Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5254_1.pdf: 1866514 bytes, checksum: 71c06cc87fad8892454d97938af40d29 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae var. anisopliae são fungos entomopatogênicos com ação comprovada contra várias espécies de Lepidoptera, porém ainda não testada em Dione juno juno, Lepidoptera de importância econômica, considerada praga-chave do maracujazeiro (Passiflora edulis Sims.). Assim, objetivou-se avaliar a patogenicidade e a virulência de B. bassiana e M. anisopliae var. anisopliae em diferentes concentrações sobre lagartas de D. juno juno em condições de laboratório, visando o desenvolvimento de estratégias para o controle biológico desta praga. Os resultados demonstram que B. bassiana e M. anisopliae var. anisopliae têm ação patogênica sobre a praga do maracujazeiro. M. anisopliae var. anisopliae foi mais eficiente no índice de mortalidade sobre as lagartas de D. juno juno em relação ao tempo, considerando-se que B. bassiana também foi eficiente, podendo ser usados em programas de controle biológico, proporcionando uma importante alternativa de controle para essa praga

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Joao Paulo Machado de Araujo.pdf: 1095116 bytes, checksum: 1abc62db3a6c0e189fb12de4697e8f77 (MD5) Previous issue date: 2012-06-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Ophiocordyceps are the main entomopathogenic fungi. They are highly virulent and may have an important influence on their hosts communities. In the present study, we collected ants of the genus Camponotus infected by fungi belonging to the complex Ophiocordyceps unilatera-lis sensu lato in three areas of the Brazilian Amazon. In Ducke Reserve, two samples were taken, one in the dry season of 2011 and another in the rainy season of 2012. In Parque Na-cional do Viruá and Estação Ecológica de Maracá, the samples were taken during one dry sea-son of 2012. Within each area, nine 250 m-long transects, at least 1 km distant from each oth-er, were sampled. We found 424 infected Camponotus by Ophiocordyceps in various stages of development. The infection rate in the rainy season was on average three times higher than the dry season, probably reflecting the survival and developmental needs of spores, however, even in the dry season there were infected. The infection rate was similar between the three areas despite differences in climate, vegetation and ant species composition. We found 17 Camponotus species infected, but we believe this number is even higher. Hyperpara-site occurrence rate was low, representing 6% of total infected ants found, suggesting little effect on Ophiocordyceps population in these areas. There was no relationship between the number of infected ants and the soil type (in terms of granulome-try). We found morphological differences among the spores infecting different species of ants, indicating that there are several species of the O. unilateralis not yet described, requiring fur-ther taxonomic studies to better understand this relationship. / Os Ophiocordyceps são os principais fungos entomopatogênicos, possuem alta virulência e podem ter grande influência nas comunidades de seus hospedeiros. No presente estudo, foram coletadas formigas do gênero Camponotus infectadas por fungos pertencentes ao complexo Ophiocordyceps unilateralis sensu lato em três áreas da Amazônia brasileira. Na Reserva Ducke foram realizadas duas coletas, uma na época mais chuvosa e uma na época mais seca. Nas reservas de Viruá e Maracá, as coletas foram feitas na época seca. Dentro de cada área, nove transectos de 250 metros foram amostrados, sendo estes, distantes no mínimo 1 km entre si. Foram encontradas 424 formigas Camponotus infectadas com o fungo em vários estádios de desenvolvimento. A taxa de infecção na época chuvosa foi em média 3 vezes superior à época seca, provavelmente em função das necessidades de sobrevivência e desenvolvimento dos esporos, entretanto, mesmo na época seca houveram formigas infectadas. A taxa de infec-ção foi semelhante entre as três áreas estudadas apesar das diferenças de clima, vegetação e composição de espécies de formigas. Foram encontradas 17 espécies de Camponotus infecta-das, mas acreditamos que este número seja ainda maior. A taxa de hiperparasitismo foi baixa, menos de 6% no total das formigas encontradas infectadas, bastante inferior a outros estudos, aparentemente afetando pouco a população de Ophiocordyceps unilateralis nessas áreas. Não encontramos influência da granulometria do solo sobre essas infecções. Foram encontrados diferentes tipos de esporos para diferentes espécies de formigas infectadas, indicando que há várias espécies diferentes entre os O. unilateralis ainda não descritos, sendo necessário estu-dos taxonômicos posteriores para um melhor entendimento desta relação.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5158_1.pdf: 1219168 bytes, checksum: 88c2523b7802f1a2d1804b141d7f6de0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae amplamente distribuídos em todas as regiões do mundo podem ser isolados de insetos, solo e de outros substratos. Essas espécies apresentam variabilidade genética e habilidades sobre diferentes insetos-praga. Patogenicidade e virulência sobre diversos artrópodes têm sido observadas com a variação de atividades enzimáticas e características genéticas dos isolados. A ação desses agentes está relacionada com as condições climáticas, causando epizootias em população de insetos e observado o controle biológico de Coleoptera, Hemiptera, Lepdoptera, Isoptera e de outras importantes pragas no Brasil e no mundo. Este trabalho teve por objetivos avaliar a ação de patogenicidade, viabilidade e virulência das linhagens de B. bassiana, M. anisopliae var. anisopliae e M. anisopliae var. acridum sobre ovos, larvas e adultos antes e após reisoladas de Anthonomus grandis (Boheman) (Coleoptera: Curculionidae), importante praga do algodão, avaliadas em condições de laboratório, visando o desenvolvimento de estratégias para o controle biológico da praga. Os resultados apresentados neste trabalho confirmaram que B. bassiana, M. anisopliae var. anisopliae e M. anisopliae var. acridum têm ação patogênica, elevada viabilidade sobre o bicudo-do-algodoeiro e significante virulência após reisolados das diferentes fases do inseto, podendo ser usados contra o inseto adulto em programas de controle biológico, proporcionando uma importante alternativa de controle contra A. grandis

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6499_1.pdf: 2052434 bytes, checksum: 0d0ed4c819168b93a4f1be887b9da045 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Metarhizium anisopliae é um patógeno de insetos economicamente importante usado em todo o mundo no controle biológico de insetos-praga. Porém, sua utlização é limitada devido ao tempo de mortalidade ser relativamente alto quando comparado aos inseticidas químicos. A análise das expressões de genes envolvidos na virulência é um passo importante na identificação de métodos para aumentar a sua eficácia. Neste trabalho foi investigado pela técnica de RT-qPCR o nível de expressão relativa do gene cag8 (regulador da sinalização da proteína G) e do nrr1 (regulador da resposta ao nitrogênio) durante a germinação, conidiogenese e em diferentes fases de patogênese de M. anisopliae var. anisopliae e de M. anisopliae var. acridum. A expressão relativa do gene pr1A (codificador da protease subtilisina) foi analisado em M. anisopliae var. anisopliae e em M. anisopliae var. acrdum durante o crescimento em diferentes meios de cultura e durante a patogênese. Em ambas as variedades, o gene cag8 foi reprimido durante a germinação e induzido durante a conidiogenese e patogênese, o gene nrr1 apresentou-se constitutivamente expresso durante a germinação, conidiogenese e patogênese e o gene pr1A foi induzido nos diferentes meios de cultura e induzido e reprimido durante as fases de patogênese. Considerando as diferenças entre as duas variedades, M. anisopliae var. anisopliae apresentou maior expressão em todos os genes analisados durante a patogênese, isso pode justificar o fato dessa linhagem ter apresentado maior potencial para o controle de Diatraea saccharalis no teste de patogenicidade demonstrando que M. anisopliae pode apresentar variações na ativação de genes ligados à virulência para determinados ambientes e hospedeiros

O inseto vetor Diaphorina citri Kuwayama 1907 (Hemiptera: Liviidae) é considerado a principal praga da citricultura mundial. O controle desta praga é feito quase exclusivamente com inseticidas químicos, existindo a demanda por alternativas mais sustentáveis de controle. O desenvolvimento de um bioproduto a base de fungo entomopatogênico pode ser uma alternativa promissora para o manejo integrado de D. citri em pomares comerciais de citros. Assim, esse estudo teve como objetivo viabilizar a utilização do fungo entomopatogênico Isaria fumosorosea ESALQ-1296 para o controle de D. citri, avaliando: 1- a ação de adjuvantes na adesão e germinação de I. fumosorosea em ninfas e adultos de D. citri; 2- a relação entre a viabilidade dos conídios e a mortalidade de D. citri; 3- o efeito da umidade relativa do ar e da radiação ultravioleta na eficácia de I. fumosorosea em condições de laboratório; 4- o período entre a aplicação de fungicidas químicos e I. fumosorosea em campo; 5- a seletividade de I. fumosorosea aos inimigos naturais Tamarixia radiata e Ceraeochrysa cincta em condições de laboratório; 6- o volume de calda adequado para as aplicações de I. fumosorosea para o controle de D. citri em pomares comerciais; 7- a eficiência de I. fumosorosea no manejo de D. citri e seu efeito em outras espécies de artrópodes em dois sistemas de produção de citros. Análises por microscopia eletrônica de varredura revelaram que a adição dos adjuvantes KBRAdj e Silwet L-77 acelerou o desenvolvimento dos conídios de I. fumosorosea na cutícula de todos os estágios do inseto em comparação com o Tween 80. As formulações de I. fumosorosea com KBRAdj 0,075% apresentaram melhor desempenho no controle de D. citri em todos os níveis de umidade, mas especialmente em períodos de baixa umidade relativas (≤50%) e sob exposição à radiação UV-B (> 2 horas) em relação a aplicação com Tween. Os fungicidas Kumus® DF, Kocide® WDG, Nativo®, Flint 500® WG não influenciaram no desempenho do entomopatógeno quando esses foram pulverizados um dia antes ou após a aplicação do fungo sobre os adultos de D. citri. Nos estudos de seletividade foi demonstrado que a maioria das misturas de I. fumosorosea com os adjuvantes foi inócua para os adultos de T. radiata e as larvas neonatas de C. cincta. Em pomares comerciais, foi demostrado que as aplicações de I. fumosorosea foram mais eficientes no volume de 60 mL.m-3 de área de copa. Na área com produção orgânica de citros foi verificado que as aplicações de I. fumosorosea reduziram significativamente a população natural de D. citri e do ácaro da leprose (Brevipalpus spp.). Já na área com produção convencional de citros foi observado que as pulverizações de I. fumosorosea reduziram significativamente a população do ácaro da falsa ferrugem (Phyllocoptruta oleivora) e a população de D. citri foi extremamente baixa em todos os tratamentos. As aplicações de I. fumosorosea não apresentaram efeitos negativos nas populações dos predadores joaninhas, crisopídeos e hemerobídeos. Portanto, conclui-se que a utilização do fungo I. fumosorosea no manejo de D. citri pode ser uma tática sustentável para minimizar as aplicações sistemáticas de pesticidas, diminuindo seus impactos no agroecossistema. / The insect vector Diaphorina citri Kuwayama 1907 (Hemiptera: Liviidae) is the main citrus pest in the world. The control of this pest is done almost exclusively with chemical insecticides, and there is a demand for more sustainable control alternatives. The development of a bioproduct based on entomopathogenic fungi may be a promising alternative for the integrated management of D. citri in commercial citrus orchards. The objective of this study was to evaluate important parameters to increase efficiency of applications of the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea ESALQ-1296 for the control of D. citri. The following studies have been developed: 1- the action of adjuvants on adhesion and germination of I. fumosorosea on nymphs and adults of D. citri; 2- the relationship between the conidia viability and the mortality of D. citri; 3- the effect of relative air humidity and ultraviolet radiation on the efficacy of I. fumosorosea under laboratory conditions; 4 - the period between the application of chemical fungicides and I. fumosorosea in field; 5- the selectivity of I. fumosorosea to the natural enemies Tamarixia radiata and Ceraeochrysa cincta under laboratory conditions; 6 - the volume of syrup suitable for I. fumosorosea applications for the control of D. citri in commercial orchards; 7- the efficiency of I. fumosorosea to management of D. citri and its effect against other species of arthropods in two systems of citrus production. Scanning electron microscopy analysis revealed that the addition of the adjuvants KBRAdj and Silwet L-77 accelerated the development of I. fumosorosea conidia on the cuticle of all stages of the insect compared to Tween 80. The formulations of I. fumosorosea with KBRAdj 0.075% showed better performance in controling D. citri at all moisture levels, but especially in periods of low relative humidity (≤50%) and exposure to UV-B radiation (> 2 hours) compared to Tween application. The fungicides Kumus® DF, Kocide® WDG, Nativo®, Flint 500® WG did not influence the performance of the entomopathogen when they were sprayed the day before or after application of the fungus on D. citri adults. In the selectivity studies, it was shown that most of the mixtures of I. fumosorosea with the adjuvants were innocuous for the adults of T. radiata and the neonates of C. cincta. In commercial orchards, it was demonstrated that I. fumosorosea applications were more efficient in the volume of 60 mL.m-3 of leaves. In the area with organic citrus production it was verified that I. fumosorosea applications significantly reduced the natural population of D. citri and the false spider mite (Brevipalpus spp.). In the area with conventional citrus production it was observed that sprays of I. fumosorosea significantly reduced the population of the false rust mite (Phyllocoptruta oleivora) and D. citri population was extremely low in all treatments. The applications of I. fumosorosea did not present negative effects in the populations of the ladybirds, lacewings and hemerobide predators. Therefore, it is concluded that the use of I. fumosorosea fungus in the management of D. citri can be a sustainable tactic to minimize the systematic applications of pesticides, reducing their impacts on the agroecosystem.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

A região espaçadora ITS rDNA tem sido utilizada como uma importante ferramenta molecular para a identificação de fungos. Neste estudo a região ITS1 - 5.8S - ITS2 foi analisada em diferentes espécies do fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride com o objetivo de se construir primers específicos para a detecção e identificação do fungo no interior de larvas infectadas de Diatraea saccharalis. A amplificação desta região produziu um fragmento único de aproximadamente 540 pb para as linhagens E9, B/Vi e C, e de 600 pb para a linhagem 14 de M. anisopliae var. anisopliae; de 650 bp para M. album e 600 pb para M. flavoviride. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com diferentes enzimas de restrição Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II e Sau 3A I; e os perfis de PCR-RFLP mostraram nítidas diferenças entre as espécies analisadas. O sequenciamento da região ITS1 - 5.8S - ITS2 permitiu o desenho de primers específicos para as linhagens de M.a. var. anisopliae do Brasil e da Austrália. A amplificação não ocorreu em linhagens de M. álbum, M. flavoviride e Beauveria bassiana. Os DNAs extraídos de larvas infectadas pelas linhagens E9, B/Vi e C do Brasil e linhagem 14, da Austrália, foram testados utilizando-se os primers desenvolvidos. Em todos os experimentos o fungo M.a. var. anisopliae foi detectado 48 horas após a inoculação. A técnica molecular empregada neste estudo permite a rápida e segura detecção e identificação de M.a. var. anisopliae em bioensaios de laboratório e de campo, programas de manejo de pragas e estudos de epizootiologia. / The ITS rDNA have been used as an important molecular tool for fungi identification. In this study the ITS1 - 5.8S - ITS2 rDNA regions were analyzed in different species of the entomopathogenic fungus Metarhizium including M. anisopliae, M. album and M. flavoviride, in order to construct specific primers for their detection and identification within infected Diatraea saccharalis larvae. The amplification of this region yielded a unique fragment of approximately 540 bp for E9, B/Vi and C, and 600 bp for strain 14 of M. anisopliae var. anisopliae; of 650 bp for M. album and 600 bp for M. flavoviride. The PCR products were digested with the different restriction endonucleases Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II and Sau 3A I; and the PCR-RFLP profiles showed clear differences amongst the species. The sequencing of the ITS-5.8S rDNA regions allowed for the design of specific primers for M. anisopliae var. anisopliae. The amplification was not observed with M. album, M flavoviride and Beauveria bassiana strains. DNAs extracted from infected larvae by E9 and C strains from Brazil and the strain 14 from Australia in individual bioassays were tested using previously designed specific primers. In all experiments, the fungus was detected after 48 hours of post-inoculation. This molecular technique allows a fast and secure detection and identification of the entomopathogen in bioassays, in pest management programs and epizootiology.

A região espaçadora ITS rDNA tem sido utilizada como uma importante ferramenta molecular para a identificação de fungos. Neste estudo a região ITS1 - 5.8S - ITS2 foi analisada em diferentes espécies do fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride com o objetivo de se construir primers específicos para a detecção e identificação do fungo no interior de larvas infectadas de Diatraea saccharalis. A amplificação desta região produziu um fragmento único de aproximadamente 540 pb para as linhagens E9, B/Vi e C, e de 600 pb para a linhagem 14 de M. anisopliae var. anisopliae; de 650 bp para M. album e 600 pb para M. flavoviride. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com diferentes enzimas de restrição Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II e Sau 3A I; e os perfis de PCR-RFLP mostraram nítidas diferenças entre as espécies analisadas. O sequenciamento da região ITS1 – 5.8S – ITS2 permitiu o desenho de primers específicos para as linhagens de M.a. var. anisopliae do Brasil e da Austrália. A amplificação não ocorreu em linhagens de M. álbum, M. flavoviride e Beauveria bassiana. Os DNAs extraídos de larvas infectadas pelas linhagens E9, B/Vi e C do Brasil e linhagem 14, da Austrália, foram testados utilizando-se os primers desenvolvidos. Em todos os experimentos o fungo M.a. var. anisopliae foi detectado 48 horas após a inoculação. A técnica molecular empregada neste estudo permite a rápida e segura detecção e identificação de M.a. var. anisopliae em bioensaios de laboratório e de campo, programas de manejo de pragas e estudos de epizootiologia. / The ITS rDNA have been used as an important molecular tool for fungi identification. In this study the ITS1 - 5.8S – ITS2 rDNA regions were analyzed in different species of the entomopathogenic fungus Metarhizium including M. anisopliae, M. album and M. flavoviride, in order to construct specific primers for their detection and identification within infected Diatraea saccharalis larvae. The amplification of this region yielded a unique fragment of approximately 540 bp for E9, B/Vi and C, and 600 bp for strain 14 of M. anisopliae var. anisopliae; of 650 bp for M. album and 600 bp for M. flavoviride. The PCR products were digested with the different restriction endonucleases Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II and Sau 3A I; and the PCR-RFLP profiles showed clear differences amongst the species. The sequencing of the ITS-5.8S rDNA regions allowed for the design of specific primers for M. anisopliae var. anisopliae. The amplification was not observed with M. album, M flavoviride and Beauveria bassiana strains. DNAs extracted from infected larvae by E9 and C strains from Brazil and the strain 14 from Australia in individual bioassays were tested using previously designed specific primers. In all experiments, the fungus was detected after 48 hours of post-inoculation. This molecular technique allows a fast and secure detection and identification of the entomopathogen in bioassays, in pest management programs and epizootiology.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-07-17T16:47:39Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliano Juscelino Silva - 2017.pdf: 1989710 bytes, checksum: f45b210b1488868b181e806fa7091267 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-18T11:01:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliano Juscelino Silva - 2017.pdf: 1989710 bytes, checksum: f45b210b1488868b181e806fa7091267 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T11:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliano Juscelino Silva - 2017.pdf: 1989710 bytes, checksum: f45b210b1488868b181e806fa7091267 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-06-01 / Microorganisms are agents of biological control, among them, the entomopathogenic fungi stand out. Tolypocladium cylindrosporum IP419 and IP425, Lecanicillium psalliotae IP456, IP491 and IP492 were isolated from sentinel larvae. Conidiobolus macrosporus IP396 and L. psalliotae IP455 isolated from adult culicíneos. At 5 and 15 days, depending on the fungus, conidia were scraped from sporulated culture plates and adjusted in suspensions. In 30 eggs/ replicate, 50 μL of suspension of the isolates IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 and IP492 were applied in five concentrations (3.3 × 103 to 3.3 × 105 conidia/cm2). For IP 396, 2.5 × 104 conidia/cm2 was applied. In experiments with larvae (10 L3/repeat), five concentrations were applied (3.3 × 105 to 3.3 × 107 conidia/ml) for IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 and IP492, and (103 to 105 conidia/ ml) for IP396. The controls were treated with distilled water. Adults were exposed to five concentrations (3.3 × 104 to 3.3 × 106 conidia/cm2) of conidia of IP419 and IP425. For IP396 and IP455, IP456, IP491 and IP492, adults were exposed to the sporulated culture. Adult controls were not exposed to fungi. Ten adults were exposed in 4 replicates. There was no significant activity of the isolates tested against eggs. Mortality of larvae treated with T. cylindrosporum was ≤ 90% at the lowest concentration (3.3 × 105 conidia/ml) and 100% at the highest concentration (3.3 × 107 conidia/ml). The LC50 and LC90 were 3.5 × 104 conidia/ml and 6.8 × 106 conidia/ml for IP419 and 5.9 × 105 and 1.3 × 107 conidia/ml for IP425. The TL50 and TL90 for IP419 at the highest concentration (3 × 107 conidia/ml) was ≤ 7 hours. The concentrations applied had a significant effect (P <0.001). In larvae treated with IP396, mortality of L3 increased with conidia concentration, in the highest concentration (105 conidia /ml), was ≤ 57% in 48 h. There was no growth of the fungus on L3 exposed in agar medium for IP396, for T. cylindrosporum the fungal development was ≤ 70%. Mortality of larvae in controls was ≤ 15%. L. psalliotae had no larvicidal activity. Mortality of adults treated with T. cylindrosporum was ≤ 75%. There was fungal development on corpses ≤ 65%, the concentrations applied had a significant effect (P <0.001). The cumulative mortality of IP396 treated adults reached 100% after 5 days, and ≥ 80% over 10 days for L. psalliotae. The results show that T. cylindrosporum and C. macrosporus have potential for integrated control of larvae and adults of A. aegypti. / Microrganismos são agentes de controle biológico, dentre eles, destacam-se os fungos entomopatogênicos. Tolypocladium cylindrosporum IP419 e IP425, Lecanicillium psalliotae IP456, IP491 e IP492 foram isolados de larvas sentinela. Conidiobolus macrosporus IP396 e L. psalliotae IP455 isolados de culicíneos adultos. Em 5 e 15 dias, dependendo do fungo, conídios foram raspados de placas com cultura esporulada e ajustados em suspensões. Em ovos (30 ovos/repetição), foram aplicados 50 μL de suspensão dos isolados IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 e IP492 em cinco concentrações (3,3 × 103 a 3,3 × 105 conídios/cm2). Para IP396, aplicou-se 2,5 × 104 conídios/cm2. Em testes com larvas (10 L3/repetição), cinco concentrações foram aplicadas (3,3 × 105 a 3,3 × 107 conídios/ml) para IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 e IP492, e (103 a 105 conídios/ml) para IP396. Os controles foram tratados com água destilada. Adultos foram expostos a cinco concentrações (3,3 × 104 a 3,3 × 106 conídios/cm2) de conídios de IP419 e IP425. Para IP396 e IP455, IP456, IP491 e IP492, adultos foram expostos à cultura esporulada. Adultos controle não foram expostos aos fungos. Foram expostos 10 adultos, em 4 repetições. Não houve atividade significante dos isolados testados contra ovos. A mortalidade de larvas tratadas com T. cylindrosporum, foi ≤ 90% na menor concentração (3,3 × 105 conídios/ml) e 100% na maior concentração (3,3 × 107 conídios/ml). A CL50 e CL90 foi de 3.5 × 104 conídios/ml e 6.8 × 106 conídios/ml para IP419 e de 5.9 × 105 e 1.3 × 107 conídios/ml para IP425. O TL50 e TL90 para IP419, na maior concentração (3 × 107 conídios/ml) foi ≤ 7 horas. As concentrações aplicadas tiveram efeito significativo (P < 0,001). Em larvas tratadas com IP396, a mortalidade de L3 aumentou com a concentração de conídios, na maior concentração (105 conídios/ml), foi ≤ 57% em 48 h. Não houve crescimento do fungo sobre L3 expostas em meio ágar para IP396, para T. cylindrosporum o desenvolvimento fúngico foi ≤ 70%. A mortalidade de larvas nos controles foi ≤ 15%. L. psalliotae não teve atividade larvicida. A mortalidade de adultos tratados com T. cylindrosporum foi ≤ 75%. Houve desenvolvimento fúngico sobre cadáveres ≤ 65%, as concentrações aplicadas tiveram efeito significativo (P < 0,001). A mortalidade acumulada de adultos tratados com IP396 chegou a 100% após 5 dias, e ≥ 80% em dez dias para L. psalliotae. Os resultados mostram que T. cylindrosporum e C. macrosporus têm potencial para controle integrado de larvas e adultos de A. aegypti.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-09T14:38:25Z No. of bitstreams: 2 Tese - Rodrigo Alves da Silva - 2012.pdf: 2207385 bytes, checksum: a2450ec59543ec17b23f8c3632087770 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-09T14:40:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Rodrigo Alves da Silva - 2012.pdf: 2207385 bytes, checksum: a2450ec59543ec17b23f8c3632087770 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:40:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Rodrigo Alves da Silva - 2012.pdf: 2207385 bytes, checksum: a2450ec59543ec17b23f8c3632087770 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-09-28 / This study was divided in chapters that include various aspects of the interaction between the entomopathogenic fungus M. anisopliae with rice stink bug T. limbativentris as follows: Chapter 1 (Theoretical considerations) describes an introduction about the elements involved in this study as: the importance of rice crops for Brazil, as well as socio-economic and planted areas with this crop. It also covers information about life cycle and ecology of the rice stink bug, Tibraca limbativentris stal (1869) along with its importance as a pest. Chemical and biological control measures are discussed as well. Regarding the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, general aspects of taxonomy, morphology, infection process of this fungus to their hosts and virulence factors were also addressed. To sum up, chemical ecology was explored addressing intraspecific and interspecific interactions among insect family pentatomidae with emphasis on studies of chemical compounds of defense in order to understand the natural resistance of this group of insects to entomopathogenic fungi. Chapter 2 (Toxicity of compounds extracted from the cuticle and the stink methatoracic gland (MTG) of T. limbativentris to the fungus M. anisopliae) describes the susceptibility of different life stages of T. limbativentris to M. anisopliae and correlates these results with the fungicidal activity of aldehydes (E)-2-octenal and (E)-2-dedecenal extracted from metathoracic scent glands (MTG) of adults as well as the (E)-2-hexenal, extracted from dorsal abdominal scent glands (DAG) of nymphal stages (second to fifth instar), by collecting exuviae. All compounds extracted were characterized by GC-MS and their fungistatic potential determined measuring the minimum inhibitory concentration (MIC) of these compounds, which expresses the ability of these compounds to inhibit the conidial germination of this fungus entirely. The aldehyde (E)-2-decenal was the most harmful to M. anisopliae germination, with MIC of 0.003% (30 ppm) compared to the (E)-2-hexenal and (E)-2-octenal, which in turn showed MIC of 0.012 and 0.025%, respectively. Chapter 3 (Effect of pesticides used in conventional rice cultivation with the entomopathogenic fungus M. anisopliae.) Describes the assessment of the compatibility of M. anisopliae to eight insecticides, five herbicides and four fungicides registered for rice cultivation. In this study we evaluated the germination (GER), vegetative growth (VG) and sporulation (ESP) of the fungus after three hours in the mixture, stirring with agrochemicals. The parameters evaluated were the fungus equated using the following formula: BI = [(VG * 47) + (ESP * 43) + (10 * GER)] / 100, in which through the biological index value (BI) was possible to determine the compatibility level of agrochemicals to the fungus. Among the tested pesticides, insecticides Bravic™, Actara™, Karate Zeon™; herbicide Roundup™, Basagran™, Kifix™ and fungicide Priori ™ were the only products compatible with M. anisopliae. Chapter 4 (enhanced pathogenicity toT. limbativentris with sublethal doses of chemical insecticides.) describes the interaction of M. anisopliae combined with sublethal concentrations of thiamethoxam against adults of T. limbativentris. This combination as hypothesis has to overcome the natural chemical resistance of T. limbativentris to M. anisopliae. The results showed that T. limbativentris was more susceptible to M. anisopliae (strain CG-168) associated with sublethal doses of thiamethoxam (Actara™) or lambda-cyhalothrin (Karate Zeon™) than the fungus alone. In addition, the optimum concentration was observed for the fungus at 5x107 conidia combined with concentrations of the insecticide thiamethoxam. The fungus in xxi this concentration mixed with thiamethoxam at 3.1 ppm caused 80% adult mortality, whereas the mortality rates in treatments with the fungus and 3.1 ppm thiamethoxam both applied alone were 38 and 35% respectively. Sublethal doses of Actara™ (3.1 ppm) and Karate Zeon™ (186 ppm) was estimated by Probit equation. For the purpose of using a commercial strain of M. anisopliae, the virulence of strain CG-168, used in all previous tests, was compared to strain 1037-ESALQ, registered commercially. According to the results both strains had similar virulence to adult T. limbativentris. commercially registered in Brazil market. According to the results, adults of T. Limbativentris were similarly susceptible to both strains of M. anisopliae. In the field experiment, five treatments were prepared: Fungus + Actara™ sublethal dose (50g ha), Fungus, Actara™ sublethal dose (50g./ha) Actara™ full dose (200g./ha) and control; which were applied on rice plants infested with insects inside nylon cages under field conditions. After seven and 14 days of application, 20 insects were collected from each cage and evaluated in the laboratory. According to the results, the evaluation of the first collection, mixture of M. anisopliae with 50g/ha Actara™ caused 54% mortality compared with 40, 32, 26 and 18% respectively for the full dose of Actara™ (200g/ha), fungus alone, Actara™ sublethal dose (50g/ha) and control. In the second collection, fungus + Actara™ highlightedin relation to the others, causing a 50% mortality, while treatment with the fungus alone the mortality was16% and the others treatment was 0% As a result, we found a synergism effect between fungus and sublethal dose of the insecticide. In summary, our results highlight the potential of sublethal concentrations of the neonicotinoid insecticide thiamethoxan in increasing the susceptibility of adults of T. Limbativentris to the fungus M. anisopliae. In fact, this strategy consists in a control method effective and feasible to combat this stink rice bug in the field from a viewpoint of an integrated pest management and sustainability. / O presente estudo foi dividido em capítulos que inclui diversos aspectos da interação entre o fungo entomopatogênico M. anisopliae com o percevejo do colmo do arroz T. limbativentris como se seguem: O capítulo 1 (Considerações teóricas) descreve uma introdução sobre os elementos envolvidos neste estudo como: A importância da cultura do arroz para o Brasil, assim como aspectos sócio-econômicos e fitossanitário dessa cultura. O mesmo capítulo também aborda informações sobre o percevejo do colmo do arroz, Tibraca limbativentris stal (1869) como aspectos morfológicos, biológicos, importância como praga e métodos de controle químico e biológico. Sobre o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin esse capítulo aborda aspectos gerais como taxonomia, morfologia, processo de infecção desse fungo aos seus hospedeiros e fatores de virulência. Para finalizar o capítulo foi explorado o assunto sobre ecologia química abordando as interações interespecíficas e intraespecíficas entre os insetos da família pentatomidae com ênfase nos estudos sobre compostos de defesas já elucidados nesta família de insetos. O capítulo 2 (Toxicidade de compostos extraídos da Glândulas Metatorácica (GMT), de adultos, e da Abdominal Dorsal (GAD), de ninfas, de T. limbativentris a M. anisopliae) descreve os resultados relacionados a diferença de susceptibilidade entre os estágios de vida do T. limbativentris ao fungo M. anisopliae e correlaciona estes resultados a atividade fungitóxica dos aldeídos (E)-2-octenal e (E)-2-decenal, extraído da glândula metatorácica (MTG) de adultos, e também o (E)-2-hexenal, extraído da glândula abdominal dorsal (DAG) nos estágios ninfais de segundo a quinto instar deste percevejo, por meio de coleta de exúvias. Todos os compostos extraídos foram caracterizados por CG-EM e o potencial fungitóxico determinado por meio da concentração inibitória mínima (MIC) desses compostos capaz de inibir totalmente a germinação do fungo. O aldeído (E)-2-decenal foi o mais ativo, apresentando MIC de 0,003% (30 ppm), em comparação com o (E)-2-hexenal e o (E)-2-octenal que apresentaram MIC de 0,012 e 0,025% respectivamente. O capítulo 3 (Efeito de agroquímicos convencionais utilizados na cultura do arroz ao fungo M. anisopliae.) descreve a avaliação da compatibilidade do M. anisopliae à oito inseticidas, cinco herbicidas e quatro fungicidas registrados para a cultura do arroz. Neste trabalho avaliou-se a germinação (GER), o crescimento vegetativo (CV) e a esporulação (ESP) do fungo após três horas em mistura, sob agitação, com os agroquímicos. Os parâmetros avaliados do fungo foram equacionados segundo a fórmula: IB = [(CV*47)+(ESP*43)+(GER*10)]/100; no qual através do valor índice biológico (IB) determinou-se a seletividade dos agroquímicos ao fungo. Entre os agroquímicos testados, os inseticidas Bravic™, Actara™, Karate Zeon™; os herbicidas Roundup™, Basagran™, Kifix™ e o fungicida Priori™ foram compatíveis ao M. anisopliae. No entanto, o fungicida Priori™ retardou a germinação do fungo, até 20 horas após o contato nenhum conídio germinado foi observado neste tratamento e após 48 horas foi observado 43% germinação. O capítulo 4 (Aumeto da patogenicidade de M. anisopliae a T. limbativentris com doses subletais de inseticidas químicos.) descreve a interação do M. anisopliae combinado com concentrações subletais de tiametoxam contra adultos do T. limbativentris. A combinação tem como hipótese superar resistência química natural do T. libentriventris ao M. anisopliae. Os resultados mostraram que o T. limbativentris foi mais susceptível ao M. anisopliae associado a doses subletais de tiametoxam (Actara™) ou λ-cialotrina (Karate Zeon™) do que ao xix fungo isolado. E ainda foi verificado uma concentração ótima para o fungo (5x107 conídios.mL), através de correlação com concentrações do inseticida tiametoxam. O fungo nesta concentração misturado ao tiametoxam a 3.1 ppm causou mortalidade de 80%, enquanto a taxa de mortalidade nos tratamentos com o fungo isolado e o tiametoxam 3.1 ppm foi de 38 e 35% respectivamente. As doses sobletais de Actara™ (3,1ppm) Karate Zeon™ (186ppm) foi estimada pela equação Probit. Com a intenção de utilizar uma cepa comercial do M. anisopliae foi comparada a virulência da cepa CG-168, utilizadas em todos os ensaios anteriores, com a cepa ESALQ-1037, registrada comercialmente. Segundo resultados ambas as cepas tiveram virulência semelhante para adultos de T. limbativentris. No experimento de campo, foram preparados cinco tratamentos: Fungo + Actara™ dose subletal (50g/há), Fungo, Actara™ dose subletal (50g/há), Actara™ dose cheia (200g/ha) e o controle; os quais foram aplicados nos insetos contidos em gaiolas em campo. Após um e sete dias da aplicação, foram coletados 20 insetos de cada gaiola e avaliados em laboratório. Segundo resultados, na avaliação da primeira coleta, o tratamento com a mistura do M. anisopliae com 50g/ha Actara™ apresentou taxa de mortalidade 54% contra 40, 32, 26 e 18% respectivamente para os tratamentos Actara™ dose cheia (200g/ha), Fungo, Actara™ dose subletal (50g/há) e Controle. Na avaliação da segunda coleta, o tratamento com o fungo + Actara™ destacou em relação aos demais, causando taxa de mortalidade de 50% enquanto o tratamento com o fungo isolado foi de 16% e os demais de 0%. Nesta avaliação constatou-se um sinergismo entre o fungo e a dose subletal do inseticida. Em resumo, nossos resultados destacam o potencial de concentrações subletais do inseticida tiametoxam (neonicotinóide) em aumentar a susceptibilidade dos adultos de T. limbativentris ao fungo M. anisopliae. Na verdade, esta estratégia consiste em um método de controle eficaz e viável para combater o percevejo do colmo do arroz em campo, do ponto de vista de um manejo integrado pragas com sustentabilidade.