Los objetivos de esta tesis fueron por un lado evaluar la asociación entre el polimorfismo funcional Val108/158Met de la catecol-O-metiltransferasa (COMT) fetal y materno y el riesgo de desarrollar preeclampsia (PE), examinando la influencia de dicho polimorfismo en la expresión, la actividad enzimática placentaria de la COMT y en los niveles maternos de su producto, el 2-metoxiestradiol (2ME), en gestantes control y preeclámpticas. Por otra lado, analizamos si los niveles del 2ME están relacionados con diferentes índices de gravedad clínica y biomarcadores de la enfermedad. Llevamos a cabo un estudio caso-control observacional, analítico y prospectivo en 126 gestantes (53 preeclámpticas y 73 gestaciones normales) reclutadas en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia entre enero de 2010 y enero de 2012. Se extrajeron muestras de sangre de las gestantes antes del parto y, una vez producido el mismo, se tomó sangre del cordón umbilical (fetal) y fragmentos de tejido placentario. Las muestras sanguíneas se utilizaron para realizar los estudios de genotipado, y para medir los niveles maternos de 2ME, y de diferentes biomarcadores relacionados con la PE (homocisteína, sFlt1, PlGF). Por otra parte, en el tejido placentario se realizaron los análisis de expresión y actividad enzimática de la COMT. Finalmente, obtuvimos datos clínicos y analíticos de la historia clínica de las pacientes. Los principales resultados de este trabajo muestran que el genotipo met-met fue el doble de frecuente en la sangre fetal de gestantes preeclámpticas que en las controles. La odds ratio ajustada (ORajt) para el riesgo de PE en dichas mujeres fue de 3.22 [intervalo de confianza (IC) 95%: 1.01, 10.28]. Los análisis del polimorfismo materno de la COMT no revelaron un aumento significativo del riesgo de PE, y tampoco añadió nada el estudio de los haplotipos de la COMT. Al analizar la actividad enzimática in vitro, ésta se vio determinada por el polimorfismo fetal Val108/158Met, siendo menor para el genotipo met-met que para el val-met y el val-val tanto en población total como en la preeclámptica. La actividad de la COMT in vitro no difirió entre controles y preeclámpticas dentro de cada genotipo. En cuanto a la expresión de la COMT soluble, ésta fue menor para el genotipo met-met en ambas subpoblaciones y dicha expresión se correlacionó inversamente con los valores de actividad in vitro, pudiendo por tanto estar determinada dicha actividad por la cantidad de proteína. La expresión placentaria de la COMT soluble no difirió entre controles y preeclámpticas dentro de cada genotipo. En lo que respecta a la actividad in vivo, no encontramos ninguna asociación entre el polimorfismo estudiado y los niveles de 2ME en plasma materno; no obstante los valores de 2ME sí estuvieron significativamente disminuidos en las gestantes con PE frente a las controles (1818.41±189.25 pg/ml vs 2906.43±200.69 pg/ml). Además, las gestantes con PE presentaron unos niveles plasmáticos mayores de homocisteína, condicionando éstos un mayor riesgo de PE, y correlacionándose inversamente con los valores de 2ME, lo que podría contribuir a la menor actividad observada de la COMT in vivo en PE. Por otra parte, los valores plasmáticos de 2ME se correlacionaron con parámetros clínicos y analíticos de gravedad del síndrome como la mayor tensión arterial sistólica pico, la necesidad de una mayor agresividad terapéutica antihipertensiva, el menor peso neonatal o la precocidad de la PE. Finalmente, los niveles maternos de 2ME también se correlacionaron, tanto en la población total como en la preeclámptica, con conocidos factores de desequilibrio angiogénico en PE como el sFlt1 o el PlGF, sugiriendo que el 2ME podría ser un factor clave en el mantenimiento del equilibrio angiogénico necesario para el correcto desarrollo de la gestación. / The objectives of this thesis were on one hand to assess the association between fetal and maternal catechol-O-methyltransferase (COMT) Val108/158Met functional polymorphism and the risk of developing preeclampsia (PE), examining the influence of this polymorphism in expression and activity of placental COMT enzyme and in maternal plasma levels of its product, 2-methoxyestradiol (2ME), in both control and preeclamptic pregnant women. On the other hand, we analyze whether 2ME levels are associated with different clinical severity index and biomarkers of PE. We conducted an observational, analytical and prospective case-control study in 126 pregnant women (53 preeclamptic and 73 normal pregnancies) recruited at the Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca in Murcia from January 2010 to January 2012. Blood samples of pregnant women were taken before delivery and, immediately after, cord blood (fetal) and placental tissue fragments were taken. Blood samples were used for genotyping studies, and to measure maternal levels of 2ME, and different biomarkers related to PE (homocysteine, sFlt1, PlGF). Moreover, we made the analysis of expression and enzymatic activity in vitro of COMT in placental tissue. Finally, we obtained clinical and laboratory data from the clinical history of patients. The main results of this work show that the genotype met-met was twice as frequent in fetal blood from patients with PE as in controls. The adjusted odds ratio (ORajt) for the risk of PE in these women was 3.22 [95% confidence interval (CI): 1.01 -10.28]. Analyses of maternal COMT polymorphism did no reveal a significant increased risk of PE, and either added nothing COMT haplotypes analysis. When analyzing the enzyme activity in vitro, it was determined by fetal Val108/158Met polymorphism, being lower for met-met genotype than for val-met and val-val both the total population and preeclamptic. The COMT activity in vitro did not differ between control and preeclamptic pregnant women within each genotype. The expression of soluble COMT was lower for the met-met genotype in both subpopulations and this expression was inversely correlated with in vitro activity values, then such activity may be determined by the amount of protein. Placental expression of soluble COMT not differ between controls and preeclamptic within each genotype In respect to in vivo activity, we found no association between the polymorphism studied and levels of 2ME in maternal plasma, however those values were significantly decreased in women with PE compared to control (1818.41±189.25 pg/ml versus 2906.43±200.69 pg/ml). In addition, there were a higher plasma homocysteine levels in preeclamptic women conditioning them at increased risk of PE, and correlated inversely with the values of 2ME in total population, which could contribute to the lower COMT activity in vivo observed in PE. On the other hand, plasmatic 2ME values were significantly correlated with different clinical and laboratory parameters of severity of the syndrome such as higher peak systolic blood pressure, the need for more aggressive antihypertensive therapeutic, lower birth weight or early onset of PE. Finally, maternal 2ME levels were also correlated (in patients with PE and in total population) with known angiogenic imbalance factors present in PE as sFlt1 or PlGF, suggesting that 2ME could be a key factor in maintaining the balance angiogenic necessary for the proper development of gestation.

Desde hace tiempo la explicación de la existencia de estrellas deficientes en hidrógeno ha sido de amplio debate. Uno de los mecanismos posibles que explica la formación de estrellas post-AGB con estas características, involucra un flash tardío de la capa de helio. Para arribar a este tipo de objetos hemos calculado la evolución previa, para estrellas de masa intermedia, desde la ZAMS hasta el recorrido a lo largo de la rama de enfriamiento de las enanas blancas, ya que es de crucial importancia tener un perfil químico realista lo cual es posible de obtener únicamente si se calcula toda la evolución de la estrella desde su formación.

La temática de esta tesis está orientada hacia el estudio de las propiedades pulsacionales de las estrellas variables ZZ Ceti desde un punto de vista teórico-numérico. Una de las motivaciones mas importantes para estudiar estrellas pulsantes en general radica en la posibilidad de extraer información de su estructura interna y estado evolutivo a traves del análisis de su espectro pulsacional. Esta técnica es análoga en su esencia a la tan conocida sismología en geofísica. El principio básico (muy antiguo en la historia de la física) es estudiar cómo un sistema vibra para luego inferir sus propiedades estructurales. En el caso de las estrellas, esta metodología se enmarca en la disciplina denominada astrosismología.

Mucor circinelloides es un hongo filamentoso utilizado como modelo para el estudio del mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Una vez caracterizado dicho mecanismo y los principales genes implicados, se pretende determinar el papel de la ruta de silenciamiento en la regulación de genes endógenos, así como identificar otros posibles elementos genéticos que participen en dicha ruta. Para ello, se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Identificación del gen implicado en la eliminación de la cadena pasajera de los siRNAs y estudio de la existencia de interacciones entre las proteínas de la maquinaria de silenciamiento. 2. Estudio de la participación de Ago-1 en la biogénesis de los distintos tipos de ex-siRNAs de M. circinelloides. 3. Identificación de los genes regulados por el mecanismo de silenciamiento mediante el análisis de los perfiles transcriptómicos de la estirpe silvestre y de mutantes en genes de silenciamiento. 4. Caracterización fenotípica detallada de los mutantes afectados en la ruta de silenciamiento, para identificar los procesos celulares regulados mediante dicho mecanismo. Para desarrollar estos objetivos se ha utilizado la siguiente metodología: 1. La identificación de otros genes implicados en el mecanismo de silenciamiento se llevó a cabo mediante la disrupción de los genes candidatos por recombinación homóloga y su posterior análisis fenotípico. Para ello, se utilizaron técnicas de amplificación de DNA mediante PCR, clonación, transformación de protoplastos e hibridaciones tipo Southern y Northern. Las interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento se analizaron mediante el sistema de doble híbrido de levaduras. 2. La participación de Ago-1 en la biogénesis de los ex-siRNAs se analizó mediante la secuenciación de librerías de sRNAs. Ago-1 fue purificada mediante FLPC para el aislamiento y secuenciación de los sRNAs unidos a ella. Los datos obtenidos fueron validados experimentalmente mediante hibridaciones tipo Northern. 3. El análisis transcriptómico de las distintas estirpes se realizó mediante hibridaciones con micromatrices y secuenciación de RNA (RNA-seq). 4. El análisis fenotípico de los mutantes en genes de silenciamiento incluyó la cuantificación de la producción de esporas vegetativas y zigosporas, el estudio de la respuesta frente a diferentes situaciones de estrés, la cuantificación del proceso de autolisis y el análisis de la virulencia en Galleria mellonella. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar las siguientes conclusiones: 1. El gen qip es esencial para el eficaz funcionamiento del mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes, sugiriendo un papel en la activación del complejo RISC. No se detectaron interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento de M. circinelloides, lo que podría deberse a la necesidad de modificaciones post-traduccionales específicas de las proteínas de silenciamiento o a la formación de complejos multiproteicos. 2. El gen ago-1 está implicado en el mecanismo de silenciamiento endógeno de M. circinelloides, siendo necesario para la biogénesis y/o estabilidad de las cuatro clases de ex-siRNAs. Las clases I y II de ex-siRNAs se unen específicamente a Ago-1 para llevar a cabo la identificación y degradación de sus mensajeros diana. Las clases III y IV son generadas por una ruta de silenciamiento no canónica, en la que se requiere la participación de Ago-1, pero no la unión específica de estos ex-siRNAs a dicha proteína. 3. Los análisis transcriptómicos ponen de manifiesto que el mecanismo de silenciamiento posee un papel modulador de la expresión de un gran número de genes endógenos a lo largo del crecimiento vegetativo. Las funciones de las proteínas cifradas por estos genes están relacionadas con la biogénesis y modificación de la pared celular, el control de la división celular y el crecimiento, metabolismo de carbohidratos, envejecimiento celular o respuesta a estrés. 4. La ruta canónica de silenciamiento está implicada en la regulación del proceso de esporulación vegetativa y en la activación del programa de autolisis inducido por estrés nutricional. La regulación del desarrollo sexual debe ser llevada a cabo por una ruta no canónica independiente de Dicer. Los experimentos de patogénesis no revelan una clara participación del mecanismo de silenciamiento en el proceso de virulencia, aunque no se descarta una respuesta diferencial en otros organismos modelo, como el ratón. / Regulation of endogenous gene expression by the RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides. Mucor circinelloides is a filamentous fungus used as a model for studying the RNA silencing mechanism. Once the mechanism and main genes involved were characterized, the next goal is to determine the role of the RNA silencing pathway in the regulation of endogenous genes, and to identify other possible genetic elements that participate in the pathway. To do this, the following specific objectives were proposed: 1. Identification of the gene involved in the removal of the passenger strand of siRNAs duplex, and analysis of the interactions between silencing proteins. 2. Study of the participation of Ago-1 in the biogenesis of different classes of ex-siRNAs in M. circinelloides. 3. Identification the genes regulated by the RNA silencing mechanism by analyzing the transcriptome of the wild type and silencing mutants. 4. Phenotypic characterization of mutants affected in the silencing pathway to identify the cellular processes regulated by this mechanism. To develop these objectives the following methodology has been used: 1. Identification of other genes involved in the silencing pathway was addressed by disrupting candidate genes by homologous recombination and subsequent phenotypic analysis. To this end, PCR amplification of DNA fragments, cloning, transformation of protoplasts and Southern and Northern blot hybridizations were carry out. The study of interaction between RNA silencing proteins was performed using the yeast two-hybrid system. 2. cDNA libraries of sRNAs were generated and sequenced to analyze the participation of Ago-1 in the biogenesis of ex-siRNAs. Ago-1 was purified by FPLC for the isolation and sequencing of Ago-1 bound sRNAs. The sequencing data were validated by Northern-blot experiments. 3. Transcriptomic analysis of the different strains was carried out by hybridization methods using microarrays and RNA sequencing (RNA-seq). 4. Phenotypic analysis of silencing mutants included quantification of vegetative spore and zygospores, study of the response to different stresses, quantification of the autolysis process and virulence analysis of the different silencing mutants in Galleria mellonella. The results allowed reaching the following conclusions: 1. The qip gene is essential for transgene-induced gene silencing, suggesting a role in the activation of the RISC complex. No interactions were detected between proteins involved in the RNA silencing pathway of M. circinelloides. This could be due to the need for specific post-translational modifications of silencing proteins or the formation of multiprotein complexes. 2. Ago-1 is involved in endogenous RNA silencing in M. circinelloides, and it is necessary for the biogenesis and / or stability of all ex–siRNAs classes. Classes I and II of ex-siRNAs specifically bind to Ago-1 for the identification and degradation of their mRNA targets. Classes III and IV are generated by a non-canonical silencing mechanism that requires the participation of Ago-1, but there is not specific binding of these ex-siRNAs to Ago-1 protein. 3. Transcriptomic analysis showed that the silencing mechanism has a modulatory role in the expression of a large number of endogenous genes during vegetative growth. The functions of the proteins coded by these genes are linked to the biogenesis and modification of the cell wall, the control of cell division and growth, carbohydrate metabolism, cell aging or stress response. 4. The canonical RNA silencing pathway is involved in regulation of vegetative sporulation and autolysis induced by nutritional stress. Sexual development should be regulated by a non-canonical Dicer-independent RNA pathway. Pathogenesis experiments did not reveal a role of RNA silencing in the virulence process, but a differential response can’t be ruled out when using other model organisms, such as mouse.

Los objetivos de esta tesis doctoral fueron la caracterización fenotípica y estudio del modo de herencia de los principales caracteres relacionados con la fenología y calidad del fruto en la especie albaricoquero, así como la caracterización genotípica mediante marcadores de ADN (SSRs y SNPs), construcción de mapas de ligamiento genético, identificación de QTLs asociados a caracteres de interés y localización de posibles genes candidatos. El material vegetal utilizado consistió en tres poblaciones segregantes de albaricoquero: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) y ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) con 160, 187 y 200 descendientes respectivamente. La caracterización fenotípica nos ha permitido la evaluación de fecha de floración, fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto, peso del fruto, peso del hueso, calibre, color del fruto, firmeza, contenido en sólidos solubles y acidez. Los resultados muestran una gran variabilidad y segregación en cada población, así como evidentes diferencias interanuales. Los histogramas de frecuencias revelan en general una distribución normal de los descendientes en la mayoría de los caracteres evaluados, lo que confirma el carácter poligénico y herencia cuantitativa para todos ellos. Sin embargo, fecha de floración y maduración llegan a mostrar distribuciones bi-modales o tri-modales debido a las diferencias climáticas inter-anuales. Se observa la presencia de valores transgresivos en los descendientes debido a la influencia del fondo genético de los parentales, así como de herencia intermedia. La mayoría de los caracteres evaluados muestran además una buena correlación entre años. En la población ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ se construyeron los mapas de ligamiento genético a partir de 160 descendientes, utilizando un total de 42 SSRs. Los mapas de ‘Z701-1’ y ‘Palsteyn’ cubren una extensión de 336,2 cM y 363,1 cM respectivamente. En el análisis de QTLs se identificaron QTLs significativos para los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los resultados mostraron la gran influencia del grupo de ligamiento (LG) 4 para fecha de maduración y ciclo de desarrollo del fruto. La presente tesis abordó un estudio de mejora en la eficiencia de la metodología para el desarrollo y análisis de SNPs, combinando la secuenciación masiva de ARN (RNA-Seq) y la técnica SNPlex mediante la plataforma SEQUENOM. Se diseñaron 136 SNPs procedentes del RNA-Seq de los genotipos ‘Rojo Pasión’ y ‘Z506-7’ siendo aplicados un total de 101 SNP para el genotipado de diferentes variedades de albaricoquero. A partir de los resultados del análisis de variaciones de nucleótidos, podemos decir que este enfoque proporciona alta flexibilidad, reproducibilidad y precisión en los ensayos, suponiendo una herramienta sólida para detectar diversidad de nucleótidos en regiones codificantes y no codificantes del genoma de Prunus. El genotipado con SNPs permitió asimismo establecer las relaciones fenéticas y distancias genéticas entre diferentes cultivares de albaricoquero con diversos orígenes. Finalmente se elaboraron los mapas de ligamiento genético de las poblaciones ‘B×C’ y ‘G×C’, utilizando un total de 130 y 166 descendientes respectivamente. Los mapas fueron construidos combinando marcadores tipo SSR y SNP, siendo mapeados 87 marcadores en la población ‘B×C’ y 89 en ‘G×C’, y cubriendo una extensión del genoma de 394,9 y 414,3 cM en los mapas de ‘Bergeron’ y ‘Currot’ respectivamente, mientras que en ‘Goldrich’ y ‘Currot’ fue de 353,5 y 422,3 cM respectivamente. El análisis de QTLs identificó diferentes QTLs ligados a los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los QTLs de mayor relevancia por su significación se dan en el LG 4, considerando este grupo de vital importancia para el control de fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto y contenido en sólidos solubles. En el caso del color de piel y pulpa fueron identificados importantes QTLs al final del LG 3 de ‘Goldrich’. / The objective of this thesis has been to carry out a phenotypic characterization of apricot by studying the inheritance of the major traits related to phenology and fruit quality. In addition, a genotypic characterization using DNA markers (SSRs and SNPs) has been performed to develop genetic linkage maps for QTL detection and identification of potential candidate genes and markers. The plant material used comes from three segregating populations of apricot: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) and ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) with 160, 187 and 200 seedlings respectively. The phenotipyc characterization has allowed us to evaluate blooming date, ripening time, fruit development period, fruit weight, stone weight, fruit diameter, fruit colour, firmness, soluble solids and acidity. Results show a great variability and segregation in each population as well as the obvious differences between years. The histograms frequencies usually reveal in the three populations a normal distribution in the majority of the traits which confirms the polygenic character and quantitative inheritance for all of them. Nevertheless, blooming and ripening date showed bi-modal or tri-modal distribution due to inter-annual climatic conditions. We should also note the presence of many transgressive trait values, probably due to the influence of the genetic background of the parents as well as intermediate inheritance of seedlings. We can affirm that there was good correlation between years for all traits evaluated. In the population ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ was constructed a genetic linkage maps assaying 160 seedlings with 42 SSR markers. ‘Z701-1’ and ‘Palsteyn’ maps covered a genome extension of 336.2 and 363.1 cM respectively. We subsequently carried out QTL analysis to identify significant QTLs for the most important phenological and fruit quality traits in apricot. Results show without any doubt the great influence of LG 4 on fruit quality traits, especially in the case of ripening time and fruit development period. The study has also been focused on improving the development and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) via an efficient and flexible method combining high throughput sequencing (RNA-Seq) and SNPlex technology using the SEQUENOM platform. 136 SNP markers were designed from the RNA-Seq genotypes 'Rojo Pasion' and 'Z506-7' being analyzed a total of 101 SNPs for genotyping of different apricot varieties. From the results of variations in nucleotide sequences (SNPs) we can say that this is an approach that provides high flexibility, reproducibility and accuracy and that it can be considered a robust tool for detecting nucleotide diversity in coding and non-coding regions of the Prunus genome. Moreover, logical phenetic relationships and genetic distance were shown among apricot cultivars tested according to the origin of each one. Finally, genetic linkage maps of populations ‘B×C’ and ‘G×C’ were realized using a total of 130 and 166 seedlings, respectively. Maps were constructed combining SSR and SNP markers, making it possible to map a total of 87 markers in the ‘B×C’ population and 89 markers in ‘G×C’. ‘Bergeron’ and ‘Currot’ covered a genome extension of 394.9 and 414.3 cM, while ‘Goldrich’ and ‘Currot’ covered 353.5 and 422.3 cM, respectively. In the phenotype and genotype integrated analysis, different QTLs were detected for the most important phenological and fruit quality traits. The most significant QTLs are localized in LG 4, showing that this group is of vital importance to ripening time, fruit development period and soluble solids content in both apricot populations. Regarding skin and flesh colour, the most important QTLs were detected at the end of LG 3 of ‘Goldrich’.

Els gens estan sotmesos a forces selectives diferents. Un dels objectius de la Biologia Evolutiva és entendre els factors que determinen aquestes diferències. Els gens rarament actuen de manera aïllada, sinó que normalment funcionen com a elements de xarxes complexes formades per un gran nombre de molècules que interactuen entre si. Tot i la rellevància d’aquestes xarxes per entendre l’evolució dels gens, les propietats evolutives d’aquestes xarxes són encara poc conegudes. En aquesta tesi hem estudiat les forces selectives (selecció positiva i negativa) que han actuat sobre els gens implicats en la via de la insulina/TOR, i hem relacionat aquestes forces amb la posició dels gens a la via. Aquest estudi s’ha realitzat en 12 espècies del gènere Drosophila (primer article de la tesi), i en 6 espècies de vertebrats (humà, ratolí, vaca, opòssum, ornitorinc i pollastre) (segon article). A aquests efectes, s’han identificat i anotat els gens implicats a la via en totes les espècies estudiades, s’ha reconstruït la seva història evolutiva mitjançant tècniques d’anàlisi filogenètica, i s’han caracteritzat les forces evolutives que hi han actuat a partir de la relació la divergència no sinònima (dN) i sinònima (dS), ω = dN/dS. Totes les famílies gèniques estudiades tenen almenys un representant a totes les espècies estudiades. A més, tots els gens estudiats estan sotmesos a selecció purificadora, la qual cosa indica que aquests gens són funcionals. Per tant, tots els organismes estudiats presenten una via de la insulina/TOR completa i funcional. Tant a Drosophila com a vertebrats, observem que el nivell de limitació funcional (o selecció purificadora) sota el que evolucionen els gens es correlaciona amb la posició dels gens a la via (mesurada com el nombre de passos des del receptor de la insulina –posició 0– fins la resta de components –posicions 1 a 10), essent els gens de la part downstream els que evolucionen sota un major grau de limitació funcional. El sentit d’aquesta correlació és contrari al que s’ha trobat generalment en rutes metabòliques, on són els gens de la part upstream es que estan sotmesos a un major grau de limitació funcional. Vam avaluar l’impacte d’una sèrie de factors que es correlacionen amb ω (selecció positiva, nivell d’expressió gènica, nombre de teixits en què un gen s’expressa, grau d’esbiaix en l’ús de codons, longitud de les proteïnes codificades, i connectivitat en la xarxa d’interaccions proteïna-proteïna) sobre aquesta correlació. Aquesta anàlisi demostra que la correlació entre la posició a la via i els graus de limitació funcional és independent d’aquests factors. A més, observem que els gens que codifiquen proteïnes que interactuen físicament evolucionen sota seleccions selectives semblants, la qual cosa indica que aquestes proteïnes co-evolucionen. En global, aquests resultats indiquen clarament que els nivells de limitació funcional als què estan sotmesos els gens de la via de la insulina/TOR depenen de la posició que les proteïnes codificades ocupen a la via. Per tant, l’arquitectura de la via té un impacte sobre l’evolució dels seus gens. / Genes are subject to disparate evolutionary forces. One of the goals in Evolutionary Biology is to understand the factors underlying these differences. Genes rarely act in isolation, but they rather operate as elements of complex networks of interacting molecules. Despite the relevance of these networks for understanding gene evolution, the evolutionary properties of these networks remain poorly understood. In this thesis we have studied evolutionary forces (positive and negative selection) that acted on genes involved in the insulin/TOR pathway, and we have related these forces to the position that genes occupy in the pathway. This study has been performed in 12 species of the genus Drosophila, and in 6 vertebrate species. For that purpose, we have (1) identified and annotated the genes involved in this pathway in these species; (2) reconstructed their evolutionary history using phylogenetic analysis; and (3) characterized evolutionary forces that have acted on these genes from the nonsynonymous (dN) to synonymous (dS) divergence ratio (ω = dN/dS). All the studied gene families have at least one representative in all studied species. Furthermore, all studied genes evolve under purifying selection, indicating that they are functional. Therefore, all studied organisms have a complete and functional insulin/TOR pathway. In both Drosophila and vertebrates, we observed that the strength of purifying selection acting on genes correlates with their positions in the pathway, with downstream genes evolving under stronger selective constraint. We evaluated the impact of a number of factors (positive selection, gene expression level and breadth, codon bias, protein length, and connectivity in the protein-protein interaction network) on the observed correlation. This analysis shows that the correlation between pathway position and the strength of purifying selection is independent of these factors. Furthermore, we observed that genes encoding proteins that physically interact evolve under similar selective pressures, which indicates that these proteins co-evolve. Taken together, these results clearly indicate that levels of selective constraint acting on genes of the insulin/TOR pathway are affected by the position that their encoded products occupy in the pathway. Therefore, the structure of the pathway has an effect on the patterns of molecular evolution of its components.

La salinidad está considerada como uno de los principales factores limitantes de la producción agrícola. Ante las predicciones del aumento de la población a nivel mundial con el consiguiente incremento de la demanda de alimentos, y los efectos negativos del cambio climático sobre la productividad de los cultivos de interés agronómico, como tomate (Solanum lycopersicum), un objetivo prioritario en la investigación en biología vegetal en la actualidad es avanzar en el conocimiento de los mecanismos y genes implicados en la tolerancia a la salinidad. Una de las estrategias más interesantes para abordar el anterior objetivo es el análisis de mutantes. Esta tesis se enmarca dentro del programa de mutagénesis insercional llevado a cabo por los grupos de investigación del IBMCP (Valencia), UAL (Almería) y CEBAS (Murcia), donde se han generado colecciones de mutantes de tomate cultivado y silvestre. Uno de los objetivos de este trabajo ha sido la identificación y caracterización de mutantes de la especie silvestre Solanum pennellii. La identificación de mutantes en una especie filogenéticamente relacionada con tomate, y que presenta características morfológicas muy diferentes al tomate cultivado y altos niveles de tolerancia al estrés abiótico, puede ser la mejor elección para identificar genes y procesos determinantes de la tolerancia a la salinidad. Respecto a los mutantes de S. pennellii, los cambios morfológicos y fisiológicos observados en el mutante sl-1 (succulent leaves-1) en ausencia de estrés están asociados a una menor perdida de agua por transpiración, y a un mantenimiento de la homeostasis de Na+ y K+ frente al estrés salino. Por el contrario, el mutante hipersensible a sal shp-1 (salt hypersensitive pennellii-1) experimentaba una mayor pérdida de agua por transpiración y una elevada acumulación de Na+ en las hojas durante el periodo de exposición a la sal. La caracterización de ambos mutantes ha puesto de manifiesto que la regulación de la pérdida de agua es un mecanismo clave en la tolerancia a la salinidad. En este trabajo también se ha abordado la caracterización de mutantes de tomate generados a partir del cultivar Moneymaker. A nivel fenotípico y fisiológico, el mutante hipersensible a la salinidad she-1 (salt hypersensitive esculentum-1) mostraba una respuesta similar a la observada en el mutante shp-1 de S. Pennellii, con alta acumulación de Na+ en sus hojas. Sin embargo, la sensibilidad a la sal del mutante she-1 parece estar relacionado con la alteración en los niveles de expresión de los genes SlHKT1s implicados en el transporte de Na+ a la parte aérea. Además, mediante injertos recíprocos se observó que la raíz es el órgano responsable de la sensibilidad a la sal del mutante she-1. Finalmente, se ha abordado la caracterización de un mutante que tiene anulada la expresión del gen CBL10 (CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN 10) de tomate. El mutante cbl10 es hipersensible al estrés salino a pesar de que la acumulación de Na+ en las plantas del mutante es menor que en las plantas no transformadas de Moneymaker y mantiene mayores niveles de K+ con la salinidad, lo que sugiere que la capacidad de acumular Na+ en vacuolas está alterada en el mutante y por tanto se alcanzan antes niveles citotóxicos del ion en el citoplasma. Además, el mutante tiene alterada la distribución de Na+ entre hojas jóvenes y adultas, produciéndose un mayor transporte de Na+ a los tejidos en desarrollo, que puede causar el colapso apical detectado en el mutante tras su exposición a la salinidad. Otra alteración fisiológica provocada por la anulación del gen SlCBL10 es una reducción de la pérdida de agua vía transpiración en condiciones de estrés. Además, la menor transpiración está asociada a una alteración en la homeostasis de Ca2+ y a cambios en el perfil de expresión del transportador de Ca2+ vacuolar SlCAX1, tanto en condiciones salinas como en ausencia de las mismas. Mediante injertos se ha demostrado que el principal órgano responsable de la sensibilidad del mutante cbl10 al estrés salino es la parte aérea, ya que solo muestran sensibilidad a sal las plantas injertadas con el mutante cbl10 como esqueje, pero no cuando éste es utilizado como portainjerto. Este resultado sugiere que SlCBL10 podría tener una función diferente en parte aérea y raíz, siendo su función en la parte aérea la implicada en la tolerancia a la salinidad en tomate. Además, la alteración de la homeostasis de Ca2+ en la parte aérea nos lleva a proponer como papel del gen SlCBL10 su participación en la regulación de la homeostasis de Ca2+, siendo esta función crucial para la tolerancia del tomate al estrés salino. / ABSTRACT Salinity is considered as one of the major limiting effects on agriculture production. Keeping in mind the predictions about the rise of world population resulting in an increase in food demand, and the negative effects of climate change on the productivity of plants of agronomic interest, such tomato (Solanum lycopersicum), one current critical aim in plant biology research is to advance in the knowledge of genes and mechanisms involved in salt tolerance in plants. One of the most interesting strategies to approach this goal is the analysis of mutants. This PhD thesis is framed within the insertional mutagenesis programme carried out by the Spanish research groups from IBMCP (Valencia), UAL (Almeria) and CEBAS (Murcia), where mutant collections have been generated in domesticated tomato and in wild-related species. One of the objectives of this research work has been the identification and characterization of mutants of the tomato wild species Solanum pennellii. The identification of mutants in a species phylogenetically related with tomato that exhibits so different morphological characteristics and high levels of tolerance to abiotic stress could be the best choice to identify genes and processes determining tolerance to salinity. Regarding S. pennellii mutants, the morphological and physiological alterations observed in the sl-1 (succulent leaves-1) mutant in absence of stress are associated to a lower transpirational water loss and a better maintenance of Na+ and K+ homeostasis when confronted to salt stress. On the contrary, the salt hypersensitive shp-1 (salt hypersensitive pennellii-1) mutant suffered a higher transpirational water loss and an elevated accumulation of Na+ in leaves during the period of exposition to salt stress. The characterization of both mutants has revealed that regulation of water loss is a key mechanism in salt stress tolerance. In this research work it has also been approached the characterization of tomato mutants generated in Moneymaker commercial cultivar. At phenotypical as well as physiological level the salt hypersensitive she-1 (salt hypersensitive esculentum-1) mutant showed a similar response to the one observed in shp-1 S. pennellii mutant: a remarkable increase in Na+ accumulation in leaves. However, the susceptibility to salt of she-1 mutant seems to be related to the alteration in the levels of expression of SlHKT1 genes involved in the Na+ transport from root to shoot. Moreover, it was observed by reciprocal grafting that the root was the responsible organ for the salt sensitivity of she-1 mutant. Finally, it has been approached the characterization of a mutant that exhibits a knock-out expression of CBL10 (CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN 10) tomato gene. The cbl10 mutant is hypersensitive to salt stress in spite of the fact that Na+ accumulation in mutant plants is lower than in untransformed WT ones and it upholds higher levels of K+ in salt stress condition. These observations suggest that ability to accumulate Na+ in vacuoles is compromised in the mutant and therefore cytotoxic levels of the ion in the cytoplasm are reached earlier in cbl10 than in WT. What is more, the distribution of Na+ between young and adult leaves is altered in the mutant, since a higher transport of the ion to developing tissues occurred in cbl10. This behavior could be the cause of the apical meristem collapse detected in the mutant plant after exposition to salt stress. Another physiological alteration induced by knocking out SlCBL10 gene is the reduction of water loss via transpiration in stressful conditions. Moreover, the lower transpiration is associated with a perturbation in Ca2+ homeostasis and with changes in the gene expression profile of the vacuolar Ca2+ carrier SlCAX1, in salt stress as well as in non-stressful conditions. Grafting experiments demonstrated that the main responsible organ for the salt stress sensitivity in cbl10 mutant is the shoot, as only grafted plants using cbl10 as scion exhibited such sensitivity, which is not observed when cbl10 is used as rootstock. This result suggests that SlCBL10 could have a different function in shoot and in root, being the function in shoot the one involved in salt tolerance in tomato. Also the alteration of the Ca2+ homeostasis in the shoot of cbl10 mutant lead us to propose a role for SlCBL10 in the regulation of Ca2+ homeostasis, being this potential function a crucial one for tolerance of tomato to salt stress.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Realiza una revisión sistemática integral de las poblaciones de individuos de tamaño pequeño de Neacomys presentes en el nororiente y centro del Perú asociados a Neacomys minutus. Es decir, aclara la situación taxonómica de Neacomys minutus y de las poblaciones de tamaño pequeño relacionadas a ella presentes en el Perú, describe morfológicamente a las poblaciones de tamaño pequeño del género Neacomys presentes en el nororiente y centro de Perú, establece el número cromosómico de las poblaciones del nororiente y centro del Perú y caracteriza molecularmente las poblaciones del nororiente y centro del Perú empleando como marcador molecular al gen Citocromo b. / Tesis

Geólogo / La evolución geodinámica del basamento metamórfico paleozoico de la Cordillera de la Costa de Chile Central entre los 34 y 38°S se encuentra ligada a la subducción de la placa paleo-Pacífica bajo el margen occidental de Gondwana. Ella dio lugar a un complejo acrecionario que se desarrolló en el Carbonífero Superior. Este muestra características de un cinturón pareado metamórfico, en el que se distinguen dos franjas N-S que difieren en gradiente metamórfico y protolito. Se les ha llamado Serie Occidental (baja temperatura/alta presión) y Oriental (alta temperatura/baja presión). Las estructuras observadas en la transecta Tanumé - Pichilemu fueron desarrolladas en 3 episodios de deformación D1, D2 y D3. En la Serie Oriental, las estructuras de primera generación (D1) corresponden a pliegues isoclinales recumbentes de rumbo noreste. Las estructuras de segunda generación (D2) constan de pliegues vergentes hacia el suroeste que forman parte de un antiforme y un sinforme volcados, asociado a un pliegue por propagación de falla de longitud de onda de 10 km. Este evento deformativo desarrolla un clivaje de plano axial (S2) que mantea hacia el noreste con 30° deformando la foliación anterior S1. Esta foliación penetrativa S2 envuelve porfidoblastos de granate previos a este evento, generando sombras de presión. El segundo evento deformativo está sobreimpuesto por estructuras de tercera generación (D3) de carácter frágil, el cual genera un clivaje de crenulación (S3) de alto ángulo y rumbo noroeste. La intersección de la foliación S3 con la foliación anterior (S2) se observa en la lineación L3, evidenciada por bandas de encarrujamiento de escala centimétrica que tienen el mismo rumbo y bajo buzamiento. La evolución geodinámica de este complejo acrecionario está dominada por un cabalgamiento S2 vergente hacia el noreste, de un bloque cabalgante constituido por esquistos verdes, mica esquistos, metabasaltos con almohadillas relictas y metacherts, provenientes de 15 a 25 km de profundidad (Serie Occidental), sobre un bloque yacente compuesto por metaturbiditas, que poseen un metamorfismo termal previo a este evento tectónico (Serie Oriental). En la Serie Oriental esta deformación D2 es vergente hacia el suroeste y está asociada a estructuras antitéticas que se desarrollan dentro de un prisma de acreción, ocurriendo previamente al episodio D2 de la Serie Occidental. Finalmente, el episodio deformativo D3 cabalga la Serie Oriental sobre la Occidental con vergencia hacia el suroeste con una componente de rumbo sinestral, siendo estructuralmente más somera probablemente asociada a la deformación andina.

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