Recentemente, pesquisas vêm claramente demonstrando que xenobióticos podem apresentar efeitos deletérios sobre o sistema endócrino e passam a ser de grande importância toxicológica à medida que se tornam contaminantes ambientais. Tais substâncias passaram a ser denominadas de desreguladores endócrinos (DEs). Entre os diferentes DEs identificados, muitos são praguicidas, amplamente utilizados no meio agropecuário em todo o mundo. Atualmente, já são bem estabelecidas as metodologias para avaliação do potencial efeito DE de diferentes substâncias em roedores; porém uma busca na literatura deixa clara a falta de estudos e de protocolos para avaliação de DEs em animais de produção ruminantes, os quais certamente estão expostos a um grande número de agentes tóxicos com estas características. Assim, foi objetivo desta pesquisa dar início ao desenvolvimento de um protocolo para avaliação de efeitos DEs de xenobióticos em ruminantes. Para tal, estudou-se o bisfenol A (BPA), o qual é, classicamente, um DE para roedores. Além disto, avaliou-se o potencial efeito DE da I. carnea, uma planta tóxica de grande importância para ruminantes no Brasil e em outros países. O estudo foi realizado em duas etapas, na primeira avaliou-se os efeitos do BPA e da planta nos caprinos machos púberes; na segunda etapa propôs-se avaliar os efeitos tóxicos da exposição in utero de caprinos machos púberes a estas mesmas substâncias. Os resultados obtidos mostraram que os bodes púberes expostos ao BPA apresentaram redução significante dos níveis séricos de tiroxina, e da qualidade espermática. Também observou-se nestes mesmos animais degeneração vacuolar na rete testis. Já os caprinos machos púberes que receberam a I. carnea apresentaram aumento significante do numero de espermatozoides com alterações morfológicas e degeneração vacuolar testicular. Ainda, estes mesmos animais apresentaram diminuição estatisticamente significante dos níveis séricos dos hormônios tireoidianos (T3 e T4). O protocolo empregado para avaliação dos efeitos da exposição in utero a I. carnea ou ao BPA em machos púberes, não evidenciou nenhuma alteração hormonal e/ou reprodutiva. Conclui-se que o protocolo empregado para avaliação de possíveis efeitos DEs de xenobióticos, em ruminantes foi eficaz, no entanto, futuras metodologias deverão ser introduzidas neste protocolo, para detectar alterações mais sutis no sistema endócrino. / Recently, many studies clearly showed that xenobiotics may have deleterious effects on the endocrine system. These substances are termed endocrine disruptors (EDs), and have great toxicological significance when they become environmental contaminants. Many of EDs are identified as pesticides, which were widely used in agriculture and livestock worldwide. Currently, there are already well-established methodologies for assessing the potential effect of endocrine disruptor (ED) of different substances in rodents; however, a literature search shows clearly the lack of studies and protocols for assessing EDs in ruminant livestock, which are indubitably exposed to a large number of these substances. Thus, the objective of the present research was to start developing a protocol for evaluation of possible effects of EDs in ruminants. For this, it was studied bisphenol A (BPA), a classic ED and also I. carnea, an important toxic plant to ruminants in Brazil and other countries. The study was conducted in two stages, in the first, it was evaluated the effects of BPA and I. carnea in pubescent male goats, and in the second stage it was studied the effects in pubescent male goats from mothers exposed, during pregnancy, to BPA or the toxic plant. The pubescent male goats treated with BPA showed significant reduction in serum thyroxine levels and in the sperm quality. Those animals also presented vacuolar degeneration in the rete testis. Pubescent male goats exposed to I. carnea showed many alterations: significant increase in morphological changes in the sperm, decrease in serum levels of thyroid hormones (T3 and T4) and testicular vacuolar degeneration. The used protocol for evaluation of the effects of in utero exposure to BPA or I. carnea in pubescent male goats showed no hormonal or reproductive changes in male goats evaluated at the puberty. In conclusion, the protocol used in the present study showed to be worthy to evaluate EDs effects in ruminants; however future methodologies should be introduced to detect more subtle changes in the endocrine system.

A água constitui um dos compostos de maior distribuição e importância na crosta terrestre. Sua importância para vida está no fato de que nenhum processo metabólico ocorre sem a sua ação direta ou indireta. Entre os vários compostos contaminantes dos ambientes aquáticos, os hormônios, estrógenos naturais e sintéticos, devem ser vistos com uma maior importância, devido a sua persistência no ambiente. O 17α-etinilestradiol (EE2) é um hormônio sintético utilizado na formulação de contraceptivos orais, transdérmico e injetáveis. O presente estudo tem como objetivo analisar o efeito do hormônio sintético 17α-etinilestradiol sobre a biologia do invertebrado aquático Chironomus sancticaroli analisando três gerações do ciclo de vida da espécie. Nos experimentos foram utilizados areia fina comum (lavada em água corrente, seca em estufa a 60ºC e levada a mufla por 4 horas a 560ºC) e água deionizada (condutividade entre 25-55 μS.cm-1, dureza entre 12 e 16 mg.L-1 para CaCO3, pH entre 6,5 a 7,5). Foram realizadas 4 réplicas utilizando-se potes de 2 litros para cada concentração do hormônio e para o controle. Para os testes, foram colocadas 15 larvas, contendo 60 g de areia de cultivo e 240 ml de solução contendo 17α-etinilestradiol (na proporção 1:4, sedimento-solução) nas concentrações de 50; 100; 200; 400; 800 e 1600 μg.L-1, e fotoperíodo de 12h luz/ 12 h escuro e com temperatura de 22 a 26ºC. Os testes agudos foram realizados utilizando-se larvas de IV ínstar sem aeração e os testes crônicos foram realizados utilizando-se larvas de I ínstar com aeração. Os organismos foram alimentados com 5 ml de uma solução contendo 1 litro de água deionizada e 5,0 g de ração para peixe triturada (TetraMin®). O teste realizado foi estático, ou seja, a solução não era trocada do início ao fim do teste de cada geração F1, F2 e F3. Em testes agudos (96h) os resultados mostraram que o composto em estudo não apresenta toxicidade. Nos testes crônicos apenas a terceira geração mostrou uma baixa sobrevivência (43,3 a 56,6%) indicando toxicidade do composto ao organismo-teste, o que foi confirmado pelo teste ANOVA one-way com p ≤ 0,05. O tempo de emergência do organismo na terceira geração foi de 22 dias, havendo um atraso de cinco dias em comparação aos demais tratamentos, indicando que o composto testado pode influenciar no tempo de desenvolvimento do organismo-teste. Na análise da fecundidade potencial, os testes estatísticos indicaram haver uma diferença significativa entre os tratamentos e o controle somente na terceira geração, o que se pode inferir que o composto testado interfere na fecundidade potencial do Chironomus sancticaroli. Não foram encontradas deformidades bucais nas larvas nas três gerações analisadas. Para tanto, faz-se necessários estudos posteriores, visando um número maior de organismos (n ≥ 100) em um número maior de gerações, para que os resultados sejam mais conclusivos no que diz respeito a interferência do composto testado sobre a biologia do Chironomus sancticaroli. / Water is one of the compounds of great distribution and importance in the Earth\'s. Its importance to life lies in the fact that no metabolic process occurs without its direct or indirect action. Among the various contaminating compounds in aquatic environments, hormones, natural and synthetic estrogens, should be viewed with great importance because of their persistence in the environment. 17α-ethinylestradiol (EE2) is a synthetic hormone used in the formulation of oral, transdermal, and injectable contraceptives. The present study aims to analyze the effect of the synthetic hormone 17α-ethinylestradiol on the biology of the aquatic invertebrate Chironomus sancticaroli analyzing three generations of life cycle. In the experiments, common fine sand was used (washed with deionized water, oven dried at 60ºC and muffled for 4 hours at 560ºC) and deionized water (conductivity between 25-55 μS.cm-1, hardness between 12 and 16 mg.L-1 for CaCO3, and pH between 6.5 to 7.5). Four replicates were performed using 2-liter pots for each concentration of the hormone and for the control. For the tests, 15 larvae, containing 60 g of sand and 240 ml of solution containing 17α- ethinylestradiol (1:4, sediment solution) in the concentrations of 50; 100; 200; 400; 800 and 1600 μg.L-1, and photoperiod of 12h light/12h dark and with a temperature of 22 to 26ºC. The acute tests were performed using III larvae instar without aeration and the chronic tests were performed using I instar larvae with aeration. The organisms were fed with 5 ml of a solution containing 1 liter of deionized water and 5.0 g of crushed fish feed (TetraMin®). The test performed was static, were the solution was not changed from the beginning to the end of the test of each F1, F2 and F3 generation. In acute tests (96h) the results showed that the compound under study shows no toxicity. In chronic tests only the third generation showed a low survival (43.3 to 56.6%) indicating toxicity to the test organism, which was confirmed by the one-way ANOVA test with p ≤ 0.05. The adult emergency of the organism in the third generation was of 22 days, with a delay of five days in comparison to the other treatments, indicating that the compound tested influences development. In the analysis of potential fecundity, the statistical tests indicated that there was a significant difference between the treatments and the control only in the third generation, which can be inferred that the tested compound interferes in the potential fecundity of Chironomus sancticaroli. No oral deformities were found in the larvae in the three generations analyzed. In order to do so, further studies are required, aiming at a larger number of organisms (n ≥ 100) in a larger number of generations, so that the results are more conclusive with respect to the interference of the tested compound on the biology of Chironomus sancticaroli.

Orientador: Wilson de Figueiredo Jardim / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T09:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo_CassianaCarolinaMontagner_M.pdf: 1395698 bytes, checksum: 81a15a7f6c1a1ec5477dea329e604067 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Alguns compostos orgânicos denominados interferentes endócrinos estão sendo encontrados em águas superficiais e vêm chamando a atenção da comunidade científica. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormônios (17b-estradiol, 17a-etinilestradiol, estrona, progesterona, levonorgestrel), os plastificantes (dietilftalato e dibutilfatalato), os surfactantes (4-nonilfenol e 4-octilfenol) e o bisfenol A. Além disso, alguns produtos farmacêuticos, tais como paracetamol, ácido acetil salicílico, diclofenaco e ibuprofeno, também têm sido encontrados em diversos compartimentos ambientais. Considerando o estado de degradação das águas superficiais do Estado de São Paulo, em especial os rios da bacia do Atibaia responsável pelo abastecimento público da RMC, essa dissertação apresenta uma avaliação da ocorrência dos 14 compostos citados acima, alem da cafeína que foi usada como traçador de atividade antrópica, nos corpos d'água dessa região. A determinação foi baseada em métodos já estabelecidos, os quais foram convalidados e, envolveram as etapas de extração e concentração de 1 L de amostra usando SPE e análise por HPLC empregando os detectores de DAD e fluorescência. Foram realizadas quatro campanhas amostrais no período entre fevereiro de 2006 e janeiro de 2007 sendo duas no período de alta pluviosidade e duas no período de estiagem. Dos 15 compostos determinados 12 foram encontrados em pelo menos uma amostra. As concentrações variaram entre os compostos e nas diferentes épocas do ano, sendo a maior, encontrada no ribeirão Anhumas na 2° campanha amostral (127 mg L para a cafeína). Os compostos determinados com maior freqüência foram a cafeína, dibutilftalato, bisfenol A e 17b-estradiol, e as maiores concentrações foram determinadas em regiões com elevada densidade populacional e durante os períodos de estiagem. O ibuprofeno, dietilftalato e estrona, não foram encontrados nessas matrizes considerando os limites de detecção de 51, 33 e 16 ng L, para os três compostos respectivamente / Abstract: Numerous organic compounds called endocrine disruptors have been found at low levels in surface waters. Several compounds such as hormones (17b-estradiol, 17a-ethinylestradiol, estrone, progesterone and levonorgestrel), phthalates (diethylphthalate and dibutylphthalate), surfactants (4-octylphenol and 4-nonylphenol), bisphenol A, among others are included in this class. Some pharmaceutical products, such as paracetamol, acetyl salicylic acid, diclofenaco and ibuprofen have also been detected in surface waters. Due to the degradation of the surface water quality in the State of São Paulo. especially the Atibaia river which is used for public supply to the Campinas Metropolitan Region, this work presents an updated evaluation of the occurrence of 14 compounds mentioned above, as well as caffeine, used as a chemical tracer of human activity. The determination of these compounds was accomplished using established methods, including solid phase extraction (SPE) of 1 L of sample, followed by High Performance Liquid Chromagraphy (HPLC) equipped with DAD and fluorescence detector. In order to evaluate spatial and temporal variations, four sampling campaigns were carried out from February/2006 - January/2007, involving two dry and two wet seasons sampling series. From the 15 targeted compounds, 12 of them were found at least in one of the samples analyzed. Highest concentrations were found in Anhumas river in second sampling campaign (127 mg L of caffeine). Compounds more frequently found were caffeine, dibutylphthalate, bisphenol A and 17b-estradiol. Highest concentrations were associated to populational density and in the dry season. Ibuprofen, diethylphthalate and estrone not found considering the limit of detection of 51, 33 e 16 ng L, respectively / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Un certain nombre d'études ont étudié le lien entre cancer du sein et exposition aux dioxines et au cadmium. Toutefois, les résultats de ces études ne sont pas concluants et présentent des limites méthodologiques. L'objectif principal de cette thèse était de développer un indicateur spatial permettant d'estimer les expositions atmosphériques chroniques aux dioxines et au cadmium des femmes issues de la cohorte E3N en France, entre 1990 et 2008. Nous avons créé une base de données de 2620 sources de dioxines et 2700 sources de cadmium et estimé et géolocalisé leurs émissions. L'estimation des émissions à la source et leur localisation ont servi de base pour la construction de l'indicateur spatial. Nous avons identifié une sélection de paramètres permettant d'obtenir un accord « substantiel » entre les classifications des expositions des femmes de la cohorte E3N, localisées à l'adresse de résidence, estimées avec l'indicateur, et avec le modèle gaussien SIRANE. En utilisant le modèle SIRANE, nous avons également étudié la variabilité spatio-temporelle (1990-2008) des concentrations de dioxines et de cadmium sur la métropole de Lyon. Pour la première fois des concentrations modélisées ont été comparées à des mesures de concentrations de dioxines en air ambiant. L'indicateur développé dans cette thèse a été utilisé pour estimer le risque de cancer du sein associé à l'exposition atmosphérique aux dioxines dans une étude cas-témoins niché au sein de la cohorte E3N. Il est utilisé actuellement dans une étude sur le lien entre exposition au cadmium et risque de cancer du sein, et pourra être appliqué dans de futures études portant sur d'autres polluants ou d'autres pathologies / A number of studies have examined the link between breast cancer and exposure to air pollution, including dioxins and cadmium. However, the results of these studies are inconclusive and present a number of methodological limitations. The main objective of this thesis was to develop a spatial indicator to assess chronic atmospheric exposure to dioxins and cadmium of women from the E3N cohort in France between 1990 and 2008. We first performed an inventory and created a database of 2620 dioxins and 2700 cadmium emitting sources in France between 1990 and 2008 and estimated and geolocated their annual emissions. The location of the sources and their estimated emissions were used as the basis for the construction of the indicator. Combination of additional spatial parameters, allowed us to obtain a "substantial" agreement between the dioxin and cadmium exposure classifications of the E3N subjects geolocalised at their residential address, using the estimated bythe indicator and exposures estimates derived from the Gaussian model. We also evaluated the spatial-temporal variability of dioxin and cadmium concentrations over nearly two decades in the Lyon metropolitan area, taking into account a wide variety of source types. This is the first study comparing concentrations predicted by a dispersion model to dioxin concentrations measured in ambient air. The exposure indicator was used in a case-control study within the E3N cohort to estimate the risk of breast cancer associated with atmospheric exposure to dioxins. It is currently being used in another study on cadmium exposure and breast cancer risk and may be applied in future studies on other pollutants or pathologies

O objetivo deste trabalho foi verificar a qualidade, através de um perfil anual, dos mananciais de abastecimento de água da Região Metropolitana do Rio de Janeiro, rios Guandu, Paraíba do Sul e Piraí, com foco nos poluentes emergentes estrona, 17?-estradiol, estriol, progesterona, testosterona, 17?-etinilestradiol, bisfenol A e cafeína, empregando extração em fase sólida e cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS/MS). Além de determinar, utilizando os dados de vazão nos dias das coletas, a carga fluvial e carga per capita dos poluentes quantificados. Com os dados obtidos foi realizada avaliação de risco dos poluentes emergentes tendo como referência dados de literatura de Concentração Previsível Sem Efeitos (PNEC). Os resultados demonstraram a presença de 6 dos 8 poluentes estudados em pelo menos uma das amostras. Não foram detectadas concentrações de progesterona e testosterona. A cafeína foi detectada em 100% das amostras de água tratada e em 98% das amostras de água superficial. As concentrações dos poluentes emergentes em água superficial variaram para cafeína de 181,48 a 5.204,74 ng L-1, para 17?-etinilestradiol de 148,48 a 210,59 ng L-1, para bisfenol A de 104 a 3.443,69 ng L-1, 17?-estradiol e a estrona foram quantificados em uma única amostra com concentração de 164,5 ng L-1e 145,26 ng L- 1, respectivamente. Na água tratada as concentrações variam para cafeína de 191,30 a 1,190,94 ng L-1, bisfenol A de 122,28 a 1.354,86 ng L-1, 17?-etinilestradiol e 17?-estradiol foram quantificados em uma única amostra com concentrações de 221,43 e 125,99 ng L-1, respectivamente. A redução da concentração dos poluentes emergentes entre o manancial de abastecimento e a água tratada variou de 1,4% a 85,5%. A carga fluvial de cafeína variou de 0,182 a 56,67 kg d-1, de bisfenol A entre 0,162 a 10,38 kg d-1 e de 17?-etinilestradiol de 0,046 a 1,66 kg d-1. Já a carga per capita teve as seguintes variações: cafeína de 9,65 a 89,07 mg/hab d, bisfenol A de 10,68 a 93,56 mg/hab d e 17?-etinilestradiol de 2,80 a 14,97 mg/hab d. Os testes estatísticos demonstraram predominância de contaminação pontual no Rio Piraí, comportamento não observado nos demais rios. Demonstraram, ainda, que há redução das concentrações de cafeína entre o Rio Paraíba do Sul e o Rio Guandu, e que não há redução significativa entre o ponto de adução para a ETA e a água tratada. A priorização de poluentes com maior risco em ordem crescente foi: 17?-etinilestradiol, bisfenol A, 17?-estradiol, estrona e cafeína. / The purpose of this work was to verify the quality of the water supply sources of the Rio de Janeiro Metropolitan Region, namely the rivers Guandu, Paraíba do Sul and Piraí, through an annual profile, focusing on the emerging pollutants estrone, 17?-estradiol, estriol, progesterone, testosterone, 17?-ethinylestradiol, bisphenol A and caffeine, using continuous phase extraction and chromatography on molecules coupled to the mass spectrometer (LCMS / MS), and also to quantify the fluvial load and the per capita load of the quantified pollutants using flow data regarding the collection days, in order to carry out the risk assessment of the emerging pollutants using data references from Predicted No Effect Concentrations (PNEC). The results demonstrated the presence of 6 out of the 8 pollutants studied in at least one of the samples. No progesterone and testosterone concentrations were detected. Caffeine was detected in 100% of treated water samples and in 98% of surface water samples. Concentrations of the emerging pollutants in surface water ranged to caffeine from 181.48 to 5,204.74 ng L-1, to 17?-ethinylestradiol from 148.48 to 210.59 ng L-1, to bisphenol A from 104 to 3,443.69 ng L-1. 17?-estradiol and estrone were quantified in a single sample with concentrations of 164.5 ng L-1 and 145.26 ng L-1, respectively. The concentrations in drink water ranged to caffeine from 191.30 to 1,190.94 ng L-1, bisphenol A from 122.28 to 1,354.86 ng L-1, 17?- ethinylestradiol e 17?-estradiol were quantified in a single sample with concentrations of 221,43 e 125.99 ng L-1, respectively. The decrease on the concentration of the emerging pollutants between the supply source and the drink water ranged from 1.4% to 85.5%. The fluvial load of caffeine ranged from 0.182 to 56.67 kg d-1 of bisphenol A from 0.162 to 10.38 kg d-1 and of 17?-ethinylestradiol from 0.046 to 1.66 kg d-1. The per capita load of caffeine ranged from 9.65 to 89.07 mg/d person, of bisphenol A from 10.68 to 93.56 mg/d person and of 17?-ethinylestradiol from 2.80 to 14.97 mg/d person. The statistic alanalysis showed a predominance of punctual contamination in the Piraí River, behavior not observed in the other rivers. It was further demonstrated that there is a reduction of caffeine concentrations between the Paraíba do Sul and Guandu rivers, and also that there was no significant reduction between raw water and treated water. The prioritization of pollutants with the highest risk according to the risk analysis in an increasing order was: 17?-ethinylestradiol, bisphenol A, 17?-estradiol, estrone and caffeine.

Due to the current rise of exposure to natural and synthetic compounds in our daily life, the debate concerning the safety of many substances is becoming increasingly relevant. The estrogenic activity of various compounds, described as xenoestrogens, is the major part of this debate. Humans beings are exposed to these substances from different environmental contaminations ranging from conscious intake of estrogenic substances, as in contraception or in hormone replace therapy (HRT), to unconscious exposure, from food, the use of synthetic material in daily life and air and water pollution. At this point the need for methods to investigate the activity and the safety of these substances is becoming increasingly important. Classical methods for the analysis of the estrogenic activity of substances, like batteries of in vivo test systems on the rat uterotrophic assay are not able to describe the different pathways of action of recently discovered estrogenic substances. This evidence was already shown by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), introducing new test guidelines for the investigation of effects of endocrine disruptors (according to enhanced Test Guideline 407). As reviewed by Nilsson (Nilsson et al., 2001), after the interaction of the estrogens with the Estrogen Receptor (ER) in the cells, the mechanism of activation possible is not only via direct binding of the ER to the Estrogen Responsive Elements (EREs) present in the promoter region of the target gene, very well described for many target genes, but that also other mechanisms are used: the interaction of the ER with the AP 1, Sp 1 and NFkB modes, that are discovered but not yet comprehensively described. The aim of my work is to produce a microarray DNA chip for the investigation of the estrogenic activity of different compounds present in the environment. The chip will consist of a selection of 100 genes that are estrogen responsive and it will cover the spectrum of activities of estrogenic compounds in various organs of the body. In the gene selection, genes were chosen that are estrogen responsive in the classical target tissues of estrogens, linked to reproduction, like uterus and mammary gland, and also in tissues not related to reproduction like liver, bones and capillars. In addition, other genes are included to monitor different pathways that are related to disease states; control of cell proliferation, apoptosis or cancer related genes. Currently these kinds of investigations are already in process, but by other methods which are more time consuming and with a lower throughput e.g. the gene expression profiling using the real time RT-PCR. The use of microarray’s satisfies the need for a less time consuming, high throughput method, to obtain a fast characterization of the gene expression finger print of the candidate substances and their mechanism of action in the organism. In my work I investigated the estrogenic potency of different Xenoestrogens that commonly occur in our daily life, in rat cells and tissue using well known estrogen sensitive genes like C3, Clu, IGFBP1 and CaBP9k. I focused on their effect on cell proliferation, studying PCNA expression. For the first time sensitivity of the gene CA2 was proofed in liver and uterus. A new identified mRNA sequence, r52, was characterized for its sensitivity to estrogenic exposure. This sequence was investigated at the molecular level expanding the known nucleic sequence. I produce a microarray chip with 16 genes to investigate the estrogenic potency of different compounds. As proof of principle of the microarray method completely produced in house I compared the result of gene expression obtained by the chip to that obtained by real time RT PCR finding a similarity of results. This new established method is less sensitive than the real-time RT PCR but allows a high throughput of gene expression analysis producing at the end a more complete picture of the expression signature of a compound.

En dépit de la pression règlementaire croissante pour mieux détecter les produits chimiques potentiellement responsables de perturbations de la fonction thyroïdienne, les moyens de les cribler restent insuffisants et imparfaits. Un tel criblage implique l’utilisation de nombreux tests in vitro ciblant chacun l’un des divers mécanismes de toxicité potentiellement impliqué, ou des tests in vivo plus longs et plus contraignants. Trois modèles d’étude ont ainsi été évalués pour leur potentiel à simplifier les procédures de criblage actuellement préconisées. Le premier modèle d’étude qui a été proposé est un modèle in vivo d’exposition à court terme par voie orale de rats mâles adultes. Le suivi de l’expression de gènes permet de réaliser un criblage de la perturbation de la fonction thyroïdienne après 7 jours d’exposition seulement. Le second modèle d’étude qui a été retenu pour ce travail est la lignée cellulaire PCCl3 de thyrocytes de rats, identifiée comme un modèle potentiel pour le criblage de la toxicité thyroïdienne. Enfin, la pertinence pressentie de l’utilisation d’un modèle d’hépatocytes cryopréservés (LiverbeadsTM) a été confirmée pour l’identification des composés toxiques thyroïdiens chez le rongeur dont l’action est médiée par le foie. Trois modèles d’étude in vitro et in vivo utilisables lors des tests de criblage des produits chimiques perturbateurs de la fonction thyroïdienne ont donc été identifiés. L’évaluation de cette perturbation est rendue possible par l’utilisation de variations d’expression de gènes comme principal paramètre d’étude / Whereas disruption of thyroid hormone signaling by environmental chemicals is a growing concern, identifying thyroid toxicants in early screening studies remains a challenge. Indeed, several different molecular events can initiate a such disruption of the Hypothalamus-Pituitary-Thyroid (HPT) axis. Thus, the detection of thyroid toxicants implies to conduct systematically an important battery of in vitro assays, or long in vivo studies. In the aim to simplify the procedure for the screening of all the possible mode of actions (MoAs) involved, we assessed three models for their suitability to detect in a short term different thyroid toxicants by using changes in gene expression. We identified the possibility of discriminating thyroid toxicants from compounds that do not alter thyroid function, by using this approach, in a 7-day adult male rat assay. Regarding in vitro testing, we have established the proof of concept of discriminating direct-acting thyroid toxicants from compounds that do not affect thyroid function, on the basis of up-regulated expression of a set of genes as criteria of positivity, in an early screening in vitro assay based on PCCl3 rat thyroid cells. We also confirmed the relevance of the use of alginate-embedded cryopreserved hepatocytes (LiverbeadsTM) for the screening of liver-mediated thyroid toxicity in rodents. The present work allowed the identification of three models suitable for the early screening of the disruption of the thyroid function. Such detection of multiple toxic MoAs in a short term relies on the use of gene expression as main or unique endpoint

Os desreguladores endócrinos são compostos micropoluentes de ação deletéria que causam efeitos aos animais e aos seres humanos. Estes vêm trazendo a várias décadas, problemas relacionados à má formação ou ainda infertilidade de várias espécies. A presença destes compostos na ordem de ng L-1 já é capaz de gerar efeitos nocivos ao sistema endócrino. Este trabalho visou à determinação da presença e quantidade de alguns destes compostos como 17α-etinilestradiol, bisfenol A e estrona entre outros, nas águas do rio Arroio Fundo, localizado em Jacarepaguá no RJ que possui um índice de qualidade de água ruim. A primeira etapa deste trabalho foi a implementação e validação de metodologia para determinação do 17α-etinilestradiol por cromatografia líquida acoplada a detector de fluorescência onde foram estabelecido limite de detecção, de quantificação e linearidade conforme orientação do Inmetro (2010). Além da avaliação das amostras ambientais através da metodologia estabelecida. Na etapa subsequente foram realizados os experimentos relativos à determinação dos desreguladores endócrinos através da espectrometria de massas por detector tipo tandem quadrupolo, onde também foram realizados os procedimentos de validação e determinação dos compostos bisfenol A e estrona que não foram suscetíveis a efeito de matriz durante a ionização, que acabou impedindo a determinação de outros desreguladores endócrinos. Os resultados indicam que não há redução da presença dos desreguladores endócrinos detectados, e de outros compostos orgânicos também detectados, mas não identificados, entre os pontos a montante e a jusante da Unidade de Tratamento do Rio Arroio Fundo. Todavia em função do grande efeito de matriz oriundo do fato da amostra ser de extrema complexidade, não foi possível realizar uma identificação e quantificação de todos os compostos alvos. / Endocrine disrupters are compounds micropollutants of deleterious effects that cause effects to animals and humans has brought these problems to several decades related to poor training or infertility of various species. The presence of these compounds in the ng L-1 order is already capable of generating negative effects on the endocrine system. This work aimed at determining the presence and amount of some of these compounds as 17α-ethinylestradiol, bisphenol A and estrone among others, in the waters of the river Arroio Fundo, located in Jacarepaguá in Rio de Janeiro that has a bad water quality index. The first stage of this work was the implementation and validation of a method for determination of 17α-ethinylestradiol by liquid chromatography-fluorescence detection which were established limit of detection, quantification and linearity as directed by Inmetro (2010). Besides the evaluation of the samples through the established methodology. In subsequent step were carried out experiments on the determination of endocrine disruptors by tandem quadrupole mass spectrometry detector, were being performed validation procedures and determination of the compounds bisphenol A and estrone, which were not susceptible to matrix effect during ionization, which prevented the determination of other endocrine disrupters. The results indicate that there is no reduction of the presence of detected endocrine disruptors and other organic compounds, also detected but not identified, between the points upstream and downstream of Arroio Fundo treatment plant. However due to the large matrix effect originating from the fact that the sample be extremely complex, could not perform an identification and quantification of all target compounds.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Endocrine Disrupter Compounds (EDCs) like pesticides, alkylphenols and hormones among other classes of compounds are responsible for alterations in the endocrine system functions. Endocrine disruption occurs when EDCs interact with the hormone receptors, altering the natural response patterns of the endocrine system. Aquatic organisms, such as fish, are able to accumulate EDCs residues in concentration several times higher than the surrounding water. Consequently, fish is a major source of contamination for both top predators and human consumers. This study aimed to develop and validate a fast method for the determination of 40 endocrine disrupters in fish fillet, using modified QuEChERS and Gas Chromatography coupled with Mass Spectrometry in tandem, using a triple quadrupole analyzer (GC-(TQ)MS/MS). A factorial design was performed to optimize the extraction procedure, which consist of the extraction of 10.0 g of fish fillet with 10.0 mL of acetonitrile with 1% (v/v) of acetic acid followed by manual shaking for 1 min. In the partition step 2.0 g of sodium chloride, 1.7 g of anhydrous sodium acetate and 0.3 g of anhydrous magnesium sulfate were added, followed by shaking and centrifugation at 3400 rpm for 8 min. Then the extract was transferred to a 15 mL polypropylene tube containing the C18 and PSA sorbents, beyond the anhydrous magnesium sulfate. After shaking and centrifuging, the supernatant was filtered and analyzed by GC-(TQ)MS/MS. The method was validated by spiking the blank sample at three concentration levels (10, 25 and 50 Ug kg-1) obtaining recovery values between 70.1 to 120.0% for 36 of the 40 endocrine disrupters evaluated. RSD values below 20% ensured the good precision of the method. The linearity was evaluated using the coefficient of determination (r2) with values higher than 0.996 for all compounds. The matrix effect was evaluated, and it was pretty intense for most compounds, with values exceeding 10%. This effect was compensated using analytical curves obtained with standards prepared in blank matrix extracts. This method was applied in 6 samples of fish fillet from different species. Residues of bisphenol A, chlorpyrifos and bifenthrin were detected. Therefore, the modified QuEChERS method proved to be appropriated for the determination of endocrine disrupters in fish fillet using GC-(TQ)MS/MS since it showed to be effective and can be applied to routine analysis. / Compostos conhecidos como disruptores endócrinos (DEs), tais como agrotóxicos, alquilfenóis, hormônios, dentre outras classes de substâncias são responsáveis pela alteração de funções do sistema endócrino. Esse efeito ocorre quando os DEs interagem com os receptores hormonais, alterando os padrões de resposta natural do sistema endócrimo. Os organismos aquáticos, como os peixes são capazes de acumular concentrações de DEs várias vezes superiores a água ao seu redor. Consequentemente, os peixes são uma importante fonte de contaminação para seus predadores e consumidores humanos. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método rápido para a determinação de 40 disruptores endócrinos em filé de peixe (jundiá), utilizando QuEChERS modificado e Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas em série, empregando analisador triplo quadrupolo (GC-(TQ)MS/MS). Utilizou-se do planejamento fatorial em estrela para otimização do procedimento de extração, o qual consiste da extração de 10,0 g de filé de peixe com 10,0 mL de acetonitrila/1% (v/v) ácido acético seguido de agitação manual por 1 min. Na etapa de partição adicionou-se 2,0 g de cloreto de sódio, 1,7 g de acetato de sódio anidro e 0,3 g de sulfato de magnésio anidro. Realizou-se agitação por 1 min e centrifugação a 3400 rpm por 8 min. Em seguida, o extrato foi transferido para um tubo de polipropileno de 15 mL contendo os sorventes C18 e PSA, além de sulfato de magnésio anidro. Foi realizada a agitação manual e centrifugação, o extrato foi filtrado e analisado por GC-(TQ)MS/MS. O método foi validado fortificando a amostra branco em três níveis de concentração (10, 25 e 50 Ug kg-1) obtendo valores de recuperação entre 70,1 e 120,0% para 36 dos 40 disruptores endócrinos avaliados. Valores de RSD inferiores a 20% garantiram a boa precisão do método. A linearidade foi avaliada utilizando o coeficiente de determinação (r2) sendo este maior que 0,996 para todos os compostos. O efeito matriz foi avaliado, o qual foi bastante intenso para a maioria dos compostos, com valores superiores a 10%. O efeito matriz foi compensado utilizando-se curvas analíticas preparadas no extrato branco da matriz. A aplicação do método foi realizada em 6 amostras de filé de peixe de diferentes espécies, nas quais resíduos de bisfenol A, clorpirifós etílico e bifentrina foram encontrados. O método QuEChERS modificado proposto para a determinação de disruptores endócrinos em filé de peixe utilizando GC-(TQ)MS/MS mostrou ser eficaz, podendo ser aplicado em análise de rotina.

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