A deficiência da 3-metilcrotonil-CoA-carboxilase (3-MCCD) é uma desordem autossômica recessiva do catabolismo da leucina. Os pacientes afetados pela 3-MCCD apresentam acúmulo tecidual de 3-metilcrotonil-CoA, o que leva a um aumento da formação e excreção urinária do ácido 3- hidroxiisovalérico (3-HIVA), 3-metilcrotonilglicina (3-MCG) bem como elevação das concentrações no plasma de 3-hidroxiisovaleril-carnitina (C5- OH). A apresentação clínica é extremamente variável e caracterizada principalmente por uma disfunção neurológica severa com encefalopatia e paralisia cerebral. Os pacientes também apresentam retardo psicomotor, hipotonia muscular, cardiomiopatia e leucodistrofia. Infelizmente os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentado por esses pacientes ainda são pouco conhecidos. Considerando a importância do metabolismo energético para o sistema nervoso central e que os pacientes afetados por 3-MCCD acumulam e excretam grandes quantidades de 3- MCG, o presente estudo se propôs a investigar a influência deste metabólito sobre importantes parâmetros do metabolismo energético cerebral em ratos jovens. Inicialmente, observamos que a 3-MCG diminuiu a produção de CO2 a partir de acetato [1-14C], sugerindo que houve comprometimento no funcionamento do ciclo do ácido cítrico. Além disso, a 3-MCG diminuiu a atividade do complexo II-III da cadeia transportadora de elétrons, indicando que o fluxo de elétrons através dessa cadeia está prejudicado.Também verificamos que as atividades das enzimas creatina-quinase e Na+,K+- ATPase foram alteradas pela 3-MCG. Tomados em seu conjunto, esses achados indicam que a produção e transferência de energia estão comprometidas bem como a neurotransmissão que é dependente de uma atividade normal da Na+,K+-ATPase. Observamos também que antioxidantes foram capazes de atenuar ou prevenir completamente o efeito inibitório da 3- MCG sobre as atividades da creatina-quinase e da Na+,K+-ATPase, sugerindo o envolvimento de radicais livres nesses efeitos. Essa hipótese foi reforçada pela observação de que a 3-MCG provoca dano oxidativo lipídico (peroxidação lipídica). Nossos resultados sugerem que a 3-MCG prejudica a homeostase mitocondrial e o potencial de membrana que podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da 3-metilcrotonil-CoA-carboxilase. / Deficiency of 3-methylcrotonyl-CoA-carboxylase (3-MCCD) is an autosomal recessive disorder of leucine catabolism. Affected patients usually present accumulation of 3-methylcrotonyl-CoA in tissues, leading to high synthesis and urinary excretion of 3-hydroisovalerate (3-HIVA), 3- methylcrotonylglycine (3-MCG), as well as increased levels of 3- hydroxyisovaleryl-carnitine (C5-OH) in plasma.The clinical presentation is highly variable and mainly characterized by severe neurological dysfunction with encephalopathy and cerebral paralysis.Patients also present important psychomotor retardation, muscular hypotonia, cardiomyopathy and leukodystrophy. Unfortunately, the underlying mechanisms involved in the cerebral damage of these patients are practically unknown. Considering the importance of energy metabolism to the central nervous system and that patients affected by 3-MCCD accumulate and excrete large amounts of 3- MCG, the present study investigated the influence of this metabolite on important parameters of brain energy metabolism in young rats. Initially, we observed that 3-MCG decreased CO2 production from acetate [1-14C], suggesting impairment in the function of the citric acid cycle. Furthermore, 3- MCG decreased the activities of complex II-III of the respiratory chain, indicating that the electron transport chain flow is impaired in the presence of this metabolite. We also verified that the activities of enzymes creatine-kinase and Na+,K+-ATPase from synaptic membrane were altered by 3-MCG.Taken together, these findings indicate that energy production and transfer are compromised. We also observed that antioxidants were able to attenuate or fully prevent the inhibitory effect of 3-MCG on creatine-kinase and synaptic membrane Na+,K+-ATPase activities, suggesting the involvement of free radicals in these effects.This hypothesis was reinforced by the observation that 3-MCG causes oxidative lipid damage (lipid peroxidation). Our results suggest that 3-MCG compromises mitochondrial homeostasis and membrane potential and it may be involved in the neurological damage found in patients affected by 3-MCCD.

Hiperprolinemias são erros inatos do metabolismo causados pela deficiência de enzimas envolvidas no catabolismo da prolina, o que resulta em acúmulo tecidual de desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes podem apresentar manifestações neurológicas graves como retardo mental e convulsões, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo desse trabalho foi investigar o efeito da prolina sobre parâmetros bioquímicos (metabolismo energético, estresse oxidativo e sistema glutamatérgico) em cérebro e fígado, bem como sobre parâmetros comportamentais de ratos submetidos ao modelo experimental de hiperprolinemia e investigar possíveis efeitos neuroprotetores das vitaminas E e C, da guanosina e do exercício físico sobre as alterações causadas pela prolina. Os resultados mostraram que a administração aguda e crônica de prolina induz peroxidação lipídica, compromete o metabolismo energético cerebral, diminui os níveis de ATP intracelular, inibe a atividade da Na+,K+-ATPase sem alterar a expressão de suas subunidades catalíticas, e prejudica a captação de glutamato, embora não diminua o conteúdo de seus transportadores. Todas essas alterações podem estar intimamente relacionadas ao déficit cognitivo causado pela hiperprolinemia, o qual também está relacionado à diminuição dos níveis de BDNF e da atividade colinérgica. A hiperprolinemia também altera a homeostase hepática pela indução de um leve grau de estresse oxidativo e de alterações metabólicas, as quais provavelmente não implicam em dano significativo ao tecido hepático, mas sugerem uma adaptação tecidual ao estresse oxidativo. Além disso, demonstramos que a utilização das vitaminas antioxidantes, da guanosina e/ou do exercício físico pode contribuir para a contenção do estresse oxidativo, da toxicidade glutamatérgica e dos prejuízos na cognição induzidos pela hiperprolinemia. Acreditamos que esses achados possam ser relevantes para o entendimento das alterações neurológicas presentes na hiperprolinemia, além de sugerir possibilidades de neuroproteção, como por exemplo, o exercício físico que poderia ser usado como um adjuvante terapêutico no tratamento dos pacientes hiperprolinêmicos. A magnitude dos efeitos biológicos das vitaminas antioxidantes e especialmente da guanosina requerem estudos adicionais para uma melhor compreensão das suas ações neuroprotetoras na hiperprolinemia. / Hyperprolinemias are inborn errors of metabolism of proline caused by genetic defects in the L-proline catabolic pathway, resulting in tissue accumulation of this amino acid. Clinically, patients may present severe neurological manifestations, such as mental retardation and seizures. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The aim of this study was to investigate the effect of proline on biochemical parameters (energy metabolism, oxidative stress and glutamatergic system) in brain and liver, as well as on behavior of rats submitted to experimental hiperprolinemia. In addition, we investigated some neuroprotective effects of vitamins E and C, guanosine and physical exercise on the harmful effects induced by proline. The results showed that acute and chronic proline administration induce lipid peroxidation, impair energy metabolism by inhibiting key enzymes in the brain, decrease of intracellular ATP levels and inhibit the Na+,K+-ATPase activity, but not the expression of their catalytic subunits. Moreover, this amino acid impairs glutamate uptake, but not decrease the content of their carriers. All these changes caused by proline may be closely related to cognitive impairment caused by hyperprolinemia, which also seem to involve a reduction in the BDNF levels and cholinergic activity. The hyperprolinemia also alters hepatic homeostasis by inducing a mild degree of oxidative stress and metabolic changes, which probably do not involve significant damage to liver tissue, but show a process of tissue adaptation to oxidative stress. Also, we showed that the antioxidant vitamins, the nucleoside guanosine and physical exercise may contribute to the counteracting of oxidative stress, excitotoxicity and cognitive deficit induced by hyperprolinemia. These findings may be relevant to the comprehension of neurological disorders in hyperprolinemia and suggest possibilities for neuroprotection to hyperprolinemic patients, such as physical exercise, which may be used as an adjuvant therapy for these patients. The magnitude of benefical effects of antioxidant vitamins and especially guanosine on hyperprolinemia requires additional studies to better understand its neuroprotective actions.

A doença de Fabry (DF) é um erro inato do catabolismo de glicoesfingolipídeos de herança ligada ao cromossomo X decorrente de uma atividade deficiente da enzima lisossômica C-galactosidase A. Os pacientes apresentam como principais achados angioqueratomas na pele e acroparestesias e geralmente vão a óbito na idade adulta por falência renal e acidente vascular cerebral. Como conseqüência da deficiência enzimática, os substratos (principalmente a globotriaosilceramida – Gb3) acumulam-se em fluidos corporais e lisossomas de diversos tipos celulares do organismo. Desde 2001, a terapia disponível para a DF é a Terapia de Reposição Enzimática (TRE). Antes disso, o tratamento era apenas para os sintomas. Algumas hipóteses para a fisiopatologia da DF estão intimamente ligadas à produção de espécies reativas e inflamação, porém até este momento não haviam estudos in vivo sobre esse tema. Então, o objetivo deste estudo foi investigar parâmetros de estresse oxidativo, citocinas próinflamatórias e Gb3 em pacientes com DF em tratamento com TRE e, finalmente, estabelecer uma possível relação entre eles. Analisamos amostras de sangue e urina de pacientes com DF sob TRE (n=14) e controles saudáveis pareados por idade (n=14). Os pacientes apresentaram níveis diminuídos de defesas antioxidantes, medidas através de glutationa (GSH), atividade da glutationa peroxidase (GPx) e aumento da razão superóxido dismutase/catase (SOD/CAT) em eritrócitos. Em relação ao dano a biomoléculas (lipídeos e proteínas), verificamos nos pacientes aumento de malondialdeído (MDA) e grupamentos carbonilas proteicos no plasma e de di-tirosina (di-Tyr) na urina. As citocinas próinflamatórias IL-6 e TNF-C também mostraram-se aumentadas no plasma dos pacientes. O Gb3 na urina apresentou correlação significativa direta com os níveis plasmáticos de IL-6, grupamentos carbonilas e MDA. IL-6 mostrou-se direta e significativamente correlacionada com di-Tyr e inversamente correlacionada com a atividade da GPx. Esses dados sugerem que os estados próinflamatório e pró-oxidante ocorrem, estão correlacionados e parecem ser induzidos pelo Gb3 em pacientes com DF em tratamento com TRE. / Fabry disease (FD) is an X-linked inborn error of glycosphingolipid catabolism due to deficient activity of C-galactosidase A. Patients present as main findings angiokeratomas in skin and acroparesthesias and usually die in adult age of renal failure and stroke. As a consequence of the enzyme deficiency, the substrates (mainly globotriaosylceramide - Gb3) accumulate in body fluids and lysosomes of many cell types of organism. Since 2001, the available therapy for FD is the Enzyme Replacemente Therapy (ERT). Before that, treatment was just for the symptoms. Some pathophysiology hypotheses are intimately linked to reactive species production and inflammation, but until this moment there were no in vivo studies about it. Hence, the aim of this study was to investigate oxidative stress parameters, pro-inflammatory cytokines and Gb3 in patients with FD under treatment with ERT and, finally, to establish a possible relation between them. We analyzed blood and urine samples of Fabry patients under ERT (n=14) and healthy age-matched controls (n=14). Patients presented decreased levels of antioxidant defenses, assessed by glutathione (GSH), glutathione peroxidase (GPx) activity and increased superoxide dismutase/catalase (SOD/CAT) ratio in erythrocytes. Concerning to the damage to biomolecules (lipids and proteins), we verified in patients increase of malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl groups in plasma and of dityrosine (di-Tyr) in urine. The pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF-C were also increased in plasma from patients. Urinary Gb3 presented significant direct correlation with the plasma levels of IL-6, carbonyl groups and MDA. IL-6 was directly and significantly correlated with di-Tyr and inversely correlated with GPx activity. This data suggest that a pro-inflammatory and pro-oxidant state occur, are correlated and seem to be induced by Gb3 in Fabry patients under ERT treatment.

Os ácidos fitânico (Fit) e pristânico (Prist) são ácidos graxos saturados de cadeia lateral ramificada, cujas concentrações estão aumentadas em diversas doenças peroxissomais. Os pacientes afetados por esses distúrbios apresentam predominantemente manifestações clínicas neurológicas. As concentrações elevadas do Fit e Prist, que podem chegar a 5000 μM e 300 μM, respectivamente, no plasma dos indivíduos afetados, indicam que estes ácidos graxos possam ser neurotóxicos. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos Fit e Prist sobre vários parâmetros do metabolismo energético e sobre a Na+,K+-ATPase em cerebelo e cérebro de ratos jovens. Inicialmente, observamos que o Fit diminuiu a atividade dos complexos da cadeia respiratória I, I-III, II e II-III, sem alterar o IV, indicando que o funcionamento da cadeia respiratória está prejudicado por esse ácido graxo. Além disso, o Fit diminuiu o estado 3 da respiração mitocondrial, achados que refletem uma inibição metabólica. Por outro lado, a atividade da enzima creatina quinase (CK), não foi alterada pelo Fit, enquanto a atividade da enzima Na+,K+-ATPase foi diminuída de maneira acentuada, indicando que a neurotransmissão possa estar prejudicada por esse metabólito. Além disso, o Fit aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu os valores do índice de controle respiratório (RCR). O Fit também diminuiu o potencial de membrana, que foi atenuado pela adição de NAC, e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Já o Prist inibiu a produção de 14CO2 a partir de [1-14C] acetato, sugerindo uma redução da atividade do ciclo do ácido cítrico. O Prist também diminuiu acentuadamente a atividade dos complexos I, II e II-III sem interferir na atividade do complexo IV, o que indica que esse ácido graxo interfere no fluxo dos elétrons pela cadeia respiratória, podendo comprometer a geração de ATP. Além disso, o Prist diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O, achados que indicam uma inibição metabólica e também uma diminuição na eficiência da fosforilação oxidativa provocada por esse ácido graxo. Também determinamos as atividades da enzima CK, que não foi alterada pelo Prist, e da enzima Na+,K+-ATPase que foi significativamente reduzida, o que indica que a manutenção do potencial de membrana necessário para o funcionamento da neurotransmissão possa ser comprometida pelo Prist. Além disso, o Prist aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu os valores do índice de RCR. O Prist também diminuiu o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos (NAD(P)H) da matriz mitocondrial, achados que sugerem um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. O Prist também provocou inchamento mitocondrial que foi prevenido por ciclosporina e por NacetilcisteÍna, sugerindo o envolvimento do PTP nesse efeito, provavelmente através de mecanismos oxidativos. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos Fit e Prist acumulados em algumas doenças peroxissomais comprometem o metabolismo energético, atuando como desacopladores e inibidores da fosforilação oxidativa, bem como a neurotransmissão. É possível que esses mecanismos possam estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas desordens. / Phytanic acid (Phyt) and pristanic acid (Prist) are branched-chain saturated fatty acids whose concentrations are elevated in various peroxisomal disorders. Patients affected by these disorders present predominant neurological involvement. The elevation of plasma Phyt and Prist concentrations that can reach up to 5000 μM and 300 μM, respectively, indicate that these fatty acids may be neurotoxic. Considering that the pathophysiology of the neurological symptoms of these diseases are not well established, the present work proposed to investigate the in vitro effects of Phyt and Prist on various parameters of energy metabolism and Na+,K+-ATPase in cerebellum and brain of young rats. Initially, we observed that Phyt diminished the activities of complexes I, I-III, II and II-III but not IV of the respiratory chain, indicating that the respiratory chain function is impaired by this fatty acid. In addition, Phyt decreased state 3 of respiration, reflecting a metabolic inhibition. On the other hand, the activity of creatine kinase was not altered by this metabolite, whereas the activity of Na+,K+-ATPase was drastically reduced, indicating that the neurotransmission is probably compromised by this metabolite. Besides, Phyt markedly increased state 4 respiration and reduced the respiratory control ratio. Phyt also diminished the mitochondrial membrane potential, attenuated by NAC, and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative phosphorylation. Regarding on Prist effects, this fatty acid decrease 14CO2 production from labeled acetate suggesting an impairment of CAC functioning. Prist also reduced the activities of the respiratory chain complexes and observed that this fatty acid reduced the activity of complexes I, II and II-III without interfering with complex IV, indicating that this fatty acid compromises ATP generation. In addition, Prist decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, indicating a metabolic inhibition provoked by this fatty acid. We also determined the activities of creatine kinase, that was not altered by Prist, and .Na+,K+-ATPase, that was significantly reduced, indicating that the maintenance of membrane potential necessary to a normal neurotransmission may be a compromise by Prist. In addition, Prist increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. Prist also diminished the mitochondrial membrane potential, which was not prevented by NAC, and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative phosphorylation. Prist also provoked mitochondrial swelling and this effect was prevented by both cyclosporine and NAC, suggesting a PTP involvement on this effect probably through oxidative mechanisms. Taken together, our results suggest that the fatty acids Phyt and Prist accumulated in some peroxisomal diseases compromise energy metabolism, acting as uncouplers and oxidative phosphorylation inhibitors, as well as the neurotransmission. It is feasible that these mechanisms may be involved with the neurological damage presented by patients affected by these disorders.

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é, bioquimicamente, evidenciada pelo acúmulo de guanidino acetato (GAA) e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos da disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase, a creatina quinase (CK) e a acetilcolinesterase (AChE) têm um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), e a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolimo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o SNC, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Propriedades neurotóxicas do GAA têm sido atribuídas, principalmente, à excitotoxicidade e ao estresse oxidativo. Dessa forma, esse trabalho tem como propósito ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, investigando o efeito in vitro e in vivo (administração intra-estriatal de GAA), sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, CK, AChE, metabolismo energético, bem como a recaptação de glutamato e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) em estriado de ratos. Finalmente, investigamos o efeito da administração intra-estriatal de GAA sobre a memória/aprendizagem em estriado de ratos. Nossos resultados mostraram que a administração intraestriatal de GAA diminui as atividades da Na+,K+-ATPase, CK e complexo II e aumenta o TBARS e a atividade da AChE. Além destes, mostramos que o GAA inibe a recaptação de glutamato e induz estresse oxidativo em estriado de ratos. A administração de GAA, também é capaz de prejudicar a memória de ratos adultos. A inibição das atividades da Na+,K+-ATPase, da CK e do complexo II e o aumento do TBA e da atividade da AChE, causados pela administração intraestriatal de GAA, foram prevenidos pelo pré-tratamento (uma semana) com as vitaminas E e C ou taurina. Considerando os resultados apresentados, propõe-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, da CK, do complexo II, bem como da inibição na recaptação de glutamato e de indução de estresse oxidativo causados pelo GAA possam estar envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT. / Guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT-deficiency) is an inborn error of creatine metabolism characterized by muscular hypotonia, involuntary extrapiramidal movements and epilepsy. The disease is biochemically characterized by accumulation of guanidinoacetate and deficiency of creatine and phosphocreatine in tissues of affected patients. However, the mechanisms underlying the neurological dysfunction of GAMTdeficiency patients are not well understood. Na+,K+-ATPase, creatine kinase (CK) and acetylcholinesterase (AChE) play a fundamental role in central nervous system (CNS). Alterations in these enzymes with reduction of energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated to neurological diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, Huntington’s disease and brain ischemia. Neurotoxic properties of GAA have been mainly related to excitotoxicity and oxidative stress. In this study we investigated possible pathophysiologic mechanisms of GAMT-deficiency. We studied the in vitro effect of GAA and the effect of GAA intrastriatal administration on Na+,K+- ATPase, CK and AChE activities, on brain metabolism, on glutamate uptake and on reactive oxidative species (ROS) production in striatum of adult rats. Finally, we investigated the effect of intraestriatal administration of GAA on inhibitory avoidance in adult rats. Our results showed that the intrastriatal administration inhibits Na+,K+-ATPase, CK and complex II activities and increases TBARS and AChE activity. We also showed that GAA in vitro inhibits glutamate uptake and induces oxidative stress. GAA administration also impairs memory in adult rats. The inhibition of Na+,K+-ATPase, CK and complex II activities and increase of TBARS production caused by intrastriatal administration of GAA was prevented by vitamins E and C or taurine pretreatment (for one week). Our findings indicate that inhibition of Na+,K+- ATPase, CK and complex II activities and alterations in glutamate uptake and oxidative stress caused by GAA may contribute to the neurological dysfunction characteristic of GAMT-deficiency patients.

As deficiências de aprendizado são características comuns em pacientes afetados pela doença do xarope do bordo (DXB) ou pela acidemia metilmalônica. Os sintomas predominantemente neurológicos destas doenças incluem o retardo mental, atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, convulsões e alterações neuroradiológicas variadas. Na DXB, a deficiência da atividade do complexo enzimático desidrogenase dos a-cetoácidos de cadeia ramificada acarreta o acúmulo tecidual dos aminoácidos leucina, valina e isoleucina, dos a-cetoácidos correspondentes, ácido a-cetoisocapróico, a-cetoisovalérico e a-ceto-b-metilvalérico, bem como dos a-hidroxiácidos que destes se derivam, ácido a-hidroxiisocapróico, ácido a-hidroxiisovalérico e ácido a-hidroxi-b- metilvalérico. Na acidemia metilmalônica, por sua vez, ocorre um acúmulo tecidual do ácido metilmalônico devido à deficiência da enzima metilmalonil-CoA mutase. Os níveis teciduais destes metabólitos aumentam ainda mais durante crises de descompensação metabólica. No presente trabalho investigamos o efeito da administração intrahipocampal dos metabólitos ácidos acima citados sobre o comportamento de ratos adultos, dez minutos antes ou imediatamente após o treino, em tarefas aversivas (esquiva inibitória) e não aversivas (habituação ao campo aberto). Déficits de aprendizado nas tarefas da esquiva inibitória e da habituação ao campo aberto foram observados para os metabólitos supracitados quando administrados antes do treino, mas não quando foram injetados após o treino. O o ácido metilmalônico injetado dez minutos antes do treino provocou déficit somente no teste de memória espacial, não surtindo efeito sobre a memória quando os animais foram testados na tarefa de esquiva inibitória. O pré-tratamento destes animais com substratos energéticos foi capaz de prevenir o déficit de memória causado por metabólitos acumulados nas doenças estudadas. Quando utilizou-se a creatina monohidratada ou o ácido succínico evidenciou-se prevenção do déficit de memória espacial causado pela administração do ácido a-hidroxiisovalérico no hipocampo de ratos adultos. Por sua vez, apenas o prétratamento com creatina monohidratada foi o único capaz de prevenir o déficit de memória de ratos administrados intrahipocampalmente com o ácido metilmalônico. Os estudos de captação de glutamato por fatias de córtex cerebral de ratos jovens evidenciaram diminuição na captação de L-[3H]glutamato quando as fatias eram incubadas por 23 minutos na presença dos ácidos CIC e HMV (25-50% de diminuição). Em contrapartida, a incubação com o ácido HIV aumentou a captação em 110%, acréscimo que foi prevenido quando ao meio de incubação foi adicionado 1mM de creatina monohidratada. Por último, verificamos que a viabilidade de células de córtex cerebral ou de hipocampo de ratos jovens não foi alterada quando medida através do método do MTT e da determinação da DHL no meio de incubação onde as fatias eram imersas. Em resumo, nossos resultados apontam para alterações importantes no aprendizado de animais tratados intrahipocampalmente com os metabólitos ácidos da DXB em tarefas aversivas e não aversivas, bem como alterações de aprendizado não essencial quando da administração do principal metabólito que se acumula na acidemia metilmalônica (MMA). Além disso, estes déficits comportamentais parecem estar ligados a um comprometimento do metabolismo energético cerebral, visto que o prétratamento com creatina em estudos com metabólitos que se acumulam nas duas doenças (HIV para a DXB e MMA para a acidemia metilmalônica) preveniu o déficit de memória destes animais, bem como o pré-tratamento com succinato evitou o déficit de aprendizado espacial causado pelo HIV nos animais. Por outro lado, antioxidantes ou o antagonista do receptor glutamatérgico NMDA MK-801 não preveniu esses efeitos. Além disso, apresentamos evidências de que o CIC e o HMV ativam o sistema glutamatérgico, bloqueando a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral de ratos jovens, levando a um aumento da quantidade dos neurotransmissores na fenda sináptica. / Learning disability is a common feature of patients affected by maple syrup urine disease (MSUD) or methylmalonic acidaemia. The neurological symptoms include mental retardation, delay on neuropsychomotor development, seizures and alteration on neuroradiological images. MSUD is caused by severe deficiency of the branched-chain L-a-keto acid dehydrogenase complex (BCKAD) activity leads to tissue accumulation of aminoacids leucine, valine and isoleucine, the branched chain keto acids, a-ketoisocaproic, a-ketoisovaleric and a-keto-b-methylvaleric, and corresponding a-hydroxyacids, a-hydroxyisocaproic, a-hydroxyisovaleric and a- hydroxy-b-methylvaleric. The tissual accumulation of methylmalonic acid is the biochemical hallmark of the methylmalonic acidaemia because the methylmalonyl-CoA mutase is defective on this disease. The tissual levels of these metabolites are more proeminents in crisis of metabolic decompensation. In the present study we investigated the effect of acute administration of the acid metabolites cited above on the behavior of adult rats in the inhibitory avoidance and open field habituation tasks. The DXB acid metabolites producing learning deficits on aversive and spatial learning when infused 10 minutes before the training session of the tasks but not when infused immediatelly after training. The MMA injected 10 minutes before training provokes deficit only in the spatial task, and do not caused any effect on animals submitted to inhibitory avoidance task. The pretreatment with energetic substrates was the only effective on prevent the memory deficit caused by metabolites accumulating on MSUD or methylmalonic acidaemia. The prevention of the spatial memory deficit caused by a-hydroxyisovaleric acid was achieved by administration of creatine monohydrated or succinic acid. The creatine monohydrated was the only effective on prevention of learning deficit of open field habituation provoked by methylmalonic intrahippocampal administration. The results of cerebral glutamate uptake of 30 day-old rats showed a reduction of 25-50% by 30 min treatments with a-ketoisocaproic acid and a-hydroxy-b-methylvaleric acid, respectively. Differently, the a-hydroxyisovaleric acid elevated by 110% the glutamate uptake and the creatine monohydrated pretreatment (1mM) was effective on prevented this effect. We veryfied that cellular viability of cerebral cortical slices incubated with acid metabolites of MSUD was normal when the studies on cellular viability were performed by MTT method and by mean of the LDH activity in the incubation bath of the cells. The results of cerebral glutamate uptake of 30 day-old rats showed a reduction of 25- 50% by 30 min treatments with a-ketoisocaproic acid and and a-hydroxy-b- methylvaleric acid, respectively. Differently, the a-hydroxyisovaleric acid elevated by 110% the glutamate uptake on cortical slices of yang rats, and the creatine monohydrated pretreatment was effective on the prevention of this effect. In conclusion, our results pointing to strong alterations on learning of animals treated with MSUD acids metabolites on aversive and non aversive tasks., and suggest that non essential alterations occur on learning of animals treated with methylmalonic acid, which may be of value to elucidate some aspects of the neurological dysfuncion occuring on these diseases. The behavioral deficits may be linked to a compromise on cerebral energetic metabolism because the pre treatment with energetic substrates was effective on prevention in memory deficits caused by HIV and MMA. Otherwise, focal effects on glutamatergic system may be the causative of learning deficits provoked by administration of CIC and HMV, it is reasonable because the uptake of glutamate was reduced on rats treated with these metabolites, and it is causative of elevation on neurotransmitter levels in the synaptic cleft.

A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCAD) é o mais frequente defeito de oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média octanoato (AO), decanoato (AD) e cis-4-decenoato (AcD). Embora os sinais clínicos dos afetados sejam fundamentalmente neurológicos, os mecanismos fisiopatológicos do dano do sistema nervoso central apresentado pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Tem sido, no entanto, levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nesta doença possam exercer efeitos tóxicos. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro dos ácidos AO, AD e AcD sobre parâmetros de função mitocondrial e de estresse oxidativo em cérebro de ratos de 30 dias de vida, uma vez que o metabolismo energético é muito ativo e as defesas antioxidantes estão diminuídas neste tecido. Inicialmente, observamos que todos os ácidos graxos testados dimuíram o potencial de membrana mitocondrial em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sendo que as concentrações mais altas testadas do AD e do AcD exerceram efeitos comparáveis ao de um clássico desacoplador da fosforilação oxidativa, sugerindo que estes ácidos graxos atuem como desacopladores. Os ácidos AO, AD e AcD também aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. Além disso, o AD e o AcD diminuíram o estado 3 da respiração tanto com glutamato/malato quanto com succinato como substratos, enquanto que o AO dimiuiu o mesmo parâmetro apenas com o succinato. Também encontramos uma diminuição na razão ADP/O na presença de AD e AcD. O atractilosídeo, inibidor do translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), foi capaz de impedir parcialmente o efeito desacoplador do AD, sem alterar os efeitos do AO e do AcD, sugerindo um envolvimento deste translocador no efeito desacoplador do AD. O AO e o AD também diminuíram o consumo de oxigênio em mitocôndrias desacopladas. O AcD também diminuiu a produção de peróxido de hidrogênio, sendo seu efeito maior do que o da rotenona, que inibe o fluxo reverso de elétrons. Os AO e AD diminuíram as atividades dos complexos I-III e IV da cadeia transportadora de elétrons, e o AD também inibiu a atividade do complexo II-III. Todos os três ácidos graxos testados diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial e a posterior adição de rotenona apenas reverteu o efeito do AO, sugerindo que estes equivalentes estejam sendo perdidos para o meio extramitocondrial. Os ácidos AD e AcD também induziram um maior inchamento mitocondrial, sugerindo que estes ácidos graxos possam atuar como desacopladores provavelmente devido a uma permeabilização nãoseletiva da membrana mitocondrial interna. Também avaliamos o efeito dos mesmos ácidos graxos sobre parâmetros de estresse oxidativo. Observamos que o AO, o AD e o AcD induziram um aumento na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e na medida de quimioluminescência espontânea. Os AD e AcD também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, todos os ácidos graxos testados diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas, evidenciado pela diminuição do potencial antioxidante total do tecido (TRAP). Entretanto apenas o AD e o AcD diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro. O AcD não ocasionou um aumento nos níveis de TBA-RS em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sugerindo que outros componenentes celulares sejam essenciais para os efeitos pró-oxidantes deste ácido graxo. Entretanto, não foi observado nenhum efeito do AD sobre níveis de GSH e o conteúdo de grupamentos sulfidrila em preparações citosólicas, sugerindo um papel para a mitocôndria nos efeitos causados por este ácido graxo. Devemos também enfatizar que os efeitos mais pronunciados foram verificados pelo AcD, seguido do AD e por último do AO. Estes resultados, tomados em seu conjunto, indicam que os principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD exercem efeitos neurotóxicos importantes. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, possivelmente com outros mecanismos, atuem sinergicamente, colaborando para o dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da MCAD. / Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), decanoic (AD) and cis-4-decenoic (AcD) acids. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in MCAD-deficient patients is not clear yet, and that a role for neurotoxic accumulating metabolites has been considered, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of AO, AD and AcD on mitochondrial function and oxidative stress parameters in 30-dayold rat brain. Initially we investigated the effect of these fatty acids on mitochondrial homeostasis, and we found that all these three metabolites diminished the mitochondrial membrane potential in mitochondrial preparations of rat brain, and the effects of the highest concentration of AD and AcD were similar to the CCCP effect, a classical uncoupler, suggesting that these fatty acids act as uncouplers of oxidative phosphorylation. AO, AD and AcD also increased state 4 respiration and decreased respiratory control ratio. AD and AcD also decreased state 3 respiration with either glutamate/malate or succinate as substrates, while AO only decreased in the presence of succinate. We also observed a decrease in the ADP/O ratio caused by AD and AcD. Atractyloside, an inhibitor of adenine nucleotide transporter (ANT), mildly prevented the uncoupler effect of AD, without any effect of AcD- and AO-induced effects, suggesting a role for ANT on AD-induced effects. AO and AD also diminished uncoupled state (state U) in mitochondrial preparations. AcD also decreased hydrogen peroxide production, and this effect was greater than rotenone effect, which inhibits the reverse electron flow. AO and AD inhibited the activities of the respiratory chain complexes I-III and IV, and AD also inhibited complex II-III activity. All the fatty acids tested decreased mitochondrial matrix NAD(P)H content, and the further addition of rotenone only reverted AO-induced effect, indicating that these reduced equivalents might be lost from the mitochondrial matrix. AD and AcD also induced a mitochondrial swelling, suggesting that these fatty acids act as uncouplers probably due to a non-selective mitochondrial inner-membrane. We also evaluated the effect of the same fatty acids on oxidative stress parameters. We first observed that lipid peroxidation was increased in the presence of AO, AD and AcD, as observed by the increase in the thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels and spontaneous chemiluminescence. AD and AcD also caused protein oxidative damage, since they increased carbonyl content and decreased sulfhydryl group content. All the fatty acids tested also decreased the non-enzymatic antioxidant defenses, as they decreased the total radical-trapping antioxidant potential (TRAP). However, only AD and AcD decreased reduced glutathione (GSH) levels, the major antioxidant in the cell. AcD did not induce an increase in TBA-RS levels in mitochondrial preparations, suggesting that mitochondria were not involved in AcD-induced effects. Furthermore, AD did not alter GSH levels and sulfhydryl group content in cytosolic preparations, suggesting a role for mitochondria in AD-induced effects. Taken together, these results suggest that the MCADD accumulating fatty acids cause important neurotoxic effects. Thus, it is feasible that a mitochondrial dysfunction and oxidative stress, allied to other possible toxic effects, act synergistically, collaborating to the neurological damage found in MCAD-deficient patients.

As acidúrias 3-hidroxi-3-metilgutárica (HMGA) e 3-metilglutacônica (MGTA) são doenças que afetam o catabolismo da leucina e a cetogênese. Os pacientes afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção urinária dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA), 3- metilglutacônico (MGT) e 3-hidroxiisovalérico (OHIVA), ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária de MGT, MGA e OHIVA. Os indivíduos afetados por MGTA apresentam predominantemente sintomas neurológicos. Já os pacientes acometidos pela HMGA também apresentam hepatomegalia, principalmente em situações de descompensação metabólica, quando ocorrem elevações drásticas nas concentrações dos metabólitos acumulados. Considerando que os mecanismos patogênicos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nos pacientes portadores da HMGA e da MGTA são pouco conhecidos, inicialmente investigamos os efeitos in vitro dos ácidos HMG, MGA, MGT e OHIVA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que os metabólitos testados induziram peroxidação lipídica (aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e da quimioluminescência) e dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e oxidação de grupamentos sulfidrila). Além disso, a indução de peroxidação lipídica causada pelo HMG e pelo MGT foi prevenida pela adição de antioxidantes. Também foi demonstrado que o HMG, MGA, MGT e OHIVA diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas (diminuição das concentrações de glutationa reduzida (GSH), do potencial antioxidante total e da reatividade antioxidante total) e que a diminuição das concentrações de GSH causada pelo HMG e pelo MGA foi prevenida por antioxidantes. Por outro lado, nenhum dos ácidos orgânicos foi capaz de oxidar grupamentos sulfidrila de uma solução comercial de glutationa e de membranas mitocondriais isoladas de córtex cerebral. Na segunda parte do trabalho, comparamos a vulnerabilidade do estriado cerebral e do fígado ao dano oxidativo causado pelo HMG, MGA, MGT e OHIVA. Verificamos que todos os ácidos orgânicos aumentaram a medida de TBA-RS no estriado, sendo que apenas o HMG, além de apresentar o efeito mais pronunciado, induziu peroxidação lipídica no fígado. Esses metabólitos também diminuíram as concentrações de GSH em estriado. Novamente apenas o HMG reduziu as defesas antioxidantes não-enzimáticas no fígado. Finalmente, nossos resultados demonstraram que o HMG, MGA e o MGT induziram a oxidação de grupamentos sulfidrila em estriado, ao passo que nenhum dos metabólitos alterou esse parâmetro em fígado. Os efeitos detectados no presente estudo demonstram que os ácidos orgânicos acumulados na HMGA e na MGTA induzem estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e fígado de ratos jovens. Também evidencia que os tecidos cerebrais apresentam maior vulnerabilidade que o fígado ao dano oxidativo provocado por esses metabólitos, o que está de acordo com a sintomatologia apresentada pelos pacientes que é predominantemente neurológica. Portanto, presumimos que o estresse oxidativo pode contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia dos danos teciduais encontrados nos pacientes acometidos pela HMGA e MGTA. / 3-Hydroxy-3-methylglutaric (HMGA) and 3-methylglutaconic (MGTA) acidurias are disorders that affect leucine catabolism and ketogenesis. HMGAaffected patients present tissue accumulation and high urinary excretion of 3- hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA), 3-methylglutaconic (MGT) and 3-hydroxyisovaleric (OHIVA) acids, whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of MGT, MGA and OHIVA. MGTA- and HMGAaffected patients predominantly present neurologic symptoms. HMGA patients also present hepatomegaly, especially during metabolic crisis, which is characterized by a dramatic increase of the concentrations of the accumulating organic acids. Considering that the mechanisms of brain damage in HMGA and MGTA are poorly known, we first investigated the in vitro effects of HMG, MGA, MGT and OHIVA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young rats. We verified that the organic acids induced lipid peroxidation (thiobarbituric-acid reactive species, TBA-RS, and chemiluminescence increase) and protein oxidative damage (carbonyl formation and sulfhydryl oxidation) in cortical supernatants. The lipid peroxidation induced by HMG and MGT was prevented by the addition of free radical scavengers, suggesting that free radicals are involved in these effects. It was also demonstrated that HMG, MGA, MGT and OHIVA reduced non-enzymatic antioxidant defenses (reduced glutathione, GSH, concentrations, total radical-trapping antioxidant potential and total antioxidant reactivity) and that GSH decrease caused by HMG and MGA was prevented by free radical scavengers. On the other hand, the metabolites did not oxidize sulfhydryl groups from a commercial solution of GSH and from purified membrane protein-bound thiol groups, indicating that the decrease of GSH levels caused by the organic acids was not due to a direct oxidative effect. Next, we evaluated the vulnerability of a central (striatum) and a peripheral (liver) tissue to the oxidative damage caused by HMG, MGA, MGT and OHIVA. It can be observed that HMG, MGA, MGT and OHIVA induced lipid peroxidation (TBA-RS increase) in striatum. Among the various acids, only HMG increased TBA-RS in the liver. Furthermore, HMG induced the highest degree of lipid peroxidation in the striatum. It was also verified that the organic acids diminished GSH concentrations. Again, HMG presented the strongest effect compared to the other metabolites, reducing GSH levels in the striatum and in the liver. Finally, we observed that HMG, MGT and MGA reduced the sulfhydryl content (protein oxidation) in the striatum, whereas the metabolites did not alter this parameter in the liver. The present data indicate the HMG, MGA, MGT and OHIVA induce oxidative stress in cerebral cortex, striatum and liver from young rats. It can be also observed that the brain is more vulnerable than liver to lipid and protein oxidative damage induced by these organic acids, which is in agreement with the fact that the patients present predominantly neurologic symptoms. Therefore, it may be presumed that oxidative stress elicited in vitro by HMG, MGA, MGT and OHIVA contributes, at least in part, to the pathophysiology of the brain and hepatic damage found in HMGA and MGTA.

Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é um Erro Inato do Metabolismo dos peroxissomos, que se caracteriza pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em fluidos e tecidos corporais. É causada por mutações no gene ABCD1, o qual codifica uma proteína responsável por transportar VLCFA do citosol para dentro do peroxissomo, para serem oxidados. Apesar dos mecanismos relacionados ao dano tecidual ainda não estarem bem elucidados, estudos vêm mostrando que o acúmulo de metabólitos tóxicos e o estresse oxidativo podem estar relacionados com a fisiopatologia da doença. Considerando que ainda não foi reportado dano ao DNA em pacientes X-ALD, e que muitos estudos vêm investigando as propriedades antioxidantes de N-acetil-L-cisteína (NAC), rosuvastatina (RSV) e trolox (TRO), os objetivos deste trabalho foram avaliar o dano ao DNA em HTZ e pacientes sintomáticos portadores de X-ALD, verificar o efeito in vitro de NAC, TRO e RSV sobre o dano ao DNA nestes pacientes, estudar associações entre o dano ao DNA e a peroxidação lipídica e, por fim, investigar a capacidade da NAC em aumentar, in vitro, os níveis de glutationa (GSH) e sulfidrila nos pacientes X-ALD. Não foi verificada diferença significativa no dano ao DNA em mulheres HTZ, quando comparado a controles. Em contraste, pacientes sintomáticos apresentaram um maior índice de dano ao DNA comparado às HTZ e ao grupo controle. No ensaio in vitro, foi observado que os antioxidantes NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) e RSV (0,5; 2 e 5 μM) foram capazes de reduzir o dano ao DNA em pacientes sintomáticos a níveis de controle. Além disso, observamos uma correlação positiva entre o dano ao DNA e o nível de isoprostanos urinários (biomarcador de dano a lipídios), o que nos permite inferir que o dano ao DNA poderia estar sendo causado por processos oxidativos em pacientes sintomáticos. Verificou-se também que os conteúdos de glutationa eritrocitária e sulfidrila plasmática estavam diminuídos em pacientes X-ALD (independentemente do fenótipo) e que 5 mM de NAC, in vitro, foi capaz de aumentar estes parâmetros a níveis de controle saudáveis. O presente trabalho fornece evidências experimentais de que há dano ao DNA em pacientes X-ALD, os quais possuem níveis diminuídos de GSH e sulfidrila, e que a administração dos antioxidantes NAC, TRO e RSV poderia ser considerada uma terapia adjuvante no tratamento da X-ALD. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inborn error of peroxisome metabolism which is characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in tissue and body fluids. It is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes a protein responsible for transporting VLCFA from cytosol to peroxisomes to be oxidized. Although the mechanisms underlying tissue damage are still poor understood, studies have been shown that the accumulation of toxic metabolites and oxidative stress may be related to the pathophysiology of X-ALD. Considering that DNA damage was not reported in X-ALD patients yet, and that former studies have been investigated the antioxidant properties of N-acetyl-L-cistein (NAC), rosuvastatin (RSV) and trolox (TRO), the aims of this study were to evaluate DNA damage in HTZ and symptomatic X-ALD patients, to study the in vitro effect of NAC, TRO and RSV on DNA damage in these patients, to look for associations between DNA damage and lipid peroxidation and to verify the ability of NAC in increasing, in vitro, glutathione (GSH) and sulfhydryl levels on X-ALD patients. It was verified no significant difference on DNA damage in HTZ women when compared to controls. In contrast, symptomatic patients presented higher DNA damage levels, compared to HTZ and control group. In the vitro assay, it was observed that the antioxidants NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) and RSV (0,5; 2 e 5 μM) were able to reduce DNA damage in symptomatic patients until control levels. Likewise, our results showed positive correlation between DNA damage and urinary isoprostanes (biomarker of lipid damage), allowing us to hypothesize that DNA damage might be caused by oxidative processes in symptomatic patients. It was also verified that the plasmatic sulfhydryl content and erythrocyte glutathione levels were decreased in X-ALD patients (regardless of the phenotype) and that 5mM of NAC in vitro was able to increase these parameters until control levels. The present work yields experimental evidence that DNA damage occurs in X-ALD patients, which have GSH and sulfhydryl levels reduced and that the administration of the NAC, TRO and RSV antioxidants might be considered as an adjuvant therapy for X-ALD.

doença metabólica hereditária bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ornitina (Orn), homocitrulina (Hcit), amônia e ácido orótico (Oro) no sangue e outros tecidos dos pacientes afetados. Os sintomas neurológicos desse distúrbio são comuns, incluindo retardo mental, convulsões e ataxia, porém os mecanismos que levam ao dano cerebral são praticamente desconhecidos. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito dos metabólitos acumulados nesta doença sobre a homeostase energética e redox em cérebro de ratos, bem como sobre o desempenho de animais submetidos à hiperornitinemia em tarefas comportamentais. Inicialmente avaliamos o efeito in vitro da Orn, Hcit e Oro sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro de ratos jovens. Verificamos que a Orn e a Hcit inibem o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, (inibição da produção de CO2 a partir de acetato e das enzimas aconitase e α-cetoglutarato desidrogenase), bem como a via glicolítica aeróbica (redução na síntese de CO2 a partir de glicose), além de comprometer o fluxo de elétrons pela cadeia respiratória (inibição do complexo I-III). A Hcit, mas não a Orn, também foi capaz de inibir a atividade da enzima creatina quinase, sendo que essa inibição foi prevenida por GSH, sugerindo um possível papel de espécies reativas oxidando grupamentos tióis, essenciais para a atividade desta enzima. Em contraste, a atividade das outras enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e da cadeia respiratória, bem como a Na+,K+- ATPase não foram alteradas in vitro pela Orn e pela Hcit nas doses testadas (0,1 a 5 mM). Do mesmo modo, o Oro não interferiu em nenhum dos parâmetros testados. O próximo passo deste estudo foi avaliar o efeito in vivo da administração intracerebroventricular (ICV) de Orn e Hcit sobre parâmetros de estresse oxidativo e metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn e a Hcit aumentaram os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a formação de grupamentos carbonilas, indicativos de peroxidação lipídica e dano oxidativo a proteínas, respectivamente. Além do mais, a N-acetilcisteína e a combinação de ácido ascórbico mais α-tocoferol atenuaram a oxidação lipídica e preveniram totalmente o dano oxidativo protéico provocado pela Orn e pela Hcit, sugerindo que espécies reativas estejam envolvidas nestes efeitos. A administração ICV de Hcit, mas não de Orn, também diminuiu os níveis de glutationa reduzida (GSH), bem como a atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase, indicando que a Hcit provoca uma redução nas defesas antioxidantes cerebrais. Quanto aos parâmetros de metabolismo energético avaliados após a administração ICV de Orn e Hcit, verificamos que a Orn e a Hcit inibem o funcionamento do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (inibição da síntese de CO2 a partir de acetato), a via glicolítica (redução na produção de CO2 a partir de glicose) e a atividade do complexo I-III da cadeia respiratória. A Hcit in vivo também inibiu a atividade da aconitase, uma enzima muito susceptível ao ataque de radicais livres. Investigamos também os efeitos da administração ICV de Orn e Hcit na presença ou ausência de hiperamonemia, induzida pela administração intraperitoneal de urease, sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn aumentou os níveis de TBA-RS e a formação de carbonilas, sem alterar o conteúdo de grupamentos sulfidrilas e os níveis de GSH. Além disso, a combinação de hiperamonemia com Orn resultou em uma diminuição no conteúdo de sulfidrilas e GSH, indicando um efeito sinérgico da Orn com a amônia. Além disso, a Hcit causou um aumento nos valores de TBA-RS e da formação de carbonilas, bem como uma diminuição na concentração de GSH sem alterar o conteúdo de sulfidrilas. Em relação ao tratamento com urease, a indução de hiperamonemia pela urease foi capaz de aumentar os níveis de TBA-RS, indicando que hiperamonemia causa dano oxidativo a lipídeos. Finalmente, produzimos um modelo animal quimicamente induzido de hiperornitinemia através da administração subcutânea de Orn (2-5 μmol/g de peso corporal). Altas concentrações cerebrais de Orn foram alcançadas nesse modelo, indicando que a Orn é permeável a barreira hemato-encefálica. Investigamos, então, o efeito da administração crônica de Orn do 5° ao 28° dia pós-natal sobre o desenvolvimento físico, motor e sobre o desempenho dos ratos adultos nas tarefas de campo aberto e no labirinto aquático de Morris. A administração crônica de Orn não afetou o aparecimento de pelos, a abertura dos olhos, a erupção dos incisivos e o reflexo de queda livre, sugerindo que o desenvolvimento físico e neuromotor não foram comprometidos pela administração crônica de Orn. Similarmente, o desempenho dos ratos no labirinto aquático de Morris na idade adulta não foi alterado pelo tratamento crônico dos mesmos com Orn, indicando que a memória espacial não foi afetada. Entretanto, os animais tratados com Orn não apresentaram habituação ao campo aberto, sugerindo um déficit de aprendizado/memória nesta tarefa. A atividade motora, avaliada pelo número de cruzamentos na tarefa do campo aberto, e pela velocidade de natação no labirinto aquático de Morris foram similares para os animais injetados com Orn e salina, indicando que os animais com hiperornitinemia não apresentaram déficit na atividade locomotora que pudesse atrapalhar seu desempenho nos testes de comportamento. De maneira similar, o número de bolos fecais, o número de grooming e o tempo gasto na área central na tarefa de campo aberto foram iguais em ambos os grupos, indicando que não houve alteração na ansiedade dos animais com o tratamento com Orn. A presente investigação demonstrou pela primeira vez que a Orn e especialmente a Hcit comprometem a homeostase energética e redox celular e que hiperornitinemia crônica durante o período pós-natal prejudica o desempenho de animais adultos na tarefa de campo aberto. É provável, portanto, que as concentrações cerebrais aumentadas de Orn tenham provocado um dano cerebral, possivelmente através do comprometimento do metabolismo energético e da indução de dano oxidativo, alterando vias do metabolismo necessárias para um aprendizado/memória normais. Concluindo, postulamos que alterações na bioenergética e no estado redox cerebral induzido pelos metabólitos acumulados na síndrome HHH, como demonstrado in vitro e in vivo na presente investigação, possam representar mecanismos patogênicos, contribuindo, ao menos em parte, para os sintomas neurológicos dos pacientes afetados por este transtorno. / Tissue accumulation of ornithine (Orn), homocitrulline (Hcit), ammonia and orotic acid (Oro) is the biochemical hallmark of patients affected by hyperornithinemia–hyperammonemia– homocitrullinuria (HHH) syndrome, a disorder clinically characterized by neurological symptoms, whose pathophysiology is practically unknown. The aim of this study was to evaluate the effect of the accumulating metabolite in the HHH syndrome on energetic and redox homeostasis in brain of rats, as well as the rat performance in behavioural tasks when submitted to hiperornithinemia. We first investigated the in vitro effect of Orn, Hcit and Oro on parameters of energy metabolism in brain of young rats. We verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle (inhibition of CO2 synthesis from acetate, as well as aconitase and α- ketoglutarate dehydrogenase activities), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and moderately the electron transfer flow (inhibitory effect on complex I–III). Hcit, but not Orn, was also able to inhibit the mitochondrial creatine kinase activity. Furthermore, this inhibition was prevented by glutathione, suggesting a possible role of reactive species oxidizing critical thiol groups of the enzyme. In contrast, the other enzyme activities of the citric acid cycle and of the electron transfer chain, as well as synaptic Na+,K+-ATPase were not altered by either Orn or Hcit at concentrations as high as 5.0 mM. Similarly, Oro did not interfere with any of the tested parameters. The next step of this study was to investigate the in vivo effects of intracerebroventricular (ICV) administration of Orn and Hcit on parameters of oxidative stress and energy metabolism in cerebral cortex from young rats. Orn and Hcit increased thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, indicators of lipid and protein oxidative damage, respectively. Furthermore, N-acetylcysteine and the combination of ascorbic acid plus α- tocopherol attenuated the lipid oxidation and totally prevented the protein oxidative damage provoked by Orn and Hcit, suggesting that reactive species were involved in these effects. The ICV Hcit administration, but not Orn administration, also decreased reduced glutathione (GSH) concentrations, as well as the activity of catalase and glutathione peroxidase, indicating that Hcit provokes a reduction of brain antioxidant defenses. As regards to the parameters of energy metabolism, we verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle function (inhibition of CO2 synthesis from acetate), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and complex I–III activity of the respiratory chain. Hcit also inhibited the activity of aconitase, an enzyme very susceptible to free radical attack. We also investigated the in vivo effects of ICV administration of Orn and Hcit in the presence or absence of hyperammonemia induced by intraperitoneal urease treatment on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young. Orn increased thiobarbituric acid-reactive substances levels and carbonyl formation, without altering sulfhydryl content and GSH levels. We also observed that the combination of hyperammonemia with Orn resulted in a decrease of sulfhydryl levels and GSH concentrations, highlighting a synergistic effect of ornithine and ammonia. Furthermore, homocitrulline caused increases of thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, as well as a decrease of GSH concentrations without altering sulfhydryl content. We also observed that urease treatment per se was able to enhance thiobarbituric acid-reactive substances levels indicating that hiperamonemia induce lipid peroxidation. Finally, we produced a chemical animal model of hiperornithinemia induced by a subcutaneous injection of saline-buffered Orn (2-5 μmol/g body weight) to rats. High brain Orn concentrations were achieved, indicating that Orn is permeable to the blood brain barrier. We then investigated the effect of early chronic postnatal administration of Orn (from the 5th to the 28th day of life) on physical and motor development and on the performance of adult rats in the open field and in the Morris water maze tasks. Chronic postnatal Orn treatment had no effect on the appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor on the free-fall righting task, suggesting that physical and motor development were not changed by Orn. However, Orn-treated rats did not habituate to the open field apparatus, implying a deficit of learning/memory. Motor activity was the same for Orn- and saline- injected animals. Motor activity, evaluated by the number of crossings in the open field and by the swimming speed in the Morris water maze, was the same for Orn- and saline- injected animals, indicating no deficit of locomotor activity in rats injected with Orn. Similarly, the number of fecal boli and grooming and the time spent in the central area in the open field task were the same in both groups, implying no alteration of emotionality. The current investigation shows for the first time that Orn and especially Hcit compromise energetic and redox homeostasis and that chronic hyperornithinemia during postnatal period impairs the adult rat performance in the open field task, where the animals did not habituate to the apparatus. It is possible, however, that high sustained cerebral Orn level could provoke a brain damage, possibly through induction of oxidative stress and/or compromising energy metabolism, altering some metabolic pathways essential for normal learning/memory. In conclusion, we postulate that alterations in the cerebral bioenergetic and redox state induced by metabolites accumulated in HHH syndrome, as demonstrated in vitro and in vivo in the present study, may represent pathogenic mechanisms contributing, at least in part, to the neurological symptoms of patients affected by this disorder.