In this study, resolution of racemic mandelic acid by enyzme enhanced ultrafiltration (EEUF) was studied. In order to develop a methodology, bovine serum albumin (BSA) was used as a model protein for polymer enhanced ultrafiltration (PEUF) experiments and the enzyme S-mandelate dehydrogenase was used for EEUF experiments. To be used for enzyme enhanced ultrafiltration experiments, the gene which is responsible from the production of S-mandelate dehydrogenase was isolated from Pseudomonas putida, expressed in Escherichia coli and the recombinant enzyme was produced. For PEUF experiments, effects of pH and ligand ratio were investigated. Total retention of mandelic acid increased with decrease in pH and total retention of mandelic acid reached to a maximum value of 74.4% at pH 4.3. For EEUF experiments, pH and ligand ratio effect on total retention, enantiomeric excess, enantioselectivity were investigated. Although apoenzyme was tried to be obtained by diafiltration and conversion was tried to be prevented, conversion occured especially at high pH values. To create the apoenzyme effect, three methods were studied. Enzyme conversion was prevented by sodium sulfite inhibition but enzyme did not retain mandelic acid. By oxygen saturation of enzyme, conversion was prevented, binding was achieved but enzyme showed no enantioselectivity. When the enzyme was diafiltrated at pH 10.0, total mandelic acid retention, enantiomeric excess and enantioselectivity reached to 77.2%, 38.9%, 2.27, respectively and the enzyme selectivity was reversed as R-selective.

For complete degradation of hemicellulose into its monomers from lignocellulose biomass, the synergistic action of a broad range of hydrolytic enzymes is needed. Therefore, production of enzymes from their natural producer is desirable. To obtain a powerful b-1,4-endoxylanase producing fungus, 304 environmental samples were collected from various locations in Singapore, leading to 603 isolates. Among them, 71 exhibiting b-1,4-endoxylanase activity were identified belonging mainly to the genera of Aspergillus, Penicillium, and Trichoderma. Further analysis revealed Aspergillus niger DSM 26641 as a potential and stable b-1,4-endoxylanase producer, being able to grow in hydrothermal lignocellulose hydrolysate exhibiting its maximal b-1,4-endoxylanase activity at pH 4 and 60◦C. This strain is thought to be very suitable for lactic acid production in a simultaneous saccharification and fermentation at pH values below 5.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-05-12T11:13:08Z No. of bitstreams: 1 2016 - Michele Rodrigues Francisco.pdf: 1285744 bytes, checksum: 598c2fe8a98038b9745debaf13625959 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T11:13:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Michele Rodrigues Francisco.pdf: 1285744 bytes, checksum: 598c2fe8a98038b9745debaf13625959 (MD5) Previous issue date: 2016-05-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Trichoderma spp. They are not pathogenic fungi and develop in substrates and diverse environmental conditions. Identification based only on morphological characteristics is considered complex, due to the genetic diversity of the species. Therefore, the taxonomy of the genus Trichoderma is performed with the aid of other analyzes such as biochemical and molecular changes. Some species are capable of producing high amounts of extracellular enzymes involved in the hydrolysis of polysaccharides are thus considered fungi with high potential in the production of hydrolytic enzymes. The aim of this study was to select and identify the species of the genus Trichoderma spp. And evaluate the production of industrial enzymes these isolates. They identified 58 isolates of Trichoderma spp fungi. soil and plants by morphological and molecular analysis and was also evaluated the enzymatic production capacity. Enzyme technology is a promising area in new technologies for synthesis of compounds with high added value, where biocatalisados industrial processes have a lower environmental impact, lower energy cost, because the enzymes are biodegradable substances and have specificity to minimize the undesirable effects. In this work, we used PDA culture medium for development of fungi. Morphological identification is achieved using the identification key according to Samuels et al. (2015) Molecular and held by DNA extraction from the mycelium of fungi in accordance with CTAB protocol. For enzyme analysis, qualitative assays were performed, used specific means of solid culture to evaluate the production of hydrolytic enzymes: Where the culture media containing as a substrate for development and enzyme production of Trichoderma spp. skimmed milk production peptidase; soluble starch for the production of amylase, cellulase production carboxymethylcellulose, citrus pectin for the production of pectinase and yeast extract, dextrose, ferrous sulfate, ammonium, magnesium, manganese and potassium chloride for the production of phytase. According to the results, the morphological analysis identified 4 species such as T. atroviride, T .asperelloide, T. harzianum, T. longibrachiatum, these species were verified by molecular analysis. In relation to the enzyme potential, the result was negative for the activity of peptidase enzymes, cellulase and pectinase and positive for amylase, and the activity of the enzyme phytase, only an isolated was positive, this was identified according to morphological analysis as It is the species T. longibrachiatum / Os Trichoderma spp. n?o s?o fungos patog?nicos e se desenvolvem em diversificados substratos e condi??es ambientais. Sua identifica??o baseada apenas em caracter?sticas morfol?gicas ? considerada complexa, por conta da diversidade gen?tica das esp?cies. Portanto, a taxonomia do g?nero Trichoderma ? realizada com o aux?lio de outras an?lises, tais como bioqu?micas e moleculares. Algumas esp?cies s?o capazes de produzir elevadas quantidades de enzimas extracelulares envolvidas na hidr?lise de polissacar?deos, sendo assim considerados fungos com alto potencial na produ??o de enzimas hidrol?ticas. O objetivo deste estudo foi selecionar e identificar as esp?cies do g?nero Trichoderma spp. e avaliar a produ??o de enzimas industriais destes isolados. Foram identificados 58 isolados de fungos Trichoderma spp. de solo e plantas por an?lise morfol?gica, molecular e tamb?m foi avaliado a capacidade de produ??o enzim?tica. A Tecnologia enzim?tica ? uma ?rea promissora dentro das novas tecnologias para s?ntese de compostos que possuem alto valor agregado, onde os processos industriais biocatalisados apresentam menor impacto ambiental, menor custo de energia, pois as enzimas s?o subst?ncias biodegrad?veis e possuem especificidade que minimizam os efeitos indesej?veis. Neste trabalho, foi utilizado meio de cultura BDA para desenvolvimento dos fungos. A identifica??o morfol?gica foi realizada com aux?lio da chave de identifica??o de acordo com Samuels et al. (2015) e molecular, realizada atrav?s da extra??o de DNA do mic?lio dos fungos, de acordo com protocolo CTAB. Para as an?lises enzim?ticas, foram realizados ensaios qualitativos, utilizado meio de cultura s?lido espec?fico para avaliar a produ??o de enzimas hidrol?ticas: Onde os meios de cultura continham como substrato para desenvolvimento e produ??o enzim?tica dos isolados de Trichoderma spp. leite desnatado para produ??o de peptidase; amido sol?vel para produ??o de amilase, carboximetilcelulose para produ??o de celulase, pectina c?trica para produ??o de pectinases e extrato de levedura, dextrose, sulfato ferroso, am?nio, magn?sio, mangan?s e cloreto pot?ssio para produ??o de fitase. De acordo com os resultados, a an?lise morfol?gica identificou 4 esp?cies, tais como: T. atroviride, T. asperelloide, T. harzianum, T. longibrachiatum, estas esp?cies foram confirmadas por an?lise molecular. J? com rela??o ao potencial enzim?tico, o resultado foi negativo para a atividade das enzimas peptidase, celulase e pectinase e positivo para amilase, e para a atividade da enzima fitase, somente um isolado apresentou resultado positivo, este foi identificado de acordo com an?lise morfol?gica como sendo da esp?cie T. longibrachiatum

Background: Cyclodextrin glucanotransferases (CGTases) catalyze the synthesis of cyclodextrins, cyclic oligosaccharides composed of glucose monomers that find applications in the pharmaceutical, food, and cosmetic industries. An economic application of these industrially important enzymes requires their efficient production and recovery. In this study, the effect of Sec-type signal peptides on the recombinant expression of a CGTase derived from Bacillus sp. G825-6 was investigated in Escherichia coli BL21(DE3) using a codon-adapted gene. In addition, a novel purification method for the CGTase using starch adsorption was developed. Results: Expression vectors encoding N-terminal PelB, DacD, and the native Bacillus sp. G825-6 CGTase signal peptides (SP) were constructed for the recombinant CGTase. With the DacD SP derived from E. coli, a 3.9- and 3.1-fold increase in total enzyme activity was obtained compared to using the PelB and the native CGTase SP, respectively. DacD enabled a 7.3-fold increase of activity in the extracellular fraction after induction for 24 h compared to the native CGTase SP. After induction for 48 h, 75% of the total activity was detected in the extracellular fraction. By a batch wise adsorption to starch, the extracellular produced CGTase could be purified to homogeneity with a yield of 46.5% and a specific activity of 1637 U/mg. Conclusions: The signal peptide DacD promoted the high-level heterologous extracellular expression of a recombinant CGTase from Bacillus sp. G825-6 with a pET20b(+) vector in E. coli BL21(DE3). A protocol based on starch adsorption enabled a fast and efficient purification of the recombinant enzyme.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

Die enzymatischen Transformationen mit der pilzlichen Peroxygenase aus Agrocybe aegerita haben gezeigt, dass das Enzym insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide verfügt. Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert. Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO bei Flavonoiden läuft über eine Epoxidstufe ab, wobei der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen dem Wasserstoffperoxid entstammt (Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion). Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen gehemmt. Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der Extraktzugabe beobachtet werden. Der positive bzw. negative Einfluss auf die Enzymproduktion ist bei Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf das Lösungsmittel Ethanol zurückzuführen.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sugarcane bagasse is an abundant lignocellulosic residue in traditional regions of sugar and ethanol production in Brazil. It is not only a potential substrate for second generation ethanol production but also have structural features to be classified as good inducer for cellulases production by microorganisms. However, the high cost of cellulases industrial production is the major bottleneck in the hydrolysis of this raw material for subsequent fermentation, which makes unfeasible in large scale the ethanol production using this process. In this context, the development of more efficient and less expensive fermentation processes for industrial cellulases production, as well as better alternatives of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material is crucial to achieve economic feasibility in this process. For this purpose, this work aims to develop a cellulase production process using Trichoderma reesei, as well as assessing the use of produced enzymatic extract in sugarcane bagasse hydrolysis, in order to evaluate the ultrasound effects in the hydrolysis process. The optimized process of cellulases production consisted in five days of grow in pre-inoculum Petri dishes, followed by two days of grow in optimized liquid medium and four days of solid state fermentation, using sugarcane bagasse supplemented with 1% of soybean bran and 15% (v/w) of corn steep liquor as substrate, moisture of 65%, 28±1°C and 0.5 mL of inoculum per gram of substrate. This experimental condition in bench scale (5 g) resulted in a production of 1.4 FPU/g of cellulases, and the production was approximately three-fold high in a fixed-bed bioreactor with forced aeration for 70 g of substrate capacity. For ultrasound assisted enzymatic hydrolysis using an ultrasound bath, the condition that achieved higher efficiencies were 43.4±2°C and 18.5% (v/v) of enzyme concentration, resulting in a maximal hydrolysis efficiency of 229 grams of reducing sugar per kilogram of used substrate, achieving an average increase of 12% in efficiency in those experiments where the hydrolysis was assisted by ultrasound compared with those without sonication. Regarding the saccharification using the ultrasonic probe, results using the indirect sonication during process were, on average, 158% higher than those using the direct sonication. Thus, it can be concluded that indirect sonication is more suitable to be used as an auxiliary in the hydrolysis, since the direct sonication can cause denaturation of the enzyme, reducing the process efficiency. / O bagaço de cana-de-açúcar (BC) é um resíduo lignocelulósico abundante em regiões sucroalcooleiras no Brasil e é um potencial substrato para produção de etanol de segunda geração, além de possuir características estruturais que o classificam como bom indutor para produção de celulases por microrganismos. O alto custo da produção industrial de celulases, no entanto, é um grande empecilho na hidrólise desse tipo de material para posterior fermentação, o que inviabiliza a utilização desse processo na produção de etanol em larga escala. Nesse contexto, o desenvolvimento de processos de fermentação mais eficientes e de menor custo para a produção de celulases em escala industrial, bem como alternativas mais eficazes de hidrólise enzimática desse material são necessários a fim de viabilizar economicamente o processo. Para essa finalidade, esse trabalho tem como proposta o desenvolvimento de um processo para produção de celulases utilizando uma cepa do fungo filamentoso Trichoderma reesei, bem como a utilização do extrato enzimático produzido na hidrólise enzimática de bagaço a fim de avaliar os efeitos do ultrassom no processo. O processo otimizado de produção das celulases consistiu em cinco dias de crescimento do pré-inóculo em placas de Petri, seguido de dois dias de crescimento em meio líquido otimizado, e quatro dias de FES de BC suplementado com 1% de farelo de soja (FS) e 15% de água de maceração de milho (AMM), 65% de umidade, 28±1°C e densidade de 0,5 mililitros de inóculo por grama de substrato. Essa condição experimental em escala de bancada (5 g) resultou em uma produção de 1,4 FPU/g, valor esse que aumentou aproximadamente três vezes com o aumento de escala de produção em um biorreator de leito fixo com aeração forçada com capacidade para 70 g de substrato. Para hidrólise enzimática assistida por banho de ultrassom, a condição que atingiu melhores eficiências foi de 43,4±2°C e 18,5% (v/v) de concentração de enzima, atingindo um máximo de 229 gramas de açúcares redutores por quilograma de substrato utilizado, e foi observado um aumento médio de 12% na eficiência de hidrólise naqueles experimentos em que a hidrólise foi assistida por ultrassom. Já nas sacarificações utilizando a sonda ultrassônica, os resultados utilizando sonicação indireta durante a sacarificação foram, em média, 158% maiores que aqueles utilizando sonicação direta. Dessa forma, conclui-se que a utilização de sonicação indireta é mais indicada como auxiliar nas hidrólises, uma vez que a sonicação direta pode causar desnaturação da enzima e diminuir a eficiência do processo.

Die enzymatischen Transformationen mit der pilzlichen Peroxygenase aus Agrocybe aegerita haben gezeigt, dass das Enzym insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide verfügt. Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert. Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO bei Flavonoiden läuft über eine Epoxidstufe ab, wobei der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen dem Wasserstoffperoxid entstammt (Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion). Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen gehemmt. Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der Extraktzugabe beobachtet werden. Der positive bzw. negative Einfluss auf die Enzymproduktion ist bei Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf das Lösungsmittel Ethanol zurückzuführen.