[ES] Actualmente la insuficiencia cardiaca es una de las principales causas de mortalidad y co-morbilidad a nivel mundial sobre todo en países desarrollados. Este tipo de patología a su vez, se desglosa en un gran abanico de posibles agentes que perturban el funcionamiento del músculo cardiaco en función de su causa. Uno de los problemas más importantes a niveles de afectación cardiaca se centra en pacientes que sufren algún tipo de cáncer y son tratados con antraciclinas. Estas drogas ampliamente usadas en el mundo de la oncología, tienen una serie de efectos secundarios entre los cuales destaca su posible efecto cardiotóxico. Este trabajo ahonda sobre este proceso y sobre la existencia de un perfil de paciente con una susceptibilidad a sufrir este tipo de episodios de toxicidad cardiaca. En este sentido, se investiga una serie de miRNAs que se encuentran diferencialmente expresados en pacientes que sufren este tipo de episodios frente a los que no. Una vez se detectan estos miRNA generamos un algoritmo predictor mediante el cual somos capaces de predecir si un paciente sufrirá cardiotoxicidad en función de la cantidad de ciertos miRNAs presentes en suero. Una vez descubiertos estos miRNAs nos centramos en la búsqueda de una posible opción terapéutica para esta serie de eventos. Para ello usamos las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células mesenquimales estromales (MSC), unas células que han demostrado tener un alto potencial terapéutico y de gran seguridad. Se evaluó su capacidad terapéutica en el daño inducido por doxorrubicina y posteriormente se amplió el estudio añadiendo el daño por isquemia reperfusión en diferentes frentes como puede ser la regeneración cardiaca, inhibición de la fibrosis o neoangiogénesis. Aunque es necesario un estudio más exhaustivo de los perfiles de cardiotoxicidad y de los mecanismos de acción tanto de los miRNAs como de las EVs, esta tesis demuestra la capacidad de ambos como una potente herramienta tanto de diagnóstico como terapéutica. / [CA] Actualment la insuficiència cardíaca és un dels principals causes de mortalitat i co-morbiditat a nivell mundial sobretot en països desenvolupats. Aquest tipus de patologia al seu torn, es desglossa en un gran ventall de possibles agents que pertorben el funcionament de l'múscul cardíac en funció de la seva causa. Un dels problemes més importants a nivells d'afectació cardíaca se centra en pacients que pateixen algun tipus de càncer i són tractats amb antraciclines. Aquestes drogues àmpliament usades en el món de l'oncologia, tenen una sèrie d'efectes secundaris entre els quals destaca el seu possible efecte cardiotòxic. Aquest treball aprofundeix sobre aquest succés i sobre ha un perfil de pacient amb una susceptibilitat a patir aquest tipus d'episodis de toxicitat cardíaca. En aquest sentit s'investiga una sèrie de miRNAs que es troben diferencialment expressats en pacients que pateixen aquest tipus d'episodis enfront dels que no. Un cop es detecten aquests miRNA generem un algoritme predictiu mitjançant el qual, som capaços de predir si un pacient patirà cardiotoxicitat en funció de la quantitat de certs miRNAs presents en sèrum. Un cop descoberts aquests miRNAs ens centrem en la recerca d'una possible opció terapèutica per a aquesta sèrie d'esdeveniments. Per a això fem servir les vesícules extracelulres derivades de cèl·lules mesesnquimales, unes cèl·lules que han demostrat tenir un alt potencial terapèutico i de gran seguretat. Es testen la seva capacitat terapèutica en el dany per doxurbicina i posteriorment s'amplia l'estudi afegint el dany per isquèmia reperfusió en diferents fronts com pot ser la regeneració cardíaca, inhibició de la fibrosi o neoangiogènesi. Encara que és necessari un estudi més exhaustiu dels perfils de cardiotoxicitat i dels mecanismes d'acció tant dels miRNAs com de les EVs, aquesta tesi demostra la capacitat de tots dos com una potent eina tant de diagnòstic com terapèutica. / [EN] Heart failure is currently one of the main causes of mortality and co-morbidity worldwide, especially in developed countries. This type of pathology, can be broken down into a wide range of possible agents that disturb the functioning of the cardiac muscle depending on its cause. One of the most important problems in terms of cardiac involvement is centered on patients who suffer from some type of cancer and are treated with anthracyclines. These drugs, widely used in the world of oncology, have a series of side effects, among which their possible cardiotoxic effect stands out. This work delves into this event and into the existence of a patient profile with a susceptibility to suffer this type of episodes of cardiac toxicity. In this sense, we investigate a series of miRNAs that are differentially expressed in patients who suffer this type of episodes versus those who do not. Once these miRNAs were detected, we generated a predictive algorithm by which we are able to predict whether a patient will suffer cardiotoxicity based on the amount of certain miRNAs present in serum. Once these miRNAs were discovered, we focused on the search for a possible therapeutic option for this series of events. For this we used extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal cells (MSC), cells that have been shown to have a high therapeutic potential and high safety. We tested their therapeutic capacity in doxorubicin injury and later extended the study by adding ischemia reperfusion injury on different fronts such as cardiac regeneration, inhibition of fibrosis or neoangiogenesis. Although a more exhaustive study of the cardiotoxicity profiles and mechanisms of action of both miRNAs and EVs is needed, this thesis demonstrates the capacity of both as a powerful diagnostic and therapeutic tool. / Sánchez Sánchez, R. (2021). Estudio del papel de los miRNAs y las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales en la patología cardiaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177178 / TESIS

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Background: The focus of this study was to investigate how producing human bone marrow (hBM) derived mesenchymal stromal cell (MSC) extracellular vehicles (EVs) in a high purity isolation system would affect their established characterization criteria and address the validity of these methods of EV production. Additionally, we set out to functionally characterize the hBM-MSC-EVs for their identified immunomodulatory ability while also assessing the presence of novel MSC-EV marker NRP1 identified by our group to further affirm its validity as a functional MSC-EV identity marker. Methods: Each hBM-MSC-EV donor was cultured in a hollow-fiber bioreactor system in non-stimulating serum/xeno-free conditions for 25 days to produce EVs persistently under quiescent conditions to characterize the hBM-MSC-EVs in their native form. EVs were isolated by traditional PEG-based precipitation for preliminary characterization to monitor bioreactor production wherein they were characterized using multimodal tangential flow filtration coupled with fast protein liquid chromatograph (FPLC) size exclusion/high-affinity purifications to obtain the final highly purified EV sample. Additionally, functional analysis of their immunomodulatory ability, EVs and MSCs were incubated with activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as an in-vitro model to evaluate their potency. Results: The hBM-MSC-EVs produced from the bioreactor system showed consistent characterization in accordance with the MISEV2018 establish criteria. We were also able to demonstrate their functional ability by observing statistically significantly immunomodulatory ability of activated PBMCs equivalent to native MSC ability. We were also able to validate the present of NRP1 on all hBM-MSC-EV samples produced confirming its validity as a MSC-EV marker. Conclusion: The significance of the results obtained from this study confirms the production of MSC-EV using a bioreactor and high purity isolation for obtaining consistent MSC-EVs for downstream investigation. Additionally, we were able to demonstrate the significance of MSC-EVs on MSC signaling for immunomodulation by showing equivalent functional potency when tested in-vitro. These results contribute to further understanding the biological attributes of MSC-EVs and contribute to the validation of currently established characterization guidelines.

Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine, favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy. Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC. Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake. Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure. Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.

L’asthme est une des maladies chroniques les plus prévalentes, affectant environ 300 millions d’individus dans le monde et causant plus de 400 000 décès annuellement. La condition se caractérise par une hyperréactivité bronchique, de l’inflammation pulmonaire et des changements structuraux (remodelage) des voies respiratoires. Bien que l’inflammation soit le plus souvent de type éosinophilique dans l’asthme, une proportion importante des patients affectés par la forme sévère de la maladie présente plutôt une infiltration des voies respiratoires par les neutrophiles. Cette inflammation neutrophilique a été associée à plusieurs issues cliniques négatives, notamment à une mauvaise réponse aux traitements, à une obstruction respiratoire permanente et à la mortalité. Malgré l’importance de ces conséquences cliniques pour les patients affectés, le rôle de l’inflammation neutrophilique dans la pathophysiologie de l’asthme, dont ses effets sur le remodelage bronchique, demeure peu exploré. Dans toutes les formes d’asthme, les traitements usuels de la maladie (glucocorticoïdes et bronchodilatateurs) ne permettent pas de renverser entièrement les lésions de remodelage bronchique, dont l’augmentation de la masse du muscle lisse, et ne contrôlent pas adéquatement la neutrophilie pulmonaire. L’augmentation de la masse musculaire lisse bronchique représente pourtant une cible thérapeutique importante vu son implication dans le rétrécissement de la lumière bronchique et le bronchospasme. Les objectifs de cette thèse ont donc été d’étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans l’association entre l’inflammation neutrophilique et la sévérité de la maladie, et d’investiguer les effets de thérapies anti-neutrophiliques sur le remodelage bronchique dans le modèle de l’asthme équin sévère. Similairement à la condition humaine, l’asthme équin sévère est caractérisé par une obstruction respiratoire fluctuante, de l’inflammation pulmonaire et un remodelage bronchique, notamment une augmentation de la masse du muscle lisse. Cette maladie se prête particulièrement bien à l’étude du phénotype neutrophilique puisque c’est cette cellule granulocytaire qui infiltre le milieu pulmonaire lors des exacerbations cliniques. Les études réalisées dans ce projet doctoral ont permis de déterminer que l’azithromycine, un macrolide possédant des propriétés immunomodulatrices, réduit l’inflammation neutrophilique dans le modèle de l’asthme équin. Toutefois, ce traitement n’a pas diminué l’obstruction bronchique ni les lésions de remodelage lorsqu’utilisé en monothérapie, et n’a pas potentialisé les effets des corticostéroïdes inhalés. Ces résultats suggèrent que l’atténuation de l’inflammation pulmonaire ne suffit pas à rétablir l’homéostasie tissulaire dans la phase chronique de la maladie. Toutefois, l’hétérogénéité phénotypique des neutrophiles pourrait rendre leur simple quantification dans les sécrétions respiratoires insuffisante pour élucider leurs répercussions dans l’asthme. Par exemple, les neutrophiles pourraient contribuer au remodelage bronchique par la relâche de vésicules extracellulaires, des nanoparticules qui peuvent modifier la biologie des cellules locales et distantes. Ainsi, les caractéristiques des vésicules neutrophiliques et leur effet prolifératif sur le muscle lisse bronchique ont été examinés. Les résultats obtenus indiquent que les vésicules produites par les neutrophiles augmentent la prolifération du muscle lisse bronchique lorsqu’elles proviennent de cellules exposées au lipopolysaccharide, un fragment bactérien omniprésent dans l’environnement et incriminé dans l’infiltration neutrophilique et le développement de l’obstruction bronchique dans l’asthme humain et équin. / Asthma is one of the most prevalent chronic diseases, affecting approximately 300 million people worldwide and causing over 400,000 deaths annually. The condition is characterized by the combination of bronchial hyperreactivity, lung inflammation, and structural changes in the airways (remodeling). Although an eosinophilic inflammation is common in asthma, a significant proportion of patients affected by the severe form of the disease have a neutrophilic airway infiltration. The neutrophilic phenotype has been associated with several negative outcomes in human asthma, including poor response to therapy, permanent airway obstruction and mortality. Despite these associations, the role of neutrophils in asthma, including its effects on airway remodeling, remains insufficiently explored. Unfortunately, standard asthma therapies (glucocorticoids and bronchodilators) do not adequately control neutrophilic inflammation and reverse only partially, if at all, bronchial remodeling lesions, including the increased airway smooth muscle mass. This structural modification is however an important therapeutic target because of its involvement in bronchial lumen narrowing and bronchospasm. The main objectives of this thesis were therefore to study mechanisms potentially involved in the association between neutrophilic inflammation and asthma severity, and to investigate the effects of anti-neutrophilic therapies on bronchial remodeling reversibility in the severe equine asthma model. Similar to the human disease, severe equine asthma is characterized by fluctuating airflow obstruction, pulmonary inflammation, and remodeling lesions, including a large increase in airway smooth muscle mass. Clinical exacerbations are characterized by a marked pulmonary neutrophilic influx, making this disease particularly suitable to study the neutrophilic phenotype. Studies conducted during this doctoral program revealed that azithromycin, a macrolide with immunomodulatory properties, reduces neutrophilic inflammation in the equine asthma model, but fails to alleviate bronchial obstruction and remodeling lesions, suggesting that the control of neutrophilic inflammation is not sufficient to restore tissue homeostasis when the disease reaches its chronic phase. However, the simple quantification of neutrophils within respiratory secretions might not elucidate comprehensively the possible functional consequences of this cell in the pathophysiology of asthma. For instance, neutrophils could lead and sustain bronchial structural lesions through the release of extracellular vesicles. Those nanoparticles can modify the biology of local and distant cells and are involved in the pathophysiology of several inflammatory diseases. Thus, the characteristics and the effect of neutrophil extracellular vesicles on airway smooth muscle proliferation were studied in horses with severe asthma. The results obtained indicate that extracellular vesicles increase bronchial smooth muscle cell proliferation when they are produced by neutrophils exposed to lipopolysaccharide, a ubiquitous environmental contaminant incriminated in the development of neutrophilic infiltration and bronchial obstruction in human and equine asthma.

Les plaquettes sont essentielles au développement lymphatique dès l’embryogenèse et maintiennent la séparation lympho-sanguine au cours de la vie. Elles participent directement à la lymphangiogenèse et à la réparation des vaisseaux en plus d’améliorer l’intégrité lymphatique in vitro. En présence d’apolipoprotéine A-I (apoA-I), les plaquettes consolident les connexions intercellulaires en adhérant à l’endothélium lymphatique. Toutefois, les plaquettes sont absentes de la lymphe, contrairement à leurs vésicules extracellulaires (pEVs) exprimant un protéome similaire. De plus, leur concentration dans la lymphe s’accentue en condition d’inflammation chronique, par exemple lors de l’athérosclérose. En ayant caractérisé les effets de ces vésicules sur l’intégrité lymphatique durant ma maîtrise, nous montrons que les pEVs sont rapidement internalisées par les LECs et aident à préserver l’intégrité lymphatique des effets délétères des constituants de la lymphe tels que les EVs dérivées des globules rouges (rbEVs). In vitro, des concentrations physiologiques de pEVs limitent la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et diminuent la nécrose des cellules. Comme les pEVs injectées dans le derme de la peau sont prises en charge par les cellules endothéliales des vaisseaux lymphatiques collecteurs et qu’elles voyagent jusqu’aux ganglions afférents, nous croyons qu’une partie des pEVs circulantes dans la lymphe serait cruciale pour le maintien d’une fonction lymphatique adéquate lors de maladies chroniques inflammatoires telles que l’athérosclérose. / Platelets have a protective role in lymphatic function both at the embryogenic stage and throughout life by maintaining blood-lymphatic separation. In addition, platelets enhance the integrity of lymphatic endothelial cells (LECs) in vitro and appear to exert a shielding effect on the lymphatic endothelium by consolidating the connexion between lymphatic endothelial cells when incubated with apolipoprotein A-I (apoA-I). Whereas platelets are absent from lymph, platelet extracellular vesicles (pEVs) are abundantly circulating within lymphatic vessels, and their level increases during chronic inflammation such as atherosclerosis. Having characterized their effect on lymphatic integrity during my Master internship, we show that pEVs are rapidly internalized by LECs, which in turn help preserve the integrity of the lymphatic endothelium when harmful blood constituent such as red blood cell EVs (rbEVs) are infiltrating lymph. In vitro, physiological concentrations of pEVs are limiting the production of reactive oxygen species (ROS) by lymphatic endothelial cells and decreasing their necrosis rate. Furthermore, pEVs injected in the skin interstitium travel through the collecting lymphatics and are rapidly internalized by LECs, which in turn might help preserve the integrity of the lymphatic endothelium. Lymph pEVs might be critical for the maintenance of a proper lymphatic function during chronic inflammatory settings such as atherosclerosis.

Les exosomes apoptotiques (ApoExo) sont des vésicules extracellulaires (EVs) dérivées de lésions vasculaires et libérées par des cellules endothéliales (ECs) apoptotiques dont la taille, les protéines, le profil en ARN et l'activité enzymatique sont différents de ceux des corps apoptotiques classiques. Notre groupe a montré que les ApoExos accéléreraient le rejet vasculaire en association avec les anti-LG3 circulants, des auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre le LG3, le fragment 5' du perlécan. Nous avons également démontré le rôle de biomarqueur et le rôle effecteur des anti-LG3 dans les lésions vasculaires rénales, à la fois dans les reins natifs et transplantés. La néphrite lupique (NL) est une manifestation fréquente et grave du lupus érythémateux disséminé (LED). Il n'existe pas de biomarqueurs du dysfonctionnement rénal progressif dans la NL. Nous émettons l'hypothèse que les ApoExos stimulent des cellules B spécifiques qui existent dans le répertoire immunitaire normal et que les conditions pro-inflammatoires prévalant chez les patients atteints de LED, telles que l'activation accrue des récepteurs Toll-like (TLRs), amplifient cette réponse, conduisant à la production d'anti-LG3, un auto-Ac important dans l'établissement de la NL. Des cellules B productrices d’anti-LG3 ont été trouvées dans la cavité péritonéale de souris saines et ont produit des anti-LG3 suite à une stimulation in vitro avec des agonistes des TLR1/2, TLR4, TLR7 et TLR9. Il est intéressant de noter que ces cellules sont absentes de la cavité péritonéale de souris saines ayant reçu une injection d'ApoExos. En explorant l'importance fonctionnelle des TLRs dans le déclenchement d'une réponse auto-immune dans un modèle murin lupique, nous montrons que les agonistes de TLRs connus pour contribuer à la pathogenèse du LED (TLR2, 4, 7 et 9) déclenchent une production significativement plus élevée d'IgM anti-LG3, alors que la stimulation des TLRs qui ne sont pas associés à la pathogenèse du LED (TLR3 et 5) ne le fait pas. L’injection d'ApoExo a également déclenché l'axe auto-immun IL-23/IL-17 (mesuré par ELISA et essai cytokinique), augmenté les cellules B de centres germinatifs spléniques (mesuré par cytométrie de flux), augmenté les taux circulants d’IgG totaux, d’anti-LG3 et d’auto-Ac classiques du LED (mesuré par micropuce et ELISA) par rapport à l’injection de véhicule. Des niveaux élevés d'IgG anti-LG3 circulants sont observés chez les souris prédisposées au LED par rapport aux souris saines (mesurés par ELISA), ainsi qu'une proportion accrue de cellules B1 spléniques et de cavité péritonéale (mesurés par cytométrie de flux) augmentant avec l’établissement de la maladie. Ces observations suggèrent un rôle spécifique des ApoExos dans la modulation de la production d'auto-Ac qui, à son tour, déclenche l'involution microvasculaire importante dans les maladies auto-immunes et le rejet de greffe. Ces observations suggèrent également que les cellules B spécifiques de LG3 peuvent être modulées dans des conditions pro-inflammatoires telles que celles qui prévalent chez les patients atteints de LED, conduisant à la production d'auto-Ac. Une meilleure compréhension de l'impact de ces mécanismes permettra d'améliorer l'identification, la prédiction et la prise en charge de la NL. / Apoptotic exosomes (ApoExo) are vascular injury derived extracellular vesicles (EVs) released by apoptotic endothelial cells (ECs) with distinct size, protein, RNA profile and enzymatic activity from classical apoptotic bodies. Our group showed that ApoExo accelerated vascular rejection in association with circulating anti-LG3, autoantibodies (autoAb) against LG3, the 5’ fragment of the perlecan. We have also unravelled biomarkers and effector roles of anti-LG3 in kidney vascular damage in both native and transplanted kidneys. Lupus Nephritis (LN) is a common and serious manifestation of systemic lupus erythematosus (SLE). Biomarkers of progressive renal dysfunction in LN, are lacking. We hypothesize that ApoExo stimulate specific B cells that exist in the normal immune repertoire and that the pro-inflammatory conditions prevalent in SLE patients, such as increased Toll-like Receptors (TLRs) activation, amplify this response, leading to anti-LG3 production, autoAb of importance in LN development. B cells producing anti-LG3 were found in the peritoneal cavity of healthy mice and produced anti-LG3 AutoAb when stimulated in vitro with TLR 1/2, 4, 7 and 9 agonists. Interestingly, these cells disappeared from the peritoneal cavity of healthy mice infused with ApoExo. ApoExo infusion also triggered circulating IL-23/IL-17 autoimmune axis (measured by cytokines assay), increased splenic germinal centre B cells (measured by flow cytometry), increased total circulating IgG, anti-LG3 and classical autoAb (measured by microarray and ELISA) compared to vehicle infusion. Elevated circulating anti-LG3 IgG levels are found in SLE prone mice compared to healthy ones (measured by ELISA) as well as an increased proportion of splenic and peritoneal cavity B1 cells (measured by flow cytometry). Exploring the functional importance of TLRs in triggering such a response, we show that while TLR agonists known to contribute to SLE pathogenesis (TLR2, 4, 7 and 9) triggered significantly higher IgM anti-LG3 production, stimulation of TLR that are not associated with SLE pathogenesis (TLR3 and 5) did not. These observations suggest a specific role for ApoExo in modulating the production of autoAb which, in turn, trigger microvascular involution of importance in autoimmune diseases and transplant rejection. These observations also suggest that LG3-specific B cells may be modulated under pro-inflammatory conditions such as those prevalent in lupus patients, leading to production of autoAb. A better understanding of the impact of these mechanisms will lead to improved identification, prediction, and management of LN.

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Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.