Face à un environnement changeant, la cellule a dû développer des systèmes de régulation lui permettant de s’adapter et d’assurer son développement et sa survie. Ces systèmes de régulation s’organisent autour de réseaux de régulation transcriptionnelle permettant l’expression des gènes codant pour les protéines dont la cellule a besoin. Dans la plupart des réseaux trancriptionnels, la régulation de la transcription des gènes est « raffinée » par la présence de circuits de rétroaction positifs et négatifs à l’origine de deux types de comportements différents: la multistabilité d’une part, et les comportements homéostatiques ou oscillants d’autre part. Deux réseaux de régulation transcriptionnelle de complexité différente ont été étudiés au cours de cette thèse :le réseau p53-Mdm2 impliqué dans l'arrêt de la croissance cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose chez les mammifères, et le réseau de facteurs transcriptionnels GATA impliqué dans la régulation du catabolisme de l’azote chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L’analyse théorique du réseau p53-Mdm2 a eu pour principal objectif de reproduire et d’interpréter les données expérimentales disponibles dans la littérature concernant la réponse oscillante de la p53 lorsque l’ADN de la cellule est endommagé. L’analyse théorique des comportements du réseau GATA, quant à elle, a été couplée à une étude expérimentale dans les milieux de qualité intermédiaire en azote peu investigués jusqu’à présent. Pour analyser les propriétés dynamiques de ces deux réseaux, plusieurs approches complémentaires, se situant à différents niveaux de description, ont été utilisées: l’approche logique, différentielle et stochastique.<p>La première partie de cette thèse a été consacrée à l’étude du réseau p53-Mdm2 pour lequel nous avons développé un modèle simple composé d’un circuit de rétroaction positif imbriqué dans un circuit de rétroaction négatif. Les résultats de notre analyse logique montrent que les principales propriétés dynamiques du réseau peuvent être résumées par un petit nombre de diagrammes de bifurcation logique. Ces scénarios de bifurcations diffèrent par la séquence d’activation du circuit positif et négatif composant le réseau et dépendent d’une part de l’affinité de la p53 pour ses gènes cibles et d’autre part de son activité transcriptionnelle. Nous proposons que différents stress et types cellulaires pourraient correspondre à différents scénarios de bifurcation et donc conduire à des réponses différentes après irradiation. Cette première analyse qualitative nous a permis de rendre compte de différents aspects de la dynamique du réseau observés expérimentalement, tels que le changement de fréquence des oscillations en cours de réponse, les oscillations de longue durée de la p53 ou l’amortissement rapide des oscillations à l’échelle d’une population de cellules. Pour nous affranchir des fortes non-linéarités inhérentes au traitement logique, nous avons ensuite traduit le modèle logique en un modèle différentiel et montré que les principaux comportements présentés par le modèle logique sont conservés, suggérant que la structure du réseau détermine dans une large mesure les principales potentialités dynamiques du système. L’analyse des propriétés de bifurcation du modèle différentiel en fonction du niveau de dommage à l’ADN nous a également permis de mettre en évidence la présence de deux régimes oscillants d’amplitude, de valeur moyenne et de fréquence nettement différentes, séparés par une zone de bicyclicité où ces deux régimes coexistent. Cette propriété permet d’expliquer l’existence des deux fréquences d’oscillation différentes qui ont été observées expérimentalement en fonction de la dose d’irradiation. Enfin l’analyse stochastique de notre modèle nous a, en particulier, permis de rendre compte de l’augmentation du nombre de cellules oscillant à des fréquences élevées lorsque la dose d’irradiation augmente, observée expérimentalement.<p>La deuxième partie de notre thèse a été consacrée à l’étude du réseau de facteurs GATA chez la levure S.cerevisiae. Ce réseau, constitué des activateurs Gln3 et Nil1 et des répresseurs Dal80 et Gzf3, comporte plusieurs circuits de rétroaction positifs et négatifs interconnectés. Dans le but d’aider à comprendre le rôle et le fonctionnement du réseau GATA, nous avons effectué une analyse théorique et expérimentale de son comportement dynamique en fonction de la qualité de la source azotée. L’analyse différentielle montre la possibilité d’un comportement bistable dans les milieux de qualité intermédiaire en azote et d’oscillations amorties suite à un transfert nutritionnel d’une condition azotée à une autre, lorsque l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 est synergique ou lorsque le gène Gln3 est supprimé. Gzf3 serait le répresseur clef impliqué dans la bistabilité tandis que Dal80 serait le répresseur clef impliqué dans les comportements oscillants. L’analyse stochastique nous a permis d’étudier l’effet des fluctuations moléculaires sur ces comportements et les distributions de variables importantes du système dans une population de cellules. Pour le modèle synergique de la souche sauvage et celui du mutant gln3°, elle a montré l’existence, dans des milieux de qualité intermédiaire en azote, de deux populations de cellules qui coexistent :une population où l’expression de Dal80 est réprimée, une autre où son expression est activée. Enfin, l’étude de la dynamique du couplage entre la protéine fluorescente Gfp, sous le contrôle du promoteur de DAL80, et le réseau GATA montre que, pour des ordres de grandeur physiologique de la vitesse de disparition de la Gfp, la bimodalité présente au niveau du réseau GATA devrait se refléter au niveau de la Gfp.<p>Les comportements bistables et oscillants mis en évidence dans notre étude théorique du réseau GATA ont ensuite été testés expérimentalement en suivant la Gfp sous le contrôle du promoteur de DAL80 en fonction de la concentration de la source azotée glutamine. Cette étude expérimentale nous a permis de mettre en évidence l’existence d’oscillations amorties de la fluorescence de la protéine de fusion Dal80-Gfp. De telles oscillations cependant n’ont pas été observées dans les expériences réalisées sur les autres souches testées pour lesquelles le gène de la Gfp est fusionné au promoteur de DAL80. Notre étude expérimentale montre également l’existence, chez la souche sauvage, d’une population unique de cellules fluorescentes quelle que soit la concentration du milieu extérieur en glutamine testé (0.2mM à 10mM). Un modèle additif où l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 n’est pas synergique serait donc en meilleur accord avec nos observations. Chez les souches où le facteur Gln3 est inactivé, par contre, deux populations cellulaires, l’une de forte fluorescence et constituée de cellules de grande taille, l’autre de plus faible fluorescence et constituée de cellules de taille plus petite, coexistent pour des concentrations intermédiaires du milieu extérieur en glutamine. La forte corrélation observée entre la taille et la fluorescence des cellules suggère que le comportement bimodal observé au niveau de la fluorescence est lié au comportement bimodal observé au niveau de la taille. Enfin, un modèle phénoménologique de la croissance cellulaire nous a permis de reproduire l’existence de deux populations cellulaires de taille distincte.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La vitesse de réplication du HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1), qui semble corrélée de manière directe à la vitesse de progression de la maladie vers le stade SIDA, est essentiellement contrôlée au niveau transcriptionnel. La transcription du HIV-1 est régulée par la structure chromatinienne, des éléments agissant en cis localisés dans les LTRs, des facteurs de transcription agissant en trans et par la protéine virale trans-activatrice Tat (revu dans Quivy et al. 2007, Bisgrove et al. 2005, Rohr et al. 2003, Rabson and Graves 1997). En plus de l’enhancer localisé dans le LTR5’ du HIV-1, un enhancer intragénique, localisé dans le gène pol du HIV-1, inductible par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été identifié. La localisation progressive de l’activité enhancer a permis de définir deux domaines distincts et indépendants dans cet enhancer intragénique :les fragments 5103 et 5105 localisés respectivement dans la partie centrale du gène pol et dans une région couvrant la fin du gène pol, le gène vif, le gène vpr et le premier exon codant des gènes tat et rev (Verdin et al. 1990). Les fragments 5103 et 5105 se comportent tous deux comme des enhancers inductibles par le PMA lorsqu’ils sont clonés en amont du promoteur de la thymidine kinase dans un vecteur rapporteur en cellules HeLa. Notre laboratoire a précédemment identifié trois sites de liaison pour les facteurs de transcription AP-1 dans le fragment 5103 (Van Lint et al. 1991). <p><p>Au cours de notre thèse, nous avons poursuivi la caractérisation de ces sites de liaison AP-1 et avons montré que les facteurs c Fos, JunB et JunD interagissent in vitro avec ces motifs. Pour chaque site, nous avons identifié des mutations qui abolissent la liaison des facteurs AP-1 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de la transcriptase inverse. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons démontré que les sites AP 1 intragéniques sont entièrement responsables de l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103. De plus, l’activité PMA-inductible du fragment 5103 est inhibée par le mutant dominant négatif A-Fos à condition que les sites ne soient pas mutés. A l’inverse, l’expression ectopique de dimères forcés AP-1 affecte positivement l’activité enhancer du fragment 5103. Enfin, nous avons étudié le rôle biologique des sites AP-1 intragéniques dans la réplication virale et avons montré que ces sites contribuent positivement à l’infectivité du virus.<p><p>Durant la seconde partie de notre thèse, nous avons entamé la caractérisation physique et fonctionnelle du fragment 5105. Nos résultats de transfection transitoire montrent que l’activité PMA inductible du fragment 5105 est localisée dans le dernier tiers de ce dernier :le sous fragment 5105.3. L’analyse bioinformatique de cette région a permis de mettre en évidence un site de liaison pour les facteurs AP-1 in vitro. Des mutations ponctuelles permettent d’abolir la liaison des facteurs à leur site mais altèrent la séquence en acides aminés sous-jacente codant pour les protéines Tat et Rev. Nous avons montré que ce site est impliqué dans l’activité transcriptionnelle de ce fragment. L’expression ectopique du mutant dominant négatif A-Fos inhibe l’activité transcriptionnelle PMA-inductible du fragment 5105. Une analyse bioinformatique plus large nous a ensuite permis d’identifier in vitro, par retard de migration sur gel, 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU.1 dont les implications pour le virus restent encore à déterminer.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Hox transcription factors are extensively investigated in diverse fields of molecular and evolutionary biology. Hox genes belong to the family of homeobox transcription factors characterised by a 60 amino acids region called homeodomain. These genes are evolutionary conserved and play crucial roles in the development of animals. In particular, they are involved in the specification of segmental identity, and in the tetrapod limb differentiation. In vertebrates, this family of genes can be divided into 14 groups of homology. Common methods to classify Hox proteins focus on the homeodomain. Classification is however hampered by the high conservation of this short domain. Since phylogenetic tree reconstruction is time-consuming, it is not suitable to classify the growing number of Hox sequences. The first goal of this thesis is therefore to design an automated approach to classify vertebrate Hox proteins in their groups of homology. This approach classifies Hox proteins on the basis of their scores for a combination of protein generalised profiles. The resulting program, HoxPred, combines predictive accuracy and time efficiency. We used this program to detect and classify Hox genes in several teleost fish genomes. In particular, it allowed us to clarify the evolutionary history of the HoxC1a genes in teleosts. Overall, HoxPred could efficiently contribute to the bioinformatics toolbox commonly used to annotate vertebrate Hox sequences. This program was then evaluated in non-vertebrate species. Although not intended for the classification of Hox proteins in distantly related species, HoxPred showed a high accuracy in bilaterians. It has also given insights into the evolutionary relationships between bilaterian posterior Hox genes, which are notoriously difficult to classify with phylogenetic trees.<p><p>As transcription factors, Hox proteins regulate target genes by specifically binding DNA on cis-regulatory elements. Only a few of these target genes have been identified so far. The second goal of this work was to evaluate whether it is possible to apply computational approaches to detect Hox cis-regulatory elements in genomic sequences. Regulatory Sequence Analysis Tools (RSAT) is a suite of bioinformatics tools dedicated to the detection of cis-regulatory elements in genomes. We participated to the development of matrix-based pattern matching approaches in RSAT. After having performed a statistical validation of the pattern-matching scores, we focused on a study case based on the vertebrate HoxB1 protein, which binds DNA with its cofactors Pbx and Meis. This study aimed at predicting combinations of cis-regulatory elements for these three transcription factors. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Au cours d'une étude sur le contrôle transcriptionnel du gène de l'alpha-foetoprotéine, le laboratoire s'était intéressé aux facteurs de transcription de la famille SP/KLF et S. Scohy avait découvert une séquence définissant un nouveau membre: SP6.<p><p>Afin de déterminer la structure du gène chez la souris, nous avons isolé un fragment génomique contenant la totalité du gène et nous l'avons séquencé. Une analyse informatique de cette séquence, l'isolement d'ESTs ainsi qu'une expérience d'extension d'amorce, nous ont permis d'affirmer que le gène Sp6 murin possède deux exons, générant une protéine de 376 acides aminés à partir d'un ATG repéré au début de l'exon 2.<p>En même temps, des travaux réalisés sur un gène nommé epiprofin ont été publiés (Nakamura et al. 2004). Ce gène s'est avéré correspondre au gène Sp6 car il code pour la même protéine. Les exons 2 sont en effet identiques, seuls les exons 1 diffèrent.<p>Nos études sur l'expression du gène Sp6 ont indiqué qu'elle est ubiquiste mais que c'est durant le développement embryonnaire, et surtout pendant les stades les plus tardifs de celui-ci, qu'il est le plus exprimé. Cette expression se localise surtout au niveau des dents, de l'épithélium olfactif, du cerveau, des bourgeons de membres et des follicules pileux de l'embryon. A l'état adulte, l'expression de Sp6 se réduit fortement dans tous les tissus; seuls les poumons présentent un taux d'expression relativement important.<p>Ce travail a également permis de mettre en évidence l'existence d'un transcrit non-codant issu d'une transcription antisens du locus Sp6 et dont le premier exon inclu la totalité de l'exon 2 du gène Sp6. Nous l'avons appelé Sp6os et avons montré que son expression est absente dans de nombreux tissus et est très faible dans les tissus où on détecte le transcrit. Une comparaison de l'expression des transcrits Sp6 et Sp6os nous a permis d'imaginer un rôle pour Sp6 dans le développement et une possible modulation de son activité, par Sp6os, dans certains tissus.<p><p>Afin de préciser la fonction du locus Sp6, nous l'avons invalidé chez la souris. Les mutants Sp6-/- se sont avérés viables mais présentent des anomalies dans tous les tissus où Sp6 est le plus fortement exprimé. En effet, ils n'ont ni pelage, ni vibrisse et montrent des anomalies des dents, des membres et des poumons. Nous avons également noté une dérégulation importante de l'apoptose (et parfois aussi de la prolifération cellulaire) chez ces souris Sp6-/-. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La grande famille des facteurs de transcription Ets est caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN, le domaine ETS, qui présente une structure de type hélice-tour-hélice ailé et qui reconnaît la séquence nucléotidique GGAA/T. Ces facteurs sont des protéines modulaires, dont les domaines sont structurellement conservés, régulent la transcription de leurs gènes cibles. L’action régulatrice de ces facteurs de transcription, ainsi que leur spécificité, dépendent de leurs sites d’expression, du taux auquel ils sont exprimés ainsi que des modifications post-traductionnelles qui les touchent. Au sein de la famille Ets, les trois membres du groupe PEA3 - Erm, Pea3 et Er81 - sont impliqués dans divers processus tant physiologiques tels que le développement des neurones sensitifs et moteurs que pathologiques tels que la croissance et l’invasion tumorale ou l’apparition de métastases, au niveau mammaire notamment.<p><p>Notre travail a eu pour ambition de mieux comprendre les relations structure/fonction des membres du groupe PEA3, et plus particulièrement de Erm. <p><p>\ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus B-lymphotrope qui a été identifié comme l’agent étiologique de la leucose bovine enzootique. L’infection par le BLV se caractérise par l’absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle du provirus in vivo; elle favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d’échapper au système immunitaire de l’hôte. Cependant, la transcription du BLV peut être activée de manière rapide et très efficace par la protéine virale TaxBLV. La trans-activation par TaxBLV joue un rôle crucial dans la pathogenèse associée au BLV car elle permet la production de nouvelles particules virales nécessaires à la propagation du virus. Au cours de notre travail de thèse, nous avons étudié différents mécanismes impliqués au cours de ces deux phases clés (latence et trans-activation par TaxBLV) de l’expression du BLV.<p><p>Le promoteur unique de la transcription du BLV se situe à l’extrémité 5’ du génome proviral, dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) composée des régions U3, R et U5. Les mécanismes impliqués dans la trans-activation du LTR 5’ par TaxBLV sont encore mal connus. La trans-activation du LTR 5’ du BLV par TaxBLV requiert la présence de trois répétitions imparfaites de 21pb (TxREs pour Tax Responsive Elements) agissant en cis et situées dans la région U3. Chacune des TxREs possède dans sa partie centrale un motif imparfait de 8 nucléotides correspondant au site de liaison des protéines de la famille CREB/ATF (sites CREs pour cAMP-Responsive Element). Des expériences de retard de migration sur gel ont montré que les protéines CREB, ATF-1 et ATF-2 lient les CREs viraux in vitro. Comme TaxBLV ne semble pas capable de lier directement l’ADN du LTR, il a été suggéré que les facteurs CREB/ATF serviraient de médiateurs de la trans-activation par TaxBLV. De plus, il a également été suggéré au cours de ces dernières années que les facteurs de transcription CREB/ATF jouent aussi un rôle essentiel en l’absence de TaxBLV lors de l’initiation de la transcription virale.<p><p>CREB/ATF sont connus pour recruter les co-activateurs CBP/p300 qui possèdent une activité histone-acétyltransférase, suggérant qu’à l’instar d’autres rétrovirus tels que HIV-I ou HTLV-I, l’acétylation protéique pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la transcription du BLV. Au cours de la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence un synergisme transcriptionnel entre TaxBLV et les inhibiteurs de désacétylases TSA et NaBut, indiquant que l’acétylation protéique joue un rôle important dans la trans-activation par TaxBLV. Nous avons ensuite montré que ni TaxBLV, ni son médiateur CREB ne sont acétylés in vivo au niveau d’un résidu lysine interne, mais que la TSA synergise avec TaxBLV via un mécanisme indirect, sensible à l’inhibition de la synthèse protéique. Fonctionnellement, CREB/ATF semblent jouer un rôle crucial dans le synergisme TaxBLV/TSA car la mutation des CREs viraux ou la sur-expression d’un dominant négatif CREB inhibent ce synergisme. Des expériences de gel retard et de ChIP ont démontré, in vitro et in vivo, que les inhibiteurs de désacétylases augmentent la liaison des facteurs CREB/ATF aux TxREs. Nos résultats suggèrent donc que le synergisme TaxBLV/TSA serait dû à une augmentation de la trans-activation par TaxBLV observée suite à l’augmentation, induite par la TSA, du recrutement de CREB/ATF au niveau des TxREs.<p><p>CREB/ATF appartiennent à la famille des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF agissant au niveau des promoteurs contenant des éléments CREs. Cependant, la liaison de CREM aux CREs imparfaits du LTR du BLV n’a jamais été étudiée. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré que des isoformes du gène CREM sont exprimées dans des PBMCs isolés à partir d’un mouton infecté par le BLV et que ces protéines CREM sont capables de lier in vitro et in vivo le promoteur du BLV, via les motifs CREs présents au centre de chacune des TxREs. Des analyses fonctionnelles ont ensuite montré qu’en l’absence de TaxBLV, la surexpression de l’isoforme activatrice CREMt induit la transcription dirigée par le LTR 5’ du BLV. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que CREMt serait capable d’activer la transcription du BLV en réponse à l’activation des cellules B infectées, via la phosphorylation de la sérine 117 de CREMt et via le recrutement par CREMt des co-activateurs CBP/p300. CREMt serait donc impliqué dans les stades précoces de l’initiation de la transcription du BLV. Cependant, nous avons montré que CREMt n’est pas impliqué dans les stades tardifs de l’expression virale puisqu’il ne semble pas capable d’induire la trans-activation par TaxBLV. Au contraire, nous avons montré par des expériences de compétition que CREMt diminue la trans-activation par TaxBLV lorsque celle-ci est induite par CREB, probablement en entrant en compétition avec CREB pour la liaison au niveau des TxREs.<p><p>L’expression du gène CREM est régulée transcriptionnellement et post-transcriptionnellement et mène à la production de différentes isoformes capables d’agir comme des activateurs ou des répresseurs de la transcription. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence la présence d’isoformes répressives ICER dans les cellules YR2 infectées par le BLV. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons montré qu’ICER est capable de réprimer la trans-activation par TaxBLV, suggérant qu’ICER retarderait la trans-activation par TaxBLV afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte infecté jusqu’à ce qu’un niveau suffisant du trans-activateur TaxBLV soit produit.<p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les protéines de la Famille Ets sont des facteurs de transcription qui reconnaissent par l'intermédiaire d'un domaine de liaison à l'ADN, appelé le domaine ETS, une séquence nucléotidique centrée sur un core consensus 5'-GGAA/T-3'. Le gène fev, un membre de cette famille, a été isolé chez l'humain après avoir été identifié dans une tumeur de Ewing chez l'enfant comme le résultat d'une translocation chromosomique. Une étude préliminaire de 1997 indiquait que chez l'Homme, Fev possède une expression tissulaire restreinte au petit intestin et à la prostate "adulte". Dans la première partie de ce travail, nous avons observé une surexpression de l'ARNm de ce facteur de transcription dans une large série d'adénocarcinomes prostatiques de différenciation variable en comparaison au profil d'expression observé dans un groupe témoin de prostates hyperplasiées. En recherchant des lignées cellulaires qui expriment ce facteur, nous avons mis en évidence la présence de ce messager dans la lignée humaine d'origine prostatique LNCaP. De même, les lignées humaines d'origine hématopoïétiques Dami/HEL92.1.7, K-562, KU-812 F et U-937 expriment ce facteur. Parallèlement, nous avons réalisé l'étude de l'expression de Fev dans le cerveau humain. En effet, chez le rat et chez la souris, l'homologue de Fev (mPet-1/Pet-1) est exprimé spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques. Nous avons ainsi montré sur le cerveau humain que l'ARNm de Fev est exclusivement exprimé dans les noyaux du raphé qui contiennent les neurones sérotoninergiques. Il est co-exprimé avec deux marqueurs de ces neurones, la SERT/5-HTT et la TPH2.<p>Parallèlement, nos travaux de caractérisation fonctionnelle de la protéine Fev ont permis de définir ce facteur comme un répresseur transcriptionnel. En effet, ce facteur possède un domaine carboxy-terminal riche en résidus alanines qui lui confère, en partie, sa fonction de répresseur de la transcription (répression active); la délétion de cette région conduisant à une réduction drastique de l'effet répresseur. Parallèlement, nous avons montré que le domaine ETS de Fev est responsable d'une activité répressive passive par l'occupation des sites de liaison aux facteurs Ets. Néanmoins, nous ne connaissons pas, à l'heure actuelle, les gènes-cibles spécifiques qui sont directement réprimés par Fev dans les cellules dans lesquelles le gène est normalement exprimé. Nous avons tenté de développer, par établissement de clones stables, des modèles cellulaires où le gène d'intérêt est surexprimé, mais ces tentatives furent infructueuses. Cet effet drastique de Fev est conféré par la partie carboxy-terminale. Il est ainsi probable que la surexpression de ce répresseur transcriptionnel spécifique de certains gènes cibles de la famille Ets provoque des effets sur la survie des cellules en régulant des gènes indispensables à la croissance cellulaire, et ainsi empêchant la prolifération de clones cellulaires.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le placenta humain est un organe indispensable au maintien de la grossesse et au développement foetal. Son unité structurale et fonctionnelle est la villosité choriale constituée principalement de trophoblastes qui se différencient selon la voie villeuse endocrine ou extravilleuse invasive. Ces deux populations trophoblastiques sécrètent de l'hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG), hormone indispensable à la grossesse. C'est une glycoprotéine constituée de deux sous-unités: la sous-unité alpha commune avec la LH, FSH et la TSH et la sous-unité beta, spécifique à chaque hormone, codée par un cluster de gênes regroupés en type I (gêne beta 7) et type II (gênes beta 3, 5 et 8). L'hCG est sécrétée dans le compartiment maternel où elle joue un rôle endocrine essentiel au maintien de la grossesse en stimulant la production de progestérone par l'ovaire. L'hCG joue également un rôle localement en stimulant la différenciation de chaque type de trophoblaste. Elle présente, dans le sang maternel, un pic de sécrétion à 10-12 semaines d'aménorrhée (SA), période ou le statut oxydatif placentaire change. En effet, les bouchons trophoblastiques obstruant la lumière des artères spiralées utérines se délitent à cette période, permettant l'entrée progressive du sang maternel dans la chambre intervilleuse. La pression en oxygène augmente de 18 mm/Hg (8-9 SA, 1er trimestre précoce) à 60 mm/Hg (12-14 SA, 1er trimestre tardif). Dans mon travail de thèse, j'ai cherché à mettre en évidence in situ et in vitro l'impact de ce changement de statut oxydatif sur la différenciation des trophoblastes villeux du 1er trimestre, et plus particulièrement sur l'expression des hCG beta de type I et de type II. J'ai ainsi mis en évidence que les trophoblastes villeux mononucléés du 1er trimestre précoce sécrétaient plus d'hCG beta de type I et II, fusionnaient plus rapidement et exprimaient un panel de facteurs de transcription différents par rapport aux trophoblastes villeux du 1er trimestre tardif. Dans un deuxième temps, j'ai comparé in vitro l'expression et la régulation des deux types d'hCG beta entre les trophoblastes villeux et extravilleux. J'ai montré que: 1) les trophoblastes villeux expriment plus d'hCG beta de type I et II que les trophoblastes extravilleux, 2) dans les deux cas l'hCG beta de type II est majoritaire et 3) PPAR gamma régule de façon opposée ces deux types d'hCG entre les trophoblastes villeux et extravilleux. Enfin j'ai mis en évidence que l'expression de ces deux types d'hCG était dérégulée dans la pré-éclampsie et le RCIU. L'étude des mécanismes impliqués dans la régulation des gênes codants pour l'hCG représente un enjeu important pour la compréhension de la différenciation du trophoblaste humain, du développement précoce du placenta et des pathologies de la grossesse. / The human placenta is an essential organ to maintain pregnancy and for foetal growth. Its structural and functional unit is the chorionic villous, which is mainly composed of cytotrophoblasts that follow two differentiation pathways: the endocrine villous and the invasive extravillous trophoblasts. These two trophoblastic subtypes secrete the human chorionic gonadotropin hormone (hCG), an essential hormone for trophoblast differentiation, placental development and pregnancy. hCG is a glycoprotein composed of two subunits: the alpha subunit, which is common to LH, FSH and TSH, and the beta subunit that confers hormone specificity. A gene cluster encodes the beta subunit, type I (CGB7) and type II (CGB3, 5 and 8), that code for two different proteins. hCG is detected in the maternal blood from the first week of pregnancy, with a peak level at 10-12 weeks of gestation (WG). During the first trimester the oxygen concentration in the intervillous space changes from about 2% (prior to 10 WG) to approximately 6-8% (after 12 WG) due to development of blood flow to the placenta. During my PhD work, I studied in situ and in vitro the impact of these different environments during the first trimester on villous cytotrophoblast differentiation, and more specifically on the type I and type II beta hCG gene expression. I showed that type I and type II beta hCG are more expressed in early first trimester cytotrophoblasts and that these cells exibit more fusion features and express a different panel of transcription factors compare to cells from late first trimester. In the second part of my work, I compared the expression and the regulation in vitro of the two types of beta hCG between villous and extravillous cytotrophoblasts. I demonstrated: 1) villous trophoblast express more type I and type II beta hCG compared to the extravillous trophoblast, 2) in both case type II hCG beta is the major form of beta hCG and 3) PPAR gamma differentially regulates type I and type II beta hCG expression in villous and extravillous trophoblasts. Lastly I showed that the expression of type I and type II beta hCG is deregulated in pre-eclampsia and FGR. The study of the mechanisms involved in hCG regulation represents an important issue for the understanding of human trophoblast differenciation and pregnancy pathophysiology.

Notre objectif était de mieux comprendre la régulation de la biosynthèse des parois secondaires lors de la formation du bois chez l'Eucalyptus, le feuillu le plus planté au monde et le deuxième dont le génome est séquencé. Nous avons caractérisé trois facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3 et montré que EgMYB137 était un nouveau régulateur de la biosynthèse des parois secondaires. Nous avons aussi démontré que l'activité transcriptionnelle de EgMYB1, un répresseur de la biosynthèse des lignines, était régulée par une interaction protéine-protéine impliquant une histone linker (EgH1.3). Enfin, nous avons mis au point une méthode de transformation homologue chez l'Eucalyptus via A. rhizogenes. Les " hairy roots " transgéniques sont adaptées à la caractérisation fonctionnelle de gènes reliés à la formation du xylème. Nos résultats ont permis de découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans la régulation des parois secondaires, mettant en lumière la complexité de ce processus mais aussi offrant de nouvelles perspectives pour l'amélioration du bois pour des applications industrielles comme la production de bioéthanol de deuxième génération. / Our objective was to better understand the regulation of the biosynthesis of the lignified secondary cell walls during wood formation in Eucalyptus, the most planted hardwood tree, and the second whose genome has been sequenced. We functionally characterized three Eucalyptus transcription factors of the R2R3-MYB family and identified EgMYB137 as a new regulator of secondary cell wall deposition. We also showed that the transcriptional activity of EgMYB1, a repressor of lignin biosynthesis was modulated by protein-protein interactions involving a linker histone (EgH1.3). Finally, we set up a homologous transformation system for Eucalyptus using Agrobacterium rhizogenes. The transgenic hairy roots are suitable for high throughput functional characterization of cell wall-related genes. Our findings not only allowed getting new insights into the complexity of the network regulating secondary cell walls but also open new avenues to improve wood quality for industrial applications such as second-generation bioethanol.

Les interactions ADN-protéine sont fondamentales dans de nombreux processus biologiques tels que la régulation des gènes et la réparation de l'ADN. Cette thèse est centrée sur l'analyse des propriétés physiques et dynamiques des interfaces ADN-protéine. À partir de l'étude de quatre complexes ADN-protéine, nous avons montré que l'interface ADN-protéine est dynamique et que les ponts salins et liaisons hydrogène se forment et se rompent dans une échelle de temps de l'ordre de la centaine de picosecondes. L'oscillation des chaînes latérales des résidus est dans certains cas capable de moduler la spécificité d'interaction. Nous avons ensuite développé un modèle de protéine gros grains dans le but de décomposer les interactions ADN-protéine en identifiant les facteurs qui modulent la stabilité et la conformation de l'ADN ainsi que les facteurs responsables de la spécificité de reconnaissance ADN-protéine. Notre modèle est adaptable, allant d'un simple volume mimant une protéine à une représentation plus complexe comportant des charges formelles sur les résidus polaires, ou des chaînes latérales à l'échelle atomique dans le cas de résidus clés ayant des comportements particuliers, tels que les cycles aromatiques qui s'intercalent entre les paires de base de l'acide nucléique / DNA-protein interactions are fundamental in many biological processes such as gene regulation and DNA repair. This thesis is focused on an analysis of the physical and dynamic properties of DNA-protein interfaces. In a study of four DNA-protein complexes, we have shown that DNA-protein interfaces are dynamic and that the salt bridges and hydrogen bonds break and reform over a time scale of hundreds of picoseconds. In certain cases, this oscillation of protein side chains is able to modulate interaction specificity. We have also developed a coarse-grain model of proteins in order to deconvolute the nature of protein-DNA interactions, identifying factors that modulate the stability and conformation of DNA and factors responsible for the protein-DNA recognition specificity. The design of our model can be changed from a simple volume mimicking the protein to a more complicated representation by the addition of formal charges on polar residues, or by adding atomic-scale side chains in the case of key residues with more precise behaviors, such as aromatic rings that intercalate between DNA base pairs