Le fonctionnement du cortex cérébral nécessite l’action coordonnée de deux des sous-types majeurs de neurones, soient les neurones à projections glutamatergiques et les interneurones GABAergiques. Les interneurones GABAergiques ne constituent que 20 à 30% des cellules corticales par rapport au grand nombre de neurones glutamatergiques. Leur rôle est toutefois prépondérant puisqu’ils modulent fortement la dynamique et la plasticité des réseaux néocorticaux. Il n’est donc pas surprenant que les altérations de développement des circuits GABAergiques soient associées à plusieurs maladies du cerveau, incluant l’épilepsie, le syndrome de Rett et la schizophrénie. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant le développement des circuits GABAergiques est une étape essentielle menant vers une meilleure compréhension de la façon dont les anormalités se produisent. Conséquemment, nous nous intéressons au rôle de l’acide polysialique (PSA) dans le développement des synapses GABAergiques. PSA est un homopolymère de chaînons polysialylés en α-2,8, et est exclusivement lié à la molécule d’adhésion aux cellules neuronales (NCAM) dans les cerveaux de mammifères. PSA est impliqué dans plusieurs processus développementaux, y compris la formation et la plasticité des synapses glutamatergiques, mais son rôle dans les réseaux GABAergiques reste à préciser. Les données générées dans le laboratoire du Dr. Di Cristo démontrent que PSA est fortement exprimé post- natalement dans le néocortex des rongeurs, que son abondance diminue au cours du développement, et, faits importants, que son expression dépend de l’activité visuelle i et est inversement corrélée à la maturation des synapses GABAergiques. La présente propose de caractériser les mécanismes moléculaires régulant l’expression de PSA dans le néocortex visuel de la souris. Les enzymes polysialyltransférases ST8SiaII (STX) et ST8SiaIV (PST) sont responsables de la formation de la chaîne de PSA sur NCAM. En contrôlant ainsi la quantité de PSA sur NCAM, ils influenceraient le développement des synapses GABAergiques. Mon projet consiste à déterminer comment l’expression des polysialyltransférases est régulée dans le néocortex visuel des souris durant la période post-natale; ces données sont à la fois inconnues, et cruciales. Nous utilisons un système de cultures organotypiques dont la maturation des synapses GABAergiques est comparable au modèle in vivo. L’analyse de l’expression génique par qPCR a démontré que l’expression des polysialyltransférases diminue au cours du développement; une baisse majeure corrélant avec l’ouverture des yeux chez la souris. Nous avons de plus illustré pour la première fois que l’expression de STX, et non celle de PST, est activité-dépendante, et que ce processus requiert l’activation du récepteur NMDA, une augmentation du niveau de calcium intracellulaire et la protéine kinase C (PKC). Ces données démontrent que STX est l’enzyme régulant préférentiellement le niveau de PSA sur NCAM au cours de la période post-natale dans le cortex visuel des souris. Des données préliminaires d’un second volet de notre investigation suggèrent que l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN pourraient également contribuer à la régulation de la transcription de cette enzyme durant le développement. Plus d’investigations seront toutefois nécessaires afin de confirmer cette hypothèse. En somme, la connaissance des mécanismes par lesquels l’expression des ii polysialyltransférases est modulée est essentielle à la compréhension du processus de maturation des synapses GABAergiques. Ceci permettrait de moduler pharmacologiquement l’expression de ces enzymes; la sur-expression de STX et/ou PST pourrait produire une plus grande quantité de PSA, déstabiliser les synapses GABAergiques, et conséquemment, ré-induire la plasticité cérébrale. / The functioning of the cerebral cortex requires coordinated action of two major neuronal subtypes - the glutamatergic projection neurons and the GABAergic interneurons. GABAergic interneurons represent 20 to 30% of all cortical cells. Even though they are a minor cell population in the cerebral cortex compared to glutamatergic neurons, they are key modulators of network dynamics and plasticity of neocortical circuits. It is therefore not surprising that aberrant development of GABAergic circuits is implicated in many neurodevelopmental disorders including epilepsy, Rett syndrome and schizophrenia. Understanding the molecular mechanisms governing the development of GABAergic inhibitory synapses in neocortex is important towards a better comprehension of how abnormalities in this developmental process can occur. Therefore, we focus specifically on the role of polysialic acid (PSA) in the development of GABAergic synapses. PSA is a α-2,8 polysialylated homopolymer, which is exclusively linked to the Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) in the mammalian brain. It is involved in several developmental processes including formation and plasticity of glutamatergic synapses; however its role in GABAergic circuit formation has not been explored so far. Previously in Dr Di Cristo’s lab, we showed that PSA is strongly expressed post-natally and its expression steadily declines during development in mice neocortex. We also showed that the developmental and activity-dependant regulation of PSA expression is inversely correlated with the maturation of perisomatic GABAergic innervation. Our aim is to characterize the molecular mechanisms regulating PSA expression in mouse iv visual cortex during post-natal development. Two polysialyltransferases, ST8SiaII (STX) and ST8SiaIV (PST), are responsible for PSA attachment to NCAM. By controlling the amount of PSA on NCAM, they can influence GABAergic synapses development. The mechanisms regulating STX and PST expression is crucial but remain still unknown. My research project focused on the mechanisms regulating STX and PST transcription in the mouse postnatal cortex. We used an organotypic culture system, which recapitulates many aspects of GABAergic synapse maturation as observed in vivo. Polysialyltransferases transcript levels were measured by qPCR and showed that STX and PST mRNA levels steadily decline during post-natal development in the mouse cortex; the sharpest reduction in the expression of both enzymes correlate with eye opening. We further demonstrate for the first time that STX mRNA levels is activity-dependant, requires the activation of NMDA receptors, an increase in intracellular Calcium levels and is PKC-dependent. Altogether, we show that the regulation of the expression of STX is the main mechanism responsible for PSA expression levels in the cortex around eyes opening. We next investigated whether epigenetic mechanisms regulate STX transcription and preliminary data suggest that histone acetylation and DNA methylation may contribute to STX expression during development. However, further experiments are required to confirm this hypothesis. In summary, understanding the mechanisms modulating STX and PST expression in the neocortex is essential for the comprehension of their precise role in GABAergic synapse maturation. This knowledge could allow us to modulate pharmacologically the expression of these enzymes; in turn overexpression of STX and PST may re-induce PSA expression, thereby destabilizing GABAergic synapses, and ultimately facilitating cortical plasticity in the adult.

Implications des complexes Polycomb et Trithorax au cours du développement précoce chez Ciona intestinalisLes protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) ont été initialement découvertes chez Drosophila melanogaster. Ces deux groupes sont classiquement connus pour leurs rôles respectifs de répresseurs et d'activateurs épigénétiques qui contrôlent et maintiennent les états chromatiniens au cours du temps. Ces facteurs régulent de nombreux gènes cibles dont les gènes homéotiques. Au cours de ma thèse, j'ai étudié trois composants de ces deux groupes : Enhancer of zeste (E(z)), appartenant au complexe PRC2 du PcG et responsable du dépôt de la marque de répression génique H3K27me3, Polyhomeotic (Ph), appartenant au complexe PRC1 du PcG et dont le rôle exact reste à déterminer, et Trithorax (Trx), appartenant au complexe TAC1 du TrxG et responsable du dépôt de la marque d'activation génique H3K4me3. Jusqu'à présent, aucune étude n'a abordé la régulation épigénétique via les PcG et TrxG chez l'ascidie solitaire Ciona intestinalis. Cette espèce présente un cluster des gènes Hox désorganisé et ne possède pas la protéine Polycomb (Pc) du PRC1, responsable de la reconnaissance de la marque de répression H3K27me3 déposée par la protéine E(z).Nos travaux montrent que la protéine E(z) est fonctionnelle et conserve son activité méthyltransférase sur le résidu H3K27 chez Ciona intestinalis. Nous avons ensuite observé, par des expériences de knockdown par micro-injection de morpholinos, que les inhibitions protéiques d'E(z), Ph et Trx ont des conséquences dramatiques sur la différenciation et la mise en place des différents tissus au cours du développement larvaire, notamment sur la mise en place de la notochorde puisque celle-ci est totalement absente chez les morphants E(z) et Ph. Les défauts de phénotype du morphant E(z) sont corrélés à la perte du dépôt d'H3K27me3 et nous avons mis en évidence, lors de l'inhibition d'E(z), une dérépression des gènes tissu-spécifiques impliqués dans le développement embryonnaire précoce alors que les gènes tardivement exprimés sont réprimés. De plus, l'expression des gènes Hox n'est pas significativement modifiée au cours du développement embryonnaire lorsque la protéine E(z) est inhibée, à l'exception du gène Hox12 qui est déréprimé, comme attendu.L'ensemble de ces résultats permet d'émettre l'idée innovante selon laquelle les protéines des PcG et TrxG jouent un rôle déterminant dans la régulation de l'expression génique lors de l'embryogénèse de Ciona intestinalis tout en ayant une implication mineure dans la régulation de l'expression des gènes Hox à ce stade du développement. / Implications of Polycomb and Trithorax complexes in the early development of Ciona intestinalisPolycomb and Trithorax group (PcG and TrxG) proteins were discovered originally in Drosophila melanogaster. Both groups are classically known for their roles in the maintenance of silenced and active chromatin states over time, respectively. These factors regulate many target genes including the homeotic genes. During my PhD, I studied three components of these two groups: Enhancer of zest (E(z)), belonging to the PRC2 complex of PcG and responsible for H3K27me3 mark deposit for gene repression, Polyhomeotic (Ph), belonging to the PRC1 complex of PcG whose role remains to be determined, and Trithorax (Trx), belonging to the TAC1 complex of TrxG and responsible for H3K4me3 mark deposit for gene activation. Until now, no study addresses the epigenetic regulation mediated by PcG and TrxG in the solitary ascidian Ciona intestinalis. This specie has a disorganized Hox cluster and in which the Polycomb (Pc) protein of PRC1, responsible for the recognition of the repressive H3K27me3 mark, is absent.Our work shows that the E(z) protein is functional and retains its methyltransferase activity on H3K27 residue in Ciona intestinalis. Then, we demonstrated, by knockdown experiments with morpholino microinjection, that the inhibition of E(z), Ph and Trx has dramatic consequences on differentiation and on the establishment of different tissues during larval development, particularly on the notochord establishment since it is totally absent in E(z) and Ph morphants. E(z) morphant phenotypic defects are correlated with lack of H3K27me3 mark deposit and we highlighted that, during the E(z) inhibition, tissue-specific genes implied in early development are de-repressed while late-expressed genes are down-regulated. In addition among Hox genes, only Hox12 expression is significantly modified and found to be de-repressed in E(z) morphant context, as expected.Altogether, our results present the innovative idea that the PcG and TrxG proteins play a major role in the gene expression regulation during embryogenesis of Ciona intestinalis while having a minor involvement in the regulation of Hox genes expression at this stage of development.

Les protéines à « Methyl-CpG-binding domain » (MBD) jouent un rôle important dans l’interprétationde la méthylation de l’ADN conduisant à la répression transcriptionnelle via le recrutement decomplexes remodelant la chromatine. Dans les cancers, MBD2 jouerait un rôle essentiel dans la perted’expression des gènes hyperméthylés. Ainsi, MBD2 serait une cible potentielle pour rétablir, enpartie au moins, leur expression. Caractériser, à l’échelle du génome, la distribution de MBD2 et sesconséquences sur la répression transcriptionnelle au cours de la cancérogenèse est donc une étapeincontournable. (1) L’impact sur l’expression génique de l’inhibition de MBD2 par interférence àl’ARN, a été étudié en utilisant des puces, dans des cellules normales MRC5. La perte de MBD2n’induit pas de surexpression génique globale et la densité en CpG des promoteurs méthylés sembleêtre une composante importante dans la force de répression par MBD2. (2) Les profils de méthylationde l’ADN, de liaisons de MBD2 et de l’ARN polymérase II dans les cellules HeLa ont été analysés parChIP-on-chip avec des puces promoteurs. Ces mêmes approches couplées à l’analyse de l’acétylationdes histones H3 ont été réalisées dans un modèle cellulaire syngénique de progression tumoralemammaire humain. Dans les modèles étudiés, une forte proportion de gènes silencieux et méthylés estliée par MBD2. Les comparaisons entre cellules immortalisées et transformées ne montrent pas dechangements majeurs de la méthylation de l’ADN ou de la répression transcriptionnelle, par contreune redistribution de MBD2 parmi ces sites est observée, suggérant une redondance entre les protéinesliant l’ADN méthylé. / The Methyl-CpG-Binding Domain (MBD) proteins represent key molecules in the interpretation ofDNA methylation signals leading to gene silencing through recruitment of chromatin remodelingcomplexes. In cancer, a member of this protein family, MBD2, seems to play an important role in theloss of expression of aberrantly methylated genes. Thus, MBD2 may be a potential target toreestablish their expression. Mapping of MBD2 binding sites and the relationship between MBD2binding and transcriptional activity was, therefore, a crucial step. (1) We investigated the impact ofMBD2 inhibition by RNA interference on gene expression, using microarray analysis, in a normalhuman fibroblastic cell line, MRC-5. MBD2 depletion did not induce global gene overexpression andCpG density of the methylated promoters seems to be an important parameter in the strength of thetranscriptional repression mediated by MBD2. (2) Global profiling for different layers of epigeneticmodifications (DNA methylation, MBD2 association) and RNA polymerase II binding sites in HeLacells was analyzed by a ChIP-chip method using human promoter arrays. This approach, combinedwith an analysis of H3 histone acetylation patterns, was performed in a syngenic model of breastcancer progression. In the models analyzed MBD2 appeared to be a true methylation-dependenttranscriptional repressor. Furthermore, MBD2 binds to a high proportion of methylated silent genes.Comparisons between immortalized and transformed cells did not indicate major changes of DNAmethylation or gene silencing, while a redistribution of MBD2 among these sites was observed,suggesting a redundancy between methylated binding proteins.

La formation et le stockage à long terme des souvenirs mettent en jeu le processus de consolidation mnésique. S’il est maintenant bien admis que ce processus requiert une interaction entre la formation hippocampique et différentes régions corticales dépositaires des souvenirs, les mécanismes qui sous-tendent ce dialogue restent encore mal connus. En combinant chez le rat des approches comportementale, d’imagerie cellulaire et d’inactivations pharmacologiques des voies de signalisation intracérébrales impliquées dans l’épigenèse, nous avons cherché dans ce travail de thèse à élucider certains des mécanismes responsables de la formation des souvenirs au niveau cortical. Dans la perspective de pouvoir appréhender de façon temporellement précise le dialogue hippocampo-cortical au cours du processus de consolidation à l’échelle systémique, notre premier objectif a été de valider une épreuve comportementale adaptée à l’étude de ce processus, la transmission sociale de préférence alimentaire. Nos résultats ont montré que cette tâche, qui ne nécessite qu’une phase d’acquisition ponctuelle, induit une mémoire robuste et durable. Cette mémoire s’appuie sur des stimuli olfactifs de nature non spatiale. Son caractère associatif nécessite l’implication fonctionnelle de l’hippocampe et de régions corticales spécifiques comme le cortex orbitofrontal qui joue un rôle crucial dans le traitement d’informations de nature olfactive. Dans une deuxième série d’expériences, une approche d’imagerie cellulaire utilisant le facteur de transcription c-fos couplée à une approche pharmacologique d’inactivation transitoire région-spécifique a révélé le rôle crucial du cortex orbitofrontal dans le rappel d’informations anciennes (délai de 30 jours) mais pas récentes (délai de 1 jour). Nous avons par ailleurs mis en évidence que la consolidation des informations dans cette structure s’accompagnait de changements progressifs de l’architecture des réseaux neuronaux comme la formation de nouvelles synapses (synaptogénèse) ou l’augmentation du nombre d’épines dendritiques. En accord avec le modèle standard de la consolidation mnésique, ce recrutement cortical était associé à un désengagement de l’hippocampe, confirmant le rôle transitoire de cette structure dans le rappel à long terme d’informations olfactives associatives. Dans une troisième série d’expériences, nous nous sommes intéressés aux mécanismes pouvant sous-tendre l’établissement de la mémoire à long terme au niveau cortical. Nos résultats apportent un éclairage nouveau sur la dynamique des interactions hippocampo-corticales pendant la consolidation systémique en démontrant la nécessité d’un étiquetage des assemblées neuronales du cortex orbitofrontal dès l’encodage des informations. Un blocage de cet étiquetage par une inactivation de ce cortex au moment de l’interaction sociale (phase d’acquisition) a perturbé le rappel à long terme et empêché les modifications de l’architecture des réseaux neuronaux corticaux normalement associés au stockage à long terme des informations olfactives. Sur le plan cellulaire, cet étiquetage requiert l’activation des récepteurs NMDA et de la voie des MAPK, ainsi que l’acétylation des protéines histones impliquées dans la régulation de l’état transcriptionnel de la chromatine. En modifiant leur état d’acétylation, nous avons pu moduler positivement ou négativement le rappel à long terme des informations olfactives relatives à la préférence alimentaire. Ainsi, nos données soulignent l’importance du dialogue hippocampo-cortical dans l’établissement de la mémoire à long terme. / Abstract :

Chez les plantes et les mammifères, la méthylation de l’ADN est une modification chromatinienne qui joue un rôle pivot dans le maintien de l’intégrité des génomes, notamment au travers de l’extinction épigénétique des éléments transposables (ET). Cependant, dans la mesure où la désamination spontanée des cytosines méthylées, qui peut conduire à des transitions C>T, est plus fréquente que celle des cytosines non méthylées, la méthylation est également intrinsèquement mutagène. Cette mutabilité accrue est de fait très certainement à l’origine de la déplétion en dinucléotides CpG observée dans les génomes de mammifères, naturellement méthylés à ces sites sauf au sein des «îlots CpG». A l’exception de cet effet bien connu, aucune étude à ce jour n’a exploré directement et de façon exhaustive l’impact de la méthylation sur le spectre des mutations spontanées. Dans ce travail, je tire profit d’une population de lignées epiRIL (epigenetic recombinant inbred lines) établie chez la plante Arabidopsis pour évaluer à l’échelle du génome l’impact de la méthylation de l’ADN sur le paysage mutationnel. Les epiRILs dérivent du croisement entre deux parents quasi- isogéniques, l’un sauvage et l’autre porteur d’une mutation conduisant à une réduction de 70% de la méthylation du génome, et il a pu être mis en évidence que des différences parentales de méthylation pouvaient être héritées de façon stable pour >1000 régions le long du génome. Au moyen de données de séquençage disponibles pour >100 epiRIL, j’ai effectué la caractérisation exhaustive des variants ADN (autres qu’ET) uniques à chaque lignée mais également en ségrégation parmi les epiRIL, ce qui constitue à terme une ressource pour les différentes équipes qui utilisent cette population. En analysant le patron de variants uniques, j’ai mis en évidence une réduction spécifique du taux de transitions C>T en lien avec l’hypométhylation stable dans les epiRIL. J’ai aussi pu décrire que si la remobilisation extensive des ET dans cette population a modelé le spectre des insertions et délétions ponctuelles, elle ne se traduit pas pour autant par des réarrangements récurrents. Je présente également les développements méthodologiques mis en place afin d’effectuer la caractérisation de QTL (quantitative trait loci) “épigénétiques” préalablement identifiés dans la population. / In both plants and mammals, DNA methylation plays a pivotal role in ensuring proper genome function and integrity, notably through the epigenetic silencing of transposable elements (TEs). However, as spontaneous deamination of 5- methylcytosine (5mC), which can lead to C>T transitions, is more frequent than that of unmethylated C, DNA methylation is also inherently mutagenic. This higher mutability of 5mC has indeed been proposed to explain the depletion in CpG dinucleotides in mammalian genomes, which are typically methylated at these sites except in socalled CpG islands. Despite this well-characterized effect of DNA methylation, we still lack a comprehensive view of its impact on the whole mutation spectrum in any given organism. Here, I take advantage of a population of so-called epigenetic Recombinant Inbred Lines (epiRILs) established in the flowering plant Arabidopsis thaliana to investigate the impact of DNA methylation on the spectrum of spontaneous mutations genome wide. The epiRIL population derives from a cross between a wild-type individual and a near-isogenic mutation deficient in DNA methylation, and it could be shown that parental differences in DNA methylation are stably inherited for at least 8 generations over >1000 regions across the genome. Building on whole-genome sequencing data available for >100 epiRILs, I performed a thorough characterization of non- TE DNA sequence variants that are either private to one line or segregating in the population, therefore establishing a resource for research groups that make use of the epiRIL population. Based on the pattern of private variants, I show a specific reduction in the rate of C>T transitions in the epiRILs, in line with the heritable hypomethylation in this population. I also describe that the extensive TE remobilisation at play among the epiRILs shapes the spectrum of short insertions and deletions yet does not translate into recurrent large-scale mutation events. On another note, I also present methodological developments aimed towards the identification of causal (epi)variants underlying so-called “epigenetic QTL” (quantitative trait loci) previously described in the epiRIL population.

O desenvolvimento infantil inclui dimensões interdependentes que abrangem os ajustes fisiológicos às perturbações, com a modulação de genes via mecanismos epigenéticos em resposta às influências do ambiente físico e social que, por sua vez, moldam a saúde e o desenvolvimento da criança, refletindo-se na aprendizagem, no comportamento e no bem-estar físico e mental durante a infância e ao longo da vida. É um processo dinâmico no qual a criança passa de um indivíduo totalmente dependente de seu cuidador, para um ser que responde às percepções de forma planejada, organizada e independente. Promover as condições para que o desenvolvimento da criança ocorra de forma saudável depende de se conhecer como ele se manifesta nos diferentes aspectos ao longo do desenvolvimento infantil. No presente trabalho, foram estudados os aspectos cognição, motricidade, nutrição, metabolismo e fatores de influência epigenética durante o desenvolvimento infantil, de forma integrada e multidisciplinar, tendo, como base, pesquisas realizadas nos últimos 40 anos sobre esses aspectos; como parâmetro, os períodos sensíveis, nos quais a plasticidade é maior, sendo janelas de oportunidades para intervenções em prol da saúde e bem-estar da criança; e como apresentação, ferramentas para o acompanhamento dos marcos do desenvolvimento infantil, de sugestão de estímulos e de investigação do andamento do desenvolvimento infantil, com o objetivo de democratizar este conhecimento, tornando-o acessível e funcional a pais, educadores e cuidadores de crianças entre 0 e 6 anos de idade / Child development comprises interdependent dimensions which embrace physiological adjustments to disturbances caused by epigenetic modulations of genes in response to physical and social environmental influences, which in turn, shape the health of the child during his/her development, and reflects on his/her learning, behavior, and physical and mental well-being through his/her life span. It is a dynamic process in which the child turns from a totally dependent on his/her caregiver to a human being who responds to one who perceptions in a planned, organized and independent way. Promoting the conditions to a child healthy development depends on knowing how it manifests in different aspects through his/her development. In the present work, cognition, motricity, nutrition, metabolism, and epigenetics during child development were studied in an integrative and multidisciplinary manner based on the last 40 years of research on child development; with the use of sensitive periods as parameters, in which the plasticity is greater than in any other period in life, and which are translated into windows of opportunity for healthy interventions; and tools to keep up with child development milestones, to suggest stimuli according to a specific milestone, and to investigate the progress of child development, with the purpose of democratizing such knowledge, thus making it accessible and functional to parents, teachers and caregivers of children from zero to six years of age

Afin de protéger durablement les écosystèmes face aux rejets planifiés ou accidentels de radionucléides dans l’environnement, il est essentiel d’évaluer l’impact de l’exposition des organismes aux radiations ionisantes sur le long terme, à l’échelle de plusieurs générations. Dans ce contexte, ce travail de doctorat vise à améliorer la caractérisation des processus moléculaires et la prédiction des effets transgénérationnels lors d’une exposition aux radiations gamma. Une approche expérimentale concerne l’étude des modifications épigénétiques radio-induites, c’est-à-dire des modifications des mécanismes régulant l’activité des gènes sans modification de la séquence d’ADN elle-même et de leur transmission au fil des générations. Cette étude a permis de mettre en évidence que certaines modifications de la méthylation de l’ADN, l’un des mécanismes épigénétiques les plus étudiés, peuvent être transmises par la lignée germinale aux les générations non-exposées (génération F3) suite à une exposition parentale (génération F0) externe aux radiations gamma (6,5 µGy.h-1 et 41,3 mGy.h-1) pendant 25 jours. Dans une seconde approche, un modèle mécaniste DEBtox (Budget Energétique Dynamique appliqué à la toxicologie) est modifié pour permettre l’analyse des effets des radiations gamma sur la croissance et la reproduction de D. magna à l’échelle de plusieurs générations. Pour ce faire, on utilise des compartiments de dommage, dont le niveau peut être hérité d’une génération à la suivante. Le modèle est ajusté aux données avec des méthodes d’inférence bayésienne afin d’estimer les paramètres tout en tenant compte des incertitudes qui leur sont associées. / In order to durably protect ecosystems facing planned or accidental releases of radionuclides, the long-term impact of organism exposure to ionizing radiation must be studied on a multigenerational scale. The aim of this PhD is to improve the characterization of molecular processes and the prediction of transgenerational effects during a gamma irradiation. First, an experimental approach investigated on radio-induced modifications of epigenetic processes, i.e. changes in mechanisms that regulate gene expression without changing DNA sequence itself and on the transmission of these modifications to subsequent generations. Significant changes in DNA methylation, a well-studied epigenetic mechanism, detected in generation F3 clearly showed that epigenetic modifications could be transmitted to unexposed generations, in response to the exposure of a parental generation (F0) to external gamma radiation (6.5 µGy.h-1 et 41.3 mGy.h-1) for 25 days. Second, a mechanistic modelling approach used a modified version of the DEBtox model (Dynamic Energy Budget model applied to toxicology) in order to analyze effects of gamma radiation on D. magna growth and reproduction over several generations. To that end, damage compartments, with damage levels that were transmitted from one generation to the next, were included. The model was fitted to data using Bayesian inference methods, in order to estimate the parameters while considering their associated uncertainty.

L'une des stratégies mise en œuvre pour améliorer la prise en charge thérapeutique des patients concerne le développement d'outils diagnostiques sensibles et spécifiques. Les aptamères sont des oligonucléotides artificiels obtenus par SELEX avec une très haute affinité ainsi qu'une excellente spécificité pour leurs cibles. L'immobilisation de ces motifs de reconnaissance moléculaire à la surface de nanomatériaux tels que des nanoparticules d'or (AuNPs), dont les propriétés optiques et électroniques sont uniques, permet d'amplifier le signal généré par l'interaction du ligand avec sa cible. Deux systèmes de biosensing ont été élaboré en fonctionnalisant des AuNPs avec des aptamères, l'un dirigé contre la thrombine et le second dirigé contre une marque épigénétique portée par une protéine histone. La réduction des sels d'or aurique précurseurs a été réalisée en présence de PEG4 et a conduit à l'obtention d'une population homodisperse de AuNPs sphériques d'un diamètre moyen de 14 nm et présentant une isotropie de taille et de forme. Ces AuNPs ont ensuite été fonctionnalisées par des bras espaceurs de longueur variable constitués d'unités tétraéthylène glycol successives reliées entre elles par des ponts éthers ou triazoles. L'acide lipoique a été utilisé comme motif d'ancrage à la surface des AuNPs via une liaison covalente Au-S et a été couplé aux différents bras espaceurs via une réaction de Steglich. Les linkers étaient porteurs d'un groupement terminal azoture afin de réaliser le couplage par chimie-click avec les aptamères. La stratégie de détection de la thrombine utilisait les propriétés de quenching de fluorescence des AuNPs alors que la détection de l'histone était colorimétrique et mettait à profit l'effet de résonance plasmonique de surface des nanoparticules d'or. / Improving patients therapeutic care needs the development of sensitive and specific diagnostic tools. Aptamers are synthetic oligonucleotides obtained by SELEX with a very high affinity and excellent specificity for their targets. Grafting of these molecular recognition patterns onto nanomaterials such as gold nanoparticles (GNPs), which unique optical and electronic properties, can amplify the signal induce by the interaction between the ligand and its target. Two biosensing systems have been developed by GNP functionalization with aptamers, one is directed against thrombin and the second against an epigenetic mark carried by a histone protein. Gold precursors was reduced in the presence of PEO4 and led to a homodisperse population of spherical GNP with an average diameter of 14 nm and an isotropy of size and shape. GNP were functionalized with tetraethylene glycol units interconnected by ether or triazoles bridges as a linker. Lipoic acid was used as an anchor moiety onto gold surface via a covalent Au-S bond and was coupled to the spacer through a Steglich reaction. The linkers were functionalized with an azide group to perform the coupling with aptamers by click chemistry. The thrombin sensing strategy used the fluorescence quenching properties of GNPs while the histone detection involved the gold nanoparticle plasmon resonance surface effect.

A principal característica do diabetes mellitus (DM) é a perda da homeostasia glicêmica. O músculo esquelético desempenha papel chave e a adequada expressão do transportador de glicose GLUT4 (gene Slc2a4) é fundamental. Regulações epigenéticas do Slc2a4, como acetilação/trimetilação de histona H3, nunca foram investigadas no DM; e o resveratrol, sugerido como sensibilizador da insulina, poderia modular essas regulações, pois ativa a desacetilase sirtuína 1 (SIRT1). O objetivo foi avaliar em modelos de DM o efeito do tratamento com resveratrol sobre a homeostasia glicêmica, a expressão de Slc2a4/GLUT4 em músculo esquelético, a regulação epigenética do Slc2a4, e a possível participação da SIRT1. Os dados revelam a ocorrência de regulações epigenéticas no gene Slc2a4 em músculo de animais diabéticos e mostra que o tratamento com insulina ou resveratrol modula algumas dessas alterações, melhorando o controle glicêmico. Esses resultados apoiam o resveratrol como um sensibilizador da insulina, e constroem bases para o desenvolvimento de terapias epigenéticas para o DM. / The main characteristic of diabetes mellitus (DM) is the loss of glycemic homeostasis. The skeletal muscle plays a key role and the maintenance expression of the GLUT4 glucose transporter (encoded by the Slc2a4 gene) is fundamental. Epigenetic regulations of Slc2a4, such as histone H3 acetylation/trimethylation, have never been investigated in DM; and resveratrol, suggested as an insulin sensitizer, could modulate these regulations, as it is an activator of the deacetylase sirtuin 1 (SIRT1). The aim was to evaluate in skeletal muscle of diabetic animals the effect of resveratrol treatment on glycemic homeostasis, Slc2a4/GLUT4 expression in skeletal muscle, the epigenetic regulation of Slc2a4, and the possible participation of SIRT1. The data reveals the occurrence of epigenetic regulation in the Slc2a4 gene in muscle of diabetic animals and the insulin or resveratrol treatment modulates some of these changes, improving glycemic control. These results support resveratrol as an insulin sensitizer, and build bases for the development of epigenetic therapies for DM.

A reprogramação nuclear de uma célula somática a um estado embrionário tem diversas aplicações, como pesquisas básicas na biologia do desenvolvimento, terapia celular, melhoramento genético em animais de produção e conservação de espécies. As principais técnicas utilizadas para a reprogramação nuclear são a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) e a geração de células tronco pluripotente induzidas (iPS). Muitos trabalhos têm mostrado uma baixa eficiência no processo de reprogramação nuclear nas duas técnicas, além disso, modificações epigenéticas tem sido apontada como a principal barreira para uma reprogramação nuclear eficiente. Por esse motivo, medidas como a utilização de células menos diferenciadas e/ou alteração do perfil epigenético das células somáticas podem aumentar a eficiência destas técnicas. Por isso, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência de marcas epigenéticas em células bovinas utilizadas na reprogramação nuclear mediada por TNCS ou superexpressão de genes relacionados a pluripotêcia (iPS). Para isso, utilizamos 3 abordagens. Primeiro, analisamos marcações epigenéticas relacionadas ao desenvolvimento embrionário e pluripotência (H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC e 5hmC) em diferentes tipos celulares, analisamos a expressão gênica de genes responsáveis por essas marcações em células de diferentes tecidos (ex. células tronco mesenquimais (MSC) e fibroblastos) e as utilizamos como doadoras de núcleo na TNCS. Na segunda e a terceira abordagem, utilizamos células com menores níveis de H3K9me2 para a geração de iPS e na TNCS, respectivamente. Além disso, por se mostrar eficiente na TNCS, analisamos o efeito da sincronização do ciclo celular por privação de soro fetal bovino (SFB) na geração de células iPS. Com o intuito de diminuir os níveis de H3K9me2, as células foram tratadas com UNC0638, um inibidor especifico das metiltransferases de histona G9a/GLP. Nossos resultados do primeiro experimento mostraram que as MSC podem ser utilizadas como doadoras de núcleo na TNCS, no entanto, mesmo com algumas diferenças na expressão gênica em relação aos fibroblastos, a produção de blastocistos não foi diferente entre as duas células. No segundo experimento, as células privadas de SFB geraram mais colônias que as células controle, enquanto que as células tratadas não apresentaram diferença. Por último, as células tratadas com o UNC0638 apresentaram um menor nível de metilação no DNA em zigotos em relação às células controle. Os resultados encontrados neste trabalho podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos epigenéticos envolvidos na reprogramação nuclear de bovinos / Nuclear reprogramming of somatic cells to embryonic state has several aplications, such as basic research on developmental biology, cell therapy, genetic improvement in livestock animals and preservation of endangered species. The principal techniques utilized to achieve nuclear reprogramming are Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) and induced pluripotency. Several works has reported low efficiency rates of nuclear reprogramming when these techniques are used to reprogram somatic cells. Moreover, epigenetic modifications acquired during development act as epigenetic barrier to the complete reprogramming process. For this reason, strategies such as use of less differentiated cells and/or modification of epigenetic profile of somatic cells might increase the efficiency these techniques. The objective of this work was investigate the influence of epigenetic marks in bovine cells utilized on nuclear reprogramming experiments mediated by SCNT or induced pluripotency. To investigate it, we used three approaches. First, we analyzed the epigenetic marks related to the embryonic development and pluripotency (e.g H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC and 5hmC), gene expression of genes involved in these epigenetic marks in different tissues (i.e. mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts) and their use as nuclear donor cells on SCNT procedure. Regarding the second and the third approach, we utilized cells with reduced levels of H3K9me2 to generate iPS cells and cloned embryos, respectively. Furthermore, since serum starvation has been demonstrated increase SCNT developmental rates, we assessed the effect of cell cycle synchronization mediated by serum starvation on nuclear reprogramming using iPS cells. Aiming decrease the levels of H3K9me2, cells were treated with UNC0638, a chemical probe that works as a specific inhibitor of the histone methyltransferases G9a and its counterpartner GLP. Our results showed that MSC are suitable to be used as nuclear donors on SCNT procedures, however, in spite of differences on gene expression comparing with fibroblasts, the embryonic developmental rates were not improved. On the second experiment, cells privated of fetal calf serum produced more iPS cells colonies than control cells, whereas cells treated with UNC did not show differences when compared with untreated cells. Lastly, UNC treated donor cells treated produced cloned zygotes with lower levels of DNA methylation compared to zygotes derivated from untreated cells. The results presented here will contribute to the better understanding of the epigenetic mechanisms involved on bovine nuclear reprogramming