A poliploidia teve importante papel no melhoramento de muitas espécies de plantas, principalmente nos cereais, incluindo híbridos intergenéricos. O processo de poliploidização, geralmente, produz novos e desejáveis fenótipos ou fornece suporte para cruzamentos de plantas em programas de melhoramento. Esse trabalho apresenta o resultado da indução de poliploidia em duas cultivares de mandioca (\'Porquinho\' e \'Vassourinha\') que foram tratadas com diferentes concentrações de colchicina (0,05%, 0,10% e 0,15%), em meio de cultura, durante 48 e 96 horas. As plantas regeneradas foram analisadas citologicamente por citometria de fluxo e pela contagem do número de cromossomos. Adicionalmente, análises do tamanho e da frequência dos estômatos foram realizadas e o resultado comprovou que podem ser utilizadas como screening das plantas tratadas. O tratamento com 0,1% de colchicina, em meio de cultura, durante 96 horas apresentou maior número de plantas tetraplóides produzidas sobre o número de plantas regeneradas nas duas cultivares avaliadas. Não há diferenças entre as doses de colchicina e tempos de exposição a droga no número de tetraplóides encontrados em cada tratamento. Entretanto, foi possível verificar que existe diferença significativa na produção de tetraplóides entre as cultivares analisadas, indicando que pode haver uma resposta genética à indução da duplicação dos cromossomos com colchicina. / The polyploidy played an important role in the improvement of many species of plants, especially in cereals including intergeneric hybrids. The process of polyploidy usually produces new and desirable phenotypes or provides support for crosses of plants in breeding programs. This research work reports the result of polyploidy induction in two cassava cultivars (\'Porquinho\' and \'Vassourinha\') by different colchicine concentrations (0.05 %, 0.10 % and 0.15 %) in culture medium exposed for 48 or 96 hours. Regenerated plants were examined cytologically by flow cytometry and chromosome counting. Additionally, analysis of the size and frequency of stomata were performed and the results showed that can be used for screening of the treated plants. Treatment with 0.1% colchicine in the culture medium for 96 hours showed a higher number of tetraploid plants produced about the number of regenerated plants in both cultivars evaluated. No significant differences among colchicine doses and duration times treatment were found in the number of tetraploids found in each treatment. However, we observed a significant difference in tetraploid production between the cultivars analyzed, indicating that there may be a genetic response to induction of chromosome doubling with colchicine.

Apesar dos esforços mundiais a malária ainda é uma doença com altas taxas de morbidade e mortalidade. Investigamos o efeito de moléculas sintéticas relacionadas a melatonina e a triptamina no ciclo celular de P. falciparum, bem como mostramos que essa classe de compostos apresenta ação antimalárica significativa. Avaliamos também 5 novas hidroxinaftoquinonas sintéticas em cultura in vitro de P. falciparum, todas apresentaram atividade antimalárica, tendo N3 destacado-se por apresentar um IC50 na faixa nanomolar. Mostramos que o possível mecanismo de ação de N3 é inibindo o potencial de membrana mitocondrial. Em células de mamíferos HEK293, N3 não mostrou toxicidade significativa. No modelo de infecção utilizando P. berghei (ANKA GFP) o composto N3 não foi capaz de curar os animais infectados, apesar da redução significativa da parasitemia no quarto dia após a infecção. Nessa tese mostramos o uso da citometria de fluxo como uma ferramenta prática possibilitando a avaliação do ciclo do parasita. / Despite the worldwide effort the malaria is still a devastating disease. We have tested melatonin and synthetic related indoles molecules on P. falciparum cell cycle and showed the potential antimalarial activity. We have tested 5 new synthetic hydroxynaphthoquinones on in vivo culture of P. falciparum 3D7, all of them showed antimalarial activity, but only N3 showed an IC50 in the nanomolar range. We demonstrate that the probable mechanism of action of N3 is inhibiting the mitochondrial membrane potential. In mammalian cells, N3 did not show cytotoxicity. Subsequently, we tested the compound N3 in murine infection model of P. berghei. After 4 days the parasitemia was assessed and the survival monitored for 30 days. N3 was not able to cure the infected animals, despite the initial reduction of parasitemia on 4th day post-infection. In this thesis we have demonstrated the use of flow cytometry as a useful and powerful tool in malaria research.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-02-09T11:45:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kamila Pereira da Silva - 2014.pdf: 1336089 bytes, checksum: 2658c99debc59b350392edc7239568d9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-20T10:55:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kamila Pereira da Silva - 2014.pdf: 1336089 bytes, checksum: 2658c99debc59b350392edc7239568d9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-20T10:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kamila Pereira da Silva - 2014.pdf: 1336089 bytes, checksum: 2658c99debc59b350392edc7239568d9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-05-14 / Fungal infections caused by yeasts of Cryptococcus neoformans complex have increased considerably among immunosuppressed especially in patients infected with human immunodeficiency virus (HIV). Antifungal drugs available to treat these infections have a wide spectrum of action, but the high costs, side effects, besides the acquisition of resistance of fungi make their limited effectiveness. In these circumstances, the search for new drugs is needed. In the present study, we evaluated the antifungal activity of tamoxifen, bisabolol, indinavir, didanosine, UFMG, Labiocon 241, solasodine, Labiocon 237, Clonazepam, semicarbonado Benzaldehyde, Cardanol, AB 36 and three natural extracts of Psychotria spp, Sclerolobium paniculatum, Hymenaea courbaril and cell viability and mechanism of action of the compound showed antifungal activity of 20 isolates of Cryptococcus neoformans. To evaluate the antifungal activity , we used the in vitro susceptibility to yeast broth microdilution protocol M27 - A3 ( CLSI 2008) and to verify the mechanism of action, flow cytometry was performed with the cellular marker Propidium Iodide ( PI ) and cell viability assay with MTT salt. Among the compounds analyzed, only tamoxifen and olanzapine showed inhibitory action on fungal samples at concentrations 128-256 μg/mL. Analysis by flow cytometry was performed with tamoxifen and showed that the compound did not alter the cell membrane of Cryptococcus neoformans ATCC 28957 , however, the cell viability test showed that tamoxifen was able to inhibit the metabolism of the fungus in different concentrations ranging 4-1024 μg/mL. / As infecções fúngicas causadas por leveduras do complexo Cryptococcus neoformans tem sido reduzida entre os imunossuprimidos principalmente nos pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Os antifúngicos disponíveis para o tratamento destas infecções apresentam um amplo espectro de ação, porém os altos custos, efeitos colaterais, além da aquisição de resistência dos fungos tornam sua eficácia limitada. Nestas circunstâncias, a busca por novos fármacos é necessária. No presente trabalho, foi avaliada a atividade antifúngica de tamoxifeno, bisabolol, indinavir, didanosina, Olanzapina, UFMG, Labiocon 241, Solasodina, Labiocon 237, Clonazepam, Benzaldeído semicarbonado, Cardanol, AB 36 e três extratos naturais obtidos de Psychotria spp, Sclerolobium paniculatum, Hymenaea courbaril. A viabilidade celular e o mecanismo de ação do composto que apresentou ação antifúngica sobre 20 isolados de Cryptococcus neoformans formam determinados. A atividade antifúngica foi realizada utilizando-se o método microdiluição em caldo para leveduras. Para verificar do mecanismo de ação, foi realizada a citometria de fluxo com o marcador celular Iodeto de Propídio (PI), enquanto que o teste da viabilidade celular foi obtido usando-se o sal MTT. Dentre os compostos analisados, apenas o tamoxifeno e olanzapina apresentaram ação inibitória sobre as amostras fúngicas, em concentrações de 128 a 256 μg/mL. Pela análise por citometria de fluxo com o tamoxifeno não se verificou alteração da membrana celular de Cryptococcus neoformans ATCC 28957. Entretanto, o tamoxifeno inibiu o metabolismo do fungo em diferentes concentrações, variando de 4 a 1024 μg/mL verificado pelo teste da viabilidade celular.

A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma ferramenta importante na reprodução animal, com aplicações acadêmicas e comerciais, e com grande relevância econômica. Apesar da sua aplicabilidade, a eficiência da PIVE ainda pode ser aumentada. Efeitos espermáticos podem ser evidenciados no desenvolvimento embrionário durante a PIVE apresentando grandes variações nas taxas de produção. Devido ao aspecto multifatorial da fertilidade, as avaliações espermáticas apresentam resultados inconstantes, mesmo com o uso de métodos mais precisos de análise como a citometria de fluxo, combinada às sondas fluorescentes, que permitem avaliar maior número de espermatozoides e de atributos simultaneamente. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de atributos espermáticos (motilidade antes e após gradiente de Percoll®, integridade de membranas plasmática e acrossomal, alto potencial de membrana mitocondrial e resistência da cromatina) de maneira individual, (diferença para apenas para um atributo espermático) e de maneira combinada em perfis espermáticos (diferença para todos os atributos espermáticos simultaneamente). O efeito foi avaliado por meio das taxas de clivagem, blastocisto e eficiência de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivagem). Os resultados demonstraram que os atributos motilidade prévia ao Percoll®, a integridade da membrana acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, individuais, apresentam efeito negativo sobre as taxas de desenvolvimento embrionário e de blastocisto. A motilidade após o gradiente de Percoll®, a integridade da membrana plasmática e a resistência da cromatina, bem como a combinação de todos os atributos espermáticos analisados, sob mesmas condições, não apresentaram efeito sobre a PIVE. Deste modo, conclui-se que controversamente alguns atributos espermáticos podem apresentar efeitos negativos sobre as taxas da PIVE e que a função e interação de atributos espermáticos com o processo in vitro devem ser mais bem compreendidas, a fim de permitir o aprimoramento deste processo podendo aumentar as taxas de produção, maximizando a eficiência da PIVE. / In vitro production (IVP) of bovine embryos is an important technology of animal reproduction. This technology is applied on research and livestock, with economic highlights, however IVP efficiency could be higher, and can be influenced by male effects. Until now, sperm evaluations had failed to determine these male effects, even using advanced technologies such as large mix of fluorescent probes by flow cytometry analysis, which evaluates a large number of sperm cells and traits simultaneously. Then, the aim of this study was to determine the effect of sperm traits (motility before and after Percoll® selection, plasma membrane and acrosome integrity, high mitochondrial membrane potential, and chromatin structure) on IVP rates. Effect of each trait was enriched to evaluate the individual trait effect (differences between groups of bulls exclusively for the enriched trait, while others traits was homogenous). Combined effect of traits was also evaluated (differences between groups of bulls, and groups of batches from same bulls, for all traits simultaneously, generating a sperm profile). Enriched and combined effects were evaluated on cleavage, blastocyst and embryo development (blastocyst/cleavage) rates. Results showed that motility before Percoll® selection, acrosome integrity, and high mitochondrial membrane enriched effects had negative impact on blastocyst and embryo development rates. Motility after Percoll® selection, plasma membrane integrity, chromatin structure, and combined effects were not significant on IVP rates. We can conclude that controversially, some sperm traits could have a negative effect on IVP outcomes, thereafter sperm traits physiology and interactions with in vitro systems must be better understood to enhance in vitro fertilization conditions, increasing IVP yields.

Os trabalhos na área de neuroimunomodulação vêm contribuindo de forma marcante para o entendimento da regulação/modulação das respostas adaptativas dos organismos frente ao estresse ou às doenças. A integração de modelos biológicos e psicológicos surge e torna-se cada vez mais importante para a neuroimunologia. Cada animal comunica-se com outros de sua ou de outra espécie através de mecanismos que são característicos dentro de seus respectivos grupos; sabe-se que a comunicação entre os animais pode ser visual, táctil, química e sonora. Procuramos neste trabalho identificar o(s) tipo(s) de comunicação mais relevante(s) entre camundongas saudáveis e conspecíficas doentes. Mais especificamente, avaliamos efeitos neuroimunes decorrentes da convivência por 14 dias com companheiras inoculadas com tumor ascítico de Ehrlich e buscamos caracterizar o tipo de comunicação envolvida com este processo. Os resultados obtidos mostraram que a simples convivência com um portador do tumor de Ehrlich produziu em camundongas: 1) redução do peso e celulariedade do baço; 2) redução na contagem diferencial de blastos, eritrócitos jovens e linfócitos no esplenograma; 3) redução da porcentagem de linfócitos B e T helper e na proporção CD4/CD8 no baço; 4) aumento da atividade citotóxica de células NK; 5) aumento da celulariedade total da medula; 6) aumento na contagem absoluta de blastos e redução de eritrócitos jovens e de linfócitos no mielograma; na contagem relativa observamos um aumento dos blastos; 7) aumento de células na fase G1 e redução na fase G2 do ciclo celular da medula; 8) aumento de células tumorais de Ehrlich na fase G1 e redução destas na fase G2, 9) aumento de permanência na zona animal estranho e redução de tempo na zona companheiro doente em um labirinto em T, 10) aumento de interação social; 11) redução do burst oxidativo basal de neutrófilos provenientes de animais que conviveram com dois doentes, e reversão destas alterações quanto da convivência com dois sadios. Observamos, ainda que: 12) a convivência não modificou os níveis de corticosterona dos animais desafiados ou não por contenção; 13) a ausência de contato físico não foi relevante para reverter as alterações induzidas pela convivência; 14) a falta de contato visual também não foi relevante para reverter as alterações observadas; 15) os estímulos olfativos foram relevantes para as alterações induzidas pela convivência sobre o burst oxidativo e fagocitose de neutrófilos, crescimento tumoral, alterações comportamentais, dosagem plasmática de noradrenalina e de adrenalina e níveis hipotalâmicos de noradrenalina. Em seu conjunto observamos que a convivência por 14 dias com um animal portador de um tumor de Ehrlich produziu relevantes alterações no comportamento, em parâmetros neuroquímicos e de atividade imune inata de camundongas. Nossos resultados sugerem que a percepção do odor da doente esteja diretamente relacionada com as alterações relatadas. / Several papers are showing relevant neuroimmune regulation and/or modulation during stress or diseases. The incorporation of biological and psychological models of humans conditions are of high relevance in neuroscience. Animals exhibit a variety of adaptative behaviors for communicating with conspecifics; communication between animals can be visual, tactile, chemical and sound induced. The present experiment was designed to analyze the effects induced by cohabitation with a sick cage mate and some aspects of communication between sick mice and their companions. Specifically, we analyzed some neuroimmune effects induced by cohabitation with a sick cage-mate for 14 days (mice bearing an ascitic Ehrlich tumor), looking also for the type of communication related to this process. Our results showed that cohabitation with a sick cage-mate induced, in female mice 1) decreased spleen weight and total cellullarity; 2) decreased the number of blast, young erythrocytes and lymphocytes in spleen 3) decreased percentage of B and T helper cells, and decreased proportion of CD4/CD8 cells in the spleen; 4) increased NK cells cytotoxicity; 5) increased bone marrow total celullarity; 6) increased absolute number of blasts, and decreased the number of young erythrocytes and lymphocytes; in the relative count, an increase of blast cells in bone marrow was observed; 7) increased amount of cells on G1 cellular cycle phase, and a decreased population of cells on G2 cellular cycle phase in the bone marrow; 8) increased amount of Ehrlich tumor cells in G0-G1 cellular cycle phases, and decreased population of tumor cells in S/G2/M phases; 9) increased time spent with an strange animal and decreased time spent will sick companion in a T maze and increased locomotion in this apparatus; 10) increased social interaction; 11) decreased neutrophil basal oxidative burst in animals that lived with two sick companions. We also observed that: 12) cohabitation with a sick partner was unable to modify serum corticosterone levels with or without an immobilization stress challenge; 13) physical contact was not relevant for the neuroimune changes induced by cohabitation; 14) visual cues were not relevant for the present contextual immune changes; 15) odor cues were effective mechanisms of communication used by the mice in the present experiment; because it removal abrogated or reversed the neuroimmune changes reported above for cohabitation. The present findings showed that cohabitation with an ascitic Ehrlich tumor bearing mice produced behavioral, neurochemical, and immunological changes. The present results strongly suggest that volatile compounds released by the sick companion are directly relationed to the neuroimmune changes now reported in mice for cohabitation with a sick companion.

Os resultados obtidos no mestrado mostraram que a samambaia do campo (Pteridium aquilinum) reduz a citotoxicidade das células natural killer (NK) esplênicas e a resposta imune celular do tipo tardia (DTH) de camundongos. Entretanto, até aquele momento não era sabido qual a célula afetada pela planta causava a diminuição da DTH. Assim, o objetivo inicial deste estudo foi verificar qual a célula envolvida na diminuição da DTH. Além disto, buscou-se descobrir o mecanismo de ação imunotóxico da P. aquilinum, o principio tóxico envolvido e se este efeito poderia ser revertido pelo selênio (Se). Para tal, camundongos C57BL/6 foram administrados com extrato de P. aquilinum, por gavage, durante 30 dias e suplementados com Se por mais 30 dias e a análise histológica revelou redução significativa na área de polpa branca esplênica que foi completamente revertida pelo tratamento com Se. Ainda, foi possível verificar que a diminuição da DTH foi causada pela redução da produção de IFNγ pelas células NK durante a indução da resposta imune celular. Além disto, camundongos administrados com ptaquilosídeo, por gavage, durante 14 dias mostraram a mesma redução na atividade das células NK causada pelo extrato de P. aquilinum, assim como a prevenção deste efeito pela co-administração de Se. Por fim, na análise da expressão gênica das células NK esplênicas dos camundongos tratados com ptaquilosídeo e/ou selênio pôde-se observar o aumento da expressão dos genes Mt1 e Mt2, possíveis responsáveis pelo mecanismo imunotóxico da planta, sendo posteriormente confirmado pelo aumento de metalotioneína e consequente redução de Zn2+ livre no espaço intracelular das células NK. Os resultados deste estudo claramente mostram que os efeitos imunossupressores da P. aquilinum são induzidos pelo ptaquilosídeo e são decorrentes do aumento da expressão dos genes da Mt1 e Mt2 e que a suplementação com Se pode prevenir e reverter estes efeitos tóxicos. / The results obtained in the master showed that the bracken fern (Pteridium aquilinum) reduces both the cytotoxicity of splenic natural killer cells (NK) and the delayed-type hypersensitivity (DTH) from mice. However, it was not known until that time, which cell affected by the plant that caused a decrease in DTH. Thus, the initial goal of this study was to determine which cell was involved in the reduction of DTH. Moreover, we sought to discover the mechanism of action of the P. aquilinum, the toxic principle involved and whether this effect could be reversed by selenium (Se). For that, C57BL/6 mice were treated with extract of P. aquilinum, by gavage, for 30 days and supplemented with Se for following 30 days. The histological analysis revealed a significant reduction in the splenic white pulp area that was completely reversed by treatment with Se. Still, it was verified that the decrease in DTH was caused by reduced production of IFNγ by NK cells during the induction of cellular immune response. In addition, the mice administered with ptaquiloside, by gavage, for 14 days showed the same reduction in the NK cell activity caused by the extract of P. aquilinum, as well as the prevention of this effect by co-administration of Se. Finally, we could observe an increase in the expression of Mt1 and Mt2 genes in the gene expression analysis of splenic NK cells from mice treated with ptaquiloside and/or selenium. These genes were probably responsible for immunotoxic mechanism of the plant, which was confirmed later by the augment of metallothionein and consequent reduction of free Zn2+ into the intracellular space of NK cells. The results of this study clearly show that the immunosuppressive effects of P. aquilinum are induced by ptaquiloside and they are a consequence of the augment in the gene expression of Mt1 and Mt2 and that the supplementation with Se can prevent and reverse these toxic effects.

A mudança anual de penas é um componente crítico do ciclo biológico de todas as espécies de aves e pode modificar as respostas imunológicas individuais, sendo que suas consequências são pouco estudadas. Neste contexto, uma vez que são escassos os estudos acerca do perfil clínico e parâmetros imunológicos de pinguins-de-Magalhães em diferentes fases da muda, este estudo propôs avaliar determinados aspectos relacionados a esses perfis, em animais mantidos em ambiente controlado. Foram estudados 21 indivíduos adultos (dez machos e 11 fêmeas) e os parâmetros avaliados foram: teste de hipersensibilidade cutânea tardia à fitohemaglutinina (FHA) com a avaliação histopatológica de biópsias que incluíram a análise qualitativa e quantitativa dos tipos celulares presentes na reação e no controle às 6, 24 e 48 horas; parâmetros clínicos (massa corpórea e hematologia); fagocitose e burst oxidativo; fenotipagem e resposta linfoproliferativa. O teste de FHA demonstrou diferença significativa na espessura da membrana interdigital de ambas as patas inoculadas com FHA e com o controle (PBS) quando comparadas antes da inoculação e antes da biópsia às 24 e 48 horas. A análise histomorfométrica revelou não haver diferenças significativas na frequência relativa de granulócitos (heterófilos/ eosinófilos), linfócitos, macrófagos ou trombócitos entre as patas inoculadas com FHA e PBS em nenhum dos momentos analisados. Este resultado sugere que a diferença na espessura da membrana interdigital das patas inoculadas seja em decorrência do edema e não do infiltrado inflamatório. Para analisar os efeitos do ciclo da muda nos parâmetros clínicos e hematológicos, os animais foram divididos em três grupos: pré-muda (-5 a 0 dias da muda), muda (10º ao 21º dia da muda) e padrão basal (>120 dias da muda). Os resultados mostraram que em relação ao momento basal: houve aumento significativo na massa corpórea dos animais no momento da pré-muda; diminuição significativa de proteínas totais, hematócrito, eritrócitos totais e leucócitos totais na pré-muda e muda. Não houve diferença no número total de monócitos e heterófilos, contudo, houve eosinofilia e linfopenia na pré-muda e muda, respectivamente. Com relação aos parâmetros imunológicos, houve aumento no burst oxidativo gerado pelo estímulo biológico (Staphylococcus aureus) na pré-muda em relação à muda e ao padrão basal; ocorreu aumento do burst oxidativo gerado pelo estímulo químico (éster de forbol) na pré-muda em relação à muda. Em relação à fagocitose, houve diminuição desta capacidade dos leucócitos dos animais na pré-muda e muda em relação ao padrão basal quando o agente foi bacteriano; entretanto, o mesmo não foi observado para a fagocitose de leveduras (Zymosan A); houve diminuição de linfócitos T CD4+ circulantes na pré-muda e muda em relação ao padrão basal e o índice de proliferação de linfócitos aumentou durante o período de muda em relação ao basal. Esses resultados tomados em conjunto sugerem que as mudanças fisiológicas observadas durante o ciclo da muda interferem na modulação de parâmetros imunológicos e são sugestivas de serem consequência do prejuízo energético sofrido, mesmo em animais mantidos em ambientes controlados / The annual replacement of feathers is a critical component of the biological cycle of all bird species. Molt can modify their individual immune response, and the consequences of this are not well known. Within this context, and the few studies on the clinical profile and immunological parameters of Magellanic penguins at different stages of their molt, this study aimed to evaluate certain aspects related to the clinical profiles of animals kept in a controlled environment. A total of 21 adult individuals (ten males and 11 females) was analyzed and the parameters evaluated in this study were: delayed-type hypersensitivity test to phytohemagglutinin (PHA) based on the histopathological evaluation of foot web biopsies that included qualitative and quantitative analysis of cell types present in the essay and control at 6, 24 and 48 hours; clinical parameters (body mass and hematology); phagocytosis and oxidative burst; phenotyping and lymphoproliferative response. The PHA test showed significant differences in the thickness of the webbing of both feet inoculated with PHA and control (PBS), when compared before inoculation and before biopsy at 24 and 48 hours. Histomorphometric analysis revealed no significant differences in the relative frequencies of granulocytes (heterophils/ eosinophils), lymphocytes, macrophages, thrombocytes, or between the feet inoculated with PHA and with PBS in any of the samples. This result suggests that the difference in thickness of the foot webbing is due to edema and not an inflammatory infiltrate. To analyze the effects of the molting cycle on clinical and hematological parameters, the birds were divided into three groups: pre-molt (from -5 days to the start of the molt, day 0), molt (10th to 21st days of molt) and baseline (>120 days after the completion of the molt). The results showed that in comparison with baseline values: a significant increase in body mass occurred during pre-molt; and a significant decrease in total protein, hematocrit, total erythrocytes and total leukocytes occurred during pre-molt and molt. There was no difference in the total numbers of monocytes and heterophils, however, there were eosinophilia and lymphopenia during pre-molt and molt, respectively. There was an increase in the oxidative burst generated by the biological stimulus (Staphylococcus aureus) in the pre-molt compared to molt and baseline levels; and there was an increased oxidative burst generated by the chemical stimuli (phorbol esters) in the pre-molt in relation to the molt. There was a decreased capacity of phagocytosis for the leukocytes in animals during pre-molt and molt compared to baseline when the agent was bacterial; however, this was not observed for the phagocytosis of yeast (Zymosan A). There was a decrease of circulating CD4+ T lymphocytes in the pre-molt and molt compared to baseline, and the lymphocyte proliferation index increased during the molt compared to baseline. The results suggest that the physiological changes observed during the molt cycle does interfere with the modulation of immune parameters, and are suggestive of resulting as a consequence of from the high energy demands of molt, even for birds kept in controlled environments

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.

A demodicidose é uma importante dermatopatia parasitária em cães. É decorrente da proliferação excessiva de ácaros comensais do gênero Demodex sp no tegumento canino. A manifestação clínica da demodicidose juvenil generalizada têm sido associada à disfunção imune hereditária de linfócitos T específica ao parasita, enquanto que, a demodicidose do aduto pode ser consequente a doenças imunossupressoras. A resposta imune celular é considerada crucial na defesa contra o parasita e, encontra-se comprometida em cães com demodicidose. Com o escôpo de se determinar se linfócitos sanguíneos periféricos, TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+ são bons indicadores da evolução clínica da doença e do estado imune de cães demodicidose generalizada, tais parâmetros foram quantificados em 16 animais com demodicidose generalizada, na pré, trans e pós terapia, e em outros 30 animais hígidos, utilizando-se da técnica de citometria de fluxo. Para as análises estatísticas comparativas, foram padronizados quatro momentos de observação dos animais com demodicidose, a saber: primeira consulta: quando do estabelecimento do diagnóstico; segunda consulta; consulta de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo e, finalmente, naquela de estabelecimento da alta clínica, preconizada quando da ausência de evidenciação do ácaro no exame parasitológico cutâneo, por três consultas consecutivas. Os valores absolutos médios de linfócitos totais, linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos animais com demodicidose, mostraram-se inferiores àqueles do Grupo Controle em todos os momentos de observação. Somente os valores absolutos de linfócitos TCD4+, apresentaram diminuição significativa, em relação ao Grupo Controle, no momento da primeira consulta. Entre o Grupo Experimental, foi observado elevação signficativa entre os valores absolutos dos linfócitos totais, TCD4+ e TCD8+, entre a primeira consulta e aquela de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo, quando estes valores se aproximaram daqueles observados no Grupo Controle. Paralelamente, evidenciou-se alta correlação da elevação dos número absoluto médio dos linfócitos TCD4+ e TCD8+, com a diminuição da contagem de ácaros. A razão TCD4+:TCD8+, não diferiu significativamente entre o Grupo Controle e Experimental. O tratamento da demodicidose não alterou a razão TCD4+: TCD8+. Não foi observado correlação entre o período necessário para o estabelecimento da alta clínica e a razão TCD4+:TCD8+. O comportamento dos linfócitos sanguíneos periféricos TCD4+, TCD8+, e da razão TCD4+:TCD8+, demonstra que a participação de outros mecanismos, que não a franca alteração destas subpopulações, sejam importantes na patogenia da doença. Em linhas gerais, não foram observadas diferenças significativas, nos valores dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+, entre os animais do Grupo Controle, e os animais com demodicidose generalizada , de forma que, o uso da determinação destes parâmetros, é desaconselhado no monitoramento da evolução clínica e no estabelecimento do prognóstico, nos animais com demodicidose generalizada. / Demodicosis is a serious canine parasitic skin disease. It is caused by the presence of increasead amounts of Demodex mite in the skin. Clinical signs of juvenile-onset generalized demodicosis are associated with specific hereditary dysfunction of T lymphocytes while adult-onset can be induced by immunosuppressive diseases. The cellular immunity is crucial in keeping low numbers of skin mites and it is depressed in dogs with generalized demodicosis. The aim of this study was to verify whether CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio could be good indicators of disease progression and immune status in canine demodicosis. For this, using the flow cytometry technique, the CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio of 16 dogs with generalized demodicosis were evaluated at four moments: first and second consultation, first time animal was presented without mites in skin scrapings and finally, on clinical improvement. These values were then compared with those of 30 controls healthy dogs. The absolute numbers of CD4+, CD8+ and total lymphocytes were lower than control healthy dogs at all moments of analysis. Only at the first consultation CD4+ lymphocyte counts was significant lower than control group. Dogs with generalized demodicosis had signicant increased counts of CD4+, CD8+ and total lymphocytes from the first consultation until the first negative skin scraping. At this point lymphocyte counts reached levels closesth to control group ones. CD4 : CD8+ ratio didn´t differ throughout treatment of canine demodicosis neither when average level for ill dogs were compared to with those healthy ones. Furthermore CD4+, CD8+ and CD4:CD8+ ratio didn´t correlated with time taken for successfull treatment completion and so they couldn´t be used as prognosis predictor. A high correlation between increased of CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and decreased mites counts was observed in dogs with generalized demodicosis. Circulating lymphocyte subpopulations are therefore similar in dogs with canine demodicosis and healthy dogs and there is no correlation between clinical status or response to therapy and the lymphocytes subpopulations counts. We can than conclude that CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio cannot be used as a parameters to predict progression of an individual patient in a clinical context.

A doença articular, especificamente a osteoartrite é uma das enfermidades mais prevalentes e mais debilitantes que acomete os cavalos, tendo um grande impacto econômico na indústria eqüina. Assim sendo, a investigação contínua e avanços na área terapêutica são de fundamental importância. A osteoartrite é uma doença degenerativa que pode ser deflagrada por uma série de fatores e onde, ultimamente, todos os tecidos articulares encontram-se comprometidos. Não obstante, é na degradação da matriz extracelular da cartilagem articular que ocorrem os eventos de maior expressão e repercussão. Na gênese da degradação da matriz extracelular encontra-se um desequilíbrio entre os processos anabólicos e catabólicos responsáveis pela homeostase normal da cartilagem articular e pela adaptação deste tecido às forças que sobre ele incidem. Estes processos são orquestrados por proteínas anabólicas, como, por exemplo o fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-l), e por citocinas inflamatórias que, de forma contrária, são responsáveis pela depleção de colágeno e de proteoglicanas da matriz, representando o grupo de proteínas catabólicas, cujo exemplo clássico é a interleucina-1. A interleucina-1 tem papel central nos processos fisiopatológicos da osteoartrite por desencadear vários eventos catabólicos nos sinoviócitos e condrócitos, incluindo a indução de gens de metaloproteinases e agrecanases e de outros mediadores inflamatórios como a cicloxigenase, a prostaglandina E2 e as espécies reativas do oxigênio. Seus efeitos biológicos se verificam após a ligação com dois tipos de receptores específicos e são modulados pela ocorrência natural de uma proteína antagonista destes receptores. O presente estudo procurou observar os efeitos antiinflamatórios desta proteína antagonista do receptor (IRAP) no líquido sinovial de equino através do emprego da técnica de citometria de fluxo. Nos ensaios observou-se que: 1-a adição de IRAP às células de líquido sinovial estimuladas in vitro por LPS e PMA reduziu a liberação de espécies reativas de oxigênio produzidas por elas; 2 - o plasma, quando utilizado como controle, exibiu efeitos semelhantes aos do IRAP sobre as células de líquido sinovial ativadas in vitro; 3- o efeito antiinflamatório deve-se mais à variação na intensidade de produção de espécies reativas do oxigênio do que à flutuação no percentil de células do líquido sinovial engajadas em sua geração, in vitro. Estes resultados suportam a aplicabilidade terapêutica do IRAP® pelo efeito antiinflamatório verificado sobre as células do liquido sinovial avaliadas por citometria de fluxo. Eles corroboram, ainda, para o uso da citometria de fluxo como instrumento eficaz na avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio por células do líquido sinovial ativadas pelos estímulos de LPS e PMA, tanto quantitativamente como qualitativamente. / Joint disease in horses, specifically osteoarthritis, is one of the most prevalent and debilitating illnesses affecting equine industry and for this reason continued research and improvements in therapeutics are needed. Osteoarthritis is a degenerative disease that can be triggered by a number of factors and where ultimately all articular tissues are affected. The hallmark of osteoarthritis is the degeneration of the articular cartilage matrix, where the most relevant and expressive events take place. In the development of osteoarthritis there is disruption in extracellular matrix homeostasis with an overall balance toward cartilage metabolism. Homeostasis of the articular environment relies on balance between anabolic and catabolic events and results in ability of cartilage to respond to molecular or mechanical cues. This apparently antagonic processes are orquestrated by soluble protein mediators, for example the anabolic insulin-like growth factor-I (IGF-I), and, on the other side, by inflammatory cytokines, which in turn, are implicated in degradative processes of articular cartilage, characteristic of osteoarthritis. They deplete cartilage matrix from collagen and proteoglycans and the classical example of such a cytokine is interleukin-1. Interleukin-1 has a central role in the physiopathologic processes of osteoarthritis and has been implicated in the genesis of a number of catabolic events when acting on chondrocytes and synoviocytes. Examples are gene induction for metalloproteinases and agrecanases production, as well as production of other inflammatory mediators like ciclooxygenase, prostaglandin E2 and oxygen-derived reactive species. Its biological effects are observed after interaction with two different but specific types of receptors and are modulated by the occurrence of a natural antagonist, the interleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP). In the present study the anti-inflammatory effects of this antagonist protein were evaluated in synovial fluid using cytometric flow techniques. It was observed that: 1- addition of IRAP to synovial fluid cells stimulated in vitro by LPS and PMA reduced the production of oxygen-derived reactive species; 2- plasma, used as a control, exhibited similar effects on activated synovial cells when compared to IRAP in vitro 3- the anti-inflammatory effect is due, in its majority, to the variation in intensity of oxygen-derived reactive species, more than on fluctuations on the percentage of synovial fluid cells actively engaged in its generation in vitro. These results support the therapeutic aplicability of IRAP® for its anti-inflammatory effect observed on synovial fluid cells evaluated with flow cytometric techniques. They also corroborate to the usefulness of cytometric flow techniques in equine synovial fluid cells; they are an invaluable tool to evaluate quantitative and qualitatively the production of oxygen-derived reactive species mediated by their activation with PMA and LPS.