Nos últimos anos a incidência do câncer tem crescido significativamente mundialmente, porém, as técnicas atualmente empregadas para a detecção da doença não são individualmente conclusivas, além de serem extremamente invasivas e não permitirem seu diagnóstico precoce, o que justifica o desenvolvimento de novas tecnologias alternativas para a detecção do câncer. Células cancerígenas possuem receptores específicos de alta afinidade com folato e por serem altamente replicativas, são extremamente dependentes do suprimento de folato reduzido. Os alfa-receptores de folato (FR α) são proteínas com propriedades bioquímicas específicas as quais podem ser exploradas pela estratégia de marcação para detecção e tratamento do câncer (biomarcadores). Com raras exceções, são induzidos seletivamente em tecidos cancerígenos e raramente expressos em células normais, mostrando-se, assim, altamente seletivos e específicos. Sendo assim, neste projeto objetivou-se a expressão e a purificação dos FR α, além da sua imobilização em microssistema para estudos subsequentes em biossensores. Foram promovidos testes de expressão da proteína heteróloga (rFR α) em E. coli em diferentes linhagens, temperaturas e tempos de indução da expressão sendo observada a expressão da proteína recombinante de forma insolúvel. Paralelamente foram promovidos testes de expressão da proteína rFR α em P. pastoris, os quais não se mostraram eficientes, uma vez que não foi possível a detecção da proteína em estudo. Como alternativa, uma nova construção, em fusão com a proteína Trigger fator (TF) de E. coli, uma chaperona molecular de alta solubilidade, foi testada. Através de análises por SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL e espectrometria de massas, foi possível comprovar a produção da proteína recombinante TFFRα. Ainda, a proteína foi imobilizada em lipossomos, o que proporcionou o desenvolvimento de um padrão analítico que poderá ser utilizado em estudos subsequentes com biossensores de FR α. Este estudo será útil para o desenvolvimento de drogas visando a inativação desta proteína, como os anti-folatos, que são hoje os agentes anti-neoplásicos mais investigados, e possibilitará a caracterização bioanalítica da proteína FR α recombinante (rFR α) bem como o desenvolvimento de novos biossensores. / In recent years the incidence of cancer has grown significantly globally. Even though, the techniques currently employed for the detection of cancer are not individually conclusive due to the subjectivity of the analysis, inherently invasive, and are unable to provide early diagnosis. Therefore, the development of new technologies for cancer detection and prognostic are justified. Cancer cells have specific receptors with high affinity towards folate and are highly replicative. Alpha folate receptor (FR α) are extracellular proteins with specific biochemical properties since, with rare exceptions, are induced selectively in cancerous tissues and rarely expressed in normal cells, being highly sensitive and specific. In this work we produced FR α heterologously and we immobilized it on a microsystem mimicking a cancer cell that will become an analytical standard for studies with biosensors. Firstly, we produced rFR α in different E. coli strains, exploring variation of temperature and induction times, in which we observed the expression of insoluble protein. We also tried the expression in P. pastoris system, which was not efficient as well. Alternatively, we cloned FOLR1 gene in a special vector that enables the expression of FR α fusioned with the Trigger fator from E. coli, a highly soluble molecular chaperone. Using SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL and mass espectrometry we observed the production of soluble TFFR α. The recombinant protein was immobilized in liposomes, producing an analytical standard for studies with FR α-based biosensors. Our findings open research possibility in drug development, like anti-folates, besides the development of new biosensors.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistêmicas humanas mais prevalentes na América Latina. Componentes da cadeia respiratória mitocondrial são potenciais alvos quimioterapêuticos. Nesse sentido, em nosso trabalho demonstramos diferenças entre a cadeia respiratória do fungo P. brasiliensis e do hospedeiro mamífero. A respiração, potencial de membrana e fosforilação oxidativa mitocondrial de esferoplastos de P. brasiliensis foram avaliados in situ, os quais demonstraram a presença de uma cadeia respiratória funcional. A adição de ADP induziu a transição da respiração do estado de repouso para o fosforilativo, em esferoplastos energizados com succinato, NADH, NAD+ e substratos ligados ao complex I. A presença de uma NADH-ubiquinona oxidoredutase foi demonstrada pela capacidade das células oxidarem NADH exógeno, assim como, pela respiração insensível a rotenona e sensível a flavona. Além disso, a respiração mantida por NAD+ foi sensível a rotenona e flavona, sugerindo que vias metabólicas citosolicas contribuem para a produção de NADH e substratos ligados ao complexo I. Foi demonstrado também que os níveis de expressão do complexo I e da NADH desidrogenase alternativa alternam-se durante a curva de crescimento de leveduras de P. brasiliensis. A respiração induzida por NADH ou succinato foi parcialmente inibida por KCN ou antimicina A e sensível à inibição por BHAM, indicando a presença de uma oxidase alternativa. A fim de se caracterizar esta enzima oxidase alternativa, o seu gene foi clonado e expressado em xii S. cerevisiae e E. coli, o qual conferiu uma respiração resistente a cianeto e sensível a BHAM. S. cerevisiae expressando oxidase alternativa mostraram uma menor taxa de multiplicação celular e diminuição na geração de EROs. Nós também observamos que inibidores da cadeia transportadora de elétrons retardaram a transição de micélio para levedura em culturas de P. brasiliensis. Além disso, estes inibidores e outras drogas geradoras de EROs aumentaram a expressão do gene da oxidase alternativa, assim como a produção de EROs em leveduras de P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermically dimorphic fungus, is the etiological agent of endemic paracoccidioidomycosis, one of the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. Components of the respiratory chain constitute potential pharmacological targets, and here are reported differences between the respiratory chain of the mammalian host and the fungus P. brasiliensis. Respiration, membrane potential and oxidative phosphorylation of mitochondria from P. brasiliensis spheroplasts were evaluated in situ, which demonstrated the existence of a functional respiratory chain. Adenosine 5\'-diphosphate (ADP) induced a transition from resting to phosphorylating respiration in mitochondria energized by succinate, NADH, NAD+ and complex I linked substrates. The presence of an alternative NADH-ubiquinone oxidoreductase was indicated by: the ability of the fungus to oxidize exogenous NADH; the insensitivity substrate-supported respiration to rotenone and sensitivity of this respiration to flavone. In addition, the sensitivity of NAD+-supported respiration to rotenone and flavone suggest that citosolic pathways contribute to NADH and complex I linked substrates production. Moreover, it was demonstrated that expression levels of complex I and alternative NADH dehydrogenase change during P. brasiliensis growth curve. The partial sensitivity of NADH or succinate-supported respiration to antimycin A and cyanide, as well as the sensitivity to BHAM, indicates the presence of an alternative oxidase. Therefore, to characterize the alternative oxidase its gene was cloned and heterologously xii expressed in S. cerevisiae and E. coli, wich confered, a cyanide resistant respiration and BHAM sensitivity. Moreover, S. cerevisiae that expressed alternative oxidase showed slower growth rate and decreased ROS generation. We also observed that electron transport pathways inhibitors delayed the P. brasiliensis mycelium to yeast transition in cultures. Besides, these inhibitors and other ROS generated drugs increase the ROS production and altenative oxidase expression.

A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose. / Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.

Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros produzidos por diversas bactérias como material de reserva de carbono e energia, apresentando propriedades termoplásticas comparáveis às dos plásticos de origem petroquímica, além da vantagem de ser totalmente biodegradáveis. A bactéria Cupriavidus necator DSMZ 545 é considerada o organismo modelo para a produção de PHA, possuindo a capacidade de utilizar CO2 como fonte de carbono, porém existem sérias limitações para o seu cultivo autotrófico. Visando otimizar a capacidade autotrófica desta bactéria, foi realizada neste trabalho a clonagem e expressão do gene da bacteriorodopsina (bop) de Halobacterium salinarum em C. necator. Esta proteína de membrana é capaz de converter a energia luminosa em um gradiente de prótons, que pode ser utilizado pela célula para produzir ATP. Obtiveram-se clones recombinantes de C. necator, que, sob iluminação, apresentaram maior produção de ATP, assim como produção aumentada de PHA, sem alterações no crescimento celular. / Polihydroxyalcanoates (PHAs) are polymers produced by several bacteria as carbon and energy storage materials, which show comparable thermoplastic properties with plastics from petrochemical origin and present the advantage of being completely biodegradable. The bacterium Cupriavidus necator DSM 545 is considered as a model organism for PHA production, being able to produce PHA utilizing CO2 as the carbon source, although there are severe limitations for its autotrophic cultivation. In the present work, with the purpose of optimizing the autotrophic capability of this bacterium, the cloning and expression of the Halobacterium salinarum bacteriorhodopsin gene (bop) was undertaken in C. necator. This membrane protein is able to convert light energy in a proton gradient that can be utilized by the cell for ATP production. Upon illumination, the C. necator recombinant clones showed an increase in ATP production, as well as an increase in PHA production, and no alterations in cell growth.

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

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Through the cleavage process with restriction enzymes NdeI and BamHI, it was possible to obtain the coding sequence of the fusion protein between enterokinase and thioredoxin (ETK-Trx) of approximately 1259 bp from pENTK plasmid. Then, this sequence was subcloned at NdeI and BamHI sites of the expression vector pDM02, originating the recombinant plasmid pDMK06. This vector contains the TH2 promoter, which is efficiently regulated by Lac operator/repressor. E. coli JM110 cells transformed with the recombinant plasmid showed smaller growth in a solid medium when the expression of the heterologous protein was induced by IPTG in comparison with the control; however, this effect was not detected in the liquid medium. Furthermore, the E. coli cells morphology was analyzed through optical microscopy containing the recombinant plasmid pDMK06, when it was observed, all through the growth time, modifications on cell morphology, characterized by the formation of filaments in those induced with IPTG, in comparison with the control. For expression analysis of the recombinant protein ETKTrx, polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE was performed with the samples that grew with IPTG induction for eight hours. The results showed that the protein ETK-Trx is about 47 kDa with a high level of expression at the insoluble fraction, probably as an inclusion corpuscle. The high levels of expression of ETK-Trx protein occurred in a perfectly regulated way, showing the functionality of the pDM02 plasmid expression/regulation system. / A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp- Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle. Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túnei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-23T11:41:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T11:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) Previous issue date: 2001-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A região codificadora do gene LAC4, que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis, foi isolada do plasmídeo pLAC4-12, por meio da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores, que amplificam um fragmento de aproximadamente 3.000 pb. Com os objetivos de expressar e secretar a β- galactosidase, este fragmento foi clonado em um vetor de expressão e secreção pPIC9 do sistema de expressão de Pichia pastoris. A região codificadora LAC4 intacta e uma versão truncada foram fundidas em fase com a seqüência sinal de secreção do fator-α, sob controle do promotor AOX1. A hidrólise dos DNAs recombinantes obtidos com as enzimas de restrição apropriadas confirmou a clonagem da região codificadora LAC4 intacta nas orientações anti-senso e senso e da versão truncada no vetor pPIC9. Os clones foram linearizados e usados para transformar células eletrocompetentes de Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ). Colônias recombinantes foram isoladas e as inserções da região codificadora LAC4 intacta e truncada no genoma da levedura foram confirmadas por “PCR” com iniciadores específicos. Colônias recombinantes positivas foram cultivadas em glicerol e a expressão dos genes recombinantes foi induzida com metanol. Amostras foram coletadas periodicamente e o meio extracelular e a massa de células analisados quanto à atividade de β -galactosidase. Nenhum aumento na atividade de β - galactosidase foi observado perante o controle. Espera-se que a transformação de linhagens da levedura Mut - com os clones obtidos possa resultar na produção de uma proteína funcional. / The codins Kluyveromyces region marxianus of var. the lactis β-galactosidase was isolated LAC4 from gene, pLAC4-12, from by polimerase chain reaction (PCR) technique with primers that amplify a fragment of approximately 3.000 bp. Expression and secretion vector to expresse and secrete β-galactosidase, the intact and truncated LAC4 coding regions were fused in phase with the factor-α secretion signal sequence in the Pichia pastoris pPIC9. Appropriate restriction enzyme hydrolates confirmed the insertion of the intact LAC4 coding region in sense and antisense orientations, as well as its truncated version in to the pPIC9 vector. The clones were linearized and used to transform electrocompetent Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ) cells. Recombinant cells were isolated and the insertions of intact and truncated LAC4 coding regions in the yeast genome were confirmed by PCR with specific primers. Positive recombinant colonies were grown in glycerol and the expression of the heterologous genes was induced with methanol. Samples were periodically collected and the extracellular medium and cell mass were analyzed for β-galactosidase activity. No increase in β-galactosidase activity was observed over the control. The transformation of Mut - yeast cell lines with the clones is expectial to result in the production of a functional protein. / Dissertação importada do Alexandria