Einleitung: Tiermodelle spielen für die Aufklärung pathophysiologischer Mechanismen und die Entwicklung erfolgsversprechender Therapieoptionen zentralnervöser Bewegungsstörungen eine unverzichtbare Rolle. Die Identifizierung von Gendefekten für die Parkinson-Krankheit und Dystonien ermöglichte die Generierung von Tiermodellen mit einer hohen „construct validity“. Weibliche transgene Thy1-aSyn Mäuse sowie DYT1 Knock-in (KI) Mäuse zeigen jedoch keine motorischen Störungen. In der vorliegenden Arbeit sollten zur Aufdeckung sensomotorischer Beeinträchtigungen, die bei Parkinson- und Dystoniepatienten beobachtet werden, detaillierte Untersuchungen des Verhaltens an diesen beiden Mausmodellen durchgeführt werden. Zielstellung: Zunächst sollte ein sensitiver Verhaltenstest konstruiert und entwickelt werden, bei dem sich ändernde sensorische Stimuli während der Ausübung der motorischen Aufgabe impliziert werden. Bei der Etablierung dieses sogenannten „adaptiven rotierenden Balkentests“ (ARB-Test) sollte auch der Einfluss des genetischen Hintergrunds bei Wildtyp-Mäusen evaluiert werden. Daraufhin sollte überprüft werden, ob dieser Test den Endophänotyp der weiblichen Thy1-aSyn Mäuse aufdecken kann. In dem DYT1 KI Mausmodell sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Tiere Verhaltensdefizite in spezifischen Tests zeigen, die sensomotorische Verschaltungen untersuchen. Material und Methoden: Die mRNA-Expression von α-Synuclein in der Substantia nigra bei männlichen und weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde mithilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) ermittelt. Im Anschluss an die Entwicklung des neuen Verhaltensapparates für den ARB-Test wurden Thy1-aSyn Tiere beider Geschlechter in diesem Versuch getestet und ihre Leistung den Ergebnissen auf etablierten motorischen Verhaltenstests („challenging beam test“, „pole test“) gegenübergestellt. Um den Einfluss des Hintergrundstammes auf das Verhalten der Tiere auf dem ARB-Test zu untersuchen, wurden Wildtypen der reinen C57BL/6J-Linie sowie Hybrid-Tiere des Stammes C57Bl/6J × DBA2 (BDF1) allen drei o. g. Versuchen unterzogen. Bei den Mäusen des DYT1 KI Modells wurde der „adhesive removal test“ und der ARB-Test zur Analyse der Sensomotorik durchgeführt. Im Vergleich dazu wurden vielfältige Verhaltensparameter in einer Reihe vorwiegend motorischer (Offenfeld-Test, „challenging beam test“, „pole test“, Zylinder-Test, Block-Test, Nestbau-Test) und kognitiver („y-maze test“) Verhaltenstests ausgewertet. Ergebnisse: Bei den weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde eine geringere Expression des Transgens im Vergleich zu den männlichen Tieren festgestellt. Der neue ARB-Test wurde erfolgreich etabliert und konnte signifikante Verhaltensdefizite der weiblichen und männlichen Mutanten des Parkinson-Modells im Vergleich zu den Kontrolltieren aufdecken. Der genetische Hintergrund beeinflusste die Leistung der Wildtypen auf diesem Balkentest. Während die DYT1 KI Tiere in den rein motorischen und kognitiven Versuchen keine Beeinträchtigungen des Verhaltens zeigten, konnten der „adhesive removal test“ sowie der neue ARB-Test signifikante sensomotorische Defizite der KI Mäuse im Unterschied zu den Wildtypen zum Vorschein bringen. Schlussfolgerung: Im Thy1-aSyn Mausmodell konnte die Bedeutung der sensomotorischen Integration für die Ausprägung motorischer Defizite sowie für eine mögliche Kompensation solcher motorischen Beeinträchtigungen demonstriert werden. Hierfür hat sich der neu entwickelte, sensitive ARB-Test als geeignet herausgestellt. Die Aufdeckung von Beeinträchtigungen der Sensomotorik spricht auch bei den DYT1 KI Tieren für den Einfluss einer gestörten sensomotorischen Integration bei der Ausprägung der Symptomatik. Damit eignet sich dieses Mausmodell für die Untersuchung weiterer Parameter, die Auswirkungen auf die Aufdeckung des Phänotyps und die Penetranz der Erkrankung haben sowie um die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen.

Huntington’s Disease (HD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich durch motorische, kognitive sowie psychiatrische Beeinträchtigungen auszeichnet. Die Verlängerung eines Polyglutamin (polyQ)-Abschnittes im Protein Huntingtin (Htt) über 37 Qs hinaus bedingt die Aggregation des mutierten Proteins (mHtt) und dessen Ablagerung in neuronalen Einschlüssen. Als potenzieller Modulator der polyQ-abhängigen mHtt Aggregation und Toxizität wurde der Q-reiche Transkriptionstransaktivator SS18L1 in silico identifiziert. Rekombinantes Volllängen-SS18L1 sowie die beiden verkürzten Fragmente SS18L1_NM und SS18L1_C weisen in wässriger Lösung einen hohen Anteil an Random-Coil-Strukturen auf und bilden Oligomere. Alle SS18L1-Proteine verzögern dosisabhängig die spontane Aggregation eines Htt Exon 1 Fragmentes mit 49 Glutaminen (Ex1Q49). Dabei wird die Entstehung SDS-stabiler Ex1Q49 Aggregate durch die Stabilisierung von Ex1Q49 Mono- und Oligomeren gebremst. In HEK293 Zellen verringern rekombinante SS18L1-Proteine sowohl die Anzahl der SDS-unlöslichen Ex1Q49-Aggregate als auch die mHtt-vermittelte Zytotoxizität. Auch hierbei scheint eine Stabilisierung früher Aggregatspezies, wahrscheinlich durch die Interaktion der SS18L1-Proteine mit dem jeweiligen mHtt Fragment, eine wesentliche Rolle zu spielen. Entsprechende Interaktionen konnten mittels LUMIER-Studien und konfokaler Mikroskopie nachgewiesen werden. Humanes, exogenes SS18L1 unterdrückt die polyQ-bedingte Aggregation in einem C. elegans-Modell für HD und in transgenen R6/2 HD-Mäusen sind die Mengen an endogenem SS18L1 im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen verändert. Beides weist darauf hin, dass SS18L1 auch in vivo von Relevanz sein könnte. Dafür spricht zudem, dass murines SS18L1 in Gehirnen von R6/2-Mäusen mit neuronalen mHtt-Aggregaten co-lokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten einen Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Therapieansätze und die weitere Erforschung der HD Pathologie darstellen. / Huntington’s Disease (HD) is a neurodegenerative disease, which is characterised by motor, cognitive and psychiatric disturbances. The abnormal extension of an N-terminal polyQ tract in the protein huntingtin (Htt) results in aggregation of the mutant protein (mHtt) and the deposition of neuronal inclusions. The Q-rich transcriptional transactivator SS18L1 was identified in silico as a potential modulator of polyQ-mediated mHtt aggregation and toxicity. Recombinant full-length SS18L1 and the truncated fragments SS18L1_NM and SS18L1_C have a high random-coil content and form oligomeric structures in aqueous solutions. In addition, all three proteins delay the spontaneous aggregation of an Htt exon 1 fragment with a stretch of 49 glutamines (Ex1Q49). The formation of SDS-resistant Ex1Q49 aggregates is postponed in a concentration-dependent manner as monomers and oligomers, appearing early in the amyloid formation cascade, are stabilised. In mammalian cells recombinant SS18L1 proteins reduce both the number of SDS-stable Ex1Q49 aggregates and mHtt-induced cytotoxicity. These effects are likely due to the stabilisation of early aggregation intermediates, which could result from interactions of the SS18L1 proteins with the respective mutant Htt exon 1 fragment. Such interactions have been demonstrated employing a LUMIER assay and confocal microscopy. Exogenous human SS18L1 suppresses polyQ-mediated aggregation in a C. elegans model of HD and levels of endogenous SS18L1 are altered in transgenic R6/2 HD mice compared to wild type mice. As a consequence, SS18L1 might be of relevance in vivo. This is also supported by the finding that murine SS18L1 interacts with mHtt inclusions in R6/2 mice. The results of this study could provide a basis for the development of a therapeutical strategy or for the further elucidation of HD pathology.

Eine Gemeinsamkeit verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen ist die abnormale Ansammlung von Proteinen im Gehirn, wie z. B. von alpha-Synuclein (Syn)-Aggregaten bei der Parkinson''schen Krankheit (PD) oder von Huntingtin (Htt)-Aggregaten bei Chorea Huntington (HD). Am Anfang dieser Studie wurde eine Bibliothek von ca. 5000 natürlichen Substanzen nach Inhibitoren der Htt-Aggregation durchsucht. Eine der wirksamen Substanzen war (-)-Epigallocatechingallat (EGCG), eine Verbindung, die in grünem und schwarzem Tee vorkommt. Die antioxidativen Eigenschaften von EGCG wurden bereits mit einer neuroprotektiven Wirkung in Verbindung gebracht, was EGCG zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Entwicklung einer neuen Behandlungsmethode macht. Eine inhibierende Wirkung auf Proteinaggregation wurde jedoch bis jetzt noch nicht nachgewiesen. Diese Studie zeigt, dass EGCG die Aggregation von Htt und Syn hemmt, indem es dosisabhängig eine oligomere Proteinkonformation stabilisiert. Diese Oligomere wirken jedoch nicht als Keime in Aggregationsreaktionen. Zusätzlich verändert EGCG die Exposition bestimmter Epitope, die von konformationsspezifischen Antikörpern im Laufe der Aggregation erkannt werden. Daher könnte die Substanz Proteine, die zur Aggregation neigen, auf einen alternativen Faltungspfad in der Missfaltungskaskade führen. Weiterhin legen die Ergebnisse nahe, dass eine direkte Wechselwirkung zwischen EGCG und Proteinen in einer ungefalteten Konformation stattfindet. In verschiedenen Zellkultur-Modellsystemen verringerte EGCG die Toxizität, die von missgefalteten Proteinen ausgeht, was nahelegt, dass die neu geformten oligomeren Spezies nicht toxisch sind. EGCG könnte daher ein chemisches Chaperon darstellen, das die Missfaltung und Toxizität von Proteinen, die mit neurodegenerativen Krankheiten assoziiert sind, verringert. Die Substanz könnte daher die Basis zur Entwicklung einer neuen Therapie für diese unheilbaren Krankheiten darstellen. / A common feature of neurodegenerative disorders is the abnormal accumulation of aggregated protein the brain, such as alpha-Synuclein (Syn) aggregates in Parkinson''s disease (PD) and Huntingtin (Htt) aggregates in Huntington''s disease (HD). In this study, a library of approximately 5000 natural compounds was screened for inhibitors of Htt aggregation. One of the hits was (-)- Epigallocatechin gallate (EGCG), a compound present in green and black tea. The antioxidant properties of this substance have been linked to neuroprotection before, making it a promising candidate for the development of a treatment for neurodegenerative diseases. Inhibition of protein aggregation by EGCG, however, has not been demonstrated so far. This study shows that EGCG inhibits the aggregation of Htt and Syn by stabilizing an oligomeric conformation of the respective proteins in a dose-dependent manner. These oligomers do not seed the aggregation of Htt and Syn. Also, EGCG modifies the exposure of different epitopes recognized by conformation-specific antibodies during the aggregation process. The compound might therefore lead aggregation-prone proteins on an alternative folding pathway in the misfolding cascade. The results furthermore suggest that direct interaction occurs between EGCG and proteins in an unfolded conformation. EGCG also reduces toxicity caused by misfolded Htt or Syn in cell culture model systems, suggesting that the oligomeric protein species formed in the presence of EGCG are not toxic to living cells. EGCG might therefore represent a chemical chaperone that can modulate misfolding and toxicity of proteins associated with neurodegenerative diseases and could provide the basis for the development of a novel pharmacotherapy for these fatal disorders.

Sphingolipide sind eine wichtige Klasse von Lipiden, die nicht nur als Strukturmoleküle von Bedeutung sind sondern auch in Signaltransduktionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Insbesondere die Sphingolipidmetaboliten Ceramid, Sphingosin und Sphingosin-1-phosphat sind an zellulären Prozessen wie Differenzierung, Apoptose, Proliferation und Inflammation beteiligt. Sphingomyelinasen üben daher als katabole Enzyme des Sphingolipidstoffwechsels eine wichtige Funktion aus. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Expression und Reinigung der rekombinanten humanen sauren Sphingomyelinase sowie ausgewählter varianter Formen des Enzyms, die verschiedene Subtypen der Niemann-Pick-Erkrankung widerspiegeln. Die Kinetiken und weitere Parameter der erhaltenen Enzyme wurden nach Michaelis-Menten bestimmt. Durch Gabe der rekombinanten Enzyme zu metabolisch radiomarkierten (NPA -/-) Fibroblasten wurde die Stimulation des Sphingolipidmetabolismus nachverfolgt. Mittels FT-IR Spektroskopie gelang die Bestimmung und Quantifizierung von Sekundärstrukturelementen im Wildtypenzym und den varianten Formen. Darüber hinaus wurde in SPR-Messungen die biomolekulare Interaktion der sauren Sphingomyelinase mit dem Krebstherapeutikum Siramesin untersucht. Siramesin, welches als Inhibitor der sauren Sphingomyelinase wirkt, induziert selektiv in Krebszellen den lysosmalen Zelltod. In diesem Zusammenhang wurde die saure Sphingomyelinase als potentielles Zielmolekül für Krebstherapien identifiziert. / Sphingolipids are an important class of lipid molecules. Beyond their structural role, they also serve as bioactive signalling entities. Sphingolipid metabolites like ceramide, sphingosine and sphingosine-1-phosphate are involved in many cellular processes including differentiation, apoptosis, proliferation, inflammation and intracellular trafficking. In this context, sphingomyelinases are of special interest. The present work focuses on the expression and purification of recombinant human acid sphingomyelinase and selectively chosen variant forms of the enzyme, representing prominent Niemann-Pick disease types. Subsequently the biochemical parameters of all obtained enzymes were determined by Michaelis-Menten kinetics. In order to asses the stimulation of sphingolipid metabolism metabolically radiolabeled (NPA -/-) cells were treated with the recombinant enzymes. Based on FT-IR spectroscopy, structural components of the acid sphingomyelinase and its variants, were determined and quantified. Furthermore SPR-experiments were performed to analyse the biomolecular interaction of immobilized acid sphingomyelinase and the anticancer agent siramesine. Siramesine acts as an inhibitor on acid sphingomyelinase, thereby triggering cancer-specific lysosomal cell death. In this context the human acid sphingomyelinase was identfied as a target for cancer therapy.

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Die Bildung von Amyloidablagerungen ist ein Kennzeichen der Alzheimerschen Erkrankung. Hauptbestandteil dieser senilen Plaques sind sogenannte A beta Peptide, die durch proteolytische Prozessierung aus einem Vorläufermolekül (APP) gebildet werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Klonierung des Meerschweinchen - APP. Diese cDNA-Sequenz zeigt auf DNA-Ebene eine Homologie zum Human-APP von ca. 90%, auf Proteinebene beträgt die Identität ca. 97 %. Damit wird ein weiterer experimenteller Beweis für die evolutionäre Konservierung des Amyloidvorläuferproteins in Säugetieren erbracht. APP mRNA wird in Meerschweinchen-Geweben ubiquitär exprimiert. Durch alternatives Spleißen wird ein zum Human-APP im wesentlichen ähnliches Isoformenmuster gebildet: Isoformen, welche eine Proteaseinhibitordomäne enthalten, werden dominierend in peripheren Organen exprimiert, dagegen ist im Zentralnervensystem das APP 695 mit über 60 % der Gesamttranskripte die bevorzugt exprimierte Isoform. Die klonierte cDNA des Meerschweinchen-APP wurde in prokaryontischen wie auch eukaryontischen Zellsystemen exprimiert. Dabei wurde die Eignung einer Anzahl von gegen Human-APP gewonnenen Antikörpern zur Detektion des Meerschweinchen-APP und seiner Prozessierungsprodukte gezeigt. Die Expression der neuronal dominierend exprimierten Isoform APP 695 des Meerschweinchen-APP in humanen Neuroblastom-Zellen zeigte keine Unterschiede hinsichtlich der APP-Prozessierung und A beta-Bildung im direkten Vergleich zu Human-APP 695. Die proteolytische Prozessierung des Proteins wurde durch Detektion der typischen Spaltprodukte in vivo (im Liquor) als auch in einem neu etablierten in vitro-Modell primär kultivierter neuronaler Zellen untersucht. Diese Zellkulturen wurden zunächst immunhistochemisch und biochemisch charakterisiert und als "mixed brain"-Typ mit einem hohen neuronalen Anteil beschrieben. Die Prozessierung des endogenen Meerschweinchen-APP in kultivierten Zellen führt dabei zur Bildung und Akkumulation aggregationsfähiger A beta - Peptide. Zur Detektion dieser Peptide wurde ein sensitiver Nachweis durch Western-Blot etabliert. Es wird damit ein Modellsystem für in vitro-Untersuchungen vorgeschlagen, welches ein Studium der Expression und Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins unter angenähert physiologischen Bedingungen ermöglicht. / A beta peptides, the major component of neuritic plaques found in the brains of patients with Alzheimer’s disease, are derived by proteolytic processing from a larger precursor molecule (amyloid precursor protein - APP). A combination of PCR methods was used to clone and sequence APP cDNA from guinea pig (Cavia porcellus). Guinea pig APP exhibits extensive similarities to human APP in terms of primary structure, mRNA expression of differentially spliced isoforms as shown by Northern blot and RT-PCR analysis as well as proteolytic processing to amyloidogenic A beta peptides. In contrast to rat and mouse APP, guinea pig APP - recombinantly expressed in human neuroblastoma-cells - was processed indistinguishable from human APP thus excluding intrinsic sequence-specific factors influencing processing. Further studies were performed using newly established primary cell cultures of guinea pig neurons. Refined methods have been used to detect and characterize major proteolytic processing products of APP in vitro and in vivo. In conclusion, guinea pigs provide a model to study expression and processing of APP that closely resembles the physiological situation in humans and should, therefore, be important in elucidating potential strategies to prevent amyloid formation in Alzheimers Disease.

Erdheim-Chester disease (ECD) represents a clonal non-Langerhans histiocytosis, which manifests under an extensive variety of clinical symptoms. This creates a challenge for the physician, who is required to recognize and diagnose the disease in the early stages. Despite this considerable challenge, in the last decade there has been a dramatic increase in ECD diagnoses, in most part due to an increasing awareness of this rare disorder. Involvement of the axial skeleton is exclusively uncommon with no official recommendations for the treatment of the bone lesions. Here, we present a case report of a young male patient with isolated lesions of the spine, ribs, and pelvis, who was successfully treated with a combination therapy of alfa-interferon and zoledronic acid.