow rates of 0.02, 0.05, 0.08/h, respectively, in relation to group treated with HMCS but not to the group CG. The group treated with PAP showed effect on soluble fraction (a) of starch of CG decreasing it in 45.26% and 45.37% in relation to CON and MON group respectively. It was observed that the treatment with MON decreased in 16.14% the value of potentially soluble fraction (b) of DM from HMCS in relation to CON group but not in relation to PAP. For the degradation rate (c) the MON increased it values in 63.18% and 60.65% in relation to CON and PAP group respectively. Also, MON treatment decreased potential degradability (Pd) of DM of HMCS in 3.40% in relation to CON group but not to PAP. It was observed that PAP treatment increased in 93.65% the relative counting of Isotricha in relation to CON group but not in relation to MON group. It was observed that CiPu diet increased in 334.42% (0h) and 399.75% (4h) the relative counting of Isotricha in relation to CG and HMCS. It was observed that CiPu increased in 52% the counting of the numbers of bands in DGGE for Archaea community in relation to CG without difference to HMCS group. In general lines, in the present experiment, it was not possible to assign that there was a pattern in the structures of amplification by Bacteria and Archaea communities of the ruminal content of animals treated with two different rumen modifiers or three distinct energetic sources.

O trabalho teve por objetivo avaliar fatores associados à ensilagem da cana-deaçúcar, com destaque para a aplicação de aditivos químicos e microbianos sobre a dinâmica fermentativa, composição bromatológica, atividade da álcool desidrogenase e desenvolvimento e diversidade da micloflora em silagens de cana-de-açúcar. No ensaio conduzido durante 110 dias o delineamento experimental adotado foi o inteiramente ao acaso, com 4 tratamentos, 2 repetições, e seis épocas de abertura (1, 3, 7, 15, 35, 110 dias). Os tratamentos foram: uréia 1% MV e os inoculantes microbianos Lactobacillus buchneri (3,65x105 ufc/g da MV) e a combinação de bactérias Pedioccocus pentosassus e Lactobacillus buchneri (1x106 ufc/g MV). As maiores variações na composição bromatológica e perdas de MS, das silagens controle ocorreram dos 7 aos 15 dias, estabilizando após esse período. As regressões ajustadas para perdas de MS e carboidratos solúveis foram bem similares e de forma contrária ao acúmulo de FDN. As perdas por gases alcançaram valores de 28,27%, de carboidratos solúveis em apenas 2,98% e FDN em torno de 67,77% da MS. Os aumentos nos teores de etanol e perda na digestibilidade nas silagens controle se extenderam até o 35º dia, com valores máximos de etanol de 12,23%. Foi possível relacionar etanol com a digestibilidade mostrando que cada 1% de aumento nos teores de etanol, 2 unidades de digestibilidade foram perdidas. Os aditivos uréia e o aditivo Lactobacillus buchneri mais Pediococcus foram eficazes em diminuir a produção de etanol (2,75 e 1,30 vs 8,27% no tratamento controle), em diminuir perdas de MS em 47 e 60%, e de carboidratos soluveis em 22 e 56% em relação à silagem controle, respectivamente. As silagens aditivadas com uréia obtiveram maiores valores de pH e maiores valores de ácido lático em relação às silagen controle. As silagens aditivadas com L. buchneri apenas foram as de maiores produções de etanol, acima da silagem controle (11.53 vs 8.27%), além de grandes perdas de matéria seca e baixa digestibilidade pelo acúmulo de FDN, comparáveis às silagens controle. A diferença entre aditivos na composição químico-bromatológica e perdas ocorreu após 7 dias de fermentação. Os dados apresentados pelos aditivos uréia e L. buchneri mais Pediococcus foram ajustados em curvas simples, através de modelos lineares, para descrever e predizer as variações durante a ensilagem. Os tratamentos controle e a aditivação com L. buchneri apenas, pelas altas taxas fermentativas, observaram melhor ajuste dos dados em polinômios de segundo e terceiro grau. Apesar dos altos teores de ácido acético em todas as silagens, principalmente nas silagens aditivadas com a combinação de bactérias, não foram verificadas efeitos deste sobre a população de leveduras. Os teores obtidos de ácido lático e ácido propiônico e a relação entre esses ácidos e o ácido acético, durante a fermentação, conseguiu explicar parte do sucesso dos tratamentos uréia e L. buchneri mais Pediococcus na redução da atividade da enzima álcool desidrogenase e na producão de etanol. A análise de grupamentos hieráquicos mostrou que os aditivos alteraram a diversidade bacteriana durante a ensilagem. / The present trial aimed to study the ensiling associated factors of sugarcane focusing on chemical and microbial additives on fermentation, chemical composition, enzymatic activity of alcohol dehydrogenase and the microflora development and diversity in sugarcane silages. A complete randomized design was set to a 110-d trial with 4 treatments, two replications within 6 opening dates (1, 3, 7, 15, 35, 110-d). Treatments were described as follows: urea 1% (wet basis), Lactobacillus buchneri (3.65x105 cfu/g of forage), a combination of Pediococus pentosassus and Lactobacillus buchneri (1x106). Major variation observed on the chemical composition and the DM losses in sugarcane silages without additives took place from the day 7 through the day 15. Losses of DM and soluble carbohydrates showed similar trend and in opposition to the NDF increase. Gases losses averaged 28.27%, while the soluble carbohydrates and NDF contents reached respectively, 2.98% and 67.77% when fermentation was stabilized. Conversely, ethanol and the digestibility were changed across the storage period up to the day 35, with ethanol content increasing to 12.23%. 1% of ethanol increase was associated with 2 percentage units of digestibility decrease. Both urea and the combination of microorganisms were effective in decrease the ethanol content (2.75, 1.30 vs 8.27% - without additives), decrease DM losses (47 and 60%) and reduce soluble carbohydrates losses (22 and 56%) when compared to the control treatment. The urea treated silages showed higher pH and lactic acid values. The L. buchneri treatment led to higher ethanol content (11.23 vs 8.27%) compared to the control, resulting in low DM recovery rate, higher losses and decreased digestibility as well as the silages without additives. The major changes on the chemical composition were noticed after the day 7 of fermentation. For the addition of urea and the combination of microorganisms L. buchneri and Pediococcus the variation was better described by linear equations whereas quadratic and cubic effects were more suitable for fitting the data from the control and the L. buchneri added silages. Even tough all silages has shown high acetic acid contents, mainly the combination of lactic bacteria, no significant effects were observed upon the yeast counts. However, the levels of lactic acid and propionic acid and the ratio of both over the acetic acid content were related to the decrease on the activity of the alcohol dehydrogenase enzyme and, furthermore, on the ethanol content of the silages. The cluster analysis based on molecular evaluation demonstrated a change promoted over the bacterial population mediated by the additives applied during the ensiling of sugarcane.

Os amarelos estão associados a fitoplasmas, procariotos pertencentes à classe Mollicutes que não possuem parede celular e habitam o floema de plantas. Os danos causados pelas doenças de etiologia fitoplasmática são relevantes e podem ocorrer em diversas espécies economicamente importantes. Em videira, pesquisas realizadas em várias partes do mundo têm relatado a presença das doenças do tipo "amarelo", porém, no Brasil, estas doenças ainda não foram relatadas para esta cultura. Em vinhedos comerciais localizados nos Estados de São Paulo e Paraná têm sido observadas plantas com sintomas semelhantes àqueles provocados por fitoplasmas em outros países. Estes sintomas têm sido caracterizados por amarelecimento e ou avermelhamento foliar, necrose do limbo e rachaduras nas nervuras principais. Com o objetivo de detectar e identificar molecularmente fitoplasmas associados a estes tipos de sintomas, folhas e ramos foram amostrados a partir de plantas sintomática e assintomáticas. A detecção foi conduzida com PCR duplo usando-se os iniciadores R16 mF1/mR2 ou P1/P7 na primeira reação e R16 F2n/R2 na segunda reação. A identificação foi realizada através de PCR duplo com iniciadores específicos e análises de RFLP com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, HinfI e MboI. Em 23 plantas amostradas, fitoplasmas foram detectados em 10 delas, através da amplificação do 16S rDNA, visualizado em gel de agarose na forma de bandas de 1,2Kb. A identificação por PCR demonstrou que os fitoplasmas associados ao amarelo da videira pertenciam aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises dos perfis eletroforéticos obtidos com o uso da técnica de RFLP revelaram a presença de fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrI-B. A constatação de fitoplasmas pertencentes a estes dois grupos nas plantas amostradas demonstraram a ocorrência da doença conhecida como amarelo da videira nos Estados de São Paulo e Paraná. As pesquisas desenvolvidas neste trabalho vêm contribuir para aumentar os conhecimentos sobre o papel e a diversidade dos fitoplasmas no agroecossistema brasileiro. / Yellows diseases are associated with phytoplasmas, wall-less prokaryotes, inhabitant of phloem vessels. Damage caused by these diseases are relevant for some important cultivated botanical species. Grapevine yellows diseases have been observed in several areas of the world, but in Brazil the presence of these diseases had not been reported yet. In vineyards located in São Paulo and Paraná States, plants exhibiting symptoms similar those observed in grapevines from other countries have been observed. The symptoms were characterized by yellowing or redding of leaf blade and ribs, leaf blade necrosis and main ribs fissures. In order to detect and identify phytoplasmas associated with those kind of symptoms, leaves and stems were sampled from symptomatic and asymptomatic plants. The phytoplasma detection was conducted with nested PCR using the primer pairs R16mF1/mR2 or P1/P7 for first reaction and 16 F2n/R2 for second reaction. The identification was carried out by nested PCR with group-specifc primer pairs and RFLP analyses with enzymes AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, HinfI and MboI. From a total of 23 samples analysed, phytoplasmas were detected in 10 of them, through amplification of the 16S rDNA, visualized through a 1.2Kb band in agarose gel. The identification by PCR demonstrated that phytoplasmas associated with grapevine yellow belong to 16SrI and 16SrIII groups. Analyses of electrophoretic profiles revealed the presence of phytoplasmas affiliated to 16SrI-B subgroup. The presence of phytoplasmas belonging to these two groups in the sampled plants demonstrated the occurrence of yellow disease in grapevine in São Paulo and Paraná States. The investigation conducted in the present work contributed to the knowledgement of the role and the diversity of phytoplasmas in Brasilian ecosystem.

A Doença Reumática Cardíaca (DRC) é uma séria complicação de orofaringite causada por determinados sorotipos de Streptococcus pyogenes não tratada adequadamente em indivíduos suscetíveis. É um grande problema de saúde pública, principalmente nos países não desenvolvidos e em desenvolvimento, como Brasil, Índia, países da África, regiões de população aborígine da Austrália, e Egito. É altamente debilitante e com alta taxa de mortalidade devido ao comprometimento cardíaco. As lesões miocárdicas iniciais regridem, mas as lesões valvares, principalmente a mitral e a aórtica, são irreversíveis e progressivas. Muitos estudos já caracterizaram a resposta imune celular (linfócitos T) e humoral nos indivíduos acometidos pela doença. Mimetismo molecular e espalhamento de epítopo são os principais mecanismos que se pensa estar envolvidos na patogênese da DRC. Avaliamos, nesta pesquisa, o perfil de expressão proteica em valvas mitrais de indivíduos acometidos por DRC. Para detectar alterações específicas desta doença, comparamos as expressões de proteínas nos grupos portadores de DRC com insuficiência (DRC-INS) e com estenose (DRC-EST) a um grupo de indivíduos com degeneração mixomatosa de valva mitral (DMX) e outro sem valvulopatias (CTL). Alterações especificamente observadas em tecido mitral na DRC-INS ou DRC-EST em fases avançadas da doença podem explicar o mecanismo de desenvolvimento desses dois tipos de lesão. Foram encontradas 25 \"spots\", correpondendo a 29 proteínas diferencialmente expressas nos grupos com valvulopatias, refletindo principalmente alterações na matriz extracelular. Encontramos importante clivagem diferencial da vimentina, cuja proteína íntegra possui 54 kDa, formando fragmentos com ~40 e ~45 kDa, aumentados na DRC, principalmente na DRC-INS. O colágeno do tipo VI, com aproximadamente 95 kDa, encontrou-se com expressão diminuída exclusivamente no grupo DRC-INS. A Vitronectina foi encontrou-se aumentada em na DMX e na DRC-EST, em relação ao grupo controle, principalmente na DRC-EST. Lumican, por sua vez, teve expressão diminuída na DMX e na DRC-EST, apesar de possuir um único \"spot\" com expressão aumentada na DRC. Utilizando métodos de análise de padrões de expressão protéica in silico foram identificados conjuntos de proteínas capazes de discriminar as amostras de valva mitral por etiologia da doença. O presente trabalho pode auxiliar na elucidação dos mecanismos de desenvolvimento da doença e de alterações estruturais do tecido mitral em resposta às lesões autoimunes, bem como no diagnósticoda DRC. / Rheumatic Heart Disease (RHD) is a serious complication of oropharingitis caused by some serotypes of Streptococcus pyogenes not properly treated in susceptible individuals. It is a public health concern, mainly for undeveloped and developing countries, such as Brazil, India, some countries in Africa, aboriginal regions in Australia, and Egypt. It is highly debilitating with a high mortality rate due to cardiac commitment. Initial myocardial lesions disappear, but valvar lesions, mainly mitral and aortic, are irreversible and progressive. Many studies have characterized cellular (T lymphocytes) and humoral responses in individuals affected by the disease. Molecular mimicry and epitope spreading are the main mechanisms thought to be involved in the pathogenesis of RHD. We evaluated, in this research, the profile of protein expression in mitral valves from individuals affected by RHD. To detect alterations specific of this disease, we compared protein expression in the group of RHD with regurgitation (RHD-RGT) and stenosis (RHD-STN) to a group of individuals with mitral valve myxomatous degeneration (MXD) and another group without valvulopathies (CTL). Alterations specifically observed in the mitral tissue of RHD-RGT and RHD-STN in advanced stages of the disease can explain the mechanism of development for these two kinds of lesions. Twenty-five spots, corresponding to 29 proteins were found to be differentially expressed in the valvulopathy groups, reflecting mainly alterations in extracellular matrix. We found important differential cleavage of vimentin, the whole protein having 54 kDa, in fragments with ~40 and ~45 kDa, increased in RHD, mainly in RHD-RGT. Collagen type-VI, with approximatelly 95 kDa, was found to have decreased expression exclusivelly in the RHD-RGT group. Increased expression of Vitronectin was detected in DMX and RHD-EST groups, compared to the CTL group, mainly in the RHD-STN. Lumican, in turn, had decreased expression in the MXD and RHD-STN groups. By using in silico methods for analysis of patterns of protein expression, we identified sets of proteins capable of discriminating mitral valve samples by disease etiology. The present study might help elucidating the mechanisms of disease development and structural alterations in the mitral tissue in response to the autoimmune lesions, as well as in the diagnosis of RHD.

Orientador: Antonio Carlos Cicogna / Resumo: A obesidade é uma doença metabólica complexa considerada uma pandemia global e associada à alta incidência de doença cardiovascular. O excesso de tecido adiposo pode promover mal adaptação que resulta em alterações na estrutura e função do coração; no entanto, os mecanismos não estão totalmente elucidados. A proteômica pode fornecer uma compreensão mais profunda do processo fisiopatológico e contribuir para a identificação de novos potenciais alvos terapêuticos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão proteica miocárdica em ratos saudáveis e obesos por dieta Ocidental, empregando duas abordagens proteômicas, para melhor compreender a rede de mecanismos inerentes à disfunção cardíaca na obesidade. Ratos Wistar foram distribuídos em dois grupos: controle (C, n = 13; dieta controle) e obeso (Ob, n = 13; dieta Ocidental) alimentados por 41 semanas. A obesidade foi determinada pelo índice de adiposidade. A função cardíaca foi avaliada pelo ecocardiograma e análise do músculo papilar isolado. A proteômica foi baseada em eletroforese em gel bidimensional (2-DE) juntamente com espectrometria de massa (LC-MS/MS) e cromatografia-líquida em nanofluxo com espectrometria de massa em tandem (nanoLC-MS/MS) seguida de quantificação label-free. Ratos obesos apresentaram aumento do índice de adiposidade e disfunção cardíaca sistólica e diastólica comparados aos controles. Um total de 82 proteínas miocárdicas foram identificadas como diferencialmente expressas entre os grupos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Obesity is a complex metabolic disease considered a global pandemic and associated with high incidence of cardiovascular disease. The excess of adipose tissue may promotes maladaptation that result in alterations in structure and function of the heart; however, the mechanisms are not fully elucidated. Proteomics may provide a deeper understanding into the pathophysiological process and contribute to the identification of new potential therapeutic targets. Thus, the aim of this was evaluate the myocardial protein expression in healthy and obese rats, employing two proteomic approaches to better comprehend the network of mechanisms inherent to cardiac dysfunction in obesity. Male Wistar rats were distributed into two groups: control (C, n=13; standard diet) and obese (Ob, n=13; Western diet) fed for 41 weeks. The obesity was determined by adipose index. Cardiac function was evaluated by echocardiogram and isolated papillary muscle analysis. The proteomics was based on two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) along with mass spectrometry identification (LC-MS/MS) and nano-liquid chromatography with tandem mass spectrometry (nanoLC-MS/MS) followed by label-free quantification. Obese rats showed increased adiposity index and systolic and diastolic cardiac dysfunction. A total of 82 myocardial proteins was identified as differentially expressed between C and Ob groups using two proteomic strategies, being 43 up- and 39 down-regulated by obesity. These proteins are involved in imp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor